WO2020153248A1 - 核酸の単離方法、核酸の単離キット、及び検査チップ - Google Patents

核酸の単離方法、核酸の単離キット、及び検査チップ Download PDF

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WO2020153248A1
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WO
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nucleic acid
solution
basic compound
extraction solution
recovery
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PCT/JP2020/001461
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隆昌 河野
延彦 乾
中村　勤
智也 佐々木
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積水化学工業株式会社
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid isolation method, a nucleic acid isolation kit, and a test chip.
  • RNA and DNA contained in viruses and cells there is known a method of filtering nucleic acids extracted from viruses and cells and washing impurities such as salts adhering to the filters together with the nucleic acids. ing.
  • the cleaning liquid used for such cleaning alcohol such as ethanol is usually used.
  • Patent Document 1 discloses a method of binding a nucleic acid to a material for binding the nucleic acid vertically housed in a pipette tip and washing with a washing buffer.
  • a nucleic acid is isolated with an eluent through a drying step.
  • alcohol such as ethanol is used as a washing buffer.
  • An object of the present invention is to provide a method for isolating a nucleic acid, a kit for isolating a nucleic acid, and a test chip that can easily extract a nucleic acid without using alcohol.
  • a step of mixing a sample containing a nucleic acid with an extraction solution and dispersing the nucleic acid in the extraction solution, and an extraction solution containing the nucleic acid are subjected to anionic adsorption.
  • the washing solution contains a basic compound and has a pH of not more than the pKa of the conjugate acid of the basic compound, and the recovery solution has a pH of not less than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the extraction solution further contains a metal cation having a valence of 2 or more.
  • a step of mixing a sample containing a nucleic acid with an extraction solution, dispersing the nucleic acid in the extraction solution, and an extraction solution containing the nucleic acid And a step of bringing the recovered solution into contact with the anionic adsorbent, wherein the extraction solution contains a protein denaturant and a basic compound, and has a pH of the basic compound.
  • the pKa of the conjugate acid of the basic compound is not more than pKa, and the pH of the recovery solution is not less than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the conjugate compound of the basic compound has a pKa of 4 or more and 6 or less.
  • the basic compound has an amino group.
  • the extraction solution further contains a zwitterionic compound.
  • the step of bringing a solution containing alcohol into contact with the anionic adsorbent is not included.
  • an extraction solution contains a protein denaturant
  • the washing solution is A basic compound
  • the pH is not more than the pKa of the conjugate acid of the basic compound
  • the pH of the recovery solution is not less than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the extraction solution further contains a metal cation having a valence of 2 or more.
  • an extraction solution, a recovery solution, and an anionic adsorbent are included, and the extraction solution contains a protein denaturant and a basic compound, Further, the pH is not more than the pKa of the conjugate acid of the basic compound, and the pH of the recovery solution is not less than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • an extraction solution holding unit holding an extraction solution containing nucleic acid
  • a washing solution holding unit holding a washing solution
  • a recovery solution holding unit holding a recovery solution
  • an anionic adsorption A recovery unit including a body and a nucleic acid analysis unit, the extraction solution contains a protein denaturant, the washing solution contains a basic compound, and the pH is pKa or less of the conjugate acid of the basic compound.
  • the pH of the recovery solution is pKa or higher of the conjugate acid of the basic compound.
  • the extraction solution further contains a metal cation having a valence of 2 or more.
  • an extraction solution holding part holding an extraction solution containing nucleic acid
  • a recovery solution holding part holding a recovery solution
  • a recovery part containing an anionic adsorbent
  • a nucleic acid analysis contains a protein denaturant and a basic compound, and has a pH of pKa or less of the conjugate acid of the basic compound
  • the recovery solution has a pH of the basic compound.
  • the pKa of the conjugate acid of is not less than pKa.
  • nucleic acid isolation method it is possible to provide a nucleic acid isolation method, a nucleic acid isolation kit, and a test chip that can easily extract nucleic acids without the need to use alcohol.
  • FIG. 1 is a schematic plan view showing a chip used in the nucleic acid recovery method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of a portion taken along the line AA of FIG.
  • FIG. 3(a) is a schematic diagram for explaining a state in which the nucleic acid is adsorbed on the anionic adsorbent in the nucleic acid isolation method according to the present invention, and FIG. It is a schematic diagram for demonstrating the state isolated from a sexual adsorbent.
  • FIG. 4 is a schematic plan view showing an example of the flow channel structure in the inspection chip according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic sectional view of a portion taken along the line BB of FIG.
  • the present invention relates to a method for isolating nucleic acid.
  • the present invention will be clarified by describing specific embodiments of the present invention.
  • the method for isolating a nucleic acid according to the first embodiment of the present invention comprises a step of mixing a sample containing a nucleic acid and an extraction solution, dispersing the nucleic acid in the extraction solution, and anionic adsorption of the extraction solution containing the nucleic acid.
  • the method comprises the steps of contacting with the body, contacting the washing solution with the anionic adsorbent, and contacting the recovery solution with the anionic adsorbent.
  • the extraction solution contains a protein denaturant.
  • the washing solution contains a basic compound and has a pH not higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the pH of the recovery solution is pKa or higher of the conjugate acid of the basic compound.
  • the method for isolating a nucleic acid according to the first embodiment of the present invention includes a step of mixing a sample containing a nucleic acid with an extraction solution and dispersing the nucleic acid in the extraction solution.
  • this step will be described as an “extraction step”.
  • sample containing the nucleic acid examples include biological samples containing nucleic acid such as DNA and RNA.
  • biological samples include viruses, cells, blood, tissue fluid, feces and the like.
  • the sample containing the nucleic acid may be, for example, a sample containing the nucleic acid in the environment such as soil, seawater, river water, etc., and is not particularly limited.
  • the above extraction solution contains a protein denaturant.
  • the protein denaturing agent has a role of breaking the higher-order structure of the protein by interacting with the protein and dissolving the nucleic acid in the extraction solution.
  • a surfactant for example, sodium dodecyl sulfate (SDS), polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20) or the like can be used.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Tween 20 polyoxyethylene sorbitan monolaurate
  • the reducing agent for example, 2-mercaptoethanol, dithiothreitol (DTT) or the like can be used.
  • a salt such as guanidine hydrochloride can be used.
  • the concentration of the protein denaturing agent in the extraction solution is not particularly limited, but is preferably 2 mol/L or more, more preferably 4 mol/L or more, further preferably 8 mol/L or more, preferably 10 mol/L or less.
  • concentration of the protein denaturing agent within the above range, the nucleic acid can be more reliably extracted.
  • the total concentration is preferably within the above range.
  • the extraction solution preferably contains a zwitterionic compound as a protein denaturant.
  • the extraction solution contains a zwitterionic compound
  • a cationic functional group in a protein such as histone contained in the sample and an anionic functional group of the zwitterionic compound are formed. Interact. Thereby, the bond between the protein and the nucleic acid can be cleaved, and the nucleic acid can be efficiently extracted. Therefore, the nucleic acid can be more efficiently recovered in the subsequent step.
  • the zwitterionic compound since the zwitterionic compound has a cationic functional group at the same time, it can also be provided with a charge binding point for nucleic acid. Specifically, since the anionic functional group of the zwitterionic compound forms a bond with the base of the nucleic acid, the cationic functional group of the zwitterionic compound can prevent the nucleic acid from becoming electrically neutral. it can. When it becomes electrically neutral, aggregation between nucleic acids progresses, and the reaction efficiency of PCR and the like decreases, but by suppressing that the nucleic acid becomes electrically neutral by the zwitterionic compound, it is possible to reduce the reaction time in a short time. In analysis such as PCR that requires analysis, the analysis accuracy can be further improved.
  • the above zwitterionic compound preferably has no surface activity.
  • having no surface activity means that the HLB value obtained by the Griffin method is 0 to 6 to 13 to 20.
  • the inhibition of the reaction such as PCR can be further suppressed in the inspection and analysis in the subsequent step, and the nucleic acid can be extracted in a shorter time.
  • Such a zwitterionic compound is not particularly limited, but an amino acid or an amino acid derivative, a nucleotide, and a polymer having a repeating structural unit derived from the above monomer can be used.
  • the zwitterionic compound is preferably an amino acid or an amino acid derivative.
  • the nucleic acid can be efficiently recovered in a shorter time.
  • the amino acid or amino acid derivative is not particularly limited, and examples thereof include natural amino acids such as glycine, acetyl cysteine, D-amino acid, diamine, ⁇ amino acid, ⁇ amino acid, ⁇ amino acid, aminophosphonic acid, and repeats derived from the above monomers.
  • a polymer having a structural unit can be used.
  • zwitterionic compounds commercially available compounds include, for example, LIPIDURE (manufactured by NOF CORPORATION), PNA (manufactured by Cosmo Bio Inc.) and the like.
  • the zwitterionic compound may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the zwitterionic compound contained in the extraction solution is not particularly limited, but is preferably 0.5 mol/L or more, more preferably 1.0 mol/L or more, preferably Is 10.0 mol/L or less, more preferably 8.0 mol/L or less.
  • concentration of the zwitterionic compound contained in the nucleic acid extraction solution is within the above range, the nucleic acid can be efficiently recovered in a shorter time.
  • the above extraction solution preferably contains a metal cation having a valence of 2 or more.
  • the divalent or higher valent metal cation include calcium ion and magnesium ion.
  • the metal cation ionically bonds to the nucleic acid having a negative charge.
  • the extraction solution after the nucleic acid to which such a metal cation is ionically bound is extracted is brought into contact with the anionic adsorbent, the metal cation is ionically bound to the anionic adsorbent as shown in FIG. Thereby, the nucleic acid can be adsorbed on the anionic adsorbent through the metal cation.
  • the above extraction solution may further contain a coprecipitating agent.
  • the coprecipitating agent include tRNA, polyadenine, acrylamide polymer, glycogen and the like.
  • the extraction solution further contains a coprecipitating agent, the nucleic acid can be more efficiently adsorbed on the anionic adsorbent.
  • the above metal cations do not interfere with the extraction of nucleic acids even if they are added to the extraction solution in advance. Therefore, complicated steps are not required for the extraction of nucleic acid.
  • the concentration of the divalent or higher valent metal cation contained in the extraction solution is not particularly limited, but is preferably 0.5 mol/L or higher, more preferably 1. It is 0 mol/L or more, preferably 6.0 mol/L or less, and more preferably 5.0 mol/L or less.
  • concentration of the divalent or higher valent metal cation contained in the extraction solution is within the above range, the nucleic acid can be efficiently recovered in a shorter time.
  • the above extraction solution may further contain other components such as a pH adjuster and a stabilizer in addition to the above components.
  • the method for isolating a nucleic acid according to the first embodiment of the present invention comprises a step of bringing an extraction solution containing a nucleic acid into contact with an anionic adsorbent.
  • this step will be described as an “adsorption step”.
  • FIG. 1 is a schematic plan view showing a chip used in the method for isolating nucleic acid according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of a portion taken along the line AA of FIG.
  • the nucleic acid is isolated using the microfluidic device including the chip 1, but the nucleic acid may be isolated using another container and is not particularly limited.
  • the chip 1 has a flow path 2 through which a fluid is sent.
  • a collecting unit 3 is provided in the middle of the flow path 2. Therefore, the flow path 2 has an upstream flow path 2 a provided upstream of the collection unit 3 and a downstream flow path 2 b provided downstream of the collection unit 3.
  • the chip 1 has a plate-shaped substrate 5 and a cover member 6.
  • the cover member 6 is provided on the main surface 5 a of the substrate 5 so as to close the opening of the recess 5 b of the substrate 5. Thereby, the upstream channel 2a, the recovery unit 3, and the downstream channel 2b are formed.
  • the material forming the substrate 5 is not particularly limited, and for example, synthetic resin, rubber, metal or the like can be used. Further, the cover member 6 can be made of, for example, a flexible material such as a resin film.
  • the recovery unit 3 is provided with an anionic adsorbent 4 for supporting and recovering nucleic acid.
  • the anionic adsorbent 4 is a carrier for supporting nucleic acid.
  • the form of the anionic adsorbent 4 is not particularly limited, but it can be used in the form of, for example, a membrane, filter, plate, fiber, tube, particle, or porous.
  • the shape of the anionic adsorbent 4 is preferably a fiber, a particle, or a porous body.
  • the anionic adsorbent 4 is not particularly limited, but may be composed of, for example, silicon compounds, phosphate minerals, silicate minerals, aluminosilicate minerals, or the like.
  • silicon compounds include silica and glass.
  • phosphate minerals include hydroxyapatite and the like.
  • silicate minerals include talc and montmorillonite. Zeolite etc. are mentioned as aluminosilicate minerals. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the anionic adsorbent 4 is preferably silica fiber or glass fiber, and more preferably silica fiber.
  • silica fibers are used as the anionic adsorbent 4.
  • the anionic adsorbent 4 may be silica particles or a porous silica material.
  • the extraction solution containing the nucleic acid obtained in the extraction step is sent from the upstream channel 2a to the recovery section 3 and brought into contact with the anionic adsorbent 4.
  • the nucleic acid contained in the extraction solution is adsorbed on the anionic adsorbent 4.
  • the method for isolating a nucleic acid according to the first embodiment of the present invention includes a step of bringing a washing solution into contact with an anionic adsorbent. Further, the cleaning solution contains a basic compound and has a pH of not more than pKa of the conjugate acid of the basic compound. Hereinafter, this step will be described as a “cleaning step”.
  • the washing step is a step of feeding the washing solution from the upstream channel 2a to the recovery unit 3 and bringing it into contact with the anionic adsorbent 4. ..
  • the washing step a crosslinked structure is formed between the nucleic acid and the anionic adsorbent 4 through the basic compound contained in the washing solution. Further, the above-mentioned washing step can wash away the impurities adsorbed on the anionic adsorbent 4.
  • the washing solution contains a basic compound and has a pH of not more than the pKa of the conjugate acid of the basic compound. Therefore, in the cleaning solution, a part of the basic compound exists as a positively charged cation. In this case, as shown in FIG. 3( a ), the cation forms a cross-linking structure between the anionic adsorbent 4 and the nucleic acid (usually negatively charged), so that the nucleic acid is strongly anionic. It can be adsorbed on the sexual adsorbent 4. Furthermore, since the basic compound is dissolved in the washing solution as a cation, a crosslinked structure can be uniformly formed with the nucleic acid, and the recovery rate of the nucleic acid is easily increased.
  • the basic compound refers to a compound or an ion thereof that receives a proton (H + ) based on the definition of Bronsted-Lowry.
  • the pKa of the conjugate acid of the basic compound means the acid dissociation constant pKa1 of the conjugate acid at the time of one-step ionization when the basic compound undergoes multi-step ionization.
  • the above basic compound may be any of a monomer, an oligomer and a polymer, and may be a combination of these. When used in a microfluidic device, a monomer having a low thickening effect is preferable.
  • the weight average molecular weight of the monomer is preferably 700 or less.
  • the weight average molecular weight of the oligomer is preferably less than 10,000.
  • the weight average molecular weight of the polymer is preferably 10,000 or more.
  • the pKa of the conjugate acid of the basic compound is preferably 4 or more, more preferably 4.5 or more, preferably 6 or less, and more preferably 5.5 or less.
  • the nucleic acid can be extracted more efficiently.
  • the basic compound may be a monovalent base or a divalent or higher valent base, but a divalent or higher valent base is preferred.
  • the nucleic acid can be more strongly adsorbed.
  • the above basic compound preferably has an amino group.
  • examples of such a monomer include a polyamine-based monomer, a radical-reactive amine monomer, a polycondensable amine monomer, an amino sugar, and pyridines. These monomers may be used alone or in combination of two or more.
  • polyamine-based monomer examples include melamine, piperazine, 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO), methoxyamine, dimethylhydroxyamine, trisdimethylaminoethylamine, diethylenetriamine, methylaminoacetonitrile, diethylaminoacetonitrile, Examples thereof include nitrourea, aminoethylmorpholine, hexamethylenetetramine, triethylenediamine, dimethylhydroxyamine, isoquinoline, histidine, benzimidazole, biguanide, spermine, spermidine and putrescine.
  • DABCO 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane
  • radical-reactive amine monomer examples include allylamine and acrylamine.
  • Examples of the polycondensable amine monomer include polyethyleneimine.
  • amino sugars examples include acarbose, N-acetylneuraminic acid, phosphoribosylamine, glucosamine and the like.
  • pyridines examples include pyridine, nicotinic acid, cotinamide, isoniazid, nicotine, brucine, vitamin B6 and the like.
  • the basic compound is a polymer having an amino group
  • examples of such a polymer include long-chain polyamines (LCPAs), amino sugar-based polysaccharides, pyridine-based polymers, and repeating structural units derived from the above monomers.
  • LCPAs long-chain polyamines
  • amino sugar-based polysaccharides amino sugar-based polysaccharides
  • pyridine-based polymers pyridine-based polymers
  • repeating structural units derived from the above monomers The polymer etc. which it has are mentioned. These polymers may be used alone or in combination of two or more.
  • LCPAs long-chain polyamines
  • silafin examples include silafin and silacidin.
  • amino sugar-based polysaccharides examples include chitosan and the like.
  • pyridine-based polymers examples include polypyridine and polyalkylpyridinium.
  • oligomer for example, an oligomer having a repeating structural unit derived from the above monomer can be used.
  • melamine piperazine, or 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) is preferable as the basic compound from the viewpoint of more surely supporting the nucleic acid on the anionic adsorbent 4.
  • melamine is more preferable.
  • the pKa of melamine in an aqueous solution is 5.0 to 5.1. Therefore, in an aqueous solution having a pH of 7, as shown in the following formula (1), it is in a non-ionized state.
  • a part or the whole is ionized to become monovalent to trivalent cations. Therefore, melamine can be suitably used as a compound having a pKa of 4 or more and 6 or less.
  • the pH of the cleaning solution is not particularly limited as long as it is the pKa or less.
  • the difference between the pKa and the pH of the cleaning solution is preferably 1 or more, more preferably 2 or more.
  • the upper limit of the difference between the pKa and the pH of the cleaning solution is not particularly limited, but may be 5, for example.
  • the concentration of the basic compound in the washing solution is not particularly limited, but is preferably 10 mmol/L or more, preferably 1 mol/L or less, more preferably 500 mmol/L or less.
  • concentration of the basic compound is within the above range, the nucleic acid can be more surely supported by the anionic adsorbent 4 via the basic compound.
  • the above compound is preferably a monomer. In this case, the contact between the anionic adsorbent 4 and the above compound can be performed more efficiently.
  • the amine compound is preferably a polymer. In this case, the contact between the anionic adsorbent 4 and the amine compound can be performed more efficiently.
  • the method for isolating a nucleic acid according to the first embodiment of the present invention includes a step of bringing a recovery solution into contact with an anionic adsorbent.
  • this step will be described as a “recovery step”.
  • the recovery step is a step of feeding the recovery solution from the upstream channel 2a to the recovery section 3 and bringing it into contact with the anionic adsorbent 4. ..
  • the pH of the recovered solution is higher than the pKa of the basic compound, most of the basic compound in the recovered solution is in a non-ionized state. Therefore, when the recovered solution is sent to the recovery unit 3, as shown in FIG. 3B, the ionic bonds between the negatively charged nucleic acid and the basic compound and between the anionic adsorbent 4 and the basic compound collapse. To do.
  • the nucleic acid when the recovery solution is sent to the recovery unit 3, the nucleic acid can be isolated from the anionic adsorbent 4 and the nucleic acid can be recovered from the recovery port 7.
  • the difference between the pH of the recovered solution and the above pKa is preferably 1 or more, more preferably 2 or more.
  • the upper limit of the difference between the pH of the recovered solution and the above pKa is not particularly limited, but may be 3, for example.
  • the nucleic acid is anionic using the extraction solution and the washing solution containing the basic compound and having a pH not higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound. It can be strongly adsorbed to the adsorbent 4. Further, the nucleic acid can be isolated from the anionic adsorbent 4 and recovered using a recovery solution having a pH of pKa or more of the conjugate acid of the basic compound. Therefore, in the nucleic acid isolation method of the present embodiment, nucleic acids can be easily recovered by the extraction solution, the washing solution, and the recovery solution without using alcohol.
  • the pH of the recovered solution may be at least the pKa of the conjugate acid of the basic compound, and may be neutral, for example. Therefore, since the nucleic acid can be isolated and recovered by the neutral recovery solution, it is possible to suppress the inhibition of the reaction such as the enzymatic reaction in the inspection and analysis in the subsequent step.
  • the method for isolating a nucleic acid according to the first embodiment of the present invention may optionally include steps other than the steps described above. For example, after the adsorption step, other steps such as a drying step may be included.
  • a method for isolating a nucleic acid according to a second embodiment of the present invention comprises a step of mixing a sample containing a nucleic acid with an extraction solution and dispersing the nucleic acid in the extraction solution, and an extraction solution containing the nucleic acid by anionic adsorption.
  • the method includes the step of contacting the body and the step of contacting the recovered solution with the anionic adsorbent.
  • the extraction solution contains a protein denaturant and a basic compound, and has a pH not higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the pH of the recovery solution is equal to or higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the extraction solution contains a basic compound, and the pH is equal to or lower than the pKa of the conjugate acid of the basic compound. Different from the separation method.
  • the same steps as the method for isolating the nucleic acid according to the first embodiment can be adopted.
  • the nucleic acid isolation method according to the second embodiment does not necessarily require a washing step.
  • the washing step is not provided in the method for isolating nucleic acid according to the second embodiment, the nucleic acid can be isolated more simply and quickly.
  • the washing step is provided in the method for isolating a nucleic acid according to the second embodiment of the present invention, a nucleic acid having less impurities can be isolated.
  • the washing solution may be any solution having a pH of pKa or less of the basic compound.
  • impurities and the like can be washed away while the nucleic acid is adsorbed on the anionic adsorbent.
  • nucleic acids can be easily recovered by the extraction solution and the recovery solution without using alcohol.
  • the present invention also relates to a nucleic acid isolation kit.
  • the nucleic acid isolation kit according to the first embodiment of the present invention includes an extraction solution, a washing solution, a recovery solution, and an anionic adsorbent.
  • the extraction solution also contains a protein denaturant.
  • the washing solution contains a basic compound, and has a pH not higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the pH of the recovery solution is equal to or higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the extraction solution, the washing solution, the recovery solution, and the anionic adsorbent are the same as those described in the nucleic acid isolation method according to the first embodiment. The same as can be used.
  • the nucleic acid isolation kit according to the second embodiment of the present invention includes an extraction solution, a recovery solution, and an anionic adsorbent.
  • the extraction solution contains a protein denaturant and a basic compound, and has a pH not higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the pH of the recovery solution is equal to or higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the extraction solution, the recovery solution, and the anionic adsorbent are the same as those described in the nucleic acid isolation method according to the second embodiment.
  • One can be used.
  • the nucleic acid isolation kit according to the second embodiment may further include a washing solution.
  • As the washing solution the same one as described in the method for isolating nucleic acid according to the second embodiment can be used.
  • the extraction solution, the washing solution, and the recovery solution are respectively stored in a first container, a second container, and a third container.
  • the anionic adsorbent is held inside a column whose upper and lower parts are open.
  • the first container, the second container, the third container, and the column are provided in a state where they are housed in a box.
  • the box further contains a package insert explaining how to use the nucleic acid isolation kit.
  • the invention also relates to a test chip.
  • the test chip according to the first embodiment of the present invention includes an extraction solution holding section that holds an extraction solution containing nucleic acid, a washing solution holding section that holds a washing solution, and a recovery solution holding section that holds a recovery solution.
  • a recovery unit including an anionic adsorbent and a nucleic acid analysis unit are provided.
  • the extraction solution also contains a protein denaturant.
  • the washing solution contains a basic compound, and has a pH not higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the pH of the recovery solution is equal to or higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the extraction solution, the washing solution, the recovery solution, and the anionic adsorbent are the same as those described in the method for isolating the nucleic acid according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of a flow channel structure in the inspection chip according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a front sectional view of a portion along the line BB in FIG.
  • the inspection chip 11 includes a substrate 12 and a sealing sheet 13.
  • the substrate 12 is not particularly limited, but has a rectangular plate shape in the present embodiment.
  • the substrate 12 has a first surface 12a that is a surface on the sealing sheet 13 side and a second surface 12b that faces the first surface 12a.
  • the plurality of groove portions provided on the first surface 12a side are sealed by the sealing sheet 13, so that the first to fifth flow paths 24A to 24E and the recovery portion 28 are formed.
  • the recovery unit 28 is provided with the anionic adsorbent 14.
  • the substrate 12 is made of an appropriate material such as synthetic resin.
  • Examples of the material forming the sealing sheet 13 include a resin film and the like.
  • the upstream ends of the first to third flow paths 24A to 24C are connected to the micropumps 23A to 23C, and the downstream ends thereof are connected to the recovery unit 28.
  • the extract holding unit 25 is provided in the middle of the first flow path 24A.
  • a cleaning liquid holding unit 26 is provided in the middle of the second flow path 24B.
  • a recovery liquid holding unit 27 is provided in the middle of the third flow path 24C.
  • the micropumps 23A to 23C are not particularly limited, and examples thereof include a light gas generating tape.
  • the light gas generating tape is a tape that can generate gas by light irradiation.
  • An upstream end of the fourth flow path 24D is connected to the collection unit 28, and a downstream end thereof is connected to the waste liquid unit 29. Further, a valve portion 21A is provided in the middle of the fourth flow path 24D so as to open and close the fourth flow path 24D.
  • the fifth channel 24E has an upstream end connected to the collection unit 28 and a downstream end connected to the nucleic acid analysis unit 22. Further, a valve portion 21B is provided in the middle of the fifth flow path 24E so as to open and close the fifth flow path 24E.
  • nucleic acid analysis unit 22 After the nucleic acid is isolated by the recovery solution, the nucleic acid analysis unit 22 analyzes the nucleic acid.
  • the nucleic acid analysis method performed in the nucleic acid analysis unit 22 is not particularly limited, and examples thereof include PCR (Polymerase Chain Reaction). In order to rapidly isolate and analyze nucleic acid, it is preferable that the nucleic acid analysis unit 22 be provided with a reagent used for nucleic acid analysis in advance. Examples of reagents used for such nucleic acid analysis include primers for PCR and polymerases.
  • the above-mentioned extraction solution is mixed with a sample containing nucleic acid to obtain an extraction solution containing nucleic acid (extraction step).
  • the extraction solution containing nucleic acid is injected into the extraction solution holding part 25 from an injection port (not shown).
  • the micropump 23A is driven to bring the extraction solution injected into the extraction solution holding unit 25 into contact with the anionic adsorbent 14 of the recovery unit 28, and then send it to the waste liquid unit 29 (adsorption step).
  • the valve portion 21A is open and the valve portion 21B is closed.
  • the micropump 23B is driven to bring the cleaning solution held in the cleaning solution holding unit 26 into contact with the anionic adsorbent 14 in the recovery unit 28, and then to send the liquid to the waste liquid unit 29 (cleaning step).
  • the valve portion 21A is closed and the valve portion 21B is opened.
  • the micropump 23C is driven to bring the recovery solution held in the recovery solution holding unit 27 into contact with the anionic adsorbent 14 to isolate the nucleic acid, and the recovery solution containing the nucleic acid is transferred to the nucleic acid analysis unit 22. Liquid is sent (collection step).
  • nucleic acids can be easily extracted by an extraction solution, a washing solution, and a recovery solution without using alcohol. It can be isolated and analyzed.
  • test chip according to the first embodiment and the nucleic acid isolation method using the test chip are examples, and can be appropriately changed within the range in which the object of the present invention can be achieved.
  • the test chip according to the second embodiment of the present invention includes an extraction solution holding unit holding an extraction solution containing nucleic acid, a recovery solution holding unit holding a recovery solution, a collection unit containing an anionic adsorbent, and a nucleic acid. And an analysis unit.
  • the extraction solution contains a protein denaturant and a basic compound, and has a pH not higher than the pKa of the conjugate acid of the basic compound.
  • the pH of the recovered solution is pKa or more of the conjugate acid of the basic compound.
  • the same ones as those described in the nucleic acid isolation method according to the second embodiment are used. be able to.
  • the test chip according to the second embodiment may further include a cleaning solution holding unit that holds the cleaning solution.
  • a cleaning solution holding unit that holds the cleaning solution.
  • the washing solution the same one as described in the method for isolating nucleic acid according to the second embodiment described above can be used.
  • test chip according to the second embodiment a test chip having the same structure as the test chip according to the first embodiment can be used.
  • the test chip according to the second embodiment does not necessarily need to have the cleaning solution holding portion.
  • the washing solution holding part when the washing solution holding part is not provided, the nucleic acid can be isolated more simply and quickly.
  • the washing solution holding unit when the washing solution holding unit is provided, nucleic acids with less impurities can be isolated.
  • the nucleic acid isolation method using the test chip according to the second embodiment the same method as the nucleic acid isolation method using the test chip according to the first embodiment can be adopted. It should be noted that the nucleic acid isolation method using the test chip according to the second embodiment does not necessarily require a washing step. In the test chip according to the second embodiment, if the washing step is not provided, the nucleic acid can be isolated more simply and quickly. On the other hand, in the test chip according to the second embodiment, when a washing step is provided, nucleic acids with less impurities can be isolated.
  • the nucleic acid isolation method according to the above-described second embodiment by using the nucleic acid isolation method according to the above-described second embodiment, the nucleic acid can be easily extracted by the extraction solution, the washing solution, and the recovery solution without using alcohol. Can be isolated and analyzed.
  • test chip according to the second embodiment and the nucleic acid isolation method using the test chip are merely examples, and can be changed as appropriate within the range in which the object of the present invention can be achieved.
  • Example 1 In Example 1, the chip 1 shown in FIGS. 1 and 2 was manufactured as follows.
  • Cycloolefin polymer was used as a material for the substrate 5, and the substrate 5 having the recess 5b was produced by injection molding.
  • a sealing tape was used for the cover member 6, and the recess 5b of the substrate 5 was closed with the sealing tape to manufacture the chip 1.
  • Silica fibers (“GF/D” manufactured by GE Healthcare, 2 mm ⁇ , thickness 0.8 mm) were placed as the anionic adsorbent 4 in the recovery unit 3. The width of the channel 2 was 0.8 mm and the depth was 0.5 mm.
  • RNA recovery was measured as follows using such a chip 1.
  • RNA isolation First, outside the system of the chip 1, virus (FluA H1N1 manufactured by ATCC Co., Ltd.; 5000 copies) was added to 500 ⁇ L of the extraction solution having the composition shown in Table 1, and the extraction solution in which nucleic acid (RNA) was dispersed in the extraction solution was added. Obtained.
  • the coprecipitating agent (polyadenine) shown in Table 1 was added in an amount of 3 ⁇ g per 500 ⁇ L of the extraction solution.
  • 150 ⁇ L of the above-described RNA-containing extraction solution was sent to the collection unit 3 to adsorb the RNA onto the silica fiber.
  • 200 ⁇ L of the washing solution shown in Table 1 was sent to the collecting unit 3 to wash the silica fiber.
  • RNA recovery rate (Calculation of RNA recovery rate) Next, 2 ⁇ L of the recovered solution in which the nucleic acid was recovered was taken out, and the PCR reaction solution was prepared using TaqPath qPCR and RT-qPCR Master Mixes (manufactured by Thermofisher).
  • a primer for PCR a PDM 2009 H1N1 detection primer (InfA, Universal Fluorenza a Primer) manufactured by Biosearch Technology was used.
  • PCR reaction solution nucleic acid concentration: 100,000, 50,000, 5,000, 500copies/500copies/ (4 levels of ⁇ L) were also adjusted.
  • the PCR reaction solution prepared from the recovered solution and the standard PCR reaction solution were amplified using a thermal cycler "LightCycler (Roche)". Amplification was carried out by heating at 95° C. for 20 seconds and then forty-five cycles of 95° C. for 3 seconds and 60° C. for 5 seconds.
  • RNA recovery rate (nucleic acid recovery rate) was calculated by the following formula from the amount of nucleic acid obtained by the LightCycler automatically calculating from the standard.
  • Nucleic acid recovery rate (%) ⁇ (amount of nucleic acid calculated by LightCycler x recovered liquid amount/2) x 100 ⁇ /5,000
  • Examples 2 to 7 Same as Example 1 except that the type and addition amount of the compound contained in the extraction solution and the washing solution were changed as shown in Table 1 below, and that the washing step was not provided in Example 6. RNA recovery was determined. The results are shown in Table 1 below.
  • the conjugate acid of DABCO of Example 2 has a pKa of 4.2, and the conjugate acid of piperazine of Example 3 has a pKa of 5.7. Further, in Table 1, mol/L is represented by M.
  • Comparative Example 1 In Comparative Example 1, the RNA recovery rate was obtained in the same manner as in Example 1 except that 200 ⁇ L of ethanol was used as the washing solution.
  • Comparative example 2 In Comparative Example 2, the RNA recovery rate was obtained in the same manner as in Example 1 except that the washing solution was not sent after the RNA-containing extraction solution was sent.
  • nucleic acid isolation method it is possible to provide a nucleic acid isolation method, a nucleic acid isolation kit, and a test chip that can easily extract nucleic acids without the need to use alcohol.

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Abstract

アルコールを用いる必要がなく、核酸を簡便に抽出することができる、核酸の単離方法を提供する。　核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、抽出溶液中に核酸を分散する工程と、核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、洗浄溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程と、回収溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程と、を備え、抽出溶液は、タンパク質変性剤を含み、洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、回収溶液は、ｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である、核酸の単離方法。

Description

核酸の単離方法、核酸の単離キット、及び検査チップ
　本発明は、核酸の単離方法、核酸の単離キット、及び検査チップに関する。
　従来、ウイルスや細胞に含まれるＲＮＡやＤＮＡなどの核酸を単離する方法として、ウイルスや細胞から抽出された核酸をフィルタリングし、核酸とともにフィルターに付着した塩等の不純物を洗浄する方法が知られている。このような洗浄に用いられる洗浄液としては、通常、エタノールなどのアルコールが用いられている。
　例えば、下記の特許文献１には、ピペットチップ中に垂直に収容された核酸を結合させる材料に核酸を結合させ、洗浄バッファーにより洗浄する方法が開示されている。特許文献１では、洗浄バッファーによる洗浄後、乾燥工程を経て、溶出剤により核酸が単離されている。特許文献１では、洗浄バッファーとしてエタノール等のアルコールが用いられている。
特表２０１８－５２４０１７号公報
　しかしながら、特許文献１のように、アルコールを洗浄液に用いた場合、洗浄液の保管中にアルコールが揮発しやすいという問題がある。また、アルコールを洗浄液に用いた場合、特許文献１のように別途乾燥工程を設ける必要があることから、工程が煩雑になるという問題がある。もっとも、乾燥工程を設けない場合、後工程において検査や分析などに用いたときに、酵素反応などの反応が阻害される場合がある。
　本発明の目的は、アルコールを用いる必要がなく、核酸を簡便に抽出することができる、核酸の単離方法、核酸の単離キット、及び検査チップを提供することにある。
　本発明に係る核酸の単離方法の広い局面では、核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、前記抽出溶液中に前記核酸を分散する工程と、前記核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、洗浄溶液を前記アニオン性吸着体に接触させる工程と、回収溶液を前記アニオン性吸着体に接触させる工程と、を備え、前記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含み、前記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。
　本発明に係る核酸の単離方法のある特定の局面では、前記抽出溶液は、価数が２価以上である金属カチオンをさらに含む。
　本発明に係る核酸の単離方法の他の広い局面では、核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、前記抽出溶液中に前記核酸を分散する工程と、前記核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、回収溶液を前記アニオン性吸着体に接触させる工程と、を備え、前記抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。
　本発明に係る核酸の単離方法の他の特定の局面では、前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａが４以上、６以下である。
　本発明に係る核酸の単離方法のさらに他の特定の局面では、前記塩基性化合物が、アミノ基を有する。
　本発明に係る核酸の単離方法のさらに他の特定の局面では、前記抽出溶液が、さらに両性イオン化合物を含む。
　本発明に係る核酸の単離方法のさらに他の特定の局面では、前記アニオン性吸着体にアルコールを含む溶液を接触させる工程を含まない。
　本発明に係る核酸の単離キットの広い局面では、抽出溶液と、洗浄溶液と、回収溶液と、アニオン性吸着体と、を含み、前記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含み、前記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。
　本発明に係る核酸の単離キットのある特定の局面では、前記抽出溶液は、価数が２価以上である金属カチオンをさらに含む。
　本発明に係る核酸の単離キットの他の広い局面では、抽出溶液と、回収溶液と、アニオン性吸着体と、を含み、前記抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。
　本発明に係る検査チップの広い局面では、核酸を含む抽出溶液を保持する抽出溶液保持部と、洗浄溶液を保持する洗浄溶液保持部と、回収溶液を保持する回収溶液保持部と、アニオン性吸着体を含む回収部と、核酸分析部と、を備え、前記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含み、前記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。
　本発明に係る検査チップのある特定の局面では、前記抽出溶液は、価数が２価以上である金属カチオンをさらに含む。
　本発明に係る検査チップの他の広い局面では、核酸を含む抽出溶液を保持する抽出溶液保持部と、回収溶液を保持する回収溶液保持部と、アニオン性吸着体を含む回収部と、核酸分析部と、を備え、前記抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。
　本発明によれば、アルコールを用いる必要がなく、核酸を簡便に抽出することができる核酸の単離方法、核酸の単離キット、及び検査チップを提供することができる。
図１は、本発明の第１の実施形態に係る核酸の回収方法で用いるチップを示す模式的平面図である。 図２は、図１のＡ－Ａ線に沿う部分の模式的断面図である。 図３（ａ）は、本発明に係る核酸の単離方法において、核酸がアニオン性吸着体に吸着している状態を説明するための模式図であり、図３（ｂ）は、核酸がアニオン性吸着体から単離される状態を説明するための模式図である。 図４は、本発明の第１の実施形態に係る検査チップにおける流路構造の一例を示す模式的平面図である。 図５は、図４のＢ－Ｂ線に沿う部分の模式的断面図である。
　以下、本発明の詳細を説明する。
　［核酸の単離方法］
　本発明は、核酸の単離方法に関する。以下、本発明の具体的な実施形態を説明することにより、本発明を明らかにする。
　（第１の実施形態に係る核酸の単離方法）
　本発明の第１の実施形態に係る核酸の単離方法は、核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、抽出溶液中に核酸を分散する工程と、核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、洗浄溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程と、回収溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程と、を備える。上記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含む。上記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下である。上記回収溶液は、ｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。以下、それぞれの工程について説明する。
　（抽出工程）
　本発明の第１の実施形態に係る核酸の単離方法は、核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、抽出溶液中に核酸を分散する工程を備える。以下、本工程を「抽出工程」として説明する。
　上記核酸を含む試料としては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を含む生体試料が挙げられる。このような生体試料としては、例えば、ウイルス、細胞、血液、組織液、糞便等が挙げられる。また、上記核酸を含む試料としては、例えば、土壌、海水、河川水等、環境中の核酸を含む試料であってもよく、特に限定されない。
　上記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含む。タンパク質変性剤は、タンパクと相互作用することで、タンパクの高次構造を崩し、核酸を抽出溶液中に溶解させる役割を有するものである。タンパク質変性剤としては、例えば、界面活性剤、還元剤、グアニジン誘導体、チオ尿素、尿素、もしくはこれらの塩等を用いることができる。界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリオキエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等を用いることができる。還元剤としては、例えば、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）等を用いることができる。また、上記塩としては、例えば、グアニジン塩酸塩等の塩を用いることができる。これらのタンパク質変性剤は、１種類を単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。
　抽出溶液中におけるタンパク質変性剤の濃度は、特に限定されないが、好ましくは２ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは４ｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは８ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは１０ｍｏｌ／Ｌ以下である。タンパク変性剤の濃度を上記範囲内とすることにより、核酸をより一層確実に抽出することができる。なお、タンパク質変性剤を２種以上有する場合は、合計の濃度が上記範囲内であることが好ましい。
　抽出溶液は、タンパク質変性剤として両性イオン化合物を含むことが好ましい。
　抽出溶液に上記タンパク質変性剤として非イオン性界面活性剤等を用いた場合、核酸の回収率を高められるものの、後工程における検査や分析において、ＰＣＲ等の反応が阻害される場合がある。よって、非イオン性界面活性剤の添加量を減らしたり、別途洗浄工程を設けたりする必要があり、短時間で核酸を抽出することが難しい場合がある。一方で、非イオン性界面活性剤のようなタンパク質変性剤を用いない場合、核酸の回収率を十分に高められないという問題がある。
　上記抽出溶液が両性イオン化合物を含む場合、核酸を含む試料に両性イオン化合物を接触させると、試料中に含まれるヒストンなどのタンパク質におけるカチオン性官能基と、両性イオン化合物のアニオン性官能基とが相互作用する。それによって、タンパク質と核酸との結合を切断し、核酸を効率よく抽出することができる。そのため、後工程において核酸をより一層効率よく回収することができる。
　また、両性イオン化合物は、同時にカチオン性官能基を有するため、核酸の電荷的結合点を付与することもできる。具体的には、両性イオン化合物のアニオン性官能基は核酸の塩基とも結合を形成することから、両性イオン化合物のカチオン性官能基により、核酸が電気的に中性となることを抑制することができる。電気的に中性になると、核酸同士での凝集が進み、ＰＣＲ等の反応効率が低減するが、両性イオン化合物により核酸が電気的に中性となることを抑制することで、短時間での分析が求められるＰＣＲ等の分析において、より一層分析精度を高めることができる。
　上記両性イオン化合物は、界面活性を有さないことが好ましい。本明細書において、界面活性を有さないとは、グリフィン法により得られるＨＬＢ値が０～６ないし１３～２０であるということである。この場合、後工程における検査や分析において、ＰＣＲ等の反応の阻害をより一層抑制することができ、より一層短時間で核酸を抽出することができる。
　このような両性イオン化合物は、特に限定されないが、アミノ酸又はアミノ酸誘導体、ヌクレオチド、及び上記モノマーに由来する繰り返し構造単位を有するポリマーを用いることができる。なかでも、両性イオン化合物としては、アミノ酸又はアミノ酸誘導体であることが好ましい。この場合、核酸をより一層短時間でかつ効率よく回収することができる。
　アミノ酸又はアミノ酸誘導体としては、特に限定されないが、例えば、グリシン等の天然アミノ酸、アセチルシステイン、Ｄ－アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノフォスフォン酸、及び上記モノマーに由来する繰り返し構造単位を有するポリマーを用いることができる。
　また、このような両性イオン化合物のうち、市販されているものとしては、例えば、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（日油社製）、ＰＮＡ（コスモ・バイオ社製）等が挙げられる。
　両性イオン化合物は、１種を単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。
　上記抽出溶液が両性イオン化合物を含む場合、上記抽出溶液中に含まれる両性イオン化合物の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは１０．０ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは８．０ｍｏｌ／Ｌ以下である。核酸抽出溶液中に含まれる両性イオン化合物の濃度が上記範囲内にある場合、核酸をより一層短時間でかつ効率よく回収することができる。
　上記抽出溶液は、価数が２価以上の金属カチオンを含むことが好ましい。２価以上の金属カチオンとしては、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等が挙げられる。上記抽出溶液が２価以上の金属カチオンを含む場合、核酸の回収率をより一層高めることができる。
　上記抽出溶液が２価以上の金属カチオンを含む場合、核酸を含む試料を抽出溶液に添加した際に、負の電荷を帯びた核酸に金属カチオンがイオン結合する。このような金属カチオンがイオン結合した核酸が抽出された後の抽出溶液をアニオン性吸着体と接触させると、図３（ａ）に示すように金属カチオンがアニオン性吸着体とイオン結合する。それによって、金属カチオンを介して核酸をアニオン性吸着体に吸着させることができる。
　上記抽出溶液は、さらに共沈剤を含んでもよい。共沈剤としては、例えば、ｔＲＮＡ、ポリアデニン、アクリルアミド系ポリマー、グリコーゲン等が挙げられる。上記抽出溶液がさらに共沈剤を含む場合、より一層効率的に核酸をアニオン性吸着体に吸着させることができる。
　また、上記金属カチオンは、あらかじめ抽出溶液に添加していても核酸の抽出を阻害しない。したがって、核酸の抽出に煩雑な工程を必要としない。
　上記抽出溶液が２価以上の金属カチオンを含む場合、上記抽出溶液中に含まれる２価以上の金属カチオンの濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは６．０ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは５．０ｍｏｌ／Ｌ以下である。上記抽出溶液中に含まれる２価以上の金属カチオンの濃度が上記範囲内にある場合、核酸をより一層短時間でかつ効率よく回収することができる。
　上記抽出溶液は、上述した成分以外に、ｐＨ調整剤、安定化剤等の他の成分をさらに含んでいてもよい。
　（吸着工程）
　次に、本発明の第１の実施形態に係る核酸の単離方法は、核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程を備える。以下、本工程を「吸着工程」として説明する。
　図１は、本発明の第１の実施形態に係る核酸の単離方法で用いるチップを示す模式的平面図である。また、図２は、図１のＡ－Ａ線に沿う部分の模式的断面図である。なお、以下の説明において、チップ１を含むマイクロ流体デバイスを用いて核酸の単離を行っているが、他の容器を用いて核酸の単離を行ってもよく、特に限定されない。
　図１及び図２に示すように、チップ１は、流体が送液される流路２を有する。流路２の途中には、回収部３が設けられている。従って、流路２は、回収部３より上流側に設けられた上流側流路２ａと、回収部３より下流側に設けられた下流側流路２ｂとを有する。なお、チップ１は、板状の基板５と、カバー部材６とを有する。カバー部材６は、基板５の主面５ａ上において、基板５の凹部５ｂの開口を閉成するように設けられている。それによって、上流側流路２ａ、回収部３、及び下流側流路２ｂが形成されている。基板５を構成する材料は、特に限定されず、例えば、合成樹脂、ゴム、金属などを用いることができる。また、カバー部材６は、例えば、樹脂フィルムなどの可撓性を有する材料により構成することができる。
　アニオン性吸着体；
　回収部３には、核酸を担持させ、回収するためのアニオン性吸着体４が配置されている。アニオン性吸着体４は、核酸を担持させるための担持体である。
　アニオン性吸着体４の形態は、特に限定されないが、例えば、膜、フィルター、プレート、繊維状、チューブ、粒子、多孔質等の形態で用いることができる。アニオン性吸着体４の形状は、繊維、粒子、又は多孔質体であることが好ましい。
　アニオン性吸着体４としては、特に限定されないが、例えば、ケイ素化合物類、リン酸塩鉱物類、ケイ酸塩鉱物類、又はアルミノケイ酸塩鉱物類等により構成することができる。ケイ素化合物類としては、例えば、シリカ、ガラス等が挙げられる。リン酸塩鉱物類としては、ヒドロキシアパタイト等が挙げられる。ケイ酸塩鉱物類としては、タルク、モンモリロナイト等が挙げられる。アルミノケイ酸塩鉱物類としては、ゼオライト等が挙げられる。これらは、１種を単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。
　アニオン性吸着体４としては、シリカ繊維やガラス繊維であることが好ましく、シリカ繊維であることがより好ましい。本実施形態では、アニオン性吸着体４としてシリカ繊維を用いている。もっとも、アニオン性吸着体４は、シリカ粒子であってもよく、シリカの多孔質体であってもよい。
　上記吸着工程では、上記抽出工程において得られた核酸を含む抽出溶液を、上流側流路２ａから回収部３に送液し、アニオン性吸着体４に接触させる。上記吸着工程により、上記抽出溶液に含まれる核酸がアニオン性吸着体４に吸着される。
　（洗浄工程）
　次に、本発明の第１の実施形態に係る核酸の単離方法は、洗浄溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程を備える。また、上記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下である。以下、本工程を「洗浄工程」として説明する。
　本発明の第１の実施形態に係る核酸の単離方法において、上記洗浄工程は、洗浄溶液を上流側流路２ａから回収部３に送液し、アニオン性吸着体４に接触させる工程である。上記洗浄工程により、上記洗浄溶液に含まれる塩基性化合物を介して、核酸とアニオン性吸着体４との間に架橋構造が形成される。また、上記洗浄工程により、アニオン性吸着体４に吸着されている夾雑物を洗い流すことができる。
　塩基性化合物；
　上記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが上記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下である。従って、上記洗浄溶液中において、上記塩基性化合物は一部が正に帯電したカチオンとして存在している。この場合、図３（ａ）に示すように、アニオン性吸着体４と核酸（通常、負に帯電している）との間に上記カチオンが架橋構造を形成することで、核酸を強固にアニオン性吸着体４に吸着させることができる。さらに、塩基性化合物がカチオンとして洗浄溶液中に溶解していることにより、核酸と均一に架橋構造を形成でき、核酸の回収率を高めやすくなる。
　なお、本明細書において塩基性化合物とは、ブレンステッド・ローリーの定義に基づき、プロトン（Ｈ＋）を受け取る化合物又はそのイオンをいう。また、塩基性化合物の共役酸のｐＫａは、塩基性化合物が多段階電離をする場合は、１段階電離のときの共役酸の酸解離定数ｐＫａ１を意味する。
　上記塩基性化合物は、モノマー、オリゴマー、ポリマーのいずれであってもよく、これらを組み合わせてもよい。マイクロ流体デバイスで用いる場合は、増粘効果の低いモノマーであることが好ましい。なお、モノマーの重量平均分子量は７００以下であることが好ましい。オリゴマーの重量平均分子量は、１万未満であることが好ましい。ポリマーの重量平均分子量は、１万以上であることが好ましい。
　上記塩基性化合物は、共役酸のｐＫａが好ましくは４以上であり、より好ましくは４．５以上であり、好ましくは６以下であり、より好ましくは５．５以下である。共役酸のｐＫａが上記範囲内である場合、核酸をより効率的に抽出することができる。
　なお、上記塩基性化合物は、１価の塩基であっても、２価以上の塩基であってもよいが、２価以上の塩基であることが好ましい。この場合、核酸をより強固に吸着させることができる。
　上記塩基性化合物は、アミノ基を有することが好ましい。上記塩基性化合物がアミノ基を有するモノマーである場合、このようなモノマーとしては、例えば、ポリアミン系モノマー、ラジカル反応性アミンモノマー、重縮合性アミンモノマー、アミノ糖類、又はピリジン類等が挙げられる。これらのモノマーは、１種を単独で用いてもよく、複数を併用してもよい。
　ポリアミン系モノマーとしては、例えば、メラミン、ピペラジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、メトキシアミン、ジメチルヒドロキシアミン、トリスジメチルアミノエチルアミン、ジエチレントリアミン、メチルアミノアセトニトリル、ジエチルアミノアセトニトリル、ニトロウレア、アミノエチルモルフォリン、ヘキサメチレンテトラアミン、トリエチレンジアミン、ジメチルヒドロキシアミン、イソキノリン、ヒスチジン、ベンゾイミダゾール、ビグアニド、スペルミン、スペルミジン、プトレッシン等が挙げられる。
　ラジカル反応性アミンモノマーとしては、例えば、アリルアミン、アクリルアミン等が挙げられる。
　重縮合性アミンモノマーとしては、例えば、ポリエチレンイミン等が挙げられる。
　アミノ糖類としては、例えば、アカルボース、Ｎ－アセチルノイラミン酸、ホスホリボシルアミン、グルコサミン等が挙げられる。
　ピリジン類としては、例えば、ピリジン、ニコチン酸、コチン酸アミド、イソニアジド、ニコチン、ブルシン、ビタミンＢ６等が挙げられる。
　上記塩基性化合物がアミノ基を有するポリマーである場合、このようなポリマーとしては、例えば、長鎖ポリアミン（ＬＣＰＡｓ）類、アミノ糖系多糖類、ピリジン系ポリマー、上記モノマーに由来する繰り返し構造単位を有するポリマー等が挙げられる。これらのポリマーは、１種を単独で用いてもよく、複数を併用してもよい。
　長鎖ポリアミン（ＬＣＰＡｓ）類としては、例えば、シラフィンやｓｉｌａｃｉｄｉｎ等が挙げられる。
　アミノ糖系多糖類としては、例えば、キトサン等が挙げられる。
　ピリジン系ポリマーとしては、ポリピリジン、ポリアルキルピリジニウム（ｐｏｌｙａｌｋｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ）等が挙げられる。
　オリゴマーとしては、例えば、上記モノマーに由来する繰り返し構造単位を有するオリゴマーを用いることができる。
　なかでも、核酸をより一層確実にアニオン性吸着体４に担持させる観点から、上記塩基性化合物としては、メラミン、ピペラジン、又は１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）が好ましく、メラミンがより好ましい。メラミンの水溶液中におけるｐＫａは、５．０～５．１である。そのため、ｐＨが７の水溶液中では、下記式（１）に示すように、非電離状態となる。また、ｐＨが４の水溶液中では、下記式（２）～（４）に示すように、一部又は全部が電離し、１価～３価のカチオンとなる。従って、メラミンは、ｐＫａが４以上、６以下の化合物として好適に用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　上記洗浄溶液のｐＨは、上記ｐＫａ以下である限りにおいて、特に限定されない。もっとも、上記塩基性化合物を介してアニオン性吸着体４により一層確実に担持させる観点からは、上記ｐＫａと上記洗浄溶液のｐＨとの差が、好ましくは１以上、より好ましくは２以上である。上記ｐＫａと上記洗浄溶液のｐＨとの差の上限値は、特に限定されないが、例えば、５とすることができる。
　上記洗浄溶液中における塩基性化合物の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは１ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。塩基性化合物の濃度が、上記範囲内にある場合、核酸を塩基性化合物を介してアニオン性吸着体４により一層確実に担持させることができる。
　なお、本発明においては、アニオン性吸着体４の形状が、繊維又は多孔質体の場合は、上記化合物が、モノマーであることが好ましい。この場合、アニオン性吸着体４と上記化合物との接触をより一層効率良く行うこができる。
　また、アニオン性吸着体４の形状が、粒子である場合は、アミン系化合物が、ポリマーであることが好ましい。この場合、アニオン性吸着体４とアミン系化合物との接触をより一層効率良く行うことができる。
　（回収工程）
　次に、本発明の第１の実施形態に係る核酸の単離方法は、回収溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程を備える。以下、本工程を「回収工程」として説明する。
　本発明の第１の実施形態に係る核酸の単離方法において、上記回収工程は、回収溶液を上流側流路２ａから回収部３に送液し、アニオン性吸着体４に接触させる工程である。このとき、回収溶液のｐＨは上記塩基性化合物のｐＫａよりも大きいため、回収溶液中において、上記塩基性化合物の大部分は非電離状態となる。そのため、回収溶液を回収部３に送液すると、図３（ｂ）に示すように、負に帯電した核酸及び塩基性化合物間と、アニオン性吸着体４及び塩基性化合物間におけるイオン結合が崩壊する。従って、回収溶液を回収部３に送液すると、核酸をアニオン性吸着体４から単離させ、回収口７から核酸を回収することができる。なお、回収溶液のｐＨと上記ｐＫａとの差は、好ましくは１以上、より好ましくは２以上である。回収溶液のｐＨと上記ｐＫａとの差の上限値は、特に限定されないが、例えば、３とすることができる。
　このように、本実施形態における核酸の単離方法では、抽出溶液と、塩基性化合物を含み、かつｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下である洗浄溶液とを用いて、核酸をアニオン性吸着体４に強固に吸着させることができる。また、ｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である回収溶液を用いて、核酸をアニオン性吸着体４から単離させ、回収することができる。従って、本実施形態の核酸の単離方法では、アルコールを用いずとも、抽出溶液、洗浄溶液、及び回収溶液により容易に核酸を回収することができる。
　また、回収溶液のｐＨは、塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上であればよく、例えば、中性であってもよい。そのため、中性の回収溶液により核酸を単離させ、回収することができるので、後工程の検査や分析において酵素反応等の反応が阻害されることを抑制することもできる。
　（その他の工程）
　なお、本発明の第１の実施形態に係る核酸の単離方法は、上述した工程以外の工程を任意で含んでいてもよい。例えば、上記吸着工程の後に、乾燥工程等のその他の工程を含んでいてもよい。
　（第２の実施形態に係る核酸の単離方法）
　本発明の第２の実施形態に係る核酸の単離方法は、核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、抽出溶液中に核酸を分散する工程と、核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、回収溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程と、を備える。抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下である。回収溶液は、ｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。
　第２の実施形態に係る核酸の単離方法では、抽出溶液が塩基性化合物を含み、かつｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下である点において、第１の実施形態に係る核酸の単離方法と相違する。
　上記の点を除き、第２の実施形態に係る核酸の単離方法としては、第１の実施形態に係る核酸の単離方法と同様の工程を採用することができる。なお、第２の実施形態に係る核酸の単離方法においては、洗浄工程を必ずしも設ける必要はない。第２の実施形態に係る核酸の単離方法において洗浄工程を設けない場合、より簡便、迅速に核酸を単離することができる。一方、本発明の第２の実施形態に係る核酸の単離方法において洗浄工程を設ける場合、より夾雑物の少ない核酸を単離することができる。なお、第２の実施形態に係る核酸の単離方法において、洗浄溶液としては、ｐＨが上記塩基性化合物のｐＫａ以下である溶液であればよい。この場合、核酸をアニオン性吸着体に吸着させたまま、夾雑物等を洗い流すことができる。
　本発明の第２の実施形態に係る核酸の単離方法によれば、アルコールを用いずとも、抽出溶液及び回収溶液により容易に核酸を回収することができる。
　［核酸の単離キット］
　本発明は、核酸の単離キットにも関する。
　（第１の実施形態に係る核酸の単離キット）
　本発明の第１の実施形態に係る核酸の単離キットは、抽出溶液と、洗浄溶液と、回収溶液と、アニオン性吸着体と、を含む。また、抽出溶液は、タンパク質変性剤を含む。洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下である。回収溶液は、ｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。第１の実施形態に係る核酸の単離キットであれば、上述の第１の実施形態に係る核酸の単離方法を用いることにより、アルコールを用いずとも、抽出溶液、洗浄溶液及び回収溶液により容易に核酸を単離することができる。
　第１の実施形態に係る核酸の単離キットにおいて、上記抽出溶液、洗浄溶液、回収溶液、及びアニオン性吸着体としては、上述の第１の実施形態に係る核酸の単離方法において説明したものと同様のものを用いることができる。
　（第２の実施形態に係る核酸の単離キット）
　また、本発明の第２の実施形態に係る核酸の単離キットは、抽出溶液と、回収溶液と、アニオン性吸着体と、を含む。また、抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下である。回収溶液は、ｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。第２の実施形態に係る核酸の単離キットであれば、上述の第２の実施形態に係る核酸の単離方法を用いることにより、アルコールを用いずとも、抽出溶液及び回収溶液により容易に核酸を回収することができる。
　第２の実施形態に係る核酸の単離キットにおいて、上記抽出溶液、回収溶液、及びアニオン性吸着体としては、上述の第２の実施形態に係る核酸の単離方法において説明したものと同様のものを用いることができる。また、第２の実施形態に係る核酸の単離キットは、洗浄溶液をさらに含んでいてもよい。洗浄溶液としては、第２の実施形態に係る核酸の単離方法において説明したものと同様のものを用いることができる。
　第１の実施形態及び第２の実施形態に係る核酸の単離キットにおいて、抽出溶液、洗浄溶液、及び回収溶液は、第１の容器、第２の容器、及び第３の容器にそれぞれ収納されていることが好ましい。また、上記アニオン性吸着体は、上部と下部が開口しているカラムの内部に保持されていることが好ましい。さらに、上記第１の容器、第２の容器、第３の容器、及びカラムは、これらを箱に収納した状態で提供されることが好ましい。また、上記箱には当該核酸の単離キットの使用方法等を説明する添付文書がさらに収納されていることが好ましい。
　［検査チップ］
　本発明は、検査チップにも関する。
　（第１の実施形態に係る検査チップ）
　本発明の第１の実施形態に係る検査チップは、核酸を含む抽出溶液を保持する抽出溶液保持部と、洗浄溶液を保持する洗浄溶液保持部と、回収溶液を保持する回収溶液保持部と、アニオン性吸着体を含む回収部と、核酸分析部と、を備える。また、抽出溶液は、タンパク質変性剤を含む。洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下である。回収溶液は、ｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。
　第１の実施形態に係る検査チップにおいて、上記抽出溶液、洗浄溶液、回収溶液、及びアニオン性吸着体としては、上述の第１の実施形態に係る核酸の単離方法において説明したものと同様のものを用いることができる。
　図４は、本発明の第１の実施形態に係る検査チップにおける流路構造の一例を示す模式図である。また、図５は、図４のＢ－Ｂ線に沿う部分の正面断面図である。
　図４及び図５において、検査チップ１１は、基板１２と、封止シート１３とを備える。基板１２は、特に限定されないが、本実施形態では、矩形板状の形状を有する。基板１２は、封止シート１３側の面である第１の面１２ａと、第１の面１２ａに対向している第２の面１２ｂとを有する。検査チップ１１において、第１の面１２ａ側に設けられた複数の溝部が封止シート１３によって封止されることにより、第１～第５の流路２４Ａ～２４Ｅ、及び回収部２８が形成されている。また、回収部２８には、アニオン性吸着体１４が設けられている。
　基板１２を構成する材料としては、例えば合成樹脂等の適宜の材料からなる。封止シート１３を構成する材料としては、例えば樹脂フィルム等が挙げられる。
　第１～第３の流路２４Ａ～２４Ｃは、上流端がマイクロポンプ２３Ａ～２３Ｃに接続されており、下流端が回収部２８に接続されている。第１の流路２４Ａの途中には抽出液保持部２５が設けられている。第２の流路２４Ｂの途中には洗浄液保持部２６が設けられている。また、第３の流路２４Ｃの途中には、回収液保持部２７が設けられている。
　マイクロポンプ２３Ａ～２３Ｃとしては、特に限定されないが、例えば光ガス発生テープ等が挙げられる。光ガス発生テープとは、光照射により気体を発生することができるテープである。
　第４の流路２４Ｄは、上流端が回収部２８に接続されており、下流端が廃液部２９に接続されている。また、第４の流路２４Ｄの途中には、弁部２１Ａが、第４の流路２４Ｄを開閉可能とするように設けられている。
　第５の流路２４Ｅは、上流端が回収部２８に接続されており、下流端が核酸分析部２２に接続されている。また、第５の流路２４Ｅの途中には、弁部２１Ｂが第５の流路２４Ｅを開閉可能とするように設けられている。
　核酸分析部；
　回収溶液によって核酸が単離された後、核酸分析部２２において核酸の分析が行われる。核酸分析部２２において行われる核酸の分析方法としては、特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等が挙げられる。核酸の単離と分析とを迅速に行うため、核酸の分析に用いられる試薬が核酸分析部２２にあらかじめ設けられていることが好ましい。このような核酸の分析に用いられる試薬としては、例えばＰＣＲ用のプライマーやポリメラーゼ等が挙げられる。
　次に、第１の実施形態に係る検査チップを用いた核酸の単離方法の一例について説明する。
　まず、検査チップ１１の系外において、上述した抽出溶液と核酸を含む試料とを混合し、核酸を含む抽出溶液を得る（抽出工程）。次に、核酸を含む抽出溶液を、抽出溶液保持部２５に注入口（図示せず）から注入する。次に、マイクロポンプ２３Ａを駆動し、抽出溶液保持部２５に注入された抽出溶液を回収部２８のアニオン性吸着体１４に接触させた後、廃液部２９に送液する（吸着工程）。なお、このとき弁部２１Ａは開放されており、弁部２１Ｂは閉止されている。次に、マイクロポンプ２３Ｂを駆動し、洗浄溶液保持部２６に保持されている洗浄溶液を回収部２８のアニオン性吸着体１４に接触させた後、廃液部２９に送液する（洗浄工程）。次に、弁部２１Ａを閉止し、弁部２１Ｂを開放する。次に、マイクロポンプ２３Ｃを駆動し、回収溶液保持部２７に保持されている回収溶液をアニオン性吸着体１４に接触させることにより、核酸を単離し、核酸を含む回収溶液を核酸分析部２２に送液する（回収工程）。
　第１の実施形態に係る検査チップであれば、上記第１の実施形態に係る核酸の単離方法を用いることにより、アルコールを用いずとも、抽出溶液、洗浄溶液及び回収溶液により容易に核酸を単離、分析することができる。
　なお、第１の実施形態に係る検査チップの構造、及びこれを用いた核酸の単離方法は一例であり、本発明の目的を達成できる範囲内において適宜変更できる。
　（第２の実施形態に係る検査チップ）
　本発明の第２の実施形態に係る検査チップは、核酸を含む抽出溶液を保持する抽出溶液保持部と、回収溶液を保持する回収溶液保持部と、アニオン性吸着体を含む回収部と、核酸分析部と、を備える。抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下である。また、回収溶液は、ｐＨが塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である。
　第２の実施形態に係る検査チップにおいて、上記抽出溶液、回収溶液、及びアニオン性吸着体としては、上述の第２の実施形態に係る核酸の単離方法において説明したものと同様のものを用いることができる。
　また、第２の実施形態に係る検査チップは、洗浄溶液を保持する洗浄溶液保持部をさらに含んでいてもよい。洗浄溶液としては、上述の第２の実施形態に係る核酸の単離方法において説明したものと同様のものを用いることができる。
　第２の実施形態に係る検査チップとしては、第１の実施形態に係る検査チップと同様の構造の検査チップを用いることができる。なお、第２の実施形態に係る検査チップにおいては、洗浄溶液保持部を必ずしも設ける必要はない。第２の実施形態に係る検査チップにおいて、洗浄溶液保持部を設けない場合、より簡便、迅速に核酸を単離することができる。一方、第２の実施形態に係る検査チップにおいて、洗浄溶液保持部を設ける場合、より夾雑物の少ない核酸を単離することができる。
　第２の実施形態に係る検査チップを用いた核酸の単離方法としては、第１の実施形態に係る検査チップを用いた核酸の単離方法と同様の方法を採用することができる。なお、第２の実施形態に係る検査チップを用いた核酸の単離方法としては、洗浄工程を必ずしも設ける必要はない。第２の実施形態に係る検査チップにおいて、洗浄工程を設けない場合、より簡便、迅速に核酸を単離することができる。一方、第２の実施形態に係る検査チップにおいて、洗浄工程を設ける場合、より夾雑物の少ない核酸を単離することができる。
　第２の実施形態に係る検査チップであれば、上述の第２の実施形態に係る核酸の単離方法を用いることにより、アルコールを用いずとも、抽出溶液、洗浄溶液及び回収溶液により容易に核酸を単離、分析することができる。
　なお、第２の実施形態に係る検査チップの構造、及びこれを用いた核酸の単離方法は一例であり、本発明の目的を達成できる範囲内において適宜変更できる。
　以下、本発明の具体的な実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を明らかにする。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　（実施例１）
　実施例１では、以下のようにして図１及び図２に示すチップ１を作製した。
　基板５を構成する材料として、シクロオレフィンポリマーを用い、これを射出成形することにより、凹部５ｂを有する基板５を作製した。また、カバー部材６には、封止テープを用い、封止テープで基板５の凹部５ｂを閉成することによりチップ１を作製した。なお、回収部３には、アニオン性吸着体４としてシリカ繊維（ＧＥヘルスケア社製「ＧＦ／Ｄ」、２ｍｍφ、厚み０．８ｍｍ）を配置した。なお、流路２の幅は、０．８ｍｍとし、深さは０．５ｍｍとした。
　このようなチップ１を用いて、以下のようにしてＲＮＡ回収率を測定した。
　ＲＮＡの単離；
　まず、チップ１の系外において、ウイルス（ＡＴＣＣ社製のＦｌｕＡ　Ｈ１Ｎ１；５０００コピー）を表１に示す組成の抽出溶液５００μＬに添加し、核酸（ＲＮＡ）を抽出溶液中に分散させた抽出溶液を得た。なお、表１に示す共沈剤（ポリアデニン）は、抽出溶液５００μＬあたり３μｇ添加した。次に、上記のＲＮＡを含む抽出溶液１５０μＬを回収部３に送液し、ＲＮＡをシリカ繊維に吸着させた。ＲＮＡを含む抽出溶液の送液後に、表１に示す洗浄溶液２００μＬを回収部３に送液し、シリカ繊維を洗浄した。
　次に、回収溶液としてＴｒｉｓ－ＨＣｌ　Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ、ｐＨ８．５）３０μＬを回収部３に送液することにより、回収部３に担持されたＲＮＡを単離させ、回収した。
　（ＲＮＡ回収率の算出）
　次に、核酸を回収した回収溶液のうち２μＬを取り出し、ＴａｑＰａｔｈ　ｑＰＣＲ　ａｎｄ　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、ＰＣＲ反応溶液を調整した。なお、ＰＣＲ用のプライマーとしては、バイオサーチテクノロジー社製のＰＤＭ　２００９　Ｈ１Ｎ１検出用プライマー（ＩｎｆＡ，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ａ　Ｐｒｉｍｅｒ）を用いた。
　また、スタンダードとして、同じウイルスをＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ　Ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを用いて抽出・精製した溶液を２μＬ入れたＰＣＲ反応溶液（核酸濃度は１００，０００・５０，０００・５，０００・５００ｃｏｐｉｅｓ/μＬの４水準）も調整した。
　次に、回収溶液から調整したＰＣＲ反応溶液及びスタンダードＰＣＲ反応溶液をサーマルサイクラー「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社）」を用いて増幅した。増幅は９５℃－２０秒にて加熱した後、９５℃－３秒、６０℃－５秒のサイクルを４５回行った。
　増幅後、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒがスタンダードから自動計算する事により得られる核酸量から、以下の計算式によりＲＮＡ回収率（核酸回収率）を算出した。
　核酸回収率（％）＝｛（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒが算出した核酸量×回収液量／２）×１００｝／５，０００
　（実施例２～７）
　抽出溶液、洗浄溶液中に含まれる化合物の種類及び添加量を下記の表１のように変更したこと、さらに実施例６においては洗浄工程を設けなかったこと以外は、実施例１と同様にしてＲＮＡ回収率を求めた。結果を下記の表１に示す。なお、実施例２のＤＡＢＣＯの共役酸のｐＫａは４．２であり、実施例３のピペラジンの共役酸のｐＫａは５．７である。また、表１では、ｍｏｌ／ＬをＭで表している。
　（比較例１）
　比較例１では、洗浄溶液としてエタノール２００μＬを用いたこと以外は、実施例１と同様にしてＲＮＡ回収率を求めた。
　（比較例２）
　比較例２では、ＲＮＡを含む抽出溶液の送液後に、洗浄溶液を送液しなかったこと以外は、実施例１と同様にしてＲＮＡ回収率を求めた。
　結果を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明によれば、アルコールを用いる必要がなく、核酸を簡便に抽出することができる核酸の単離方法、核酸の単離キット、及び検査チップを提供することができる。
１…チップ
２…流路
２ａ…上流側流路
２ｂ…下流側流路
３…回収部
４…アニオン性吸着体
５…基板
５ａ…主面
５ｂ…凹部
６…カバー部材
７…回収口
１１…検査チップ
１２…基板
１２ａ，１２ｂ…第１，第２の面
１３…封止シート
１４…アニオン性吸着体
２１Ａ，２１Ｂ…第１，第２の弁部
２２…核酸分析部
２３Ａ～２３Ｃ…マイクロポンプ
２４Ａ～２４Ｅ…第１～第５の流路
２５…抽出液保持部
２６…洗浄液保持部
２７…回収液保持部
２８…回収部
２９…廃液部

Claims (13)

  1. 　核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、前記抽出溶液中に前記核酸を分散する工程と、
    　前記核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、
    　洗浄溶液を前記アニオン性吸着体に接触させる工程と、
    　回収溶液を前記アニオン性吸着体に接触させる工程と、
    を備え、
    　前記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含み、
    　前記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、
    　前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である、核酸の単離方法。
  2. 　前記抽出溶液は、価数が２価以上である金属カチオンをさらに含む、請求項１に記載の核酸の単離方法。
  3. 　核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、前記抽出溶液中に前記核酸を分散する工程と、
    　前記核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、
    　回収溶液を前記アニオン性吸着体に接触させる工程と、
    を備え、
    　前記抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、
    　前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である、核酸の単離方法。
  4. 　前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａが４以上、６以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸の単離方法。
  5. 　前記塩基性化合物が、アミノ基を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸の単離方法。
  6. 　前記抽出溶液が、さらに両性イオン化合物を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸の単離方法。
  7. 　前記アニオン性吸着体にアルコールを含む溶液を接触させる工程を含まない、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸の単離方法。
  8. 　抽出溶液と、
    　洗浄溶液と、
    　回収溶液と、
    　アニオン性吸着体と、
    を含み、
    　前記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含み、
    　前記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、
    　前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である、核酸の単離キット。
  9. 　前記抽出溶液は、価数が２価以上である金属カチオンをさらに含む、請求項８に記載の核酸の単離キット。
  10. 　抽出溶液と、
    　回収溶液と、
    　アニオン性吸着体と、
    を含み、
    　前記抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、
    　前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である、核酸の単離キット。
  11. 　核酸を含む抽出溶液を保持する抽出溶液保持部と、
    　洗浄溶液を保持する洗浄溶液保持部と、
    　回収溶液を保持する回収溶液保持部と、
    　アニオン性吸着体を含む回収部と、
    　核酸分析部と、
    を備え、
    　前記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含み
    　前記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、
    　前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である、検査チップ。
  12. 　前記抽出溶液は、価数が２価以上である金属カチオンをさらに含む、請求項１１に記載の検査チップ。
  13. 　核酸を含む抽出溶液を保持する抽出溶液保持部と、
    　回収溶液を保持する回収溶液保持部と、
    　アニオン性吸着体を含む回収部と、
    　核酸分析部と、
    を備え、
    　前記抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以下であり、
    　前記回収溶液は、ｐＨが前記塩基性化合物の共役酸のｐＫａ以上である、検査チップ。
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