KR20100037636A - Ｅｇｆｒ 억제제 치료에 대한 예측 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 환자에서 EGFR 억제제 치료의 임상적 이득을 예측하는 바이오마커를 제공한다.

Description

ＥＧＦＲ 억제제 치료에 대한 예측 마커 {PREDICTIVE MARKER FOR EGFR INHIBITOR TREATMENT}

본 발명은 암 환자에서의 EGFR 억제제 치료의 임상적 이득을 예측하는 바이오마커를 제공한다.

다수의 인간 악성종양은 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 일탈 또는 과발현과 연관되어 있다. EGF, 형질전환 성장 인자 α (TGF-α) 및 다수의 기타 리간드는 EGFR에 결합하여, 수용체의 세포내 타이로신 키나아제 도메인의 자가인산화를 자극한다. 여러 가지 세포내 경로들이 후속하여 활성화되며, 이들 하류방향 사건들은 시험관내 종양 세포 증식을 초래한다. EGFR을 통한 종양 세포의 자극이 생체내 종양 성장 및 종양 생존의 두 가지 모두에 중요하다는 것은 기정사실이다.

EGFR 타이로신 키나아제의 억제제인 Tarceva^TM를 이용한 초기의 임상 데이터는, 그 화합물이 안전하며, 표적으로 하는 유효 농도를 제공하는 투여량 (전임상 데이터로 결정됨)에서 일반적으로 널리 용인된다는 것을 나타낸다. 진행된 질환이 있던 환자에서의 임상 I상 및 II상 시험은, Tarceva^TM가 일정 범위의 상피 종양에서 유망한 임상 활성을 갖는다는 것을 증명했다. 실제로, Tarceva^TM가 두경부암이 있는 환자 및 NSCLC (비-소세포 폐암)이 있는 환자에서 기존 확립된 2차 항암치료의 화학요법과 비슷한 정도로 오래가는 부분적인 차도를 유도할 수 있고, 화학요법보다 더 나은 안전성 프로파일 및 개선된 편의성 (정맥내 [i.v.] 투여 대신 정제)의 이득을 추가하는 것으로 나타났다. 최근 완결된, 무작위적인 이중맹검 위약 통제 시험 (BR.21)은, 진행된 질환에 대한 표준 요법이 실패한 NSCLC 환자의 생존을 단일 약제 Tarceva^TM가 현저하게 연장시키고 개선시킨다는 것을 나타내었다.

Tarceva^TM (에를로티니브)는 소형 화학 분자이다; 이는 경구 활성인, EGFR 타이로신 키나아제 (EGFR-TKI)의 강력하고 선택적인 억제제이다.

폐암은 북미 및 유럽에서 암 관련한 사망의 주된 요인이다. 미국에서, 폐암에 부차적인 사망자 숫자는 암 관련 사망 원인을 주도하여, 두 번째 (대장암), 세 번째 (유방암) 및 네 번째 (전립선암)를 총합한 사망자 수를 능가한다. 전체 폐암의 약 75% 내지 80%가 NSCLC이며, 약 40%의 환자들은 국소적으로 진행되고/되거나 수술로 치유불가능한 질환을 나타내고 있다. 이러한 군에는 일반적으로 악성 흉수를 제외한, 종양의 부피가 큰 병기 (stage)인 IIIA기 및 IIIB기 질환을 갖는 이들이 포함된다.

유럽 연합에서, 매년 폐암의 대략적인 발생률은 100,000명당 52.5명이며, 사망률은 48.7명이다. 남성들 중에서는 상기 비율이 79.3 및 78.3이며, 여성들 중에서는 상기 비율이 각각 21.6 및 20.5이다. NSCLC는 폐암 전체의 80%를 차지한다. 남성 폐암 사망의 약 90% 및 여성 폐암 사망의 80%는 흡연이 원인이다.

US에서, 미국 암 학회에 따르면, 2004년 동안, 약 173,800건의 신규한 폐암 발병 (남성 93,100건 및 여성 80,700건)이 있었으며, 이는 모든 신규한 암 발병의 약 13%를 차지했다. 대부분의 환자들은 진단 후 2년 내에 그 질환의 결과로 사망한다. 다수의 NSCLC 환자에 있어서, 성공적인 치료는 찾기 힘든 것으로 남아있다. 한참 진행된 종양은 종종 수술로도 치료불가능하며, 용인가능한 투여량의 방사선요법 및 화학요법에도 내성이 생길 수 있다. 무작위적인 시험에서, 현재 가장 활발한 병용 화학요법은 약 30% 내지 40%의 종양 반응률을 달성하며, 1년간 생존율은 35% 내지 40%이다. 이는 단독적인 보존적 치료가 보여주는 10%의 1년 생존율을 훨씬 앞선다 (Shepherd 1999).

최근까지, 재발한 환자에 대한 치료 선택폭은 최선의 보존적 치료 또는 일시적 완화로 제한되어 있었다. 도세탁셀 (Taxotere

)과 최상의 보존적 치료를 비교한 최근의 시험은, NSCLC가 있는 환자가, 시스플라틴 기반의 1차 항암치료의 식이요법이 실패한 후, 2차 항암치료의 화학요법으로 이득을 볼 수 있다는 것을 보여주었다. 모든 연령대의, ECOG 성능 상태 (performance status)가 0, 1 또는 2인 환자에서, 먼저 했던 백금-기반의 치료로는 치료가 어려웠던 이들에서처럼, 도세탁셀의 이용으로 생존이 개선되었음이 증명되었다. 요법으로 이득을 못 본 환자들에는, 10%의 체중 손실이 있거나, 락테이트 디하이드로게나아제 수준이 높거나, 여러 장기에 연루되어 있거나 또는 간에 연루되어 있는 이들이 포함된다. 추가적으로, 도세탁셀 단독요법의 이득은 2차 항암치료 설정을 넘어서진 못했다. 3차 이상의 항암치료로서 도세탁셀을 받은 환자들은 생존의 연장을 보여주지 않았다. 단일 약제 도세탁셀은 NSCLC에 대한 표준 2차 항암치료 요법이 되었다. 최근, NSCLC의 2차 항암치료 요법에서 또 다른 무작위적인 III상 시험에서는 페메트렉세드 (Alimta

)와 도세탁셀을 비교하였다. 페메트렉세드를 이용한 치료는 임상적으로 동등한 효능을 도출했으나, 도세탁셀보다 훨씬 더 적은 부작용이 있었다.

맞춤화된 암 치료 방법 개발에 대한 필요가 있음은 오래 전부터 인정되어 왔다. 표적으로 삼은 암 치료법을 개발하면서, 종양 표적의 분자적 프로파일을 제공할 수 있는 방법론 (즉, 임상적인 이득에 대해 예측되는 것)이 특별한 관심대상이 되었다. 암에서의 유전자 발현 프로파일에 대한 법칙의 증거는, 현재의 형태학적 및 면역세포화학적 시험을 근거로 하기에는 명확하지 않은 종양 유형의 분자적 분류를 이용하여 이미 확립되어 있다. 두 개별적 질환 주체는, 유전자 발현 프로파일링을 사용하여 미만성 대세포 B-세포 림프종의 단일한 현 분류로부터 상이한 예측으로 분화되었다.

그러므로, 암 환자에서 EGFR 억제제 치료의 임상적 이득을 예측하는 발현 바이오마커를 제공하는 것이 본 발명의 목표이다.

본 발명의 첫 번째 목적에서는, 하기 단계를 포함하는 EGFR 억제제를 사용한 치료에 대해 반응하는 암 환자의 임상적 이득을 예측하는 시험관내 방법이 제공된다: 환자의 종양 샘플에서의 PTP4A1 유전자의 발현 수준을 측정하고, PTP4A1 유전자의 발현 수준을, 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 PTP4A1 유전자의 발현 수준의 대표값에 대해 비교하는 단계 (여기서 환자의 종양 샘플에서의 PTP4A1 유전자의 더 낮은 발현 수준은 치료로부터 임상적 이득을 얻을 환자에 대한 표식임).

약어 PTP4A1은 단백질 타이로신 포스페이트 유형 IVA, 구성원 1을 의미한다. Seq. Id. No. 1은 인간 PTP4A1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

용어 "치료로부터 임상적 이득을 얻지 못하는 환자 집단의 종양에서의 PTP4A1 유전자의 발현 수준의 대표값"은 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못하는 환자 집단의 종양에서의 마커 유전자의 평균 발현 수준에 대한 계산치를 나타낸다. 임상적 이득은 12주 이상 동안 목적된 반응 또는 질환 안정화를 갖는 것으로서 정의된다.

추가적인 바람직한 구현예에서, PTP4A1 유전자는 치료로부터 임상적인 이득을 얻지 못한 환자 집단의 대표값과 비교하여 환자의 종양 샘플에서 1.2 내지 1.8배 이상 더 낮은 발현 수준을 나타낸다.

바람직한 구현예에서, 마커 유전자의 발현 수준은 마이크로어레이 (microarray) 기술 또는, 정량 RT-PCR처럼 RNA 발현 수준을 평가하는 기타 기술로, 또는 각각의 단백질의 발현 수준을 관찰하는 임의의 방법, 예를 들어 면역조직화학법 (IHC)으로 측정된다. 유전자칩의 구축 및 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. U.S. 특허 제 5,202,231 호; 제 5,445,934 호; 제 5,525,464 호; 제 5,695,940 호; 제 5,744,305 호; 제 5,795,716 호 및 제 5,800,992 호를 참조한다. 또한, Johnston, M. Curr. Biol. 8:R171-174 (1998); Iyer VR 등, Science 283:83-87 (1999)을 참조한다. 물론, 유전자 발현 수준은 당업자에게 공지된 기타 방법, 예를 들어 노던 블롯, RT-PCR, 실시간 정량 PCR, 프라이머 신장, RNase 보호, RNA 발현 프로파일링으로 측정될 수 있다.

본 발명의 마커 유전자는 기타 바이오마커와의 바이오마커 집합으로 조합될 수 있다. 바이오마커 집합은, 암 환자에서의 EGFR 억제제 치료의 효과에 대한 예측을 위해 예측 바이오마커와의 임의 조합으로부터 성립될 수 있다. 본원에서 기재된 바와 같은 바이오마커 및 바이오마커 집합이, 예를 들어, EGFR 억제제를 사용한 치료적 개입에 대해 암 환자가 어떻게 반응할 것인지를 예측하는데 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "유전자"라는 용어는 유전자의 변이체를 포함한다. "변이체"라는 용어는 GenBank 접근 번호로 주어진 핵산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 서열에 관한 것이다. "실질적으로 유사한"이라는 용어는 당업자에게는 잘 이해된다. 특히, 유전자 변이체는 인간 집단 내에서 가장 우세한 대립형질의 핵산 서열과 비교하여 뉴클레오티드 교환을 보이는 대립형질일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 실질적으로 유사한 핵산 서열은 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 가장 우세한 대립형질과의 서열 유사성을 갖는다. "변이체"라는 용어는 또한 스플라이스 (splice) 변이체에 관한 것을 의미한다.

EGFR 억제제는 게피티니브, 에를로티니브, PKI-166, EKB-569, GW2016, CI-1033 및 항-erbB 항체, 예컨대 트라스투주마브 및 세툭시마브로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 구현예에서, EGFR 억제제는 에를로티니브이다.

또 다른 구현예에서, 암은 NSCLC이다.

본 발명에 의해 기재되는 유전자의 유전자 발현의 검출 및 정량 기술에는 노던 블롯, RT-PCR, 실시간 정량 PCR, 프라이머 확장, RNase 보호, RNA 발현 프로파일링 및 관련 기술이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 [Sambrook J 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000)]를 참조한다.

본 발명에 의해 기재되는 각 유전자의 단백질 발현 검출 기술에는 면역조직화학 (IHC; Immunohistochemistry)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 종양 또는 암 생검과 같은 환자 조직 샘플로부터의 세포를 검정하여, 하나 이상의 바이오마커의 발현 패턴을 측정할 수 있다. 암 치료의 성공 또는 실패는, 종양 또는 암 생검과 같은 시험 조직으로부터의 세포 (시험 세포)의 바이오마커 발현 패턴이, 하나 이상의 바이오마커의 대조군 집합의 발현 패턴과 비교적 유사 또는 상이한가에 근거해 결정될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, EGFR 억제제 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자의 종양과 비교하여 EGFR 억제제 치료로부터 임상적 이득을 얻은 환자의 종양에서, 표 3의 유전자가 하향 조절되었다는, 즉 보다 낮은 발현 수준을 보인다는 것을 발견하였다. 따라서, 시험 세포가 암 치료에 반응하였던 환자의 바이오마커 발현 프로파일에 상응하는 바이오마커 발현 프로파일을 보이는 경우, 개체의 암 또는 종양이 EGFR 억제제를 사용한 치료에 바람직하게 반응할 것 같거나 그러할 것으로 예상된다. 반대로, 시험 세포가 암 치료에 반응하지 않았던 환자의 바이오마커 발현 패턴에 상응하는 바이오마커 발현 패턴을 보이는 경우, 개체의 암 또는 종양이 EGFR 억제제를 사용한 치료에 바람직하게 반응하지 않을 것 같거나 그러할 것으로 예상된다.

본 발명의 바이오마커, 즉 표 3에 열거된 유전자는 암 환자, 특히 불응성 NSCLC 환자에 대한 맞춤 요법 (individualized therapy)을 향한 첫 번째 단계이다. 상기 맞춤 요법은 진료 의사가 암 치료요법, 특히 NSCLC에 대한 기존의 약물들 중 가장 적절한 제제를 선별할 수 있게 할 것이다. 각각의 미래의 환자에 대한 맞춤 요법의 이득은 하기와 같다: 반응률 / 이득을 얻는 환자의 수가 증가하고 비효과적인 치료로 인한 유해한 부작용의 위험성이 감소할 것이다.

본 발명의 추가 목적에서는 본 발명의 시험관내 방법에 의해 확인된 암 환자를 치료하는 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은 표 3의 유전자의 예측 발현 패턴에 근거해 치료하기로 선택된 환자에게 EGFR 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 EGFR 억제제는 에를로티니브이고, 치료하고자 하는 바람직한 암은 NSCLC이다.

도 1은 연구 설계를 보여준다;
도 2는 샘플 처리에 대한 도식을 보여준다;
도 3a는 PTP4A1 발현 수준 대 Genechip

프로파일링에 대한 임상 결과를 보여준다;
도 3b는 PTP4A1 발현 수준 대 qRT-PCR에 대한 임상 결과를 보여준다;
도 3c는 PTP4A1에 대한 Genechip

과 qRT-PCR 측정값 사이의 상관관계를 보여준다.

실험적 부분

연구에 대한 근거 및 연구 설계

최근 NSCLC 환자의 하위집합의 종양 조직 내의 EGFR 유전자에서의 돌연변이 및, 에를로티니브 및 게피티니브에 대한 감수성을 가진 이러한 돌연변이의 연관성이 기재되어 있다 (Pao W, 등. 2004; Lynch 등. 2004; Paez 등. 2004). 2가지 연구를 조합한 경우 환자에서, 돌연변이된 EGFR은 게피티니브에 반응을 보였던 환자 14명 중 13명에서 관찰되었고, 반응을 보이지 않았던 11명의 게피티니브-처리된 환자에서는 관찰되지 않았다. 이들 돌연변이의 보고된 유병률은 미선별된 NSCLC 환자 중 8% (25명 중 2명)에 달했다. 이들 돌연변이는 선암 (21%), 여성으로부터의 종양 (20%), 및 일본인 환자로부터의 종양 (26%)에서 보다 자주 발견되었다. 이들 돌연변이는 EGFR의 시험관내 활성 증가 및 게피티니브에 대한 감수성 증가를 야기하였다. 돌연변이와 장기적으로 안정된 질환 또는 생존 기간과의 관계는 유망하게 평가되지는 않았다.

BR.21 연구로부터의 예비 분석에 근거하여, 심지어 목적하는 반응을 보이는 환자를 분석에서 제외시킨 경우에도 유의한 생존 이득이 유지되기 때문에 (자료에 근거함), 관찰되는 생존 이득은 EGFR 돌연변이로 인한 것만은 아닌 것으로 보인다. 기타 분자 메커니즘도 또한 효과에 기여하는 것이 분명하다.

Tarceva^TM 치료에 대한 반응/이득을 예측하는 유전자 발현 수준의 변화가 있다는 가정에 근거하여, 마이크로어레이 분석을 사용하여 이들 변화를 측정하였다.

이를 위해서는 1차 요법의 실패 후 Tarceva^TM 단일요법으로 치료된 명확하게 정의된 연구 집단이 필요하였다. BR.21 연구로부터의 경험에 근거하여, 이득을 얻은 집단을 목적하는 반응, 또는 12주 동안의 질환 안정화를 가진 것으로서 정의하였다. 임상 및 마이크로어레이 데이터 집합을 사전 정의된 통계 계획에 따라 분석하였다.

이 기술을 적용하기 위해서는 신선한 동결 조직 (FFT; fresh frozen tissue)이 필요하다. 그러므로, 처리 시작 전에 의무적인 생검을 수행해야만 한다. 수집된 물질을 액체 질소 (N₂)에서 동결시켰다.

동시에 두 번째 종양 샘플을 수집하고, 파라핀에 저장하였다 (포르말린 고정 파라핀 포매: FFPE; formalin fixed paraffin embedded). 상기 샘플을 EGFR 신호 경로에서의 변경에 대해 분석하였다.

기관지경술을 통한 종양 생검을 실시하는 역량이 본 연구를 위한 전제 조건이었다. 기관지경술은 폐암 진단을 확인하기 위한 표준 절차이다. 일반적으로 안전하지만, 출혈과 같은 합병증의 위험이 남아있다.

본 연구는 난치성 NSCLC를 갖는 환자들에 대한 맞춤 요법을 향한 첫 단계였다. 상기 맞춤 요법은 진료 의사가 상기 징후에 대해 기존의 약물들 중 가장 적절한 제제를 선별할 수 있게 할 것이다.

일단 맞춤 요법이 가능해지면, 미래의 각 환자에 대한 이득은 현재의 연구에서 환자들이 감수해야 하는 위험을 능가할 것이다:

반응률 / 이득을 얻는 환자의 수가 증가할 것이고,

비효과적인 치료로 인한 유해한 부작용의 위험성이 감소할 것이다.

투여량 선택에 대한 근거

Tarceva^TM를 질환 진행, 용인불가한 독성 또는 사망시까지 150 mg의 투여량으로 1일 1회 경구 투여하였다. 상기 투여량에 대한 선택은 약동학적 변수 뿐 아니라 사전-치료를 과도히 받은 진행된 암 환자들에서 제 I, II 및 III상 시험에서 관찰된 상기 투여량의 안전성 및 내약성 프로파일을 근거로 하였다. 150　mg/일 투여량을 받은 암 환자들의 혈장에서 나타난 약물 수준은 임상적 효능을 목적으로 하는 500　ng　/ml의 평균 혈장 농도보다 높은 수준으로 일정했다. BR.21은, 상기 투여량으로 생존 이득을 보여주었다.

상기 연구의 목적

이의 일차적 목적은 Tarceva^TM 치료의 이득 (CR, PR 또는 SD ≥ 12주)을 예측하는 차등 발현 유전자들을 확인하는 것이었다. Tarceva^TM 치료에 대한 "반응" (CR, PR)을 예측하는 차등 발현 유전자들의 확인은 중요한 추가적인 목적이었다.

부차적인 목적은, 치료를 통한 이득에 관해서, EGFR 신호전달 경로에서의 변경을 평가하는 것이었다.

연구 설계

연구 설계 및 투여 방법에 대한 개관

이는 공개 (open-label) 예측 마커 확인 제 II상 연구였다. 본 연구는 약 12개국의 대략 26개 지역에서 수행되었다. 1가지 이상의 사전 화학요법이 실패한 진행성 NSCLC를 가진 264명의 환자가 12개월의 기간에 걸쳐 등록하였다. 지속적으로 경구 Tarceva^TM가 150　mg/일의 투여량으로 투여되었다. 약물 요법에 대한 내약성에 근거하여 투여량 감소가 허용되었다. 질환 조절 및 독성을 평가하기 위해 임상 및 실험 매개변수들을 검토 평가하였다. 치료는 질환 진행, 허용불가능한 독성 또는 사망시까지 계속되었다. 당해 연구 설계를 도 1에 나타내었다.

분자적 분석을 위해 종양 조직 및 혈액 샘플을 수득하여, Tarceva^TM의 효과를 평가하고 치료를 통해 이득을 얻는 환자들의 하위군을 확인하였다.

예측 마커 평가

종양 생검은 치료 시작 전 2주 내에 취하였다. 하기 2가지의 상이한 샘플을 채취하였다:

첫 번째 샘플은 항상 액체 N₂ 중에 즉시 동결시켰다.

두 번째 샘플은 포르말린 중에 고정시킨 후 파라핀 중에 포매시켰다.

즉시 동결 조직은 본 연구에서 가장 높은 우선순위를 가졌다.

도 2는 샘플 처리에 대한 도식을 나타낸다.

마이크로어레이 분석

종양 RNA 및 종양 주변 조직으로부터의 RNA를 추출하기 위한 종양 세포의 레이저 포획 미세절제 (laser capture microdissection; LCM)에 상기 즉시 동결 샘플을 사용하였다. 상기 RNA를 Affymetrix 마이크로어레이 칩 (HG-U133A) 상에서 분석하여 상기 환자들의 종양 유전자 발현 프로파일을 확립하였다. Affymetrix 칩에 대한 품질 관리를 사용하여 통계학적 비교를 위한 적절한 품질의 샘플을 선택하였다.

포르말린 고정된 파라핀 포매 조직에 대한 단일 바이오마커 분석

상기 두 번째 종양 생검인 FFPE 샘플을 사용하여, DNA 돌연변이, IHC 및 ISH 분석을 하기 기재한 바와 같이 수행하였다. 초기 진단시 수집된 조직에 대해서도 유사한 분석을 수행하였다.

EGFR 및 EGFR 신호전달 경로에 관여하는 기타 분자를 인코딩하는 유전자의 DNA 돌연변이 상태를 DNA 서열분석으로써 분석하였다. EGFR 및 관련 유전자들의 유전자 증폭은 FISH로 연구되었다.

단백질 발현 분석에는 EGFR 및 EGFR 신호전달 경로 내에서의 기타 단백질의 면역조직화학 [IHC] 분석이 포함되었다.

반응 평가

RECIST (Uni-dimensional Tumour Measurement) 기준을 사용하여 반응을 평가하였다. 상기 기준은 하기 링크에서 찾아볼 수 있다: http://www.eortc.be/recist/

다음을 주의해야 한다: CR 또는 PR의 상태로 규정하기 위해서는, 상기 치료 기간 중의 임의의 시점과는 적어도 4주 떨어진 시점에서의 반복 평가에 의해 종양 측정치의 변화가 확인되어야 한다.

SD의 경우, 후속적인 측정치가 연구 시작 후 최소 6주의 간격으로 적어도 1회 SD 기준을 충족해야 한다.

SD 유지의 경우, 후속적인 측정치가 연구 시작 후 12주 이상의 지속 시간에 걸쳐 적어도 1회 SD 기준을 충족해야 한다.

생존 평가

환자가 진료소로 방문하거나 또는 전화에 의해 3개월마다 정기적인 상태 체크를 수행하였다. 모든 사망을 기록하였다. 연구의 말미에는 각 환자에 대해 최종적 생존 확인이 필요하였다.

방법

RNA 샘플 제조 및 RNA 샘플에 대한 품질 관리

모든 생검 샘플 처리는 병리학 표준 실험실에서 다루어졌고; 새로 동결된 조직 샘플은 조사기관 지역에서 Roche Basel의 임상 샘플 작업 (Clinical Sample Operations) 시설로 수송되었고, 추가적인 처리를 위해 거기에서 병리학 실험실로 수송되었다. 레이저 포획 미세절제를 사용하여 주변 조직으로부터 종양 세포를 선별하였다. LCM 후, 상기 종양 풍부 물질로부터 RNA를 정제하였다. 상기 병리학 실험실은 그 후 상기 RNA의 농도 및 품질에 대한 추정을 위한 일련의 단계를 실행하였다.

RNase는 RNA 분해 효소이며 도처에서 발견되고, 따라서 RNA가 사용될 모든 절차는 RNA 분해를 최소화하도록 엄격히 조절되어야만 한다. 대부분의 mRNA 종은 자체적으로 다소 짧은 반감기를 가지며, 따라서 상당히 불안정한 것으로 간주된다. 그러므로, 임의 검정 전에 RNA 보전성 체크 및 정량화를 수행하는 것이 중요하다.

RNA 농도 및 품질 프로파일은 2100 Bioanalyzer

로 불리는 Agilent 기기 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA)를 사용하여 평가될 수 있다. 기기 소프트웨어는 RNA 보전성 번호 (RIN), 정량화 추정 (Schroeder, A., 등, The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol, 2006. 7: p.3)을 생성하고, 총 RNA 샘플의 리보솜 비율을 계산한다. RIN은 RNA 샘플의 전체 전기영동적 추적으로부터 측정되며, 이에는 분해 생성물의 존재 또는 부재가 포함된다.

RNA 품질을 2100 Bioanalyzer

로 분석하였다. Affymetrix 플랫폼 상에서의 추가적 분석을 위해, 충분한 RNA 및 첨가된 폴리-I 노이즈 초과의 하나 이상의 rRNA 피크를 갖는 샘플만을 선택하였다. 마이크로어레이에 의한 분석을 위해, 정제된 RNA를 로셰 의학 게놈학 센터 {Roche Centre for Medical Genomics (RCMG; Basel, Switzerland)}로 보냈다. 추가적인 처리를 위해 병리학 실험실로부터 122개 RNA 샘플을 받았다.

조직 RNA 샘플의 표적 표지

제조사의 지시사항에 따른 것으로서, Affymetrix로부터의 2-사이클 표적 표지 증폭 프로토콜 (Affymetrix, Santa Clara, California)에 따라 표적 표지를 실행하였다.

상기 방법은 표준 에버와인 선형 증폭 방법을 기준으로 하지만, 마이크로어레이에 대한 하이브리드화를 위해 충분히 표지된 cRNA가 생성되도록 상기 방법의 두 사이클을 사용한다.

표지 반응에서 사용된 총 RNA 투입량은, 10 ng 초과의 RNA가 활용가능한 경우 이들 샘플에 대해 10 ng 이었고; 상기 양 미만이 활용가능하거나 또는 활용가능한 양 데이터가 없는 경우 (매우 낮은 RNA 농도로 인해), 총 샘플의 절반을 반응에 사용하였다. 표지 반응으로부터의 수율은 20 ~ 180 μg cRNA이었다. 15 μg cRNA가 모든 샘플에 대해 사용된 하이브리드화의 수준에서 표준화 단계를 도입하였다.

인간 참조 RNA (Stratagene, Carlsbad, CA, USA)를, 샘플 각각의 뱃치 (batch)로의 작업량 내에서 대조군 샘플로서 사용하였다. 10 ng의 상기 RNA를 시험 샘플과 함께 투입으로서 사용하여, 표지 및 하이브리드화 시약이 예측한 바와 같이 작용하는지 확인하였다.

마이크로어레이 하이브리드화

Affymetrix HG-U133A 마이크로어레이는 약 14,500개의 잘 분석된 유전자를 나타내는 약 18,400개의 전사체 및 변이체를 표적하는 22,000개 초과의 프로브 집합을 포함한다.

Affymetrix 지시사항 (Affymetrix Inc., Expression Analysis Technical Manual, 2004)에 따라 모든 샘플에 대한 하이브리드화를 실행하였다. 간략하게는, 각각의 샘플에 대해, 15 μg의 바이오틴-표지된 cRNA를 2가 양이온의 존재 하 및 가열 하에 절편화하고, Affymetrix HG-U133A 전체 게놈 올리고뉴클레오티드 어레이에서 하룻밤 동안 하이브리드화하였다. 다음날 어레이를 제조사의 지시사항에 따라 스트렙타비딘-피코에리트린 (Molecular Probes; Eugene, OR)으로 염색하였다. 이후 GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix)을 사용하여 어레이를 스캐닝하고, GeneChip Operating Software (GCOS) 버전 1.4 (Affymetrix)로 신호 세기를 자동으로 계산하였다.

통계적 분석

Affymetrix^TM 데이터의 분석은 5개 주요 단계로 구성되었다.

단계 1은 품질 관리였다. 목표는 하위-표준 품질 프로파일을 갖는 어레이 데이터를 확인하고 분석에서 제외시키는 것이었다.

단계 2는 예비-처리 및 표준화였다. 목표는 칩 간 비교되어야 할 표준화 및 스케일화된 "분석 데이터 집합"을 생성하는 것이었다. 이는 배경 노이즈 추정 및 감산, 프로브 요약 및 스케일링을 포함하였다.

단계 3은 탐색 및 설명이었다. 목표는 가변성의 공급원 및 잠재적 경향을 확인하는 것이었다. 이는 다변 및 단변 설명적 분석 기술을 적용하여 유력한 공변 (covariate)을 확인하는 것으로 이루어졌다.

단계 4는 모델링 및 시험이었다. 목표는 "임상적 이득" 및 "임상적 무이득" 환자 사이의 평균 발현 수준에서의 차이의 통계적 평가를 기준으로 후보 마커의 목록을 확인하는 것이었다. 이는 각각의 프로브-집합에 대해 적당한 통계적 모델을 맞추고 통계적 유의성의 측정을 추론하는 것으로 이루어졌다.

단계 5는 견고성 (robustness) 분석이었다. 목표는 예비-처리 방법 및 통계적 가정에 많이 의존하지 않는 후보 마커의 적격 목록을 생성하는 것이었다. 이는 상이한 방법론적 접근으로 분석을 반복하고, 후보 목록을 교차시키는 것으로 이루어졌다. R 소프트웨어 패키지를 사용하여 모든 분석을 수행하였다.

단계 1: 품질 관리

데이터 품질의 평가는 여러 매개변수의 체크를 기준으로 하였다. 이들에는 표준 Affymetrix GeneChip^TM 품질 매개변수, 특히 스케일링 인자, 현존 호출 % (Percentage of Present Call) 및 평균 배경이 포함된다. 이러한 단계에는 또한 국지적 하이브리드화 문제점을 검출하기 위한 가상 칩 영상의 시각적 검사, 중간 거동으로부터의 임의 비정상적 이탈을 검출하기 위한, 가상 중간 칩에 대한 각각의 칩의 비교가 포함된다. 칩 간 상관관계 분석을 또한 수행하여 특이점 (outlier) 샘플을 검출하였다. 또한, Agilent Bioanalyzer^TM 2100으로 RNA 샘플을 분석하여 수득한 RNA 품질의 부수적 측정을 고려하였다.

이들 매개변수를 기준으로, 20개 어레이로부터의 데이터를 분석에서 제외시켰다. 따라서 102명 환자를 나타내는 총 102개 어레이로부터의 데이터를 분석에 포함시켰다. 이들 102개 샘플 집합의 임상적 설명을 하기 표 1에 나타내었다.

분석에 포함된 환자의 임상적 특징 설명
변수	값	n = 102
		n (%)
최상의 반응	N/A	16 (15.7%)
	PD	49 (48.0%)
	SD	31 (30.4%)
	PR	6 (5.9%)
임상적 이득	없음	81 (79.4%)
	있음	21 (20.6%)
성별	여성	25 (24.5%)
	남성	77 (74.5%)
인종	백인	65 (63.7%)
	동양인	37 (36.3%)
조직학	선암	35 (34.3%)
	편평	53 (52.0%)
	기타	14 (13.7%)
흡연 경험	없음	20 (19.6%)
	있음	82 (80.4%)

단계 2: 데이터 예비-처리 및 표준화

rma 알고리즘 (Irizarry, R.A., 등, Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. Nucl. Acids Res., 2003. 31(4): p. e15)을 예비-처리 및 표준화에 사용하였다. mas5 알고리즘 (AFFYMETRIX, GeneChip

Expression: Data Analysis Fundamentals. 2004, AFFYMETRIX)을, 개별적 프로브-집합에 대한 검출 호출을 만드는데 사용하였다. 모든 샘플에서의 "부재" 또는 "최저한 (marginal)"이라 칭하는 프로브-집합을 추가적 분석에서 제거하고; 5930개 프로브-집합을 상기 기준을 근거로 분석에서 제거하였다. 그러므로 분석 데이터 집합은 102명 환자에서 측정된 16353개 (22283개 중) 프로브-집합을 갖는 매트릭스로 이루어졌다.

단계 3: 데이터 설명 및 탐색

설명적 탐색 분석 (Descriptive exploratory analysis)을 수행하여 가변성의 주요 공급원 및 잠재적 경향을 확인하였다. 유전자 발현 프로파일에 대해 잠재적 영향을 갖는 공변 집합을 스크리닝하였다. 이는 기술적 및 임상적 변수를 모두 포함하였다. 기술적 공변에는 하기가 포함된다: RNA 처리 일자 (이후 뱃치로서 지칭됨), RIN (RNA 품질/보전성의 측정으로서), 조작자 및 샘플 채취 센터. 임상적 공변에는 하기가 포함된다: 조직학 유형, 흡연 상태, 종양 등급, 성능 점수 (Oken, M.M., 등, Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group. Am J Clin Oncol, 1982. 5(6): p. 649-55), 인구 통계학적 데이터, 반응자 상태 및 임상적 이득 상태.

분석 도구에는 단변 ANOVA 및 주요 성분 분석이 포함된다. 각각의 공변에 대해, 단변 ANOVA를 각각의 프로브-집합에 대해 독립적으로 적용하였다.

뱃치 변수의 유의한 효과가 확인되었다. 실제로, 뱃치 변수는 샘플 처리 일자와 Affymetrix 칩 롯트 (lot)의 일자 사이의 차이를 포착하였다. 뱃치 변수가 관심 변수와 거의 독립적인 것을 체크한 후, [Johnson, W.E., C. Li, 및 A. Rabinovic, Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostat, 2007. 8(1): p. 118-127]에 기재된 방법을 사용하여 뱃치 영향을 정정하였다.

뱃치 영향 정정 후 표준화된 데이터 집합은 후속 분석에서 분석 데이터 집합으로서 역할하였다.

조직학 및 RIN은 설명적 분석에 의해 강조된 두 추가적인 중요한 변수였다.

단계 4: 데이터 모델링 및 시험

선형 모델을 각각의 프로브-집합에 대해 독립적으로 맞추었다. 모델에 포함되는 변수를 표 2에 나타내었다. 최우 추정법 기술 (maximum likelihood technique)로 모델 매개변수를 추정하였다. "임상적 이득" 변수 (X1)에 상응하는 매개변수를 사용하여 임상적 이득을 갖는 환자군과 임상적 이득이 없는 환자군 사이의 발현 수준 차이를 평가하였다.

선형 모델에 포함된 변수의 설명
변수	유형	값
유전자 발현	의존적 (Yip)	환자 p에서의 프로브-집합 i의 log2 세기
절편	전체 평균 (μ)
임상적 이득	관심 예측자 (X1)	있음/없음
조직학	조정 공변 (X2)	선암/편평/기타
인종	조정 공변 (X3)	동양인/백인
성별	조정 공변 (X4)	여성/남성
RIN	조정 공변 (X5)	[2,...,7.9]
흡연자	조정 공변 (X6)	현재/과거/무경험
병기	조정 공변 (X7)	비절제.III/IV

각각의 프로브-집합 i에 대해, 통계적 시험의 목표는, 표 2에 열거한 기타 조정 공변을 고려하여, 임상적 이득을 갖는 환자 및 임상적 이득을 갖지 못한 환자에서의 평균 발현 수준이 동등하다는 가설을 거부하는 것이었다. 공식적으로, 동등성의 무효적 가설을 두 측면의 대안에 대해 시험하였다. 상응하는 p-값을 표 3에 나타내었다.

두 가지 이유에 의해 선형 모델의 선택이 유발되었다. 첫째로, 선형 모델은 다목적적이며, 잘 분석되고 견고성 접근적이어서, 관심 변수의 영향을 추정하는 경우 혼동 변수가 조정되도록 한다. 둘째로, 샘플 크기 102가 주어지고, 데이터 집합의 표준화 및 스케일링, 정상 분포 가정이 합리적이고 정당하였다.

각각의 프로브-집합에 대해, 잔류 모델을 기준으로 플리그너-킬린 (Fligner-Killeen) 시험을 사용하여 변동의 동질성 가정을 추정하였다. 분석은 하기 3개 단계로 이루어졌다:

1. 잔류 변수의 동질성에 대해 각각의 분류별 변수를 시험하는 단계,

2. 최소 p-값을 갖는 변수 V에 주의하는 단계, 및

3. 최소 p-값이 0.001 미만인 경우, 상이한 수준의 변수 V가 상이한 변동을 갖도록 모델을 다시 맞추는 단계.

단계 5: 견고성

견고성 분석의 목표는 예비-처리 단계 또는 통계적 분석의 기초가 되는 가정의 결과로서 분석 결과가 인위적일 수 있는 위험성을 감소시키는 것이었다. 하기의 세 가지 측면이 고려되었다: a) 품질 관리 단계에서의 몇몇 여분의 칩의 포함 또는 제외; b) 예비-처리 및 표준화 알고리즘; c) 통계적 가정 및 시험 접근.

상이한 분석 설정을 갖는 유의함으로서 일관적으로 표명된 유전자의 하위집합으로서 후보 마커의 목록을 정의하였다. 상이한, 적용된 분석 옵션은 하기와 같다:

a) 보다 엄격한 품질 관리 기준을 근거로 8개 칩의 추가적인 하위집합을 확인하였다. 이들 8개 칩을 제외시킴으로써 "감소된 데이터 집합"을 정의하였다.

b) 예비-처리 및 표준화용 rma에 대한 대안물로서 MAS5를 확인하였다. MAS5는 배경 추정, 프로브 요약 및 표준화에 대해 상이한 방법을 사용한다.

c) 하기 2가지의 추가적인 통계학적 시험을 사용하였다.

a. 임상적 이득ㆍ임상적 무이득 사이의 차이에 대한 윌콕슨 (wilcoxon) 시험 및

b. 응답 변수로서 임상적 이득을 취하고 공변으로서 유전자 발현을 취하는 로지스틱 회귀 (logistic regression) 모델을 시험하는 우도비 시험 (LRT; likelihood ratio test). 이들 2가지 추가적인 시험은 상이한 집합의 기초하는 통계적 가정에 따라 다르다. 각각의 프로브-집합에 있어서, LRT는 1 자유도의 카이-제곱을 따랐다.

요약하면, 2가지 집합의 샘플 ("풀 (full)" 데이터-집합 및 "감소된 (reduced)" 데이터-집합), 및 2가지의 예비-처리된 알고리즘 (mas5 및 rma)이 고려되었다; 이는 4가지의 상이한 분석 데이터 집합을 산출하였다. 상기 4가지의 데이터 집합 각각에, 3가지의 상이한 통계학적 시험을 적용하였다. 그러므로, 각 프로브-집합에 대해, 3가지 p-값을 계산하였다. 각각의 분석 데이터 집합에서, 복합 기준을 적용하여, 차등적으로 조절되는 유전자 목록을 확인하였다. 상기 복합 기준을 다음과 같이 정의하였다: 최대 p-값은 0.05 미만이고, 최소 p-값은 0.001 미만이다. 마커 유전자를 확인하기 위해 기준 1을 사용하는 견고성 분석으로 EGFR 억제제 치료에 대한 예측 마커로서 PTP4A1을 확인하였다.

표 3: 복합 기준 적용 후 견고성 분석에 근거한 임상적 이득에 대한 유전자 마커.

제 1열은 프로브-집합의 Affymetrix 확인자이다. 제 2열은 상응하는 유전자 서열의 GenBank 접근 번호이다. 제 3열은 상응하는 공식적인 유전자 명칭이다. 제 4열은 선형 모델로부터 추정된 바와 같은 임상적 이득ㆍ임상적 무이득 환자 사이의 발현 수준에 있어서의 상응하는 조정 평균 배수 변화이다. 제 5열은 선형 모델로부터 유도된 바와 같은 임상적 이득ㆍ임상적 무이득 환자 사이의 발현 수준에 있어서의 차이 시험에 대한 p-값이다. 제 6열은 발현 수준에 있어서의 조정 평균 배수 변화에 대한 95% 신뢰 구간이다.

Affymetrix 프로브 집합ID	GenBank	유전자	조정 평균 배수 변화	P-값	CI 95%
200732_s_at	NM_003463 (Seq. Id. No. 1)	PTP4A1	-1.44	3.2.1E-3	-1.8, -1.2

추가의 통계학적 분석

선별된 후보자 마커 PTP4A1의 경우, 독립적인 통계학자에 의해 인증된 환경에서 하기 추가적인 분석을 수행하였다:

ㆍ 일차 Affymetrix 분석으로부터의 PFS (Progression free survival: 무진행 생존율)에 대한 단변 콕스 회귀 (Univariate Cox Regression),

ㆍ 일차 Affymetrix 분석으로부터의 임상적 이득에 대한 단변 로지스틱 회귀 (Univariate Logistic Regression),

ㆍ 일차 Affymetrix 분석으로부터의 생존에 대한 단변 콕스 회귀.

상기 분석 결과를 하기에 제시한다. 이들은 일차 분석 결과와 일치하며, 선별된 마커 선택을 확인시켜준다.

결과: 일차 Affymetrix 분석으로부터의 PFS (Progression free survival: 무진행 생존율)에 대한 단변 콕스 회귀:

결과: 일차 Affymetrix 분석으로부터의 임상적 이득에 대한 단변 콕스 회귀:

결과: 일차 Affymetrix 분석으로부터의 생존에 대한 단변 콕스 회귀:

qRT - PCR

제조사의 지시 사항에 따라 (그러나 RNase H 소화는 포함시키지 않고) qRT-PCR용 SuperScript^TM III First-strand Synthesis SuperMix (Invitrogen, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.

제조사의 권장사항에 따라 ABI PRISM

7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA) 상에서 TaqMan

Gene Expression Assays를 사용하여 정량 PCR을 수행하였다. 모든 검정은 3벌로 수행하였다.

사용된 프라이머 및 프로브는 엑손 경계를 가로지르거나 또는 관심 Affymetrix Genechip

프로브 서열 내에 존재하였다. 2가지의 하우스-키핑 (house-keeping) 유전자가 내인성 대조군으로서 포함되었다: 베타-2-마이크로글로불린 (B2M; Assay Hs99999907_m1) 및 하이포잔틴포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT; Assay Hs99999909_m1).

모든 실행에는 교정 샘플 (calibrator sample) (성인의 폐로부터의 MVP^TM 총 RNA; Stratagene, CA, USA) 및 표준 곡선이 포함되었다. PTPRF 표준 곡선에 대해서는 Universal Human Reference 총 RNA (Stratagene, CA, USA)를 주형으로 사용하였다. 모든 샘플을 3벌로 측정하였다. 상대 정량은 -ΔCt 방법을 사용하여 수행하였다.

결과

앞서 보고한 바와 같이, 본 연구에 포함된 102명의 환자에 대해 Affymetrix Genechip

유전자 발현 프로파일을 결정하였다. 이들 환자 중, 75명에 대해 qRT-PCR 결과를 수득하였다 (표 4). qRT-PCR 결과가 나온 환자들의 인구 통계 및 임상적 특징은 전체 집단 (n=264) 및 활용가능한 Genechip

유전자 발현 프로파일을 가진 환자들의 것과 유사하였다.

치료전 특징들( Baseline characteristics ): qRT - PCR 분석된 환자들 (n=75)
특징
연령 (중간값, 범위)	62 (39~85)
성별; n (%)
남성	19 (25)
여성	56 (75)
ECOG 전신 상태 (performance status); n (%)
0	7 (9)
1	45 (60)
2	23 (31)
조직학; n (%)
선암	27 (36)
편평상피세포암종	34 (45)
대세포 암종	2 (3)
기타	12 (16)
질환 단계; n (%)
IIIB	22 (29)
IV	53 (71)
사전 화학요법의 수; n (%)
0	19 (25)
1	36 (48)
≥2	20 (27)
인종; n (%)
백인	51 (68)
아시아인	24 (32)
흡연 경력; n (%)
전혀 없음	12 (16)
현재 흡연 중	24 (32)
과거 경험 있음	39 (52)

qRT-PCR 결과가 나온 75명의 환자 중, 4명 (5%)은 부분 반응 (PR)을 나타내었고, 23명 (31%)은 SD를 나타내었고, 39명 (52%)은 PD를 나타내었고, 9명 (12%)은 평가가능하지 않았다. 이러한 결과는 전체 연구 집단 (n=264)에서 관찰된 결과와 매우 유사하였다.

도 3은 Affymetrix Genechip

프로파일링 및 qRT-PCR로 평가된 바 개별 환자들에서 PTP4A1에 대한 상대적 mRNA 수준을 보여준다. 도 3a는 발현 수준 대 Genechip

프로파일링에 있어서의 임상 결과를 보여주고, 도 3b는 qRT-PCR에 대한 발현 수준을 보여준다.

PTP4A1 mRNA 전사체에 있어서 Genechip

및 qRT-PCR 측정치 간에 양호한 상관관계가 있었다 (도 3c; 피어슨 (pearson) p=0.6, p<0.01). Genechip

프로파일링으로 관찰되는 바와 같이, qRT-PCR을 사용하여 평가된 PTP4A1 mRNA 수준은 에를로티니브에 대한 반응과 상관관계가 있는 것으로 보였고, 비반응자들에 비해 반응자들에서 더 높은 수준이 관찰되었다.

토의

조직 샘플을 고밀도 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 기술을 사용하여 분석하고, 그 데이터에 통계학적 모델링을 적용함으로써, 본 발명자들은 발현 수준을 통해, 에를로티니브를 사용한 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 예측할 수 있는 유전자를 확인할 수 있었다.

복합 기준 (상기 정의한)을 적용하였다. EGFR 억제제 치료에 대한 예측 마커로서 PTP4A1이 야기되었다.

PTP4A1은 단백질 타이로신 포스파타아제 패밀리의 두 번째 구성원이다. 이는 염색체 6q12 상에 위치하며 프레닐화 단백질 타이로신 포스파타아제 (PTP)의 소 클래스에 속하는 단백질 (PTP 도메인 및 특징적 C-말단 프레닐화 모티프를 포함함)을 인코딩한다. 상기 타이로신 포스파타아제는 핵 단백질이지만, 혈장막과 주로 연관될 수 있다.

여러 보고서에서는 PTP4A1의 높은 발현이 발암 활성, 특히 증강된 증식 속도 및 세포 운동성 및 전이성과 연관되었다. 비 소세포 폐암에서의 최근의 연구는 세포 이동 및 전이 과정에서의 PTP4A1의 기능적 역할을 입증하였다.

본 연구에서, PTP4A1은 에를로티니브를 사용한 치료로부터 임상적 이득을 얻은 환자에서 하향 조절되는 것으로 발견되었다. 상기 유전자의 발암 기능은 종양 마커로서의 이의 효용을 지지하는 명백한 주장이다.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Predictive marker for EGFR inhibitor treatment <130> 24411WO <150> EP07114309.3 <151> 2007-08-14 <160> 1 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 5099 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gatgaccgtg gttaaggcag tagaaagcag gctcgacact gagacgcggt tccagcccta 60 gaaggattgc attttacgat tcaggcaaac ttcgagtctc ctcatgtgac atgtgtgcac 120 tcctggaccg ttttaattat gagaaacgtg gtttgcagca tgattccttc cagtcgataa 180 atcggaatct ctctcgctcc caccccttct taacttcagg cttcctgcat cccggagcac 240 tcccggcagc cccttccctc ccccgccccg gggatgctcc gactcggcgc ttagccattc 300 atcaaccggt tcacaccggc ggcggccgcc gcggagtgac gtccggaggg ggcgggcctc 360 cgcccccgcc tgtcggctcc tggcccgcgg ttccaggccg cgattggtgg ctggagggtt 420 gcacgtcgcg ccggctataa aggggagggc ttgtgacgca agggcgcctc ggcgcgtgta 480 ttggctcctt cggctgcggg ccggctcggc tacgcgctct gctccgagcc gctcactgca 540 tggtagagtc tggtgccccc gccgccgcct gcatcgccgc caccgccgct ccgccacgac 600 caccgccgcc tcctgccctg cagccaccgc caccgcctgt gtcgccgccg cctcgggacc 660 ggctgtatga 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Claims (11)

1. 하기 단계를 포함하는, EGFR 억제제를 사용한 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법:
   환자의 종양 샘플에서의 PTP4A1 유전자의 발현 수준을 측정하고, PTP4A1 유전자의 발현 수준을, 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 PTP4A1 유전자의 발현 수준의 대표값에 대해 비교하는 단계 (여기서 환자의 종양 샘플에서의 PTP4A1 유전자의 더 낮은 발현 수준은 치료로부터 임상적 이득을 얻을 환자에 대한 표식임).
2. 제 1 항에 있어서, 발현 수준을 마이크로어레이 (microarray) 기술로 측정하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, PTP4A1 유전자가 치료로부터 임상적인 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 PTP4A1 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교하여 환자의 종양 샘플에서 1.2 내지 1.8배 이상 더 낮은 발현 수준을 나타내는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR 억제제가 에를로티니브인 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 NSCLC인 방법.
6. EGFR 억제제 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하기 위한 PTP4A1 유전자의 용도.
7. 제 6 항에 있어서, 암이 NSCLC인 용도.
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, EGFR 억제제가 에를로티니브인 용도.
9. EGFR 억제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인되는 암 환자 치료 방법.
10. 제 9 항에 있어서, EGFR 억제제가 에를로티니브인 방법.
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 암이 NSCLC인 방법.
    

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