ES2395879T3 - Marcador del tratamiento con inhibidor de EGFR - Google Patents

Abstract

Método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con NSCLC al tratamiento con erlotinib, que comprende:determinar un nivel de expresión de un gen PSPH en una muestra tumoral de un paciente y comparar el nivel deexpresión del gen PSPH con un valor representativo de un nivel de expresión del gen PSPH en tumores de unapoblación de pacientes no respondedores, en el que un nivel de expresión más alto del gen PSPH en la muestratumoral del paciente es indicativo de un paciente que responderá al tratamiento, en el que se ha definido el beneficioclínico como manifestar una respuesta objetiva o la estabilización de la enfermedad durante 12 semanas

Description

Marcador del tratamiento con inhibidor de EGFR

La presente invención proporciona un biomarcador que es predictivo de la respuesta al tratamiento con erlotinib en pacientes con NSCLC.

Varios tumores malignos humanos se asocian a la expresión aberrante o a la sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). El EGF, el factor a de crecimiento transformante (TGF-a), y algunos otros ligandos, se unen al EGFR, estimulando la autofosforilación del dominio intracelular de tirosina quinasa del receptor. Seguidamente se activa una diversidad de rutas intracelulares, y estos sucesos posteriores resultan en la proliferación de las células tumorales in vitro. Se ha planteado que la estimulación de las células tumorales mediante el EGFR podria resultar importante para el crecimiento y la supervivencia tumorales in vivo.

Los primeros datos clinicos con Tarceva, un inhibidor de la EGFR tirosina quinasa, indican que el compuesto es seguro y que generalmente resulta bien tolerado a dosis que proporcionan la concentracion efectiva objetivo (determinada a partir de datos preclínicos). Los ensayos clinicos de fase I y II en paciente con enfermedad avanzada han demostrado que Tarceva presenta una actividad clinica prometedora en un abanico de tumores epiteliales. En efecto se ha demostrado que Tarceva es capaz de inducir remisiones parciales duraderas en pacientes previamente tratados con cancer de cabeza y cuello y NSCLC (cancer pulmonar de celulas no pequenas) de un orden similar a la quimioterapia de segunda linea establecida, aunque con el beneficio anadido de un mejor perfil de seguridad que la quimioterapia y una mayor comodidad (administracion con tableta en lugar de intravenosa [i.v.]). Un ensayo aleatorizado, de doble ciego y controlado con placebo completado recientemente (BR.21) ha demostrado que el agente unico Tarceva prolonga y mejora significativamente la supervivencia de los pacientes con NSCLC para los que la terapia estandar para la enfermedad avanzada ha fracasado.

Tarceva (erlotinib) es una molecula quimica pequena; es un inhibidor selectivo potente activo oralmente de la EGFR tirosina quinasa (EGFR-TKI).

El cancer de pulmon es la causa principal de muertes relacionadas con el cancer en Norteamerica y Europa. En los Estados Unidos, el número de muertes secundarias a cáncer de pulmón excede el número combinado total de muertes de la segunda (colon), tercera (mama) y cuarta (prostata) causas principales del total de muertes por cáncer. Aproximadamente 75% a 80% del total de cánceres de pulmón son cáncer pulmonar de células no pequenas (NSCLC), presentando aproximadamente 40% de los pacientes una enfermedad localmente avanzada y/o irresecable. Este grupo tipicamente incluye los pacientes con enfermedad voluminosa de estadios IIIA y IIIB, excluyendo las efusiones pleurales malignas.

La incidencia bruta del cáncer de pulmón en la Union Europea es de 52,5 y la tasa de mortalidad, de 48,7 casos/100.000/ano. Entre hombres, las tasas son de 79,3 y 78,3, y entre mujeres, de 21,6 y 20,5, respectivamente. NSCLC representa 80% de todos los casos de cáncer de pulmón. Aproximadamente 90% de la mortalidad por cancer de pulmon en hombres, y 80% en mujeres, es atribuible al tabaquismo.

En los EUA, segun la American Cancer Society, durante 2004 se produjeron aproximadamente 173.800 nuevos casos de cancer de pulmon (93.100 en hombres y 80.700 en mujeres), representando aproximadamente 13% de todos los nuevos cánceres. La mayoria de pacientes muere como consecuencia de su enfermedad en los dos anos posteriores al diagnóstico. Para muchos pacientes con NSCLC, el tratamiento con éxito sigue siendo inalcanzable. Los tumores avanzados con frecuencia no admiten la cirugia y tambien pueden ser resistentes a dosis tolerables de radioterapia y quimioterapia. En ensayos aleatorizados, las quimioterapias de combinacion actualmente mas activas consiguieron tasas de respuesta de aproximadamente 30% a 40% y una tasa de supervivencia a 1 ano de entre 35% y 40%. Esto constituye un avance respecto a la tasa de supervivencia a 1 ano del 10% observada con solo cuidados de apoyo.

Hasta recientemente las opciones terapeuticas para los pacientes despues de la recaida se limitaban al mejor cuidado de apoyo disponible o a la paliacion. Un ensayo reciente que compara el docetaxel (Taxotere) con los mejores cuidados de apoyo ha demostrado que los pacientes con NSCLC podrian beneficiarse de la quimioterapia de segunda línea tras el fracaso de los regímenes de primera línea basados en cisplatino. Los pacientes de todas las edades y con estado funcional ECOG de 0, 1 o 2 mostraron una supervivencia mejorada con el docetaxel, al igual que aquellos refractarios al tratamiento previo basado en platino. Entre los pacientes que no se beneficiaron de la terapia se incluian aquellos con una perdida de peso del 10%, niveles elevados de lactato deshidrogenasa, compromiso multiorgánico o compromiso hepático. Además, el beneficio de la monoterapia con docetaxel no se extendió más allá del tratamiento de segunda línea. Los pacientes que recibieron docetaxel como tratamiento de tercera línea o posteriormente no mostraron ninguna prolongación de la supervivencia. El docetaxel como único agente se ha convertido en una terapia de segunda línea estándar para el NSCLC. Recientemente, otro ensayo de fase III aleatorizado en la terapia de segunda linea del NSCLC ha comparado el pemetrexed (Alimta®) con el docetaxel. El tratamiento con pemetrexed resultó en una eficacia clínicamente equivalente aunque con significativamente menos efectos secundarios que el docetaxel.

Se admite desde hace mucho que existe una necesidad de desarrollar métodos para individualizar el tratamiento del cáncer. Con el desarrollo de los tratamientos personalizados del cancer, existe un particular interes en las metodologías que podrían proporcionar un perfil molecular de la diana tumoral (es decir, aquéllas que son predictivas de beneficio clínico). Ya se ha establecido la prueba de principio para el perfilado de la expresión génica en el NSCLC, con la clasificacion molecular de tipos tumorales que no resultan evidentes basandose en los ensayos morfológicos e inmunohistoquímicos actuales.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invencion proporcionar biomarcadores de expresion que sean predictivos del beneficio clínico del tratamiento con erlotinib en los pacientes con NSCLC.

En un primer objetivo, la presente invención proporciona un método in vitro para predecir el beneficio clínico de un paciente con NSCLC en respuesta al tratamiento con erlotinib, que comprende las etapas siguientes:

determinar un nivel de expresión de un gen PSPH en una muestra tumoral de un paciente y comparar el nivel de expresión del gen PSPH con un valor representativo de un nivel de expresión del gen PSPH en tumores de una población de pacientes no respondedores, en el que un nivel de expresión más alto del gen PSPH en la muestra tumoral del paciente es indicativo de un paciente que responderá al tratamiento, en el que se ha definido el beneficio clinico como manifestar una respuesta objetiva o la estabilizacion de la enfermedad durante 12 semanas.

La expresión “un valor representativo de un nivel de expresión de PSPH en tumores de una población de pacientes no respondedores” se refiere a una estimación del nivel de expresión medio del gen marcador en una población de pacientes que no responden al tratamiento con erlotinib.

En una realizacion preferente, el gen marcador PSPH (SEC ID nº muestra típicamente un nivel de expresión entre 1,8 y 3,7 o mas veces superior en la muestra tumoral del paciente respondedor que un valor representativo del nivel de expresión del gen PSPH en tumores de una población de pacientes no respondedores.

En una realizacion preferente, el nivel de expresion del gen PSPH se determina mediante tecnologia de micromatrices u otras tecnologias que evaluan los niveles de expresion del ARN, tales como la RT-PCR cuantitativa

o mediante cualquier metodo que analice el nivel de expresion de la proteina respectiva, por ejemplo la inmunohistoquímica (IHC). La construccion y utilizacion de chips genicos es bien conocida de la tecnica, ver las patentes US nº 5.202.231, n° 5.445.934, n° 5.525.464, n° 5.695.940, n° 5.744.305, n° 5.795.716 y n° 5.800.992. Ver tambien Johnston M., Curr. Biol. 8:R171-174, 1998; Lyer V.R. et al., Science 283:83-87, 1999. Evidentemente el nivel de expresión génica puede determinarse mediante otros métodos que son conocidos por el experto en la materia, tales como, por ejemplo, transferencias northern, RT-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real, extensión de cebadores, proteccion frente a ARNasa y perfilado de expresion del ARN.

El gen marcador utilizado en la presente invencion puede combinarse con otros biomarcadores formando juegos de biomarcadores. Pueden construirse juegos de biomarcadores a partir de cualquier combinacion de biomarcadores predictivos con el fin de realizar predicciones sobre el efecto del tratamiento de erlotinib en los pacientes con NSCLC.Los biomarcadores y juegos de biomarcadores indicados en la presente invencion pueden utilizarse para, por ejemplo, predecir como los pacientes con NSCLC responderan a la intervencion terapeutica con erlotinib.

El termino "gen" tal como se utiliza en la presente memoria comprende variantes del gen. El término “variante” se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que son sustancialmente similares a las secuencias de ácidos nucleicos indicadas mediante el numero de acceso de GenBank. La expresión "sustancialmente similar" es perfectamente conocida por el experto en la materia. En particular, una variante génica puede ser un alelo que muestra intercambios de nucleótidos en comparación con la secuencia de nucleótidos del alelo más prevalente en la población humana. Preferentemente, dicha secuencia de ácidos nucleicos sustancialmente similar presenta una similitud de secuencias respecto al alelo más prevalente de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 85%, mas preferentemente de por lo menos 90% y todavia mas preferentemente de por lo menos 95%. El termino “variantes” también pretende referirse a las variantes de procesamiento.

Entre las tecnicas para la deteccion y cuantificacion de la expresión génica de los genes indicados en la presente invencion se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las transferencias northern, la RT-PCR, la PCR cuantitativa en tiempo real, la extensión de cebadores, la protección frente a ARNasa, el perfilado de expresion del ARN y tecnicas relacionadas. Estas tecnicas son bien conocidas por el experto en la materia; ver, por ejemplo, Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edicion (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000.

Entre las técnicas para la detección de la expresión de proteínas a partir de los genes respectivos descritos por la presente invencion se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la inmunohistoquimica (IHC).

Las celulas de una muestra de tejido del paciente, por ejemplo de un tumor o biopsia de cancer, pueden someterse a ensayo para determinar el patron de expresion de uno o mas biomarcadores. El éxito o fracaso de un tratamiento del NSCLC puede determinarse basándose en el patrón de expresión de biomarcadores de las células procedentes del tejido de ensayo (celulas de ensayo), por ejemplo del tumor o biopsia del cancer, siendo relativamente similar o diferente del patron de expresion de un juego de control de uno o mas biomarcadores. En el contexto de la presente invención, se ha encontrado que el gen PSPH se encuentra regulado positivamente, es decir, muestra un nivel de expresión más alto en tumores de pacientes que responden al tratamiento con erlotinib que en tumores de pacientes que no respondieron al tratamiento con erlotinib. De esta manera, en el caso de que las celulas de ensayo muestren un perfil de expresión que corresponda al de un paciente que respondió al tratamiento del NSCLC, es altamente probable o predecible que el NSCLC o tumor del individuo responderá favorablemente al tratamiento con erlotinib. En contraste, en el caso de que las celulas de ensayo muestren un perfil de expresion de los biomarcadores que corresponda al de un paciente que no respondió al tratamiento del NSCLC, es altamente probable o predecible que el NSCLC o tumor del individuo no responderá al tratamiento con erlotinib.

El biomarcador utilizado en la presente invencion, es decir, el gen listado en la Tabla 3, es un primer paso hacia una terapia individualizada para los pacientes con NSCLC, en particular para los pacientes con NSCLC refractario. Esta terapia individualizada permitira a los medicos tratantes seleccionar el agente mas apropiado de entre los farmacos existentes para la terapia del NSCLC. El beneficio de la terapia individualizada para cada paciente en el futuro es que: las tasas de respuesta/el numero de pacientes beneficiados se incrementara, y el riesgo de efectos secundarios adversos debidos al tratamiento inefectivo se reducirá.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra el diseno del estudio; la figura 2 muestra el esquema del procesamiento de las muestras. la figura 3a muestra los niveles de expresión frente al resultado clínico para el perfilado Genechip®; la figura 3b muestra los niveles de expresion de PTPRF frente al resultado clinico para qRT-PCR y la figura 3c muestra la correlación entre las mediciones de GeneChip® y de qRT-PCR de PSPH.

Parte experimental

Justificacion del estudio y del diseno del mismo

Recientemente, se han descrito mutaciones dentro del gen EGFR en el tejido tumoral de un subconjunto de pacientes con NSCLC y la asociacion de estas mutaciones con la sensibilidad al erlotinib y al gefitinib (Pao W. et al., 2004; Lynch et al., 2004; Paez et al., 2004, Para los pacientes agrupados de ambos estudios, se observó EGFR mutado en 13 de los 14 pacientes que respondieron al gefitinib y en ninguno de los 11 pacientes tratados con gefitinib que no respondieron. La prevalencia publicada de estas mutaciones es de 8% (2 de 25) en pacientes con NSCLC no seleccionados Estas mutaciones se encontraron mas frecuentemente en adenocarcinomas (21%), en tumores procedentes de mujeres (20%) y en tumores procedentes de pacientes japoneses (26%). Estas mutaciones resultan en una actividad in vitro incrementada de EGFR y en una sensibilidad incrementada al gefitinib. La relacion de las mutaciones con una enfermedad estable prolongada o la duración de la supervivencia no ha sido evaluada prospectivamente.

Basandose en analisis preliminares del estudio BR.21, aparentemente resultaba improbable que el beneficio de supervivencia observado se debiese unicamente a las mutaciones de EGFR ya que se mantuvo un beneficio de supervivencia significativo incluso tras excluir de los análisis a los pacientes que presentaban una respuesta objetiva (datos en archivo). Otros mecanismos moleculares tambien deben contribuir al efecto.

Basandose en la premisa de que existen cambios de los niveles de expresion genica que son predictivos de la respuesta/beneficio al tratamiento de Tarceva, se utilizo el analisis de micromatrices para detectar dichos cambios.

Lo anterior requirio una poblacion de estudio claramente definida tratada con monoterapia de Tarceva tras el fracaso de la terapia de primera línea. Basandose en la experiencia del estudio BR.21, se definio la poblacion beneficiada como aquella que presentaba una respuesta objetiva o la estabilizacion de la enfermedad durante 12 semanas. Se analizaron bases de datos clinicos y de micromatrices segun un plan estadístico predefinido.

La aplicacion de esta tecnica requiere tejido fresco congelado (TFC). Por lo tanto, tuvo que realizarse una biopsia obligatoriamente antes del inicio del tratamiento. El material recogido se congeló en nitrógeno líquido (N2).

Se recogio una segunda muestra tumoral simultaneamente y se almaceno en parafina (fijada con formalina e

incluida en parafina, FFIP). Esta muestra se analizo para alteraciones en la ruta de senalizacion de EGFR.

La capacidad de llevar a cabo biopsias tumorales mediante broncoscopia era un requisito previo para este estudio. La broncoscopia es un procedimiento estándar para confirmar el diagnóstico del cáncer de pulmón. Aunque generalmente seguro, sigue existiendo riesgo de complicaciones, por ejemplo de sangrado.

Este estudio fue una primera etapa hacia una terapia individualizada para pacientes con NSCLC refractario. Esta terapia individualizada permitira a los medicos tratantes seleccionar el agente mas apropiado de entre los farmacos existentes para esta indicación.

Tras hacerse disponible una terapia individualizada, el beneficio para cada paciente en el futuro superara el riesgo que deben correr los pacientes en el presente estudio:

las tasas de respuesta/el numero de pacientes beneficiados se incrementará, el riesgo de efectos secundarios adversos debidos al tratamiento inefectivo se reducirá.

Justificación de la selección de dosis

Se administro TarcevaTM por via oral una vez al dia a una dosis de 150 mg hasta la progresion de la enfermedad, toxicidades intolerables o muerte. La selección de dicha dosis se basó en parámetros farmacocinéticos, así como en el perfil de seguridad y tolerabilidad de dicha dosis observado en ensayos de fase I, II y III en pacientes fuertemente pretratados con cancer avanzado. Los niveles de farmaco observados en el plasma de pacientes con cancer que recibian la dosis de 150 mg/dia eran consistentemente superiores a la concentracion plasmatica media de 500 ng/ml que era el objetivo para la eficacia clinica. BR.21 mostro un beneficio de supervivencia con dicha dosis.

Objetivos del estudio

El objetivo principal era la identificacion de genes expresados diferencialmente que fuesen predictivos de beneficio (CR, RP o EE? 12 semanas) del tratamiento con Tarceva. La identificación de genes expresados diferencialmente predictivos de "respuesta" (CR, RP) al tratamiento con Tarceva era un objetivo adicional importante.

Los objetivos secundarios eran evaluar las alteraciones en las rutas de senalizacion de EGFR con respecto al beneficio del tratamiento.

Diseno del estudio

Descripcion general del diseno del estudio y del regimen de dosificacion

Estudio de fase II de etiqueta abierta de identificación de marcadores predictivos. El estudio se llevó a cabo en aproximadamente 26 sitios en aproximadamente 12 paises. Se incluyeron durante un periodo de 12 meses 264 pacientes con NSCLC avanzado tras el fracaso de por lo menos un regimen anterior de quimioterapia. Se administro Tarceva oral continuo a una dosis de 150 mg/dia. Se permitieron reducciones de las dosis basandose en la tolerabilidad a la terapia farmacológica. Se evaluaron parametros clinicos y de laboratorio con el fin de evaluar el control de la enfermedad y la toxicidad. El tratamiento se prolongó hasta la progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable o muerte. Se ilustra en la figura 1 el diseno del estudio.

Se obtuvieron muestras de tejido tumoral y de sangre para los analisis moleculares destinados a evaluar los efectos de Tarceva y para identificar los subgrupos de pacientes que se beneficiarán de la terapia

Evaluaciones de los marcadores predictivos

Se obtuvieron biopsias de tumores en las 2 semanas anteriores al inicio del tratamiento. Se recogieron dos muestras diferentes:

La primera muestra en todos los casos se congeló inmediatamente en N2 líquido. La segunda muestra se fijo en formalina y se incluyo en parafina. El tejido congelado instantaneamente se considero prioritario en el presente estudio. La figura 2 muestra un esquema del procesamiento de las muestras.

Análisis de micromatrices

Las muestras congeladas instantaneamente se utilizaron para la microdiseccion por captura con laser (MCL) de celulas tumorales con el fin de extraer el ARN tumoral y el ARN del tejido circundante al tumor. El ARN se analizo en chips micromatrices Affymetrix (HG-U133A) para establecer el perfil de expresion genica del tumor del paciente. Se utilizo un control de calidad de los chips Affymetrix para seleccionar aquellas muestras de calidad adecuada para la comparación estadística.

Analisis de biomarcadores individuales en tejido fijado en formalina e incluido en parafina

Se utilizo la segunda biopsia tumoral, la muestra FFIP, para llevar a cabo analisis de mutaciones del ADN, IHC e ISH, tal como se describe posteriormente. Se llevaron a cabo analisis similares de tejido recogido en el momento del diagnóstico inicial.

Se analizaron mediante secuenciacion del ADN el estado de mutacion del ADN de los genes codificantes de EGFR y de otras moléculas participantes en la ruta de senalizacion del EGFR. La amplificacion genica del EGFR y genes relacionados se estudiaron mediante FISH. Los analisis de expresion de proteinas incluyeron analisis inmunohistoquimicos [IHC] del EGFR y de otras proteinas en la ruta de senalizacion del EGFR.

Evaluaciones de la respuesta

Se utilizaron los criterios RECIST (medicion unidimensional de los tumores) para evaluar la respuesta. Estos criterios pueden encontrarse en el enlace siguiente:

http://www.eortc.be/recist/

Observar que: Para asignar un estatus de CR o de PR, deben confirmarse cambios en las mediciones de los tumores en evaluaciones repetidas separadas por lo menos por 4 semanas en cualquier momento durante el periodo de tratamiento.

En el caso de una EE, las mediciones de seguimiento deben cumplir los criterios de EE por lo menos en una ocasión despues del inicio del estudio a un intervalo minimo de 6 semanas.

En el caso de una EE mantenida, las mediciones de seguimiento deben cumplir los criterios de EE por lo menos en una ocasion despues del inicio en el estudio con una duracion del mantenimiento de por lo menos 12 semanas.

Evaluación de la supervivencia

Se llevó a cabo una comprobación periódica del estado cada 3 meses mediante una visita del paciente a la clínica o telefónicamente. Se registraron todas las muertes. Al final del estudio fue necesaria una confirmación definitiva de la supervivencia de cada paciente.

Respuesta al tratamiento con erlotinib

Se incluyeron en el estudio un total de 264 pacientes procedentes de 12 paises y 26 centros. 26% presentaba NSCLC de estadio IIIB y 24%, NSCLC de estadio IV. 13,6% (n=36) de los pacientes consiguieron una respuesta objetiva, mientras que 31,4% (n=83) presentaron un beneficio clínico (definido como manifestar una respuesta objetiva o una enfermedad estable durante 12 semanas o mas). La mediana de supervivencia global fue de 7,6 (IC 7 a 9) meses y la mediana de la supervivencia sin progresion fue de 11,3 (IC 8 a 12) semanas. En la Tabla 1 se proporcionan detalles completos de los datos clínicos.

Se recogieron biopsias broncoscopicas frescas congeladas de todos los sujetos, pero o no todas las muestras presentaba suficiente contenido tumoral previamente a la microdisección (MCL) o no presentaban suficiente ARN tras la MCL para continuar al análisis de micromatrices, de manera que sólo se disponía de material tumoral para 125 pacientes; 122 de ellos presentaba ARN evaluable. Otro juego de 20 muestras no paso la evaluación de control de calidad de los presentes inventores de los datos de las micromatrices. De los 102 conjuntos de datos de micromatriz que se consideraron adecuados para el analisis estadistico, se muestran las caracteristicas clinicas en la Tabla 1. Mientras que 36 pacientes en el estudio global mostraron una respuesta objetiva, solo 6 de ellos disponia de datos de micromatriz; de manera similar, de aquellos que mostraron un beneficio clinico, el numero de sujetos con datos de micromatriz era de solo 21, comparado con 83 en el conjunto completo de datos. Se estimo que 6 eran respondedores parciales (RP), 31 presentaban una EE y 49 mostraban una EP; de los 6 pacientes con una RP, 5 presentaba adenocarcinoma y uno, carcinoma de celulas escamosas. No se observaron pacientes que mostrasen una RC en el conjunto de datos.

Métodos

Preparacion de muestras de ARN y control de calidad de las muestras de ARN Todo el procesamiento de las muestras de biopsia fue realizado por un laboratorio patologico de referencia; se enviaron muestras de tejido fresco congelado procedente de los sitios de investigacion a las instalaciones de manipulacion de muestras clinicas en Roche Basel y de ahi al laboratorio de patologia para el procesamiento posterior. Se utilizo la microdiseccion con captura con laser para seleccionar las celulas tumorales del tejido circundante. Tras la MCL, se purifico el ARN a partir del material tumoral enriquecido. A continuacion, el laboratorio de patología llevó a cabo varias etapas para realizar una estimacion de la concentracion y calidad del ARN.

Las ARNasas son enzimas degradadores del ARN y se encuentran en todas partes y por lo tanto todos los procedimientos en los que se utilice ARN deben controlarse estrictamente para minimizar la degradación del ARN. La mayoria de las especies de ARNm presentan vidas medias bastante cortas y por lo tanto se consideran bastante inestables. Por lo tanto, resulta importante llevar a cabo comprobaciones de integridad y cuantificaciones del ARN antes de cualquier ensayo.

Puede evaluarse la concentracion y perfil de calidad del ARN utilizando un instrumento de Agilent (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) denominado 2100 Bioanalyzer®. El software del instrumento genera un numero de integridad del ARN (RIN), una estimación cuantitativo (Schroeder A. et al., The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7: 3, 2006) y calcula las proporciones ribosomicas de la muestra del ARN total. El RIN se determina a partir del registro electroforético completo de la muestra de ARN, que de esta manera incluye la presencia o ausencia de productos de degradacion.

Se analizo la calidad del ARN utilizando un 2100 Bioanalyzer®. Sólo se seleccionaron muestras con por lo menos un pico de ARNr sobre el ruido de poli-I anadido y suficiente ARN para el analisis posterior en la plataforma Affymetrix. Se envio el ARN purificado al Roche Centre for Medical Genomics (RCMG, Basel, Suiza) para el analisis mediante micromatrices. Se recibieron 122 muestras de ARN del laboratorio de patologia para el procesamiento posterior.

Marcaje de la diana de muestras de ARN de tejido

El marcaje de la diana se llevo a cabo siguiendo el protocolo de amplificacion de marcaje de la diana en dos ciclos de Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, California) siguiendo las instrucciones del fabricante.

El metodo se basa en el procedimiento estandar de Eberwine de amplificacion lineal, aunque utiliza dos ciclos de este procedimiento par agenerar suficiente ARNc marcado para la hibridacion con una micromatriz.

La cantidad total de ARN utilizada en la reaccion de marcaje fue de 10 ng para aquellas muestras en las que se disponia de mas de 10 ng de ARN; en caso de disponerse de menos de esta cantidad, o si no se disponía de datos cuantitativos (debido a que la concentracion de ARN era muy baja), se utilizo la mitad de la muestra total en la reacción. Los rendimientos de las reacciones de marcaje fueron de entre 20 y 180 Ig de ARNc. Se introdujo una etapa de normalizacion al nivel de la hibridacion, en la que se utilizaron 15 Ig de ARNc para cada muestra.

Se utilizo ARN de referencia humano (Stratagene, Carlsbad, CA, USA) a modo de muestra de control en el flujo de trabajo con cada lote de muestras. Se utilizaron 10 ng de dicho ARN como entrada, conjuntamente con las muestras de ensayo con el fin de verificar que los reactivos de marcaje y de hibridacion funcionaban tal como se esperaba.

Hibridaciones con micromatrices

Las micromatrices Affymetrix HG-U133A contienen mas de 22.000 juegos de sondas con diana en aproximadamente

18.400 transcritos y variantes, representando aproximadamente 14.500 genes bien caracterizados.

La hibridación para todas las muestras se llevó a cabo siguiendo las instrucciones de Affymetrix (Affymetrix Inc., manual tecnico de analisis de la expresion, 2004). Brevemente, para cada muestra se fragmentaron 15Ig de ARNc marcado con biotina en presencia de cationes divalentes y calor, y se hibridaron durante la noche con matrices Affymetrix HG-U133A de oligonucleotidos del genoma completo. Al dia siguiente las matrices se tineron con estreptavidina-ficoeritrina (Molecular Probes, Eugene, OR) siguiendo las instrucciones del fabricante. Seguidamente se escanearon las matrices utilizando un escaner GeneChip 3000 (Affymetrix) y se calcularon automaticamente las intensidades de las senales con el software operativo GeneChip (GCOS) version 1.4 (Affymetrix).

Análisis estadístico

El analisis de los datos de AffymetrixTM consistió en cinco etapas principales.

La etapa 1 fue la de control de calidad. El objetivo era identificar y excluir del analisis datos de las matrices con un perfil de calidad deficiente.

La etapa 2 fue de preprocesamiento y normalizacion. El objetivo era crear una "base de datos para el análisis” normalizada y escalada que permitiese la comparacion entre matrices. Comprendia la estimacion y subtraccion del ruido de fondo, y el agrupado ("sumarizacion") y escalado de las sondas.

La etapa 3 fue de exploracion y descripcion. El objetivo era identificar los potenciales sesgos y las fuentes de variabilidad. Consistia en la aplicacion de tecnicas de analisis descriptivo multivariante y univariante para identificar las covariables con influencia.

10 La etapa 4 fue de modelaje y ensayo. El objetivo era identificar una lista de los marcadores candidatos basandose en la evaluación estadística de las diferencias en el nivel medio de expresión entre "respondedores” (pacientes con "respuesta parcial" o "respuesta completa" como mejor respuesta) y "no respondedores" (pacientes con "enfermedad progresiva" como mejor respuesta). Consistia en ajustar un modelo estadistico adecuado a cada juego de sondas y extraer una medida de significación estadística. Todos los analisis se llevaron a cabo utilizando el paquete

15 informático R.

Etapa 1: control de calidad

La evaluación de la calidad de los datos se basó en la comprobación de varios parámetros. Entre ellos se incluían

20 parámetros de calidad de GeneChipTM de Affymetrix, en particular: el factor de escala, el porcentaje de expresion presente ("present call") y el nivel medio de fondo. Esta etapa también incluía la inspección visual de imágenes virtuales de los chips para la deteccion de problemas localizados de hibridacion y la comparacion de cada chip con un chip virtual en la mediana para la detección de cualquier desviación no habitual respecto a la mediana del comportamiento. Tambien se llevo a cabo un analisis de correlacion entre chips para detectar las muestras atipicas.

25 Además, se consideraron medidas complementarias de la calidad del ARN obtenidas a partir del análisis de muestras de ARN con el BioanalyzerTM 2100 de Agilent.

Basandose en estos parametros, se excluyeron del analisis los datos procedentes de 20 matrices. De esta manera, se incluyeron en el analisis datos procedentes de un total de 102 matrices, que representaban 102 pacientes. Se

30 proporciona en la Tabla 1 la descripcion clinica de este conjunto de 102 pacientes.

Tabla 1: Descripción de las características clínicas de los pacientes incluidos en el análisis

Variable

Valor n=102

Mejor respuesta Beneficio clinico SEXO ETNICIDAD Histología ¿Ha fumado alguna vez?

N/A EP EE RP NO SÍ FEMENINO MASCULINO CAUCÁSICA ORIENTAL ADENOCARCINOMA ESCAMOSO OTRAS NO SÍ n (%) 16 (15,7%) 49 (48,0%) 31 (30,4%) 6 (5,9%) 81 (79,4%) 21 (20,6%) 25 (24,5%) 77 (74,5%) 65 (63,7%) 37 (36,3%) 35 (34,3%) 53 (52,0%) 14 (13,7%) 20 (19,6%) 82 (80,4%)

Etapa 2: Preprocesamiento y normalizacion de los datos

Se utilizo el algoritmo rma (Irizarry R.A. et al., Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. Nucl. Acids Res. 31(4): e15, 2003) para el preprocesamiento y normalizacion. Se utilizo el algoritmo mas5 (AFFYMETRIX,

5 GeneChip® Expression: Data Analysis Fundamentals. 2004, AFFYMETRIX) para realizar analisis de deteccion para los diferentes juegos de sondas. Los juegos de sondas con resultados de "ausente" o "marginal" en todas las muestras se eliminaron de los analisis posteriores; se eliminaron 5.930 juegos de sondas del analisis basandose en este criterio. Por lo tanto, la base de datos para el analisis consistio de una matriz con 16.353 (de un total de 22.283) juegos de sondas medidos en 102 pacientes.

Etapa 3: Descripcion y exploracion de los datos

Se llevo a cabo un analisis exploratorio descriptivo para identificar sesgos potenciales y las fuentes principales de variabilidad. Se cribo un conjunto de covariables con un impacto potencial sobre los perfiles de expresión génica. 15 Comprendía variables tanto técnicas como clínicas. Entre las covariables técnicas se incluían: fecha del procesamiento del ARN (posteriormente denominado "lote"), RIN (como medida de la calidad/integridad del ARN), operador y centro de recoleccion de las muestras. Entre las covariables clinicas se incluian: tipo histologico, situacion de tabaquismo, grado del tumor, puntuacion de rendimiento (Oken M.M. et al., Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group. Am. J. Clin. Oncol. 5(6): 649-55, 1982), datos demograficos,

20 estatus del respondedor y estatus de beneficio clinico.

Entre las herramientas de analisis se incluian el ANOVA univariante y el analisis de componentes principales. Para cada una de dichas covariables, se aplico el ANOVA variante independientemente a cada juego de sondas.

25 Se identificó un efecto significativo de la variable lote. En la práctica, la variable lote captura diferencias entre fechas de procesamiento de las muestras y del grafico del chip Affymetrix. Tras comprobar que la variable lote era practicamente independiente de las variables de interes, se corrigio el efecto de lote utilizando el metodo descrito en Johnson W.E., C. Li y A. Rabinovic, Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostat. 8(1): 118-127, 2007.

30 La base de datos normalizados tras la correccion del efecto de lote sirvio como base de datos para el analisis en los análisis posteriores.

La histologia y el RIN fueron dos variables importantes adicionales subrayadas en el analisis descriptivo.

Etapa 4: Modelaje y ensayo de los datos.

Se ajusto independientemente un modelo lineal a cada juego de sondas. Las variables incluidas en el modelo se informan en la Tabla 2. Se estimaron los parametros del modelo mediante la tecnica de maxima probabilidad. El

40 parametro correspondiente a la variable "Respuesta" (X1) se utilizo para evaluar la diferencia en el nivel de expresión entre el grupo de pacientes "respondedores" y "no respondedores".

Tabla 2: Descripción de las variables incluidas en el modelo lineal. El modelo lineal definido por estas variables, incluyendo un termino de error de distribucion normal, se ajusto a cada juego de sondas.

Variable

Tipo Valores

expresión génica

Dependiente (Yip) Valor log2 intensidad normalizada del juego de sondas i en el paciente p

Punto de corte

Media global (I)

Respuesta

Factor predictivo de interes (X1) Si / NO

Histología

Covariable de ajuste (X2) ADENOCARCINOMA /ESCAMOSO / OTROS

ETNIA

Cov. Adj. (X3) ORIENTAL / CAUCASICO

SEXO

Cov. Adj. (X4) FEMENINO / MASCULINO

RIN

Cov. Adj. (X5) [2,...,7.9]

Se excluyeron los pacientes con estatus de enfermedad estable (n=31). La justificacion era que al centrarse en los

pacientes con la respuesta más marcada a la terapia, el grupo de non respondedores se volvería más homogéneo.

Para cada juego de sondas i, el objetivo de la prueba estadistica era rechazar la hipotesis de que los niveles medios de expresion en pacientes con respuesta al tratamiento y en pacientes sin respuesta al tratamiento eran iguales, considerando las otras covariables de ajuste listadas en la Tabla 2. Formalmente, la hipotesis nula de igualdad se sometio a ensayo frente a una alternativa de dos colas. Bajo la hipotesis nula, la distribucion del estadistico de Wald para este ensayo sigue una distribucion Chi cuadrado con 64 grados de libertad. Se proporcionan los valores de p correspondientes en la Tabla 3.

La eleccion de modelo lineal se baso en dos motivos. En primer lugar, el modelaje lineal es un enfoque versatil, bien caracterizado y robusto que permite el ajuste de las variables de confusión al estimar el efecto de la variable de interés. En segundo lugar, dado el tamano muestral, de 71, y la normalizacion y escalado de la base de datos, la premisa de la distribucion normal era razonable y estaba justificada.

El problema de los ensayos multiples se controlo mediante la utilizacion de un criterio de tasa de falso descubrimiento (TFD) para identificar la lista de genes expresados diferencialmente (Benjamini et al., Journal of the Royal Statistical Society serie B-metodologica 57(1):289-300, 1995. Los juegos de sondas con una TFD inferior al umbral de 0,3 se consideraron significativos. El valor de corte de 0,3 se selecciono como compromiso razonable entre una correccion rigurosa de los ensayos multiples y un control restrictivo del riesgo de falsos positivos y el riesgo de no identificar los marcadores realmente diferenciales. Se proporciona el gen marcador identificado en la Tabla 3.

Tabla 3: Marcadores basados en la comparacion entre "Respondedores" y "Progresores". Se definieron los respondedores como los pacientes con una mejor respuesta igual a una "Respuesta parcial" (RP). Se definieron los "Progresores" como los pacientes con una mejor respuesta igual a "Enfermedad progresiva" (EP) o sin evaluacion disponible.

Los pacientes sin evaluacion tumoral se incluyeron en los grupos de "Progresores" porque en la mayoria de casos no se disponía de evaluación debido a la retirada temprana causada por la progresión de la enfermedad o la muerte.

La columna 1 es el identificador Affymetrix del juego de sondas. La columna 2 es el numero de acceso de GenBank de la secuencia génica correspondiente. La columna 3 es el nombre oficial correspondiente del gen. La columna 4 es el factor medio ajustado correspondiente de cambio del nivel de expresion entre los "respondedores" y los "progresores", segun las estimaciones realizadas con el modelo lineal. La columna 5 es el valor de p para el ensayo de las diferencias del nivel de expresion entre los "respondedores" y los "progresores", según se derivan del modelo lineal. La columna 6 es el intervalo de confianza al 95% para el factor medio ajustado de cambio del nivel de expresión.

ID de Affymetrix del juego de sondas 205194 at

GenBank NM 004577 Gen PSPH Factor medio ajustado de cambio 2,6 valor de P 1,.4x105 IC al 95% 1,8 , 3,7

Para cada juego de sondas se evaluo la premisa de homogeneidad de la varianza utilizando pruebas de Fligner-Killeen basadas en los residuales del modelo. El análisis consistió de 3 etapas:

Ensayo de todas las variables categoricas para la igualidad de la varianza residual entre los niveles de las mismas Identificacion de la variable V con el valor p mas bajo En el caso de que el valor de p mas bajo sea inferior a 0,001, reajuste del modelo que permita que las variables V de diferente nivel presenten una varianza diferente.

Análisis estadístico posterior

Para el marcador candidato seleccionado PSPH, se llevaron a cabo los análisis adicionales siguientes en un entorno validado por expertos estadísticos independientes:

•

Regresion Cox univariante para la SSP (supervivencia sin progresion) del analisis primario Affymetrix,

•

Regresion logistica univariante para la respuesta del analisis primario Affymetrix, y

•

Regresion Cox univariante para la supervivencia del analisis primario Affymetrix.

Se presentan los resultados de estos análisis posteriormente. Son consistentes con los resultados del análisis primario y confirman la eleccion del marcador seleccionado.

Resultados: Regresión Cox univariante para la SSP (supervivencia sin progresion) del analisis primario Affymetrix:

Gen PSPH

Nº de pacientes 102 Cociente de riesgos 0,61 IC al 95% para el cociente de riesgos 0,42; 0,88 valor de p 0,0086

5

Resultados: Regresión Cox univariante para la respuesta del analisis primario Affymetrix:

Gen Nº de Proporción de IC al 95% para la valor de p pacientes probabilidades proporción de probabilidades PSPH 102 7,46 2,39; 23,32 0,0005

qRT-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real)

10 Se sintetizo ADNc utilizando la mezcla de sintesis de primera cadena SuperScriptTM III para qRT-PCR (Invitrogen, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante aunque sin inclusión de un digerido de ARNasa H.

Se llevó a cabo una PCR cuantitativa utilizando ensayos de expresion genica TaqMan® en un sistema de deteccion de secuencias ABI PRISM® 7900HT siguiendo las recomendaciones del fabricante (Applied Biosystems, CA, USA).

15 Todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.

Los cebadores y sondas utilizados cruzaban los limites de los exones o se encontraban dentro de la secuencia de interes de la sonda Affymetrix Genechip®. Se incluyeron dos genes de mantenimiento como controles endogenos:

�-2-microglobulina (B2M; ensayo Hs99999907 m1) e hipoxantinfosforibosil transferasa (HPRT; ensayo 20 Hs99999909 m1).

Todos los analisis incluian una muestra calibradora (ARN total MVPTM procedente de pulmon humano adulto; Stratagene, CA, USA) y una curva estandar. Se utilizo ARN humano total de referencia universal (Stratagene, CA, USA) como molde para las curvas estandares de PTPRF. Todos las muestras se midieron por triplicado. Se llevo a

25 cabo la cuantificacion relativa utilizando el metodo -LCt.

Resultados

Tal como se ha informado anteriormente, se determinaron los perfiles de expresion genica Affymetrix Genechip®

30 para los 102 pacientes incluidos en el presente estudio. De entre estos pacientes, se obtuvieron resultados de qRT-PCR para 75 (Tabla 3). Las caracteristicas demograficas y clinicas de los pacientes con resultados de qRT-PCR eran similares a las de la poblacion entera (n=264) y a las de los pacientes para los que se disponia de un perfil de expresión génica Genechip®.

35 Tabla 3: Características de línea base: pacientes con analisis de qRT-PCR (n=75)

Característica

Edad (mediana, intervalo)

62 (39-85)

Sexo, n (%)

Masculino

19 (25)

Femenino

56 (75)

Estado funcional ECOG, n (%)

0

7 (9)

1

45 (60)

2

23 (31)

Histología, n (%)

Adenocarcinoma

27 (36)

Carcinoma de células escamosas

34 (45)

Carcinoma de células grandes

2 (3)

Otro

12 (16)

Estadio de la enfermedad, n (%)

IIIB

22 (29)

IV

53 (71)

Número de regímenes de quimioterapia anteriores, n (%)

0

19 (25)

1

36 (48)

�2

20 (27)

Etnicidad; n (%)

Caucásica

51 (68)

Asiática

24 (32)

Historia de tabaquismo, n (%)

Nunca

12 (16)

Actualmente

24 (32)

Anterior

39 (52)

De los 75 pacientes con resultados de qRT-PCR, 4 (5%) presentaba una respuesta parcial (RP), 23 (31%) presentaba una EE, 39 (52%) presentaba una EP y 9 (12%) no eran evaluables. Estos resultados son muy similares a los observados en la poblacion de estudio completa (n=264).

Correlacion entre los datos de Affymetrix Genechip®, datos de qRT-PCR y resultados clínicos

La figura 3 muestra los niveles relativos de ARNm para PTPRF en pacientes individuales, evaluados mediante el perfilado Affymetrix Genechip® y qRT-PCR. La figura 3a muestra los niveles de expresión frente al resultado clínico para el perfilado Genechip® y la figura 3b muestra los niveles de expresion frente a la qRT-PCR.

La figura 3c muestra la correlación entre las mediciones de Genechip® y de qRT-PCR para PSPH. La asociación entre los niveles de ARNm de PSPH y el resultado clinico con erlotinib observado en los datos de expresión génica de Genechip® se conservaba en los datos de qRT-PCR.

Identificación de los genes asociados a la respuesta al erlotinib

Se definieron los respondedores como los pacientes cuya mejor respuesta era la respuesta parcial, mientras que los "progresores" se definieron como los pacientes con enfermedad progresiva o para los que no se realizo ninguna evaluacion (en la mayoria de casos como resultado de la retirada temprana debido a progresion de la enfermedad o muerte). De esta manera, en este modelo se compararon 6 "respondedores" con 65 "progresores".

Se ajusto un modelo lineal independientemente a cada uno de los 16.353 juegos de sondas restantes utilizados en el analisis tras la extraccion de aquellos juegos de sondas que no se encontraban presentes en ninguna muestra del total de 22283 en la micromatriz HG-U133A. Se calculó un valor de p para la diferencia de expresión entre la respuesta y la no respuesta para cada juego de sondas. Se aplicó una tasa de falso descubrimiento (TFD) de 0,3 para corregir para los ensayos multiples. En la Tabla 3 se muestra el marcador identificado en este analisis.

Comentario

Se propuesto centrarse en el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como medio para la terapia del cáncer basándose en su expresión aberrante ubicua en varios cánceres epiteliales. EGFR participa en la patogenesis y progresion de muchos tumores, entre ellos 40% a 80% de los tumores de NSCLC, como resultado de la activación de tumores en el dominio de tirosina quinasa y/o de su amplificacion. Tras la activacion, el receptor se dimeriza, resultando en la fosforilacion de las dianas posteriores con funcion en la proliferacion celular, metastasis, inhibicion de la apoptosis y neoangiogenesis.

Se han desarrollado dos clases principales de inhibidores de EGFR: anticuerpos monoclonales con diana en el dominio extracelular del receptor, e inhibidores de molecula pequena de la tirosina quinasa con diana en el dominiocatalítico del receptor. Ésta ultima incluye el erlotinib, que compite con el ATP para el sitio de union intracelular.

En los ultimos anos ha emergido que varios factores desempenan un papel en la sensibilidad al erlotinib, incluyendo el sexo femenino, el estatus de no fumador, el origen asiatico y la histologia de adenocarcinoma; dado que son evidentes las tasas de respuesta incrementadas en dichos subconjuntos clinicos de pacientes, se estan realizando esfuerzos intensivos para identificar marcadores moleculares predictivos para la estratificación de los pacientes. Las mutaciones en el EGFR, la amplificacion del locus genico de EGFR y la sobreexpresion de EGFR al nivel de las proteínas, se han asociado todos a la respuesta en diversos grados, aunque estos no son los únicos determinantes moleculares de la respuesta.

Mediante el analisis de las muestras de tejido mediante tecnologia de micromatrices de oligonucleotidos a alta densidad y la aplicacion del modelaje estadistico a los datos, los presentes inventores han podido identificar un gen cuyo nivel de expresion es predictivo de la respuesta al erlotinib (comparacion entre RP y EE) (Tabla 3). Este gen es PSPH (regulado positivamente en un factor de 2,6, p=0,000014).

La fosfoserina fosfatasa (PSPH) es un enzima intermediario en la gluconeogenesis y en la biosintesis de aminoacidos, y es especificamente responsable de la ultima etapa en la formacion de la L-serina. Se ha encontrado

5 que la actividad del enzima PSPH es mas alta en el tejido canceroso que en el tejido pulmonar normal, asi como en tumores pulmonares altamente diferenciados, en comparación con los tumores pulmonares no diferenciados o en el mesotelioma. Al nivel de transcritos de ARNm, se ha evaluado PSPH como marcador de las micrometástasis en el cancer gastrico avanzado y ha demostrado una especificidad incrementada en combinacion con un marcador estándar, el antígeno carcinoembrionario (ACE).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hofffmann-La Roche AG

<120> Marcador predictivo para el tratamiento con inhibidor de EGFR

<130> 24412WO

<150> 07114312.7

<151> 2007-08-14

<150> 08156511.1

<151> 2008-05-20

<160> 1

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 2142

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1.Método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con NSCLC al tratamiento con erlotinib, que comprende:

   5 determinar un nivel de expresion de un gen PSPH en una muestra tumoral de un paciente y comparar el nivel de expresión del gen PSPH con un valor representativo de un nivel de expresión del gen PSPH en tumores de una población de pacientes no respondedores, en el que un nivel de expresión más alto del gen PSPH en la muestra tumoral del paciente es indicativo de un paciente que responderá al tratamiento, en el que se ha definido el beneficio clinico como manifestar una respuesta objetiva o la estabilizacion de la enfermedad durante 12 semanas.

   10 2.Metodo segun la reivindicacion 1, en el que se determina el nivel de expresion mediante tecnología de micromatrices.
2. 3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el gen marcador muestra un nivel de expresion entre 1,8 y 3,7 o

   15 más veces superior en la muestra tumoral del paciente respondedor que el valor representativo de un nivel de expresión del gen PSPH en tumores de una población de pacientes no respondedores, en el que se define la poblacion beneficiada como la que manifiesta una respuesta objetiva o la estabilizacion de la enfermedad durante 12 semanas