JP2015119719A - 迅速に結果を得るハイブリッドキャプチャー法によるアッセイおよびシステム - Google Patents

Abstract

【課題】サンプル中の標的核酸分子の存在の検出に関して迅速で信頼性のある結果を安価で容易に入手できる代替品等を使用して得るための検出用組成物、及び、前記検出用組成物を含むキットの提供。【解決手段】界面活性剤を含む回収保存液でサンプルを懸濁する工程と、標的核酸分子を変性させる工程と、プローブと標的核酸分子を接触させ二本鎖核酸ハイブリッドを形成させる工程と、特異的な抗体でコーティングされた固体支持体上に二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉する工程を含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法及びそれに用いる試薬組成物、並びに試薬組成物を含む標的核酸分子の検出用キット。【選択図】図３

Description

本出願は、２００８年１０月２７日に出願の米国特許仮出願第６１，１０８，６８７号および２００９年５月１日に出願の米国特許仮出願第６１／１７４，８４８号に対して優先権を主張する。出願すべての内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。

分野
本発明は、サンプル中の核酸の存在を判定する方法、試薬、システムおよびキットに関する。

特定の核酸配列および配列変化の検出および特徴付けは、感染症を示すウイルスまたは細菌の核酸配列の存在の検出、疾患および癌に関与する哺乳類遺伝子の変異体または対立遺伝子の存在の検出、法医学サンプル中に見出される核酸の起源の同定、ならびに父子判定に利用されてきた。

例えば、多くの微生物およびウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡが単離、配列決定され、核酸プローブは多くの感染症に関して調査されてきた。試験サンプル中の相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列とハイブリダイズする、検出可能な核酸配列はこれまでも利用されてきた。プローブの検出は、試験サンプル中の個々の核酸配列の存在を示し、そのプローブは特異的である。科学研究に役立つのに加えて、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、ウイルスと細菌、酵母および原生動物など、微生物の存在の検出、ならびに患者サンプル中における具体的な疾患に関連する遺伝子変異の検出に使用することができる。

核酸ハイブリダイゼーションプローブは、他の検出方法よりも高い感受性および選択性というメリットがあり、生菌を必要としない。例えば容易に検出することができる放射性物質を用いるか、または捕捉および検出を可能にする、例えばビオチンなどのバイオマーカーを用いて、ハイブリダイゼーションプローブを標識することができる。また、核酸分子をＤＮＡハイブリッドに特異的な第一の抗体により捕捉することができ、このハイブリッドはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含んでよい。続いて、標識された第二の抗体によりこのハイブリッドを検出することができる。この第二の抗体は、例えばアルカリホスファターゼなどのバイオマーカー、または検出することができるその他のマーカーで標識してもよい。

ヒトおよび病原生物由来の遺伝子の核酸配列データが蓄積するにつれ、迅速で、費用効果が高く、簡便な試験の需要が増している。地理的に医療が容易ではない場所において、迅速で費用効果が高く、確実に標的核酸を判定する新しく効果的な方法、組成物およびキットを提供する必要がある。また、開発途上国において使用することができる迅速な選別形式でこれらのアッセイを行う必要性もある。本発明の方法およびアッセイは、これらの必要性を満たし、手動システム、部分的に自動化したシステム、自動化システム、自動化されていないシステムで使用することができる。

開発途上国および地理的に医療が容易に行えない場所における臨床分析は、特有の課題を有する。本明細書に記載される発明は、かかる国々および地域における、こうした課題の重要性に見合う、満足できる解決策を実現する。例えば、分析用試料を提供するために、女性が遠距離を移動する地区では、結果を得るスピードは特に重要である。このような地区においては、家から試験地まで移動することに関連して、継続管理が続かないことを避けるため、患者がまだ居る間の、数時間以内または同日中に結果が得られることは好都合である。

開発途上国が直面している他の要因は、アッセイを行う費用とアッセイを行うのに必要な器具類である。リピートピペットおよびシングルピペットは、先進国で日常的に使用されるたった２種の器具であるが、開発途上国においては非常に高額である可能性がある。したがって、開発途上国において、より安価で容易に入手できる代替品を使用する医療器具および製品の必要性がある。

概要
１つの態様は、生物学的物質を含むサンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法に関する。この生物学的物質には、子宮頸部上皮細胞または子宮頸部細胞由来の核酸を挙げることができる。開示された方法を用いて、比較的迅速に、例えば約２〜３時間以内で、サンプル中に標的核酸分子が存在するかどうかの判定を行うことができる。

１つの態様において、サンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法は、
ａ）回収保存液でサンプルを懸濁する工程と、
ｂ）サンプル中の標的核酸分子を回収保存液に放出する工程と、
ｃ）二本鎖標的核酸分子を一本鎖標的核酸分子に変える工程と、
ｄ）プローブおよび一本鎖標的核酸分子をハイブリダイズさせる条件下で、１つまたは複数の該プローブを一本鎖標的核酸分子と接触させ、二本鎖核酸ハイブリッドを形成する工程と、
ｅ）二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉する工程と、
ｆ）二本鎖核酸ハイブリッドを、結合していない一本鎖標的核酸分子から分離する工程と、
ｇ）二本鎖核酸ハイブリッドを検出することにより、標的核酸の存在を示す工程
を含む。

１つの態様において、この方法は大部分が手作業の場合があり、人による入力を必要とする。別の態様は、サンプル中の標的核酸分子の迅速な検出に関する。この検出方法は自動でもよく、完全に自動であるか、または部分的に自動であり、これは言い換えれば部分的に人による入力を必要とする。

別の態様は、同時または非常に短い時間内に、複数のサンプル中の標的核酸分子を検出することに関する。例えば、１台の機器または一連の機器による。

さらに別の態様は、単一の設置面積で、標的核酸分子を検出する方法を実施する装置に関する。この装置は、この方法の工程を実施する他の個々の装置の多くと、またはすべてと組み合わせられる。

別の態様は、サンプル中の標的核酸分子の検出を評価する携帯用システムに関する。

別の態様は、サンプル中の標的核酸分子を検出するキットに関する。

さらなる態様は、標的核酸分子を含むサンプルが回収される回収保存液中の試薬に関する。数週間または数カ月にわたって、標的核酸分子の分解が最低限である状態で、標的核酸分子をこの回収保存液に保持することができる。１つの態様において、数週間または数カ月にわたって、標的核酸分子の分解が最低限である状態で、ＤＮＡベースの標的サンプル物質をこの回収保存液に保持することができる。１つの態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は、迅速なサンプルの分析および処理を可能にする。

図１は、界面活性剤ベースの回収保存液が、公知の回収保存液またはサンプル輸送保存液（ＳＴＭ）（非界面活性剤ベースの保存液）より、マイクロタイタープレートのウェルに磁性ビーズを多く保持することを示す。 図２は、サンプル１ｍｌにつき標的核酸（ＤＮＡ）を０．２ｐｇのみ含むサンプルが、本発明の方法を用いて、判読できるシグナルを提供することを示す。 図３は、室温、２１日間の臨床試料の安定性を示す。 図４は、３３℃、２１日間の臨床試料の安定性を示す。 図５は、ＨＰＶ１６型ＤＮＡの１０００コピーに相当する０．２ｐｇ／ｍｌのＨＰＶ１６型プラスミドについて、試験結果がＳ／Ｎ≧２．０であると明示することを示す。 図６は、多数のサンプルを加熱するために構成されたヒーター、ルミノメーターおよびモニターを含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を検出するシステムを示す。 図７は、検出アッセイに使用される様々な試薬を示す。試薬バイアルは、使用を容易にするために色分けされ、キットに同封される場合がある。 図８は、核酸分子の存在を検出するシステムと連結して使用されるモニターを示す。 図９は、界面活性剤ベースの回収保存液に懸濁され、室温で保存されたソフトペレットに関する、１１日間の安定性データを示す。

詳細な説明
本開示は、サンプル中の核酸分子の存在を迅速に判定する方法、組成物、試薬、システムおよびキットを含む。この方法、組成物、試薬、システムおよびキットを、これに限定されないが、病原生物の検出および同定と個々の疾患の遺伝的素因の検出を含む、臨床診断目的に使用することができる。

１つの態様において、本開示はサンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法を提供する。その方法は、
ａ）界面活性剤を含む回収保存液でサンプルを懸濁する工程と、
ｂ）標的核酸分子を変性させる工程と、
ｃ）ポリヌクレオチドプローブおよび標的核酸分子のハイブリダイズを可能にする条件下で、１つまたは複数の該プローブを標的核酸分子と接触させ、それにより二本鎖核酸ハイブリッドを形成させる工程と、
ｄ）二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な第一の抗体でコーティングされた固体支持体上で二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉し、それにより二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を形成させる工程と、
ｅ）二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を、結合していない核酸から分離する工程と、
ｆ）複合体と、二本鎖核酸ハイブリッドまたは第一の抗体のいずれかに特異的な、検出可能なマーカーで標識された第二の抗体とを結合体化させて、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体抗体複合体を形成させる工程と、
ｇ）二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体抗体複合体を、界面活性剤を含む洗浄緩衝液で洗浄する工程と、
ｈ）第二の抗体の標識を検出する工程であって、該検出によって標的核酸分子の存在が示される工程
とを含む。

別の態様において、本開示は界面活性剤を含む回収保存液でサンプルを懸濁する工程；標的核酸分子を変性させる工程；ポリヌクレオチドプローブおよび標的核酸分子をハイブリダイズまたは結合させる条件下で、１つまたは複数の該プローブを標的核酸分子と接触させる工程；二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な第一の抗体でコーティングされた固体支持体上で二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉する工程を含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法を提供する。

１つの態様において、本開示は界面活性剤を含む回収保存液でサンプルを懸濁する工程；標的核酸分子を変性させる工程；ポリヌクレオチドプローブおよび標的核酸分子をハイブリダイズまたは結合させる条件下で、１つまたは複数の該プローブを標的核酸分子と接触させる工程；二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な第一の抗体でコーティングされた固体支持体上で二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉する工程；二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を、結合していない核酸から分離する工程を含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法を提供する。

１つの態様において、本開示は界面活性剤を含む回収保存液でサンプルを懸濁する工程；標的核酸分子を変性させる工程；ポリヌクレオチドプローブおよび標的核酸分子をハイブリダイズまたは結合させる条件下で、１つまたは複数の該プローブを標的核酸分子と接触させる工程；二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な第一の抗体でコーティングされた固体支持体上で二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉し、それにより二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を形成する工程；二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を、結合していない核酸から分離する工程；複合体と、二本鎖核酸ハイブリッドまたは第一の抗体に特異的な第二の抗体とを結合体化させて、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体抗体複合体を形成する工程を含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法を提供する。

別の態様において、本開示は界面活性剤を含む回収保存液でサンプルを懸濁する工程；標的核酸分子を変性させる工程；ポリヌクレオチドプローブおよび標的核酸分子をハイブリダイズまたは結合させる条件下で、１つまたは複数の該プローブを標的核酸分子と接触させる工程；二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な第一の抗体でコーティングされた固体支持体上で二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉し、それによって二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を形成させる工程；二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を、結合していない核酸から分離する工程；複合体と、二本鎖核酸ハイブリッドまたは第一の抗体に特異的な、検出可能なマーカーで標識された第二の抗体とを結合体化させて、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体抗体複合体を形成させる工程；二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体抗体複合体を、界面活性剤を含む洗浄緩衝液で洗浄する工程を含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法を提供する。

別の態様において、本開示はサンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法を提供し、その方法は、
ａ）界面活性剤を含む回収保存液でサンプルを懸濁する工程と、
ｂ）サンプル中の標的核酸分子を変性させる工程と、
ｃ）少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブと標的核酸分子との接触により、二本鎖核酸ハイブリッドを形成させる工程と、
ｄ）第一の抗体を含む支持体上での二本鎖核酸ハイブリッドの捕捉により、二本鎖核酸ハイブリッド−支持体複合体を形成させる工程と、
ｅ）二本鎖核酸ハイブリッド−支持体複合体と、検出可能なマーカーで標識された第二の抗体との接触により、二本鎖核酸ハイブリッド−支持体−第二の抗体複合体を形成させる工程と、
ｆ）二本鎖核酸ハイブリッド−支持体−第二の抗体複合体を、洗浄緩衝液で洗浄する工程と、
ｇ）第二の抗体のマーカーを検出する工程であって、該検出により標的核酸分子の存在が示される工程
とを含む。

１つの態様において、固体支持体は表面をコーティングされた修飾常磁性ビーズを含み、それに二本鎖核酸ハイブリッドに対して免疫特異的である第一の抗体を付着させている。二本鎖核酸−磁性ビーズ−抗体複合体を、結合していない核酸から分離するのに、磁場を使用する。

１つの態様において、この方法はサンプルの前処理工程を含まない。例えば、界面活性剤ベースの回収保存液はサンプル調製時間を減らすことを可能にし、これは標的核酸分子の検出を促進することができる。開示の方法、アッセイまたは装置により、サンプルを直接アッセイで解析することができる。ある例において、開示のアッセイを用いて評価する前に、サンプルの精製工程は実施されない。１つの態様において、粗溶解物は開示の方法、アッセイまたは装置により直接解析される。別の態様において、サンプルは標的増幅工程を必要としない。

１つの態様は、本明細書で提供される方法、キット、アッセイおよび装置を利用して癌を診断する方法に関する。１つの態様において、子宮頸癌はＨＰＶおよびＨＰＶ変異株に関連する核酸分子を同定することで発見される。別の態様において、本明細書で提供される方法、キット、アッセイおよび装置を使用して、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）をスクリーニングすることができる。その後、本明細書で提供される方法、キット、アッセイおよび装置により診断した後、発見された癌を治療することができる。１つの態様において、診断された癌は子宮頸癌およびその変種である。

１つの態様において、本開示は、約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む回収保存液で懸濁された、生物学的サンプルを含む組成物を提供する。

１つの態様において、本開示は
（ａ）約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウム中で懸濁された生物学的サンプルと、
（ｂ）少なくとも１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブと
を含む組成物を提供する。

１つの態様において、本開示は
（ａ）約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む回収保存液で懸濁された生物学的サンプルと、
（ｂ）少なくとも１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブと、
（ｃ）第一の抗体と
を含む組成物を提供する。

１つの態様において、本開示は
（ａ）約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む回収保存液で懸濁された生物学的サンプルと、
（ｂ）第一の抗体と、
（ｃ）第二の抗体と
を含む組成物を提供する。

１つの態様において、本開示は
（ａ）約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む回収保存液で懸濁された生物学的サンプルと、
（ｂ）少なくとも１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブと、
（ｃ）第一の抗体と、
（ｄ）第二の抗体と
を含む組成物を提供する。

１つの態様において、本開示は
（ａ）少なくとも１種の界面活性剤を含む回収保存液で懸濁された生物学的サンプルと、
（ｂ）変性試薬と、
（ｃ）標的核酸分子に結合することができる、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブと、
（ｄ）第一の抗体でコーティングされた支持体と、
（ｅ）検出可能なマーカーで標識された第二の抗体と、
を含む組成物を提供する。

１つの態様において、上記のいずれの組成物も、本明細書に記載されたいずれの回収保存液と使用することができる。

１つの態様において、上記組成物中の生物学的サンプルは、子宮頸部細胞サンプルまたはヒト子宮頸部細胞サンプルである。別の態様において、生物学的サンプル中の核酸分子は変性している。上記組成物中の生物学的サンプルは、３３℃で少なくとも２１日間にわたり回収保存液で保存されたとき、安定性を示すことができる。１つの態様において、第二の抗体は検出可能なマーカーで標識されている。

生物学的サンプル
本発明の方法は、限定されないが、生物学的および環境サンプルを含む試料または培養物（例えば、細胞、微生物およびウイルス培養物）を含む、サンプルの標的核酸分子の存在を検出するために使用することができる。生物学的サンプルは、ヒトを含む動物、流動体、固体（例えば、糞便）、または組織、ならびに液体および固形食と、乳製品、野菜、肉および肉の副産物、廃棄物などの飼料製品および成分でよい。環境サンプルには、表面物質、土、水、および産業サンプルなどの環境物質、ならびに食品および乳製品処理機器、装置、設備、器具、使い捨ておよび非使い捨て品から得られるサンプルが挙げられる。

これに限定されないが、子宮頸部上皮細胞（例えば、子宮頸部スワブから得られるサンプル）、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、母乳、リンパ液、痰および精液を含む生物学的サンプルが特に好ましい。サンプルは、二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子を含んでもよい。二本鎖核酸分子が存在すれば、例えば、アルカリの使用、プロテイナーゼＫ／ＳＤＳの使用、カオトロピック塩など当技術分野で公知の様々な方法によりハイブリダイゼーション解析用に調製することができる。一般に、ハイブリダイゼーション解析用に二本鎖核酸分子を調製する処理は、それを一本鎖核酸分子に変えることを伴う。この処理は、一般に変性として知られる。しかしながら、例えば、三本鎖構成物を介して、変性させずに二本鎖核酸分子を検出する場合も企図される。

サンプル中の標的核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＤＮＡとＲＮＡの両方であってよい。標的核酸分子は、より大きな核酸分子内に含有されることがある。標的核酸分子または標的核酸分子を含む、より大きい核酸分子どちらかを検出することは、本開示により企図される。

生物学的サンプルは、子宮頸部細胞、特にヒト子宮頸部細胞を含むことができる。サンプルは、ＤＡＣＲＯＮ綿棒などの化学的に不活性な回収器具を含む、当技術分野で公知である任意の方法、または器具を用いて回収することができる。使用されうるその他の許容できる回収器具は、これに限定されないが、綿棒、子宮頸部ブラシ、フロックドスワブ（ＤＡＣＲＯＮ綿棒のような形の綿棒であるが、より多くの細胞を回収し、より簡単に放出できるナイロン繊維で作られている）、子宮頸部ブルームブラシ、ミニブルームブラシ、洗浄、またはパップスメア検査で頻繁に使用される任意の回収器具を含む。

１つの態様において、方法には３０歳超の女性からサンプルを回収する工程が含まれる。また、この方法は、パップスメア検査または同等の検査によって３０歳超の女性からサンプルを回収する工程を含み得る。パップスメアまたは同等の検査により回収されたサンプルは、子宮頸部細胞サンプルとなる。

サンプルを回収したら、サンプルチューブに入れ、チューブはコンタミネーションを防ぐため、封をすることができる。回収器具（綿棒、ブラシなど）は、サンプルをサンプルチューブに入れると、移動する仕組みをさらに有することができる。１つの態様において、回収器具は磁石を用いて移動させることができる挿入物を含む。１つの態様において、この挿入物は金属を含む。別の態様において、この挿入物は磁性物質を含む。磁性物質には、常磁性物質、強磁性物質および反磁性物質が含まれる。サンプルチューブに入れると、回収器具が移動する利点は、回収器具がサンプル抽出またはサンプル検出器具と接触しないようにすることである。サンプル抽出器具の例には、ピペット、ピペットチップ、ドロッパーボトルまたはその他のローテク抽出器具が挙げられる。サンプル検出器具の例には、プローブおよびプローブチップが挙げられる。

このアッセイの速度は、離れた居住地区に住む患者のサンプルをスクリーニングするのに有益でもある。患者は医者または診療所を訪れるために、かなりの距離を移動することが多く、その後しばらく戻れる可能性は低い。したがって、患者が診療所で待っている間に、患者を検査し、結果を提供することができることが望ましい。状況次第では、患者が医院を去ったあとに、試験結果を提供するため、および／または患者を治療するために患者を追跡することは難しい場合がある。したがって、記述されたアッセイは、短時間で、例えば約２〜約３時間、約２〜約４時間、約３〜約５時間、約４〜約８時間、または約６〜約１２時間で結果を提供する。別の態様において、記述されたアッセイは、約２時間未満、約２時間半未満、約３時間未満、約３時間半未満、約４時間未満、約４時間半未満、約５時間未満、約８時間未満、約１２時間未満、および約２４時間未満後に結果を提供する。このような短い所要時間により、診療所に患者が居る同日に、医者が患者に結果および／または治療を提供することを可能にする。

サンプルチューブ
任意の型のサンプルチューブを使用することができる。有利には、コンタミネーションを最小限に抑えるため、サンプルチューブはふたをするか、または密封してもよい。このふたは永久的であるか取り外しできてもよい。取り外し可能なふたの例には、スナップキャップ、ねじぶた、ゴム隔膜、ホイルおよびフィルムが挙げられる。このふたは、１つまたは複数の穴または穿孔を含んでもよく、これは貫通されたとき、再度密封することができる。このような穴または穿孔を有するふたの１つの利点は、例えば、サンプル抽出器具またはサンプル検出器具がふたを貫通したときにふたが無効とならないことである。サンプル抽出器具またはサンプル検出器具が取り出されると、ふたは再度密封し、これによりコンタミネーションは最小限となる。

生物学的サンプルの保存
サンプルをサンプルチューブに入れたら、ある物質を用いて、または防腐的保存液で、あるいは両方を用いてサンプルを乾燥することにより保存できる。乾燥保存は圧力乾燥または化学物質を用いての乾燥により達成される。これにより水分のほとんどを除き、長期間の安定性に適当である。あるいは、サンプルの安定性を確保するため、トレハロースのような基質を用いてサンプルを凍結乾燥（フリーズドライ）することができる。

別の可能性として、当業者に公知および明らかである、防腐的保存液にサンプルを懸濁させて保存することができる。防腐的保存液の目的は、分解する可能性がある生物学的成分を保護することである。例えば、サンプル細胞、プローブ混合物、捕捉工程で使用される抗体：ビーズ複合体、および検出工程で使用される第二の抗体はすべて、分解の影響を受けやすい。回収の初期工程での防腐的保存液は、サンプルに安定性および完全性を理想的に提供し、核酸の捕捉および検出処理における終了段階の工程に作用することができる。１つの態様において、防腐的保存液添加の前後どちらかで、サンプルを室温、冷蔵または冷凍保存することができる。

回収保存液
１つの態様において、サンプルを回収保存液で回収および保存することができる。回収保存液には、核酸を保存すること、および解析前の核酸の分解を防ぐため、ヌクレアーゼを阻害することを含む、防腐的保存液としてのいくつかの機能を有する。１つの態様において、回収保存液は、少なくとも１種の界面活性剤を含有する。別の態様において、回収保存液は、少なくとも２種の界面活性剤、少なくとも３種の界面活性剤、または少なくとも４種の界面活性剤を含有する。１つの態様において、各界面活性剤は異なる。別の態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は異なる２種の界面活性剤を含み、そのうち１種はバックグラウンド信号を調節することができ、もう１種の界面活性剤は、例えば粘性のあるサンプルを通って移動する磁性ビーズの挙動を改善する。界面活性剤がビーズの挙動を改善するため、ビーズの過剰な破壊を引き起こすことなく、噴出瓶およびドロッパーボトルなどの様々な精密でない器具を用いて、ビーズを洗浄することができる。このような手法は、開発途上国での使用に都合がよく、こうした国では、ピペット器具などの技術的に進んだ設備への資金および入手方法が利用できない。

さらに、本発明は、精密でない試薬送達器具を用いることを支援することができる、堅牢なアッセイを提供する。このアッセイの試薬は、堅牢に設計され、試薬送達量のばらつきによく耐える。例えば、アッセイの中和反応工程は、反応において非常に塩基性であるｐＨを、非常に大きな体積許容であるハイブリダイゼーションに適当なｐＨ範囲にするため、高度に緩衝されたｐＨ中性溶液を利用する。

アッセイ用の界面活性剤ベースの回収保存液の使用について、１種または複数種の界面活性剤を含むことができる。１つの態様において、アッセイのハイブリダイゼーション、捕捉および検出工程で熱が使用される。界面活性剤および熱の利用によっても、アッセイで使用される抗体は機能性を残す。

図１は、界面活性剤ベースの回収保存液が、標準的な回収保存液と比較して、取り扱い中に磁性ビーズの損失および移動を防ぐ能力を大きく改善することを示す。界面活性剤ベースの回収保存液は、１種、２種、３種もしくは４種、またはそれ以上の界面活性剤を含む、本質的にからなる、またはからなることができる。界面活性剤は当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、以下の界面活性剤を挙げることができる。陽イオン界面活性剤としては、例えば、これらに限定されないが、臭化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム（セトリモニウム化合物としてまとめて知られる）、塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウム（ベンズアルコニウム化合物としてまとめて知られる）、およびアルキルトリメチルアンモニウム塩など；陰イオン界面活性剤としては、例えば、これらに限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびサルコシルなど；ＮＰ−４０などの非変性界面活性剤；その他の界面活性剤である。ＮＰ−４０は、テルギトールＮＰ−４０としても知られ、これはノニルフェノキシポリエトキシエタノールである。ＮＰ−４０は核膜を破壊するのに十分強力ではないが、細胞膜を破壊することはできる。このように、細胞培養物の細胞内容物を得るのに使用することができる。

他の界面活性剤および界面活性剤の組合せを使用することができ、その組合せはバックグラウンドノイズを調節し、磁性ビーズの挙動（使用される固体支持体が磁性ビーズを含む場合）を改善する能力を有利に提供する。ある種の態様において、１種の界面活性剤が陰イオン界面活性剤であり、２つ目の界面活性剤が非陰イオン界面活性剤である。例えば、１つの態様において、非イオンおよび陰イオン界面活性剤の組合せは、バックグラウンドノイズを低く維持するのに役立つ。１つの態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は、バックグラウンドノイズを調節するデオキシコール酸ナトリウムなどの陰イオン界面活性剤、および磁性ビーズの挙動を改善するＮＰ−４０を含む。

これら２つの型の界面活性剤の組合せは、２種の界面活性剤を一緒に加える単純な組合せを超える以下の相乗効果を提供する：バックグラウンドノイズの調節、優れたビーズの挙動、およびアッセイ速度の増加。（界面活性剤ベースの回収保存液中で）これらの界面活性剤が存在することで、より迅速なアッセイ結果を得る能力を提供するが、下流の解析工程で核酸または捕捉抗体に負の影響を与えない。

さらに、サンプルがより容易に溶解するとき、界面活性剤ベースの回収保存液は回収器具から試料を除去するのを改善する。さらに、界面活性剤ベースの回収保存液は、これに限定されないが、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（４０％メタノール溶液使用）、ＳＴＭ（カオトロピック剤使用）およびアルコールなど、他の回収保存液と比べてサンプルの均一性を改善する。また、界面活性剤ベースの回収保存液は、混合後（手動または自動）のサンプルの粘性を小さくする。

回収保存液中のＮＰ−４０の濃度は、約０．５〜約２．０％、約０．１〜約１．０％、ならびに列挙した範囲内の任意の数値でよい。ある種の態様において、ＮＰ−４０は、約０．８〜約１．５％、約０．９〜約１．２％の濃度で存在し、ある種の態様においては、約１．０％である。別の態様において、ＮＰ−４０は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、または約２．０％の濃度で存在する。回収保存液中のデオキシコール酸ナトリウムの濃度は、約０．１０〜約０．４０％、約０．２０〜約０．３０％、ならびに列挙した範囲内の任意の数値でよい。１つの態様において、デオキシコール酸ナトリウムの濃度は、約０．１０％、約０．１５％、約０．２０％、約０．２５％、約０．３０％、約０．３５％、または約０．４０％である。

界面活性剤ベースの回収保存液は、緩衝剤、２種の界面活性剤、キレート剤、防腐剤を含む、本質的にからなる、またはからなることができる。緩衝剤は、約２５〜約７５ｍＭ、約３０〜約６０ｍＭ、約４０〜約５０ｍＭ、および約４５〜約５５ｍＭ、ならびに列挙した範囲内の任意の数値の濃度であるトリス−ＨＣｌでよい。また、緩衝剤は約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、または約７５ｍＭの濃度であるトリス−ＨＣｌでもよい。

任意の防腐剤を使用することができ、その選択は所望の機能性、最小の副作用、価格などの要因によって決めることができる。適当な防腐剤には、ゲンタマイシン、プロクリン、ダイマーゾルおよびアジ化ナトリウムが挙げられる。回収保存液中の防腐剤の濃度は、防腐剤のタイプ、その効果、その副作用などの要因次第である。例えばアジ化ナトリウムについては、アジ化ナトリウムの濃度は、約０．０１〜約０．１％、約０．０２５〜約０．０７５％、および約０．０４〜約０．０６％、ならびに列挙された範囲内の任意の数値でよい。また防腐剤は、例えばアジ化ナトリウムについては、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、または約０．１０％で存在することができる。

１つの態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は、１．０％のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。別の態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は、約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。別の態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は、約０．８〜約１．５％のＮＰ−４０、約０．２０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約３０〜約６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約２０〜約４０ｍＭのＥＤＴＡ、約１００〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０２５〜約０．０７５％のアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。さらに別の態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は、約０．９〜約１．２％のＮＰ−４０、約０．２０〜約０．３０％のデオキシコール酸ナトリウム、約３０〜約６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約２０〜約３０ｍＭのＥＤＴＡ、約１００〜約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０４〜約０．０６％のアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。

１つの態様において、回収保存液はＮＰ−４０およびＥＤＴＡを含む、本質的にからなる、またはからなる。別の態様において、回収保存液はＮＰ−４０、ＥＤＴＡ、およびアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。１つの態様において、回収保存液はデオキシコール酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、およびアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。１つの態様において、回収保存液はＮＰ−４０、デオキシコール酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、およびアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。１つの態様において、回収保存液はＮＰ−４０、デオキシコール酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、およびアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。

別の態様において、回収保存液は０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、および１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡを含む、本質的にからなる、またはからなる。別の態様において、回収保存液は０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。１つの態様において、回収保存液は約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。１つの態様において、回収保存液は約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。１つの態様において、回収保存液は約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む、本質的にからなる、またはからなる。

１つの態様において、回収保存液は非カオトロピック保存液である。つまり、例えば、回収保存液はカオトロピック保存液またはカオトロピック塩を含まない。限定されないが、１つの態様において、回収保存液は塩酸グアニジンまたは尿素を含まない。非カオトロピック回収保存液を用いる潜在的な利点は、サンプルの優れた再懸濁性、より再現性のある試験、およびカオトロピック保存液またはカオトロピック塩を含む保存液と比較して、より均一な試験アリコートが得られる点である。

界面活性剤ベースの回収保存液を用いる利点は、サンプルの安定性を維持することである。開示されたように、界面活性剤ベースの回収保存液で保存されたサンプルは、少なくとも３１日間安定であり、１５〜３３℃の温度で保持されると、少なくとも２１日間安定である。１つの態様において、−２０℃で少なくとも６カ月間、界面活性剤ベースの回収保存液中で凍結すると、サンプルは安定である。１つの態様において、子宮頸部細胞サンプルは少なくとも３１日間、１５〜３３℃の温度で保持すると少なくとも２１日間、−２０℃で界面活性剤ベースの回収保存液中では、少なくとも６カ月間安定である。

１つの態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は、カットオフ比０．５の相対光単位について、子宮頸部上皮内腫瘍または癌の検出に関して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の感度を示す。別の態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は、カットオフ比０．５の相対光単位について、子宮頸部上皮内腫瘍または癌の検出に関して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の特異性を示す。さらに別の態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は、カットオフ比０．５の相対光単位について、重度または中等度の子宮頸部上皮内腫瘍または癌（ＣＩＮ２＋）の検出に関して、約９０％の感度、および約８４％の特異性を示す。１つの態様において、界面活性剤ベースの保存液は、０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む。

また、界面活性剤ベースの回収保存液は、厳密なハイブリダイゼーションおよび捕捉条件下（例えば、温度６５〜７５℃）で、変性剤を含む回収保存液に比べて改善されたアッセイ性能をもたらす。

１種、２種、３種、４種、またはそれ以上の変性剤の存在は、サンプルの粘性を減少させることができ、これは、磁性ビーズからの液相除去およびサンプル混合に役立つ。

１つの態様において、血液または剥離子宮頸部細胞試料などのサンプルを界面活性剤ベースの回収保存液で、回収および懸濁することができる。サンプルをＤＡＣＲＯＮ綿棒などの化学的に不活性な回収器具で回収することができる。他の適当な綿棒としては、ナイロン繊維綿棒などを使用することができる。解析前に核酸が分解することを防止し、サンプルの安定性を維持するため、サンプルを界面活性剤ベースの回収保存液で保存することができる。

サンプルをその他の公知の回収保存液で回収することができ、その後、本明細書に記載した方法で使用することができる。その他の回収保存液の例には、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ、ＳＵＲＥＰＡＴＨ、ＤＣＭ（ＤＩＧＥＮＥ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）、およびＳＴＭ（Ｓａｍｐｌｅ／Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ）などがある。ある種の回収保存液は核酸特異的である。例えば、標的核酸がＲＮＡの場合、ＤＣＭは使用されない。いくつかのこうした保存液で回収されたサンプルは、サンプル中の核酸を検出および解析する前に、処理を必要とすることがある。サンプルを処理する方法（サンプル調製とも言う）のいくつかは、当技術分野で公知である。例えば、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴなどの保存液で細胞学的解析のために回収された子宮頸部細胞サンプルを、界面活性剤ベースの可溶化緩衝液と混合することができ、続いて、核酸結合表面を含む磁性ビーズを添加する。さらに、その他公知の一般に利用できる回収保存液で、回収された他の細胞サンプルを、界面活性剤ベースの可溶化緩衝液と混合することができ、続いて核酸結合表面を含む磁性ビーズを添加する。

標的核酸分子
標的核酸分子には、制限されないが、生物学的および環境サンプルを含む試料または培養物（細胞、微生物およびウイルス培養物など）中に見出される核酸分子が挙げられる。標的核酸分子を、ヒトを含む動物、流動体、固体（糞便など）、または組織、ならびに液体および固形食と、乳製品、野菜、肉および肉の副産物、廃棄物などの飼料製品および成分からの生物学的サンプルに見出すことができる。標的核酸分子は、環境サンプル中に見出され、表面物質、土、水、および産業サンプル、ならびに食品および乳製品処理機器、装置、設備、器具、使い捨ておよび非使い捨て品から得られるサンプルなど、環境物質を含む。

生物学的サンプルに見出される標的核酸分子には、これに限定されないが、子宮頸部サンプル（例えば、子宮頸部スワブから得られるサンプル）または子宮頸部細胞サンプル、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、母乳、リンパ液、痰、尿および精液が挙げられる。標的核酸分子は、他のウイルス、細菌、マイコバクテリウム、またはプラスモジウム由来でもよく、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペス、ＨＩＶ、Ｈ１Ｎ１、クラミジア、淋病、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、結核、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス、またはインフルエンザである。１つの態様において、子宮頸部サンプル（例えば、子宮頸部スワブから得られるサンプル）または子宮頸部細胞サンプル、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、母乳、リンパ液、痰、尿および精液、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペス、ＨＩＶ、Ｈ１Ｎ１、クラミジア、淋病、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ，ＧＣ）、クラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，ＣＴ）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、結核、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス、またはインフルエンザなどのその他のウイルス、細菌、マイコバクテリウムまたはプラスモジウムのうち、いずれか１つに関連する核酸分子に対して、標的核酸分子は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。

１つの態様において、標的核酸分子はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）であり、ＨＰＶの遺伝的変異体を含む。変異体は、標的核酸の多型、突然変異体、誘導体、修飾型、改変型、または同様の形を含む。１つの態様において、標的核酸はＨＰＶ核酸である。別の態様において、ＨＰＶ核酸は、高リスク型ＨＰＶのＨＰＶ ＤＮＡである。別の態様において、ＨＰＶ核酸は、高リスク型ＨＰＶのＨＰＶ ＲＮＡである。別の態様において、標的核酸は、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２型のうちのいずれか１つ、または低リスク型ＨＰＶである６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３型のうちのいずれか１つである。

別の態様において、標的核酸分子は、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝子変異体、高リスク型ＨＰＶのＨＰＶ ＤＮＡ、または高リスク型ＨＰＶのＨＰＶ ＲＮＡのうちの、いずれか１つに関連する核酸分子に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。別の態様において、標的核酸は、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２型のうちのいずれか１つ、または低リスク型ＨＰＶである６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３型のうち、いずれか１つに関連する核酸分子に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。

本発明の方法を用いて、標的核酸分子は、１ｍｌにつき約１ｐｇ未満、１ｍｌにつき約０．７５ｐｇ未満、１ｍｌにつき０．５ｐｇ未満、１ｍｌにつき０．２５ｐｇ未満、および１ｍｌにつき０．２ｐｇほど低い濃度でさえ存在することができる。図２に見られるように、ＨＰＶ１６型ＤＮＡを、１ｍｌにつき０．２ｐｇの濃度で存在する標的核酸分子として使用したとき、高信号対雑音比が得られる。

これまでに言及したように、標的核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡでよい。標的核酸分子がＤＮＡのとき、プローブはＲＮＡであることが好ましく、標的核酸がＲＮＡのとき、プローブはＤＮＡが好ましい。しかしながら、ＤＮＡプローブはＤＮＡ標的核酸分子と使用することができ、ＲＮＡプローブはＲＮＡ標的核酸分子と使用することができる。また、これまでに示したように、標的核酸分子は使用する回収保存液を決定することができる。

変性
界面活性剤ベースの回収保存液でサンプルを回収してから、上記したように、ハイブリダイゼーションに使用できる標的核酸分子にするため、サンプルを変性剤で処理することができる。１つの態様において、アルカリ溶液を用いてサンプルを変性させる。溶液のｐＨを約ｐＨ１２、約ｐＨ１３、または約ｐＨ１４にすることができる、任意のアルカリを使用してよい。さらに、溶液のｐＨを約ｐＨ１２〜約ｐＨ１３、約ｐＨ１２〜約ｐＨ１４、および約ｐＨ１３〜約ｐＨ１４の範囲にすることができる、任意のアルカリを使用することができる。アルカリの適当な濃度は、約１．０〜約２．０Ｎ、約１．２５〜約１．７５Ｎ、約１．２５〜約１．５Ｎ、および約１．５Ｎ、ならびに列挙された範囲内の任意の数字を含む。限定されないが、適当なアルカリはＮａＯＨおよびＫＯＨなどである。

１つの例において、界面活性剤ベースの回収保存液で懸濁されたサンプルのおおよその１分量を、約半分の分量の１．７５ＮＮａＯＨ溶液で処理することができる。例えば、ある種の態様において、界面活性剤ベースの回収保存液で懸濁されたサンプルから、おおよそ５０μｌのアリコートを取り出し、おおよそ２５μｌの１．７５ＮＮａＯＨ溶液をその５０μｌのアリコートサンプルに添加する。室温で、変性試薬を用いて処理したサンプルを、手動で混合するか、または約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、約６００〜約１０００ｒｐｍ、または約６００〜１２００ｒｐｍで機械的に加振することにより、混合することができる。変性試薬添加後のサンプルのｐＨは、約１４である。別の態様において、このｐＨは約ｐＨ１２またはｐＨ１３であってよい。このような塩基性ｐＨは、試料中の核酸の大部分にニックを入れるおよび変性させる。さらに、アルカリ処理によりペプチドおよび核酸間の相互作用を分離して、標的核酸の利用しやすさを改善し、また、タンパクを分解することができる。

タンパクのアルカリ処理は、試料を効果的に均質化して、所与のサンプルに関する解析結果の再現性を保証する。これはサンプルの粘性を減少させることもでき、よって、反応速度を高め、サンプルを均質化し、かつ、サンプル中の任意の内在性一本鎖ＲＮＡ核酸、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを破壊することによって、バックグラウンドを下げる。また、サンプル中に存在する場合があるＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅなどの酵素の不活性化を促進する。ＲＮＡが（ＤＮＡに対して）標的核酸であれば、種々の試薬は、これに限定されないが、フェノール抽出およびＴＣＡ／アセトン沈殿と、グアニジンチオシアナート−フェノール−クロロホルム抽出などが好ましいことは、当業者は十分に理解するはずである。

加熱工程の使用、例えば、核酸の鎖を分離するためにサンプルを約９５℃に加熱することの使用など、他の変性方法を利用できる。ヘリカーゼなどの酵素も使用することができる。

１つの態様において、１．５〜２．０ＮのＮａＯＨをサンプルに添加し、加熱する。別の態様において、１．７５ＮのＮａＯＨをサンプルに添加し、加熱する。変性試薬とともにサンプルを、約３０分間、約６０〜約８０℃、約３０分間、約６５〜約７５℃、または約３０分間、約６７〜約７０℃、または約７０℃、約３０分間、あるいは列挙した範囲内の任意の数値にまで加熱してもよい。別の態様において、変性試薬とともにサンプルを、約２０〜約４０分間、約６０〜約８０℃、約２０〜約４０分間、約６５〜約７５℃、約２０〜約４０分間、約６７〜約７０℃、または約２０〜約４０分間、約７０℃、あるいは列挙した範囲内の任意の数値にまで加熱する。記載した時間および温度条件の目安は、ハイブリダイゼーション、捕捉、洗浄および検出の残りの工程を実施するための、適当な条件下に標的核酸を放置すると同時に、最短で最大限の変性を提供するためである。したがって、約５〜約１２０分間、約１０〜約６０分間、約２０〜約４０分間、約３０分間、または列挙した範囲内の任意の数値で、サンプルを変性試薬中で加熱してよい。より低温でより長時間のインキュベーション、またはより高温でより短時間のインキュベーションは、本明細書で述べた条件に良く似た効果を提供するため、考慮されることは当業者により容易に理解されるであろう。

ハイブリダイゼーションおよびプローブの結合
核酸を含むサンプルを変性したあと、１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブがサンプル中の標的核酸とハイブリッド形成して二本鎖核酸ハイブリッドを生じるのに十分な条件下で、１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブと接触させる。プローブは、完全長、切断または合成ＤＮＡ、あるいは完全長、切断または合成ＲＮＡでよい。標的核酸がＤＮＡであれば、プローブはＲＮＡでよく、標的核酸がＲＮＡであれば、プローブはＤＮＡでよい。１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブは、中和ハイブリダイゼーション緩衝液（塩基性の変性試薬を中和するため）としても作用する、プローブ希釈液中で希釈されることが好ましい。

ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに使用されるプローブ希釈液は、ＤＮＡ対ＲＮＡの安定性に必要な、種々の要求によって異なる。例えば、プローブがＲＮＡであれば、まずサンプルを中和し、プローブを添加するか、あるいは、ＲＮＡを破壊することができるＮａＯＨと同時に、サンプルにＲＮＡプローブおよび中和剤（プローブ希釈液）を加えるのが好ましい。プローブ希釈液はプローブを溶解、および希釈するのに使用することができ、また、ハイブリダイゼーション用の、より有利な環境を提供するため、サンプルを中性ｐＨ、例えば約ｐＨ６〜約ｐＨ９の状態に戻すのに役立つ。プローブ希釈液の十分な分量は、サンプルの半分の分量であることが好ましく、塩基性処理されたサンプルを中和するのに使用してよい。

１つの態様において、プローブ希釈液は、緩衝液、ポリアクリル酸、ＮａＯＨ、およびアジ化ナトリウムを含む。プローブ希釈液は、酢酸を含んでもよい。１つの態様において、プローブ希釈液は、２．２ＭのＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、２．６％のポリアクリル酸（ＰＡＡ）、０．７ＮのＮａＯＨ、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含む。プローブ希釈液は、約１．２〜約２．６ＭのＢＥＳ、約１．５〜約２．５ＭのＢＥＳ、約１．７５〜約２．２５ＭのＢＥＳ、約２〜２．４ＭのＢＥＳ、または約２．２ＭのＢＥＳ、ならびに列挙した範囲内の任意の数値を含んでよい。１つの態様において、プローブ希釈液は、約２〜約３．０％のＰＡＡ、ならびに列挙した範囲内の任意の数値を含んでよい。別の態様において、ＰＡＡの濃度は約２．２〜約２．７％である。さらに別の態様において、ＰＡＡの濃度は約２．６％である。さらなる態様において、プローブ希釈液は、約０．６〜約０．８ＮのＮａＯＨ、例えば、約０．７ＮのＮａＯＨを含んでよい。通常、ＮａＯＨの濃度は、ＢＥＳの量が増えるにつれて、高くなる。

完全長のプローブについて、加熱されたアルカリ溶液がサンプルに添加され、その後、プローブ希釈液が室温でサンプルに添加され、それからサンプルを再加熱することができる。かかる過程は、二次構造の形成を阻害することができる。抗体は二次構造を有する構造に不可逆的に結合する傾向がある。切断または合成プローブなどの非完全長プローブを使用するとき、二次構造問題が存在しないため、溶液またはサンプルの加熱は、必要でない場合がある。１つの態様において、切断または合成プローブを使用するとき、サンプルを加熱しない。

変性試薬で処理した後、プローブ希釈液を記述した態様で、１つまたは複数のプローブを溶解させた中和緩衝液の１アリコートを、プローブをハイブリダイゼーションまたは結合させ、標的核酸を生じさせる適当な条件下で、サンプルに添加することができる。中和緩衝液は、単一の緩衝塩を含んでよい。１つの態様において、中和緩衝液は、単一の緩衝塩以上を含まない。ハイブリダイゼーション条件は、サンプル中に存在していれば、１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブに対応する相補的な核酸配列をアニールさせるには十分であり、二本鎖核酸ハイブリッドが形成される。

本明細書で記載した、特定のプローブおよび希釈液に適当なハイブリダイゼーション条件が利用される。例えば、プローブおよびサンプル核酸を、あるハイブリダイゼーション時間でインキュベートすることができる。好ましくは、少なくとも約５〜約３０分、約５〜約２０分、約７〜約１５分、または約１０分、ならびに１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブを、対応する相補的な核酸配列とアニールさせるには十分な、列挙した範囲内の任意の数値である。ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６５℃、約６８．５℃、および約６７〜約７０℃、ならびに列挙した範囲内の任意の数値のハイブリダイゼーション温度を含むことができる。所与の標的核酸およびプローブについて、当業者は日常の実験により、所望のハイブリダイゼーション条件を簡単に決定することができる。当業者はさらに、ハイブリダイゼーションの時間および温度を、他方に対して最適化されなければならないことを十分に理解している。したがって、より高いハイブリダイゼーション温度であれば、より短時間で行うことができる。逆も同様である。限定されないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、温度を上昇させること、イオン状態を０．５Ｍ（例えば、ＮａＣｌ）よりあげること、またはＰＡＡの濃度を減少させることにより調節できる。限定されない例としては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６５℃、少なくとも約６８．５℃、約６７〜約７０℃、約６９〜約７０℃などの高温でハイブリダイゼーション反応を実行することを含んでよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６５℃、少なくとも約６８．５℃、約６７〜約７０℃などの高温も含んでもよい。

限定されない態様において、プローブは、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、高リスク型ＨＰＶのＨＰＶ ＤＮＡ、もしくは高リスク型ＨＰＶのＨＰＶ ＲＮＡ、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２型のうちのいずれか１つ、または低リスク型ＨＰＶである６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３型のうちのいずれか１つと関連する核酸分子に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である核酸分子をハイブリダイゼーションするか、または結合することができる。別の態様において、プローブは、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、高リスク型ＨＰＶのＨＰＶ ＤＮＡ、高リスク型ＨＰＶのＨＰＶ ＲＮＡ、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２型のうちのいずれか１つ、または低リスク型ＨＰＶである６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３型のうちのいずれか１つに対して、相補的である。

１つの態様において、サンプルを界面活性剤ベースの回収保存液に懸濁し、標的核酸を変性試薬で変性し、中和緩衝液中に懸濁された核酸プローブをハイブリダイズする。別の態様において、中和緩衝液は、本発明のプローブ希釈液である。プローブ希釈液は、２．２ＭのＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、２．６％のポリアクリル酸、０．７ＮのＮａＯＨ、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含むことができる。

捕捉
プローブを標的核酸分子とハイブリダイズさせ、二本鎖核酸ハイブリッドを形成させた後、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子によって、ハイブリッドを捕捉する。二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子には、これに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、限定されないが、ＲＮＡｓｅＨなどのタンパク、限定されないが、アプタマーを含む核酸、または配列特異的核酸などが挙げられる。アプタマーは、標的とハイブリダイズすること、ハイブリダイズしたアプタマーを増幅すること、および選択処理を繰り返すことにより、配列ライブラリから連続的に選択される無作為配列の短鎖である。１つの態様において、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子は、抗ハイブリッド抗体として知られる抗体により捕捉される。

１つの態様において、当業者に一般的である技術を用いて、第一の抗ハイブリッド抗体を支持体に固定する。適当な支持体の例は、共有結合または吸着を含む。例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質Ｇビーズ、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、カルボキシル基またはトシル基などに結合するＥＤＡＣなどがある。あるいは、例えばアフィニティカラム中の配列特異的核酸を用いて固体支持体に直接ハイブリダイズする。

支持体には、これに限定されないが、ビーズ、以前に示したように、常磁性、反磁性、強磁性、強磁性、および反磁性ビーズを含む磁性ビーズ、カラム、プレート、ろ紙、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、および試験紙などがある。液相の抽出をさせ、結合した抗体および結合していない抗体を分離する能力を提供する能力さえあれば、任意の支持体を使用することができる。磁性ビーズは、溶液中に放置することができる点で特に有益であり、磁場がビーズを固定するために利用されていれば、液相を抽出するか、または移すことができる。直径で約１μｍのビーズなど、小さく、高表面積を有するビーズが好ましい。（磁場に対して）スイッチング電荷またはシリカによる捕捉を利用する他のビーズも、使用することができる。

ハイブリッドを、支持体に付着させた抗ハイブリッド抗体と、十分な時間インキュベートして、固定した抗ハイブリッド抗体による二本鎖核酸ハイブリッドの捕捉を可能にする。１つの態様において、支持体はビーズである。

抗ハイブリッド抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でよい。１つの態様において、抗体はモノクローナルである。１つの態様において、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）結合剤により、抗体を支持体と結合する。１つの態様において、支持体はポリスチレンビーズである。１つの態様において、抗体に結合した支持体またはビーズは、ビーズ希釈緩衝液で希釈される。ビーズ希釈緩衝液は、ビーズ上のタンパク質変性を最小限にするのに役立つ。ビーズ希釈緩衝液の１つの例は、６％のカゼイン、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含む。

１つの態様において、抗ハイブリッド抗体でコーティングされたビーズを、約３０分間、約６７〜約７０℃でサンプルとインキュベートする。別の態様において、ビーズおよびサンプルを、約３０分間、約６８〜約６９℃でインキュベートする。さらに別の態様において、ビーズおよびサンプルを、３０分間、約６８．５℃でインキュベートする。インキュベーションの時間は約５〜約６０分、約１５〜約４５分、約２０〜約４０分、または列挙した範囲内の任意の数値でよく、通常、温度に反比例する。インキュベーション時間、温度、および／または振とう条件は、選択する所望の捕捉反応速度を得るために変更できることは、当業者により理解されるであろう。

上記のように、標的核酸／プローブハイブリッドの捕捉のあと、捕捉されていない核酸を洗い流すことにより、捕捉されたハイブリッドを残りのサンプルから分離できる。

結合体化
この方法の別の工程は、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的であるか、あるいは第一の抗体に特異的である、第二の抗体を提供することを含むことができる。第二の抗体は、直接または間接的に、検出可能な程度に標識されていることができ、モノクローナルまたはポリクローナル抗体でよい。１つの態様において、第二の抗体はモノクローナルである。別の態様において、第二の抗体は検出可能なマーカーで直接標識されており、モノクローナルである。第二の抗体は二本鎖核酸ハイブリッドの存在を検出するのに使用される。１つの態様において、第二の抗体は、検出することができるシグナルを提供する、基質と反応する必要がある標識を有する。第二の抗体を、適当な緩衝液に溶解してよい。１つの態様において、緩衝液は１００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＺｎＣｌ_２、１．０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２５％のツイーン２０、０．２ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ、４％のヒドロキシプロピル−ｂ−シクロデキストリン（シクロデキストリン）、前に論じたように、３０％のビーズ希釈緩衝液、０．０５％のヤギＩｇＧ、０．０５％のアジ化ナトリウムを含む。

１つの態様において、結合体化反応は室温で行われる。１つの態様において、結合体化反応は、約１〜２時間、室温で行われる。別の態様において、結合体化反応は約２時間、室温で行われる。別の態様において、結合体化反応は、約３７℃、約４５℃、または約５０℃で行われる。１つの態様において、結合体化反応は、約２０〜約４０分間、約３７℃、約４５℃、または約５０℃、３５〜約４０℃、４０〜約５０℃で行われる。１つの態様において、結合体化反応は、約３７℃、約４５℃、または約５０℃で約２０〜４０分間行われる。別の態様において、結合体化反応は約３０分間、約４５℃で行われる。

任意の検出可能な標識は、例えば、これに限定されないが、酵素、放射性分子、蛍光分子、または金粒子などの金属粒子を使用できることは、当業者により理解されるであろう。ある種の態様において、検出可能な標識はアルカリホスファターゼである。標識を抗体に結合体化する方法は、公知である。例えば、一価抗体の断片を生成するため、抗体をジチオトレイトール（ＤＴＴ）で還元することができる。その後、還元された抗体を、マレイン化されたアルカリホスファターゼに直接結合体化することができ、この方法はＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ４：２０９〜２３７（１９８３）およびＭｅａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｍ．１：２〜１２（１９９０）により、それぞれの内容はその全体を参照により本明細書に組み込む。結果として生じる結合体を、ＨＰＬＣで精製することができる。サイズ排除クロマトグラフィの任意の型を用いて、結合体を精製してもよい。精製の１つの効果は、１つのタンパク質と１つの抗体の結合体を、タンパク質と抗体の他の比率を有する結合体から分離できることである。

別の態様において、二本鎖核酸ハイブリッドを、直接標識されていない第二の抗ハイブリッド抗体で検出することができる。例えば、第二の抗体は、標識されたヤギ抗マウス抗体により検出されるマウス免疫グロブリンであってよい。

洗浄
第二の抗体との結合体化に続いて、サンプルを塩基性の洗浄緩衝液で洗浄する。洗浄緩衝液は、１種または複数種の界面活性剤を含んでよく、界面活性剤を含まない場合もある。洗浄緩衝液が界面活性剤を含有する場合、界面活性剤はイオン性または非イオン性界面活性剤でよい。非イオン性界面活性剤の１つの例はＴｒｉｔｏｎ−Ｘである。界面活性剤は、洗浄緩衝液中に、約０．０５〜約１．５％、約０．０７５〜約１．０％、約０．１〜約０．７５％、または約０．５％、あるいは、列挙した範囲内の任意の数値の濃度で存在してもよい。適当な洗浄緩衝液の１つの例は、４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．２、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含む。

サンプルを、洗浄緩衝液を用いて、１〜１０回、３〜７回、４〜６回、または５回、あるいは列挙された範囲内の数値の回数分、洗浄してよい。また、サンプルを、単一の洗浄緩衝液または複数の洗浄緩衝液を用いて洗浄することができる。各洗浄は、同じ洗浄緩衝液または異なる洗浄緩衝液を使用してよい。例えば、界面活性剤含有の洗浄緩衝液は、１回の洗浄に使用することができ、一方、界面活性剤を含まない洗浄緩衝液は、別の洗浄に使うことができる。１つの態様において、洗浄緩衝液の１つは、Ｔｒｉｔｏｎを含まない。

界面活性剤含有洗浄緩衝液の１つの利点は、界面活性剤を含まない洗浄緩衝液と比較して、ビーズの挙動に対する優良な効果である。界面活性剤含有洗浄緩衝液は、磁場へのビーズの迅速、効果的、および弾性のある結合を可能にする。物理的に倒置および傾瀉させても、ビーズが結合したままであるほど、磁場へのビーズの結合は十分強い。一般に、界面活性剤を含まない洗浄緩衝液は、ビーズの損失なく物理的倒置を可能にすることはないが、他の目的で使用できる。界面活性剤を含まない洗浄緩衝液の使用例とは、サンプル中の界面活性剤の除去または希釈であり、これによって、起こりうる検出時の問題を減少させる。

検出
第二の抗体、または第三の抗体、またはさらなる抗体に存在する標識は、標的核酸分子の存在を示すために検出される。様々な標識を検出する方法は、当技術分野で公知である。例えば、比色分析、放射能による方法、表面プラズモン共鳴、化学発光法は、例えば、Ｃｏｕｔｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：１００２〜１００７（１９８９）に述べられており、その内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。

例えば、結合したアルカリホスファターゼ結合体を、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ５３０試薬（Ｌｕｍｉｇｅｎ、デトロイト、ミシガン州）、またはＤＲ２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）などの試薬を用いて、Ｅ／ＬＵＭＩＮＡルミノメーター（Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、ガーデングローブ、カリフォルニア州）、ＯＰＴＯＣＯＭＰＩＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＭＧＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ハムデン、コネチカット州）、または同様のもの、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒなどの検出器を使用して、化学発光を検出することができる。複数の検出技術も、順番にまたは並行して使用することができる。例えば、結合体を、化学発光および蛍光発光により検出することができる。別の態様において、結合体を化学発光により検出することができる。

結合体の様々な検出技法を利用する検出器は、サンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法を実行することができる機械に、例えばモジュール方式によって、可逆的または不可逆的に取り付けられている場合がある。

本明細書で述べたように、第二の抗体の標識の検出は、１つまたは複数のプローブに相補的な、サンプル中の１つまたは複数の標的核酸分子の存在を示す。洗浄に続いて、例えば、第二の抗体の標識に対する基質を含む、検出緩衝液にサンプルを懸濁する。

１つの態様において、サンプルは子宮頸部細胞を含む。子宮頸部細胞のサンプル中の標的核酸分子の存在を判定する方法は、界面活性剤ベースの回収保存液でサンプルを懸濁する工程、および手動で混合する工程を含む。別の態様において、混合は機械による。サンプルのおおよそ５０μｌのアリコートを取り出し、約２５μｌの変性試薬と混合する。サンプルを手動で混合するか、または約３０〜約６０秒間、約６００〜約１２００ｒｐｍで機械的に振とうし、約３０分間、約７０℃で加熱する。高リスク型ＨＰＶのＲＮＡプローブを希釈液中に調製し、約３７５ｎｇ／ｍｌにまで希釈する。７０℃のヒーティングブロック上で、希釈したプローブの約４０μｌをサンプルに添加する。サンプルを、約６８．５℃で、約１１５０ｒｐｍ、約３０分間、さらに振とう培養する。上清をドロッパーボトルまたはその他のローテク器具で取り除くことができる。約３５μｌの検出試薬をサンプルに添加する。検出試薬は、標識された第二の抗体を含む。第二の抗体は二本鎖核酸ハイブリッドに特異的である。検出試薬を含むサンプルを、約４５℃、約３０分間インキュベートし、約３０秒〜３分間、磁性の台に静置し、上清を傾瀉する。別の態様において、検出試薬を含むサンプルは、室温でインキュベートされる。その後、約４〜５回、洗浄緩衝液でサンプルを洗浄する。

抗ハイブリッド抗体
二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な抗体を用いて、本発明に従って形成された二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉および検出することができる。該抗体は、これらに限定されないが、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡおよびその模倣体などの二本鎖ハイブリッドに対して特異的であり、模倣体とは、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと同様に作用する分子を言う。抗二本鎖核酸ハイブリッド抗体、すなわち利用される抗ハイブリッド抗体は、形成される二本鎖核酸ハイブリッドのタイプに依存する。１つの態様において、抗ハイブリッド抗体は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに免疫特異的である。

ポリクローナルまたはモノクローナル抗ハイブリッド抗体のどちらかが、以下に記述する通り、本アッセイにおいて、使用できる、および／またはビーズに結合できる、および／または支持体に固定できることは、当業者により理解されるであろう。ポリクローナル抗体の代わりに、一般的な技術を用いて調製されたモノクローナル抗体を使用することができる。モノクローナル抗体は、当技術分野で一般的な方法により作成することができる。１つの態様において、標的核酸の捕捉および検出に使用される抗体は、モノクローナル抗体である。１つの態様において、モノクローナル抗体は、捕捉工程の間に非常に厳密なインキュベーション温度を維持する。限定されないが、捕捉工程の間の非常に厳密なインキュベーション温度は、約６５〜約７５℃または約６８〜約７５℃でよい。第一の抗体および第二の抗体は、捕捉と検出のため同じでも（つまり、同じハイブリッドミエローマ細胞株により作成された）、または異なってもよく、様々なハイブリッドミエローマ細胞株により作成することができる。１つの態様において、捕捉および／または検出に使用される第一のモノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体は同じであり、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して特異的である。また、二本鎖ハイブリッドに対して特異的な抗体の免疫断片または誘導体も含まれ、かかる断片または誘導体は抗体の結合領域を含有する。

例えば、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを用いて免疫された、脾臓細胞と結合したミエローマ細胞由来のモノクローナル抗ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド抗体を、使用することができる。固体支持体に固定されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対するアフィニティ精製により、ハイブリッド特異的抗体を精製することができ、これは例えば、Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９：４１３（１９８２）および米国特許第４，７３２，８４７号に記載されている通りであり、各内容は、その全体を参照として本明細書に組み込む。

ヒト抗体または人工抗体を含む抗体を生成または単離するその他の適当な方法を使用することができ、これは例えば、ライブラリから、組換え型抗体（例えば、一本鎖Ｆ_ｖまたはＦ_ａｂ、あるいはそのその他の断片）を選択する方法、またはヒト抗体のレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（ネズミなど）の免疫に頼る方法（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、および米国特許第５，５４５，８０７号を参照のこと。それぞれの内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む）などである。

１つの態様において、検出される標的核酸分子はＤＮＡ（例えば、ＨＰＶゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ヘテロ核ＲＮＡ）であり、１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブはそれぞれ、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドである。好ましい態様において、二本鎖核酸ハイブリッドは、標的ＤＮＡおよびプローブＲＮＡのハイブリダイゼーションにより形成されるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して免疫特異的である抗体を用いて検出することができる。

本発明の態様において、ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナル抗ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド抗体を使用する。このようなハイブリドーマ細胞株は米国特許第４，８６５，９８０号、米国特許第４，７３２，８４７号、および米国特許第４，７４３，５３５号に記載され、それぞれの内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。ハイブリッド特異的モノクローナル抗体を、当技術分野で一般的な技法を使用して、調製することができる。ハイブリッド特異的モノクローナル抗体は、標的核酸の捕捉および検出の両方で、使用することができる。

任意の脊椎動物を、ポリクローナル抗ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド抗体の調製に使用してよいが、ヤギまたはウサギが好ましい。好ましくは、従来の注射手順に従って、ハイブリッドを動物に注入することにより、ヤギまたはウサギを合成ポリ（Ａ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドで免疫化する。周知の抗体単離技術に従って、免疫した動物種に特異的な抗体を使用し、動物の血液からポリクローナル抗体を回収し精製する。モノクローナル抗体の生成について、十分な時間をおいてから脾臓を動物から取り出し、脾細胞を適当なミエローマ細胞と結合させハイブリドーマを生成できる。その後、抗ハイブリッド抗体の分泌する能力について、ハイブリドーマをスクリーニングすることができる。選択されたハイブリドーマを、腹水生成のため、もう１つの動物の腹膜腔に注入するのに使用することができ、これは参照により本明細書に組み込んだ、所望のモノクローナル抗体の富んだソースとして抽出され、使用することができる。

ポリヌクレオチドプローブ
ポリヌクレオチドプローブは、標的核酸分子とハイブリダイズまたは結合するように設計される。別の態様において、ポリヌクレオチドプローブは、標的核酸分子と結合するように設計される。１つの態様において、プローブはＨＰＶおよび高リスク型ＨＰＶ変異体とハイブリダイズまたは結合することができる。追加の態様において、ポリヌクレオチドプローブは、ＨＰＶおよび高リスク型ＨＰＶ変異体に特異的である。高リスク（ＨＲ）核酸プローブは、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２型に対するプローブを含んでよい。別の態様において、ＲＮＡまたはＤＮＡプローブは断片である。１つの態様において、プローブは約６〜約８キロベースの長さであり、約７．５キロベースが好ましく、プラスミドテンプレートおよびＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターを用いて生成することができる。しかしながら、その他のプラスミド、ベクター、および方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載された、ＲＮＡプローブを生成するのに使用し得る。

プローブは、アッセイ１回あたりＨＰＶ型１つにつき、約７．５〜約６０ｎｇ、またはアッセイ１回あたりＨＰＶ型１つにつき、約２０〜約４５ｎｇの量で変動することがあり、あるいはアッセイにつき各ＨＰＶ型に対するプローブの約３０ｎｇを使用する。したがって、１つの態様において、ＨＲプローブは、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２型に対するプローブ、または低リスク型ＨＰＶである６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３型に対するプローブのうち、１つまたは複数からなる、または本質的にからなる。アッセイによって、各プローブの約３０ｎｇが、標的核酸分子の検出に使用される。

ＲＮＡプローブは、標的核酸分子にのみ特異的に結合する、短鎖合成ＲＮＡプローブでよい。その例は、２００９年４月１７日に出願の、米国特許出願第１２／４２６，０７６号に記載され、内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。

交差反応性
また、本発明は、アッセイ組成物、プローブ、および条件を提供する。ＨＰＶ ＨＲプローブセットおよび低リスク型ＨＰＶの交差反応性は、標準のＦＤＡに認可されたＨＰＶアッセイおよびプローブセットと比較して、劇的に減少する。１つの態様において、ＨＰＶ ＨＲプローブセットは、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２型、または低リスク型ＨＰＶである６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３型からなる群から選択される。これらのＨＲ ＨＰＶプローブと共に、本アッセイを用いると、低リスク型ＨＰＶおよび高リスク型ＨＰＶプローブ間の交差反応性は減少する。例えば、米国特許出願第１２／４２６，０７６号を参照のこと。

本発明はまた、約２時間以下、約２時間半以下、約３時間以下、約３時間半以下、約４時間以下、約５時間以下、約６時間以下、約７時間以下、約８時間以下、約１２時間以下、約２４時間以下で、サンプル中のＨＰＶなどの標的核酸分子の存在を判定するための方法も提供し、他の態様においては、上記の方法を用いて少なくとも１０サンプルについて約３時間半以下である。ＨＰＶまたは他の標的核酸分子の存在を短時間で判定できることの１つの理由は、この方法が検出前に標的核酸分子の増幅を行わないためである。標的の増幅の代わりに、シグナル増幅を、ＨＰＶまたは他の標的核酸分子の存在を正確に検出するのに使用することができる。１つの態様において、この開示の方法は、シグナル増幅工程を含んでよい。１つの態様において、この開示の方法は、標的増幅工程を含まない。別の態様において、この開示の方法は、シグナル増幅工程を含み、標的増幅工程は含まない。

また、本開示は、サンプル中のＨＰＶなどの標的核酸分子の存在を検出することによって、約２時間以下、約２時間半以下、約３時間以下、約３時間半以下、約４時間以下、約５時間以下、約６時間以下、約７時間以下、約８時間以下、約１２時間以下、約２４時間以下で、子宮頸癌などの癌を検出する方法およびアッセイを提供し、他の態様においては、上記の方法およびアッセイを用いて少なくとも１０サンプルについて約３時間半以下である。

多くのプラットホーム、これに限定されないが、チューブ、試験紙、マイクロアレイ、マイクロプレート、３８４ウェルプレート、他のマイクロタイタープレート、マイクロ流体システムなどで本発明を実施できることは、当業者により理解されるであろう。開発途上国に適切なように、液体の移動を伴う工程用にドロッパーボトル、ゴム球、パスツールピペット、または噴出瓶など、低技術の方法を使用できることは、当業者に理解されるだろう。これらの器具は、アッセイに必要とされるおおよその範囲内の比較的正確な容量を供給する。１つの態様において、本開示の方法は、自動ピペット、または他の電池で動く、もしくはエネルギーで動くピペット装置を含まない。

本発明の別の態様は、標的核酸を含むサンプルが回収される回収保存液を提供する。回収保存液は、数日、数週間、または数カ月間の、サンプルの安定性を提供する。例えば、回収保存液は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５ケ月、少なくとも６カ月、約１〜約４週間、約１〜３カ月、約３〜約４カ月、約３〜約６カ月間のサンプルの安定性を提供する。別の態様において、回収保存液は、少なくとも２１日間にわたり３３℃で、または少なくとも６カ月間にわたり２０℃でサンプルの安定性を提供する。１つの態様においては、上記のサンプルは、子宮頸部細胞サンプルまたはヒト子宮頸部細胞サンプルである。適当な回収保存液は、本明細書で述べられる。ある態様において、回収保存液は、ＮＰ−４０、デオキシコール酸、トリス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、およびアジ化ナトリウムを含む、からなる、または本質的にからなる。他の態様において、回収保存液は１．０％のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含む、からなる、または本質的にからなる。

別の態様は、４０ｍＭのトリスｐＨ８．２、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１〜０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含む、かならる、または本質的にからなる、界面活性剤を含有する洗浄緩衝液である。さらに別の態様は、４０ｍＭのトリスｐＨ８．２、１００ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含む、からなる、本質的にからなる、界面活性剤を含まない洗浄緩衝液である。

核酸分子の回収、検出および解析用のサンプル変換
ある態様は、あらかじめ診断解析用に調製されていたサンプルに、回収保存液を添加することに関する。１つの態様において、回収保存液が添加されるサンプルは、あらかじめ液状化細胞診（ＬＢＣ）アッセイを使用して、調製されていた。ＬＢＣ保存液は、アルコールおよびホルマリンなど、組織固定剤を含み、これは、サンプルを安定化し、細菌の成長を阻害し、細胞形態および診断クラスタを保存し、組織の単層細胞診スライドの調製を確保する。しかしながら、ＳＵＲＥＰＡＴＨなど生物学的サンプルを保存するために使われる多くの組成物は、解析する核酸分子に有害となるアルコールまたはホルマリンを含む。１つの態様において、細胞診スライドは、子宮頸部細胞サンプルまたは評価対象となる、その他の生物学的サンプルを含む。１つの態様において、ＳＵＲＥＰＡＴＨ保存液を、ＬＢＣサンプルの調製に使用する。

細胞診調製に加えて、ＬＢＣサンプルを、数ある中でも、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、淋菌（ＧＣ）、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）を含む、一般的な性感染症病原体などの疾患の検出に使用することができる。スクリーニングツールとしての利用を補うため、ＬＢＣサンプルを特定疾患の治療後、患者のウイルスクリアランスをモニターするために使用することができ、さらなる追跡調査および治療計画に通知する。１つの態様において、ＬＢＣサンプルのＨＰＶ検査を、子宮頸部疾患治療後の患者のウイルスクリアランスをモニターするために使用することができる。

１つの態様において、生物学的サンプルは、ＳＵＲＥＰＡＴＨ保存液などの保存液で回収および保存される。生物学的サンプルを含む保存保存液は、さらなる処理が必要となるまで、保存される。生物学的サンプルを含む保存保存液を、取り出して水に懸濁することができ、これによって「ソフトペレット」を形成する。ソフトペレットの一部を取り除き、スライド上で解析してもよい。１つの態様において、サンプルをＬＣＢアッセイを用いて調製する。ＳＵＲＥＰＡＴＨなど、より多くの保存保存液を残りのソフトペレット懸濁液に添加するかわりに、本明細書で記載する界面活性剤ベースの回収保存液を、残りの生物学的サンプルに添加してもよい。本明細書で記載する界面活性剤ベースの回収保存液に分散させたサンプルを、核酸分子の検出アッセイによって、直接解析することができる。さらに、界面活性剤ベースの回収保存液に懸濁させた、生物学的サンプルは、室温で、少なくとも１１日間安定である（図６）。

任意の開示された界面活性剤ベースの回収保存液を、ソフトペレットに添加することができる。別の態様において、界面活性剤およびキレート剤の保存液を、ペレットを再可溶化するために使用してもよい。限定されない態様において、約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む回収保存液を、ソフトペレットを可溶化するために使用してもよい。界面活性剤ベースの回収保存液の添加後、本明細書で記載した方法またはアッセイのいずれかと併せて、ソフトペレットサンプルを解析してもよい。

キット
提供したように、サンプル中の標的核酸分子の検出用キットは、
ａ）回収保存液と、
ｂ）変性試薬と、
ｃ）少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブと、
ｄ）第一の抗ハイブリッド抗体でコーティングされたビーズと、
ｅ）検出可能な程度に標識された第二の抗ポリハイブリッド抗体を含む、検出試薬と、
ｆ）洗浄緩衝液と、
ｇ）第二の抗体の標識に対する基質を含む第２検出試薬と
を含む、からなる、または本質的にからなる。

回収保存液、変性試薬、ビーズ、第一の抗体および第二の抗体、ポリヌクレオチドプローブ、検出試薬、および洗浄緩衝液は、これまでに述べてきた。

また、このキットは開示した方法およびアッセイに関連する、記述した手順の取扱説明書を含む。このキットは、患者情報を書き記す手段も含む。１つの態様において、この手段には、紙、コンピュータ、または患者情報を送信することができる装置が含まれる。このキットは、患者のサンプルを採取する同じ場所で、この方法を完了するのに必要な要素をすべて含むことができる。

１つの態様において、キットは検出アッセイに関連する色分けされた試薬を含んでよい。この試薬バイアルは、使いやすいように色分けされ、キットに同封してもよい。また、試薬ボトルを、記号、文字、またはその他の公知の識別子により、同定してもよい。

キットの個々の要素は使いやすいプラットホームにまとめられているため、本明細書で記載したキットの１つの利点は、サンプルの即時試験を提供することである。これは、患者の結果を迅速に判定することを可能にする。

１つの態様において、開示の方法は、その現場で患者サンプルを回収および処理する工程を含んでよい。１つの態様において、サンプルを回収した後、患者のサンプルを回収した同じ場所で、一部の工程を行う。別の態様において、サンプルを回収した同じ場所で、方法の全工程を行うことができる。患者が健康診断および評価を受けるその場所は、村、診療所、研究室、または地域社会の地区かもしれない。その場所は、常設かも、一次的かもしれない。１つの態様において、核酸分子は、サンプルを採取する場所から離れていない、研究室または診療所などの場所で検出される。１つの態様において、キットは開発途上国または医療が簡単に行きとどかない場所での使用に指定される。

システム
１つの態様において、サンプル中の標的核酸分子の存在を検出する携帯用システムを用いて、サンプルを解析してもよい。この携帯用システムは、複数のサンプルを加熱するために構成されたヒーターと、第一の抗体でコーティングされた支持体上にあり、かつ検出可能なマーカーで標識された第二の抗体に結合体化された、標的核酸分子の化学発光を検出するように構成されたルミノメーターと、化学発光データ（図７）を記録するように構成されたモニターを含んでよい。１つの態様において、ヒーターはヒーターと攪拌機を組み合わせたものである。１つの態様において、システムは、１回に９０サンプルと６コントロール（全部で９６サンプル）を、同時に解析するように設計される。１つの態様において、ルミノメーターおよびヒーターはともに、１回に９０サンプルと６コントロール（全部で９６サンプル）を同時に解析するように設計される。また、システムは１回に少なくとも５００サンプルの結果を記録することができる。携帯用システムおよび関連試薬は、図６、図７、図８に記載されている。

限定されないが、携帯用システムの個々の要素は、医者または研究室の技術者などが、個別に簡単に運ぶことができ、重量は１０ポンド未満、２０ポンド未満、３０ポンド未満、または４０ポンド未満である。別の態様において、標的核酸分子を検出する携帯用システムの全体の重さは、２０ポンド未満、３０ポンド未満、４０ポンド未満、５０ポンド未満、１００ポンド未満であり、簡単に運べるように設計されている。

携帯用システムおよびアッセイは、サンプルを採取した現場またはその地域での使用のために設計され、必要とされる卓上での占有面積は小さい（例えば、約２５ｘ５０ｃｍまたはそれ以下）。１つの態様において、携帯用システムは、電気、電源または流水がなくても動くように設計される。また、携帯用システムを、電池で完全に動かすことができる。本明細書に記述した方法を用いて、記述したキット、アッセイと使用するため、携帯用システムを設計することができる。まとめると、キットおよび携帯用システムは、開発途上国、または実験室サンプルを解析する最新式の研究室装置もしくは施設が不足している他の地域で、サンプルを解析し、核酸サンプルを検出する、効率的で迅速な方法を提供する。

範囲が本明細書に記載されているとき、範囲内の任意の数値は、本明細書に記載の発明に企図されることに注意する。記載したすべての特許、特許出願、科学出版物などの全内容は、参照によりその全体をここに組み込む。以下の実施例は、本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１：子宮頸部サンプルおよびＨＰＶプローブを用いるアッセイ
医者により回収された、計３２４個の子宮頸部サンプルは、界面活性剤ベースの回収保存液で回収され、高リスク型ＨＰＶの存在を検査した。

１ｍｌのサンプルをボルテックスして、サンプルを均質にし、５０μｌのアリコートを取り出し、アッセイ用マイクロプレートで２５μｌの変性試薬（１．７５ＮのＮａＯＨ）と合わせた。これを撹拌して混合し、７０℃で３０分間インキュベートして、一本鎖ＤＮＡを生成した。これに、１６型ＨＰＶのＲＮＡプローブを含む４０μｌの中和緩衝剤（プローブ希釈液−２．２ＭのＢＥＳ、２．６％のＰＡＡ、０．７ＮのＮａＯＨ、および０．０５％のアジ化ナトリウム）を添加して、中性ｐＨにし、６８．５℃で１０分間、インキュベートした。

この次に、１０μｌの抗体が結合体化された常磁性ビーズ（約１μｍのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒのカルボキシル化されたＳＥＲＡＤＹＮビーズ）を反応に添加し、さらに３０分間、６８．５℃でインキュベートした。互いに相補的なＲＮＡプローブおよびＤＮＡ標的分子は結合して、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成する。その後、このハイブリッドは、常磁性ＳＥＲＡＤＹＮビーズにコーティングされた、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド特異的抗体により捕捉される。

インキュベーションに続いて、磁場に曝露することで、液相／上清から常磁性ビーズを分離させる。上清のごみを、傾瀉によって取り除き、３５μｌの検出試薬１（アルカリホスファターゼと結合体化されたモノクローナル抗ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド抗体を含む、酵素と結合体化された第二の抗体）を添加して、４５℃で３０分間インキュベートする。第二の抗体が、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド−抗体結合体化常磁性ビーズ複合体に結合する。結合していない第二の抗体は、界面活性剤ベースの洗浄緩衝液（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．２、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、および０．０５％のアジ化ナトリウム）を用いて、洗い流される。

基質（ＤＣＰ Ｓｔａｒと呼ばれるＡＢＩのジオキセタンベースの基質、Ｅｍｅｒａｌｄ ＩＩ ｅｎｈａｎｃｅｒと一緒に）を洗浄したビーズおよびウェルに添加し、これらが有する高リスク型ＨＰＶのＤＮＡが生成する、ルミノメーターにより検出可能な光を、ＲＬＵ（相対発光量）について測定する。１ｐｇ／ｍｌのＨＰＶ ＤＮＡを含有するアッセイのポジティブスタンダードを使用して、ポジティブカットオフ値を規定する。全サンプルのＲＬＵ値は、ポジティブスタンダードが生成するＲＬＵ／ＣＯ（カットオフ値に対するＲＬＵ）について、ＲＬＵ値で分割する。結果はＲＬＵ／ＣＯで記録され、１．０より大きいまたは等しいものは、陽性と見なされる。

実施例２：安定性試験
最初の試験に続いて、サンプルの安定性を観察するため、サンプルを室温および３３℃で保存した。試験は、回収後２１日間の範囲で行った。図３および４は、各サンプルのＲＬＵ／ＣＯ値が２１日までの期間で変化しないことを示す。基準となる結果を、２１日間の保存後の結果と比較する２ｘ２解析、および散布図解析は、経時的にＲＬＵ／ＣＯ値の線形性を示した。これらのデータをもとに、２１日間の範囲で、室温と３３℃のどちらかで回収および保存されたサンプルが、ベースラインに匹敵するＲＬＵ／ＣＯ値を提供すると結論付けることができる。線形混合モデルを使用して、保存温度に対するＲＬＵ／ＣＯ値を比較すると、Ｐ値は室温で０．８８０３であり、サンプルを３３℃で保存すると、０．９５１７であり、これは等しい値を示す。

実施例３：検出限界研究
１６型ＨＰＶの検出限界（ＬＯＤ）は、回収保存液中のＨＰＶ−１６型プラスミド標的の連続希釈法により測定した。試験結果は、ＨＰＶ１６型ＤＮＡの１０００コピーと同等である０．２ｐｇ／ｍｌのＨＰＶ１６型プラスミドについて、Ｓ／Ｎ≧２．０を示す。図５を参照のこと。さらに、３週間の安定性研究を、ルワンダなど、比較的高温の影響下にある地域の条件に近付けるため、高温で臨床試料について実施した。すべての生物学的に変化しやすいキットの要素（ＲＮＡプローブ、捕捉抗体、検出抗体−酵素結合体、および基質）は、生成過程の一環で安定であり、３７℃で１８カ月超の安定性を観測した。

実施例４：ＳＵＲＥＰＡＴＨペレット変換および核酸の回収
この実施例において、ＳＵＲＥＰＡＴＨペレット変換および核酸回収に関する典型的なワークフローを記述する。ＳＵＲＥＰＡＴＨ保存液のワークフローは、最初のサンプルの初めの回収を含み、これは移行部またはサンプル回収点での子宮頸部上皮細胞の回収に使用されるサイトブラシでよい。ブラシにつき、平均２Ｘ１０＾８の子宮頸部細胞を回収し、これを回収バイアル中の１０ｍｌのＳＵＲＥＰＡＴＨ保存液で保存することができる。バイアルは封をすることができ、さらに処理を行うまで、室温または４℃で、固定保存液で細胞をインキュベートした。その後、細胞懸濁液を自動密度勾配精製スキームの影響下におき、平均総細胞数が１．６Ｘ１０^１＾８細胞である、得られた細胞ペレットを、最終液量を１ｍｌとして、水で懸濁することができる。この水ペレットを「ソフトペレット」または「希釈されていないソフトペレット」と呼ぶ。

２００μＬのソフトペレットを、細胞診のための自動スライド調製プロトコールに使用することができ、８００μＬに平均総細胞数１．３Ｘ１０＾８を残している。スライド調製用に２００アリコートを取り出し、１〜２ｍＬの新鮮なＳＵＲＥＰＡＴＨ保存液を、残りの８００μＬのソフトペレットに添加して、スライドを作り直さなければならない場合に備えて、ソフトペレットを安定化、保存する。ほとんどの場合、この残りの２〜３ｍＬのサンプルは、細胞診の結果を記録した後に破壊される。

本明細書に記述した界面活性剤ベースの保存液を、残りの８００μＬのソフトペレットに添加することができる。本明細書に記述した界面活性剤ベースの回収保存液のいずれかを、残りの８００μＬのソフトペレットに添加することができる。１つの態様において、この保存液は、１．０％のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含むことができる。界面活性剤ベースの回収保存液の添加後、ソフトペレットサンプルを、本明細書で記載した方法またはアッセイのいずれかと併せて、解析することができる。

さらなる態様は、標的核酸分子を含むサンプルが回収される回収保存液中の試薬に関する。数週間または数カ月にわたって、標的核酸分子の分解が最低限である状態で、標的核酸分子をこの回収保存液に保持することができる。１つの態様において、数週間または数カ月にわたって、標的核酸分子の分解が最低限である状態で、ＤＮＡベースの標的サンプル物質をこの回収保存液に保持することができる。１つの態様において、界面活性剤ベースの回収保存液は、迅速なサンプルの分析および処理を可能にする。
[本発明1001]
（ａ）少なくとも１種の界面活性剤を含む回収保存液に懸濁された生物学的サンプルと、
（ｂ）変性試薬と、
（ｃ）標的核酸分子に結合することができる、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブと、
（ｄ）第一の抗体でコーティングされた支持体と、
（ｅ）検出可能なマーカーで標識された第二の抗体と
を含む組成物。
[本発明1002]
前記生物学的サンプルが子宮頸部細胞サンプルである、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記回収保存液が、ＮＰ−４０、デオキシコール酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
前記回収保存液が、約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、および約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
前記生物学的サンプルが、３３℃で少なくとも２１日間にわたり前記回収保存液で保存されたときに安定である、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブが、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および８２型に対するプローブからなる群から選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
（ａ）約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、および約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡを含む回収保存液に懸濁された生物学的サンプルと、
（ｂ）ポリヌクレオチドプローブと
を含む組成物。
[本発明1008]
前記回収保存液が約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムをさらに含む、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
前記生物学的サンプルが子宮頸部細胞サンプルである、本発明1007の組成物。
[本発明1010]
前記生物学的サンプルが、３３℃で少なくとも２１日間にわたり前記回収保存液で保存されたときに安定である、本発明1007に記載の組成物。
[本発明1011]
前記生物学的サンプル中の核酸分子が変性している、本発明1007の組成物。
[本発明1012]
（ｃ）第一の抗体でコーティングされた支持体
をさらに含む、本発明1007の組成物。
[本発明1013]
（ｄ）第二の抗体
をさらに含む、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
前記第二の抗体が検出可能なマーカーで標識されている、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
サンプル中の標的核酸分子の検出用キットであって、
ａ）界面活性剤を含む回収保存液と、
ｂ）変性試薬と、
ｃ）第一の抗ハイブリッド抗体でコーティングされた支持体と、
ｄ）検出可能に標識された第二の抗ポリハイブリッド抗体を含む、検出試薬と、
ｅ）界面活性剤ベースの洗浄緩衝液と、
ｆ）前記第二の抗体の標識に対する基質を含む第２検出試薬と
を含むキット。
[本発明1016]
前記回収保存液がＮＰ−４０、デオキシコール酸塩およびＥＤＴＡを含む、本発明1015のキット。
[本発明1017]
前記回収保存液がアジ化ナトリウムをさらに含む、本発明1016のキット。
[本発明1018]
前記界面活性剤ベースの洗浄緩衝液が、約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む、本発明1015のキット。
[本発明1019]
前記界面活性剤ベースの洗浄緩衝液が、約４０ｍＭのトリスｐＨ８．２、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１〜０．５％のＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含む、本発明1015のキット。
[本発明1020]
前記希釈液が、ＢＥＳ、ポリアクリル酸、ＮａＯＨおよびアジ化ナトリウムを含む、本発明1015のキット。
[本発明1021]
前記変性試薬が１．７５のＮａＯＨである、本発明1015のキット。
[本発明1022]
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびその遺伝的変異体に結合することができる、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブをさらに含む、本発明1015のキット。
[本発明1023]
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブが、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および８２型に対するプローブからなる群から選択される、本発明1022のキット。
[本発明1024]
サンプル中の標的核酸の存在を検出するように構成された装置をさらに含む、本発明1015のキット。
[本発明1025]
システムがルミノメーターである、本発明1024のキット。
[本発明1026]
サンプル中の標的核酸分子の存在を検出するための携帯用システムであって、
（ａ）複数のサンプルを加熱するために構成されたヒーターと、
（ｂ）第一の抗体でコーティングされた支持体上にあり、かつ検出可能なマーカーで標識された第二の抗体に結合体化された標的核酸分子の化学発光を検出するように構成されたルミノメーターと、
（ｃ）化学発光データを記録するように構成されたモニターと
を含む、携帯用システム。

Claims (26)

1. （ａ）少なくとも１種の界面活性剤を含む回収保存液に懸濁された生物学的サンプルと、
   （ｂ）変性試薬と、
   （ｃ）標的核酸分子に結合することができる、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブと、
   （ｄ）第一の抗体でコーティングされた支持体と、
   （ｅ）検出可能なマーカーで標識された第二の抗体と
   を含む組成物。
2. 前記生物学的サンプルが子宮頸部細胞サンプルである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記回収保存液が、ＮＰ−４０、デオキシコール酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記回収保存液が、約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、および約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡを含む、請求項１に記載の組成物。
5. 前記生物学的サンプルが、３３℃で少なくとも２１日間にわたり前記回収保存液で保存されたときに安定である、請求項１に記載の組成物。
6. 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブが、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および８２型に対するプローブからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
7. （ａ）約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、および約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡを含む回収保存液に懸濁された生物学的サンプルと、
   （ｂ）ポリヌクレオチドプローブと
   を含む組成物。
8. 前記回収保存液が約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項７に記載の組成物。
9. 前記生物学的サンプルが子宮頸部細胞サンプルである、請求項７に記載の組成物。
10. 前記生物学的サンプルが、３３℃で少なくとも２１日間にわたり前記回収保存液で保存されたときに安定である、請求項７に記載の組成物。
11. 前記生物学的サンプル中の核酸分子が変性している、請求項７に記載の組成物。
12. （ｃ）第一の抗体でコーティングされた支持体
    をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
13. （ｄ）第二の抗体
    をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記第二の抗体が検出可能なマーカーで標識されている、請求項１３に記載の組成物。
15. サンプル中の標的核酸分子の検出用キットであって、
    ａ）界面活性剤を含む回収保存液と、
    ｂ）変性試薬と、
    ｃ）第一の抗ハイブリッド抗体でコーティングされた支持体と、
    ｄ）検出可能に標識された第二の抗ポリハイブリッド抗体を含む、検出試薬と、
    ｅ）界面活性剤ベースの洗浄緩衝液と、
    ｆ）前記第二の抗体の標識に対する基質を含む第２検出試薬と
    を含むキット。
16. 前記回収保存液がＮＰ−４０、デオキシコール酸塩およびＥＤＴＡを含む、請求項１５に記載のキット。
17. 前記回収保存液がアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
18. 前記界面活性剤ベースの洗浄緩衝液が、約０．５〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５〜約７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む、請求項１５に記載のキット。
19. 前記界面活性剤ベースの洗浄緩衝液が、約４０ｍＭのトリスｐＨ８．２、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１〜０．５％のＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含む、請求項１５に記載のキット。
20. 前記希釈液が、ＢＥＳ、ポリアクリル酸、ＮａＯＨおよびアジ化ナトリウムを含む、請求項１５に記載のキット。
21. 前記変性試薬が１．７５のＮａＯＨである、請求項１５に記載のキット。
22. ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびその遺伝的変異体に結合することができる、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
23. 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブが、高リスク型ＨＰＶである１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および８２型に対するプローブからなる群から選択される、請求項２２に記載のキット。
24. サンプル中の標的核酸の存在を検出するように構成された装置をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
25. システムがルミノメーターである、請求項２４に記載のキット。
26. サンプル中の標的核酸分子の存在を検出するための携帯用システムであって、
    （ａ）複数のサンプルを加熱するために構成されたヒーターと、
    （ｂ）第一の抗体でコーティングされた支持体上にあり、かつ検出可能なマーカーで標識された第二の抗体に結合体化された標的核酸分子の化学発光を検出するように構成されたルミノメーターと、
    （ｃ）化学発光データを記録するように構成されたモニターと
    を含む、携帯用システム。

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