FR2966826A1 - Procede de concentration de composes echantillons et d'amplification d'acides nucleiques - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de concentration de composés échantillons et de multiplication des acides nucléiques renfermés dans ces composés échantillons à partir d'un échantillon biologique, selon lequel les acides nucléiques sont amplifiés sur le même filtre que celui sur lequel les composés échantillons ont été séparés.

Description

Etat de la technique La présente invention a pour objet un procédé de concentration de composés échantillons et de multiplication des acides nucléiques renfermés dans ces composés échantillons.

Dans le cadre du diagnostic des maladies infectieuses, la preuve de résistances aux antibiotiques est de plus en plus importante en raison de l'augmentation croissante de ces résistances, en particulier chez le MRSA et la résistance aux fluoroquinolones chez E.coli, ainsi que chez des bactéries qui déclenchent la tuberculose, la septicémie ou la pneumonie. Dans les processus de diagnostic classiques, ces résistances sont généralement détectées à partir de cultures cellulaires. Une telle détection correspond toutefois à un procédé onéreux en temps dans la mesure où deux à trois jours sont nécessaires pour la culture et l'exploitation des résultats. L'analyse de l'ADN des bactéries permet de déterminer ces résistances notablement plus rapidement. A cet effet, l'ADN des germes doit être amplifié. De telles amplifications peuvent par exemple être effectuées en utilisant des ADN-et ARN-polymérases (Nucleic Acid Sequence Based Amplification ; NASBA), par polymérisation et déplacement de brins (Rolling Circle Amplification ; RCA) ou à l'aide de ligases (Ligase Chain Reaction : LCR). Toutefois, en raison de sa spécificité et de sa sensibilité élevée, la réaction en chaine par polymérase (PCR) correspond à la méthode d'amplification la plus couramment utilisée. En règle générale, à cet effet, le matériau renfermant les acides nucléiques est traité et purifié avant la PCR. Les protocoles de traitement des acides nucléiques comportent plusieurs étapes lors desquelles des cellules ou des virus sont enrichis par exemple par centrifugation, et les acides nucléiques sont isolés par lyse cellulaire et différentes étapes de lavage.

Le brevet européen EP 0389063 B2 décrit un procédé de purification d'usage courant en plusieurs étapes selon lequel l'ADN est immobilisé sur une phase solide renfermant de la silice en présence de sels chaotropiques. Selon ce procédé, les cellules sont tout d'abord lysées avec un tampon chaotropique. Le lysat est mis en contact avec une phase solide renfermant de la silice sur laquelle l'ADN se lie. 1

2 Ensuite, la phase solide sur laquelle est immobilisé l'ADN est séparée du reste du lysat et le complexe d'ADN est lavé. Enfin, et en fonction de l'utilisation finale, l'ADN est élué de la phase solide ou directement amplifié à l'état lié.

Par rapport à un tel procédé, les systèmes dits de « micro-analyse totale » (g Total Analysis System, g TAS) présentent l'avantage de permettre de rassembler différentes étapes, de les automatiser et simultanément de les réduire à une échelle microscopique. Le potentiel de tels systèmes réside principalement dans leurs faibles besoins en énergie, les temps de réaction rapides et la réduction des volumes des échantillons et des réactifs de façon à permettre un travail d'analyse à l'échelle des puces (laboratoire sur puce-« lab-on-a-chip »). Un tel système micro-fluidique qui permet l'isolation et l'amplification d'ADN à partir de solutions aqueuses est connu du document WO200465010. Lors de l'utilisation d'un tel système, l'échantillon est tout d'abord filtré au travers d'une membrane, les cellules étant retenues sur la membrane, puis, dans l'étape suivante étant éliminées de la chambre de filtration avec la membrane. Après introduction de la membrane dans le système micro-fluidique proprement dit, les cellules sont lavées, lysées puis, l'ADN est amplifié ; pour l'amplification la membrane est enlevée de l'appareil puis à nouveau introduite dans celui-ci. L'ADN amplifié est ensuite détecté alors qu'il s'écoule au travers d'un canal. Toutefois la préparation d'un g-TAS robuste pour le diagnostic est compliqué non seulement par les nombreuses étapes nécessaires entre le traitement des échantillons et la réaction PCR mais également, par le fait que, par exemple pour l'analyse de fluides renfermant des cellules ou des virus il est nécessaire de pouvoir disposer pour l'analyse, de quantités notablement plus importantes que quelques gouttes, dans la mesure où dans des tels milieux, il n'y a souvent que très peu de cellules ou de virus. Par exemple, dans le cas de la septicémie, il ne peut y avoir que cinq germes par ml de sang. Il est donc souvent nécessaire de traiter des volumes d'échantillons plus importants (plusieurs ml) pour avoir une chance de trouver suffisamment de cellules ou de virus dans l'analyte.

3 La nécessité qui en résulte de passer de volumes d'échantillons macroscopiques aux quantités souhaitées à l'échelle du microlitre dans un système micro-fluidique est problématique. Description de l'invention L'invention a pour objet de proposer un procédé de concentration de composés échantillons et de multiplication des acides nucléiques renfermés dans de tels composés échantillons à partir d'un échantillon biologique ne nécessitant que peu d'étapes et permettant une automatisation.

L'invention a également pour objet de proposer un dispositif pour la mise en oeuvre d'un tel procédé, remplissant les exigences relatives à une automatisation à l'échelle microscopique. L'invention a ainsi pour objet un procédé de concentration de composés échantillons et de multiplication des acides nucléiques renfermés dans de tels composés échantillons à partir d'un échantillon biologique, comportant les étapes suivantes : 1) Préparation d'un échantillon biologique sous forme liquide, 2) Introduction de cet échantillon dans un système de séparation comportant au moins un filtre, 3) Enrichissement des composés échantillons renfermés dans l'échantillon par séparation de ces composés échantillons sur le filtre, 4) Addition de réactifs d'amplification, et 5) Amplification directe d'au moins un acide nucléique renfermé dans les composés échantillons.

Par le terme « composé échantillon » on doit comprendre dans ce qui suit aussi bien des cellules que des virus. Par le terme « cellule » on doit comprendre dans ce qui suit aussi bien des cellules procaryotes que des cellules eucaryotes. Par le terme « virus » on doit comprendre dans ce qui suit des particules non cellulaires qui possèdent l'information pour permettre leur propagation et leur diffusion, mais ne comportent pas de métabolisme propre, et, qui pour cette raison, dépendent du métabolisme d'une cellule hôte. En dehors de la cellule hôte, les virus se présentent essentiellement sous la forme de virions.

4 Par l'expression « acides nucléiques renfermés dans les composés échantillons » on doit dans ce qui suit comprendre d'une part les acides nucléiques propres (endogènes) y compris les acides nucléiques des mitochondries ou les acides nucléiques de virions.

D'autre part, on doit également toutefois comprendre par cette expression des acides nucléiques étrangers (exogènes) par exemple de virus ayant infecté une cellule. Dans le cas des acides nucléiques, il peut s'agir d'ADN (acide désoxyribo-nucléique), d'ARN (acide ribonucléique) ou également d'ADNc.

L'« échantillon biologique » peut correspondre à tout matériau provenant directement ou indirectement d'organismes vivants ou morts et se trouvant déjà sous forme liquide, ou ayant été dissout de façon à pouvoir être transféré sur le système de filtration. Par le terme « système de séparation » on doit comprendre, dans ce qui suit, un dispositif dans lequel le procédé conforme à l'invention est mis en oeuvre et qui renferme au moins un filtre. Le « système de séparation » peut ainsi également désigner un système comportant plusieurs filtres. En outre, le système de séparation comporte également des branchements d'entrée et de sortie correspondants pour l'échantillon et les réactifs. Par le terme « filtre » on doit comprendre dans ce contexte un élément à l'aide duquel les composés échantillons renfermant les acides nucléiques à amplifier peuvent être séparés d'autres composants de l'échantillon biologique. La séparation sur le filtre, permet ainsi de concentrer et d'enrichir ces composés échantillons. Les composés échantillons peuvent être séparés sur le filtre et également à l'intérieur du matériau filtrant. Par le terme « amplification » on doit comprendre la multiplication souhaitée des acides nucléiques. Celle-ci peut être effectuée par exemple par NASBA, RCA, LCR et/ ou PCR. Par le terme « amplification directe » on doit comprendre la multiplication directe des acides nucléiques sur ou dans le ou les filtre(s) sans qu'auparavant une extraction séparée des acides nucléiques par exemple par lyse cellulaire soit nécessaire. Par le terme « réactifs d'amplification » on doit comprendre tous les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de l'amplification, par exemple des enzymes, tampons, nucléotides, amorces et/ou autres substances auxiliaires. 5 Par le terme « extraction » ou « extraire » on doit comprendre dans ce qui suit le procédé par lequel l'acide nucléique à amplifier est rendu accessible pour l'amplification. De façon surprenante, des composés échantillons ou les acides nucléiques qui y sont contenus peuvent être concentrés et multipliés par le procédé conforme à l'invention avec seulement peu d'étapes de procédé. Cette situation résulte en particulier du fait que l'amplification est directement effectuée sur le filtre, et qu'aucune étape d'extraction séparée des acides nucléiques n'est nécessaire dans la mesure où l'amplification directe comprend une éventuelle ouverture des composés échantillons. On peut ainsi économiser plusieurs étapes. En outre, les étapes jusqu'à présent classiquement séparées dans l'espace d'enrichissement, d'extraction des acides nucléiques, de purification des acides nucléiques et d'amplification peuvent être mises en oeuvre dans un système micro-fluidique dans lequel certaines étapes sont superflues. On peut ainsi réduire le nombre d'étapes et de milieux devant être utilisés, ce notablement, ce qui conduit à une économie importante de temps et de coût. De préférence, les composés échantillons sont des cellules ou de gros virions tels que le virion de la variole.

Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, l'amplification de l'étape 5) est effectuée par PCR et comprend au moins les étapes partielles suivantes : 5.1) Modification du filtre, extraction des acides nucléiques et dénaturation du ou des acide(s) nucléique(s). 5.2) Appariement des amorces, et 5.3) Elongation des amorces. La PCR a pour avantage que la première étape, la dénaturation extrait de façon sûre les acides nucléiques à environ 95°C et les rend disponibles pour l'amplification. Tel est en particulier le cas lorsque les composés échantillons sont des cellules.

6 La modification du filtre a pour conséquences que, dans les étapes ultérieures, ni le ou les acide(s) nucléique(s), ni les réactifs de la PCR ne sont retenus sur le filtre ou se lient à celui-ci, pour affecter et inactiver l'amplification. Ainsi, la modification du filtre conduit à un résultat de PCR amélioré. Une étape d'extraction séparée, qui en raison de l'inactivation ensuite nécessaire des réactifs d'extraction impliquait des processus de purification et de rinçage onéreux n'est ainsi plus nécessaire. Selon un mode de réalisation préférentiel, la modification du filtre dans l'étape 5.1) est effectuée par addition dans l'étape 4), de polymères de blocage du filtre choisis dans le groupe des protéines solubles ou des albumines, par exemple la BSA, ou des polymères synthétiques, de préférence le PEG ou le PPG. L'utilisation de BSA donne de particulièrement bons résultats en ce qui concerne la PCR.

Selon un autre mode de réalisation, dans l'étape 3) le filtre est traversé latéralement, c'est-à-dire que la direction d'écoulement de l'échantillon est transversale ou horizontale par rapport au filtre. L'écoulement latéral a pour avantage que la structure du système de séparation est largement moins complexe que dans des systèmes de filtres à écoulement transversal. De plus, le trajet d'écoulement au travers du filtre est notablement plus court. Ainsi, par exemple en passant d'une direction d'écoulement transversale à une direction découlement latérale, on peut remplacer un filtre à deux couches (Qiamp® Mini Spin column) ayant un diamètre d'environ 8 mm, par un filtre à une seule couche ayant une surface de 3x16 mm ou un diamètre de 8 mm, pour à peu près le même taux de séparation. Le volume de filtration peut ainsi être notablement réduit par rapport à des filtres intégrés transversaux, sans perte de taux de séparation. Dans des applications micro-fluidiques, cette réduction de volume correspond à un avantage important dans la mesure où la totalité de la structure peut être miniaturisée. En outre, des filtres traversés latéralement contribuent à une mise en oeuvre du procédé simple et susceptible d'être automatisée, ce qui favorise notablement un rendement élevé en composés échantillons ainsi que l'amplification ultérieure des acides nucléiques.

7 Tandis que le terme « taux de séparation » désigne le nombre de composés échantillons qui sont retenus par le filtre par unité de temps, le terme « séparation » ou « taux d'efficacité » désigne le pourcentage total de composés échantillons retenus sur le filtre. Dans le cas d'une solution de départ renfermant 1.000 composés échantillons une quantité de 700 composés échantillons retenus sur le filtre correspond à une séparation ou à un taux d'efficacité du filtre de 70 %. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on utilise un filtre de fibres en tant que filtre traversé latéralement. Bien que des filtres de fibres aient des pores relativement gros, ils permettent de séparer des quantités relativement importantes de composés échantillons. Dans le cas de filtres à diaphragmes ayant des pores d'environ 1 µm, seules de faibles quantités « à 10 %) de composés échantillons ayant un diamètre d'environ 1 µm peuvent être séparées, alors que pour des largeurs de pores < à 0,5 µm, on peut atteindre des taux de séparation significatifs. Dans le cas de filtres de fibres traversés latéralement ayant des diamètres de fibres de 1-10 µm et une porosité de 50-90 %, on peut au contraire atteindre un taux de séparation très élevé largement supérieur à 90 %.

En variante, le filtre de fibres est traversé transversalement. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le filtre est choisi dans le groupe formé par les filtres de fibres, de préférence les filtres de fibres renfermant de la silice, de façon particulièrement préférentielle les filtres de fibres de verre, les filtres à diaphragmes et les échangeurs d'ions, de préférence les échangeurs d'anions. On utilise de préférence, des filtres de fibres renfermant de la silice constitués de fibres de verre ayant un diamètre compris entre 0,01 µm et à 40 µm, de préférence entre à 0,1 µm et à 30 µm, et de façon particulièrement préférentielle entre à 0,1 µm et à 5 µm. Le diamètre préférentiel dépend entre autres du diamètre des composés échantillons à concentrer.

8 De surcroit, il est également possible que le filtre renferme un matériau en vrac, donc corresponde à une phase stationnaire. En variante, on peut également mettre en oeuvre des filtres à diaphragmes. Dans les filtres à diaphragmes la filtration s'effectue essentiellement par effet de tamisage. De préférence on met en oeuvre des filtres à diaphragmes de type Supor ® 200 de Pall ayant un diamètre de pores de 0,22 µm. Les largeurs de pores des filtres à diaphragmes dépendent des composés échantillons à filtrer. Dans le cas de bactéries E-coli, une largeur de pores de à 1 µm est appropriée. On peut en outre également utiliser des échangeurs d'ions, en particulier des échangeurs d'anions. Dans les échangeurs d'ions, il y a des interactions intenses entre les molécules de surface chargées des composés échantillons et les groupes d'échange de l'échangeur d'ions. En tant qu'exemple on peut citer l'échangeur d'anions de type StratoSperesTM Ion Exchange SPE PL-MIXED MP de Varian Inc. De façon surprenante, les composés échantillons peuvent également être bien séparés sur des filtres de fibres ayant des pores relativement gros. Ceci est en particulier le cas lorsque les composés échantillons sont des bactéries. Les filtres de fibres on en outre l'avantage de présenter, contrairement aux filtres à diaphragmes, une faible résistance à l'écoulement également en présence de charges relativement élevées. Au contraire, dans le cas des filtres à diaphragmes, on se heurte souvent, principalement dans le cas de concentrations en particules élevées, à un colmatage rapide du filtre, dans la mesure où chaque composé échantillon séparé colmate un pore. Par suite, pour la même pression, le taux de séparation sur des filtres à diaphragmes est plus faible que dans le cas de filtres de fibres. I1 va cependant de soi qu'il est également possible d'utiliser un filtre à diaphragmes et/ou un échangeur d'ions, comme décrit ci-dessus pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, dans la mesure où ces types de filtres présentent également des taux d'efficacité élevés proches de 100 % et par suite, garantissent

9 une séparation efficace des composés échantillons de l'échantillon biologique. Selon un autre mode de réalisation selon le procédé conforme à l'invention on utilise plus d'un filtre. De préférence, on utilise deux filtres différents, de sorte que différents composés échantillons de dimensions différentes puissent être séparés. Selon un autre mode de réalisation de l'invention l'échantillon biologique est un fluide échantillon renfermant des germes tel que par exemple de l'urine, du sang, du plasma, du sérum, un prélèvement, de la salive, une expectoration ou un fluide de lavage des alvéoles bronchiques (BAL). Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on effectue, entre les étapes 3) et 4) une ouverture enzymatique, chimique et/ou mécanique des composés échantillons, par laquelle on dissout ou on détériore la membrane cellulaire et/ ou l'enveloppe du virion et/ ou la capside du virus de façon à rendre les acides nucléiques disponibles. Par suite, par le terme « ouverture » on doit comprendre dans ce qui suit un procédé par lequel l'acide nucléique à amplifier est rendu accessible pour l'amplification. Les termes « extraction » et « ouverture » ont par suite essentiellement, la même signification, mais le terme « ouverture » a été choisi pour insister sur le fait qu'il s'agit là d'un processus séparé qui contrairement à l'extraction n'est pas conditionné par l'amplification elle-même. Cette ouverture s'effectue par exemple par une lyse selon laquelle l'acide nucléique est rendu accessible à l'aide de méthodes enzymatiques, thermiques ou chimiques. Des exemples de méthodes de lyse enzymatiques sont le traitement avec la protéinase K ou le traitement avec le lysozyme. La lyse thermique s'effectue par chauffage ou congélation du composé échantillon. Des exemples de méthodes de lyse chimiques sont le traitement par une combinaison de dodécyl sulfate de sodium (SDS) et de NaOH, le traitement par du thiocyanate de guanidine (GIT) et le traitement par une combinaison de Triton X100 et d'une concentration élevée de chlorure de lithium. Une ouverture mécanique est, par exemple, mise en oeuvre en utilisant des perles de verre ou un élément tourbillonnaire. On connaît en outre d'autres

10 procédés d'ouverture. Une combinaison de plusieurs procédés d'ouverture est également possible. L'ouverture complémentaire a pour avantage de permettre de rendre également accessibles pour l'amplification ultérieure des acides nucléiques provenant de composés échantillons, en particulier de cellules qui sont difficiles à ouvrir. L'étape d'ouverture est de préférence, effectuée par voie enzymatique ou chimique, ce qui ne nécessite aucun appareillage supplémentaire et permet d'automatiser facilement cette étape.

Selon un mode de réalisation préférentiel, le ou les acide(s) nucléique(s) libéré(s) par l'ouverture du composé échantillon est (sont) purifié(s) avant l'amplification dans l'étape 5). Une telle purification peut être nécessaire selon les conditions de l'amplification, par exemple en présence d'une amplification par PCR en raison d'un choix d'amorces limité, pour obtenir un résultat d'amplification optimum. Cette purification peut par exemple être effectuée par rinçage avec des solutions tampons qui permettent simultanément de régler les conditions optima pour l'amplification ultérieure. Selon un mode de réalisation préférentiel, l'acide nucléique amplifié lors de l'étape 5) est en outre élué de façon à être extrait du filtre. Le terme « élué » désigne la séparation et l'élimination de l'acide nucléique du filtre. A cet effet, le filtre est traité avec une phase mobile constituée d'un ou de plusieurs solvant(s) et les acides nucléiques sont extraits du filtre par lavage avec l'éluat. Cette étape doit par exemple être mise en oeuvre lorsqu'on recherche en tant qu'utilisation finale la détection de l'acide nucléique amplifié sur un array. Dans ce cas, une élution aqueuse, c'est-à-dire une élution de l'acide nucléique amplifié dans de l'eau désionisée est particulièrement préférentielle.

Lorsque l'amplification est effectuée par PCR, après la séparation du composé échantillon, le filtre est avantageusement rincé avec un tampon de PCR qui renferme de la BSA, pour par exemple éliminer des impuretés telles que des produits du métabolisme, régler le milieu pour la PCR suivante et bloquer le filtre. A cet effet, on ajoute un mélange de dNTPs, d'amorces, de polymérase et de tampon, et on met Il en oeuvre les cycles thermiques usuels de la PCR. Lors de ces cycles de thermique, l'ADN est amplifié (multiplié). Ensuite, il peut être élué du filtre. On peut ainsi isoler par exemple à partir de 10 ml d'urine renfermant 105 germes, après 20 cycles, 1011 molécules d'ADN dans s 50 µl. En outre, selon un mode de réalisation préférentiel, l'acide nucléique amplifié dans l'étape 5) est extrait du filtre par rinçage avec une solution de précipitation, l'éluat est mélangé dans un système micro-fluidique, et est à nouveau ajouté sur le filtre. La solution de io précipitation s'écoule alors de préférence au travers du filtre, dans une direction opposée à la direction d'écoulement antérieure de l'échantillon, tandis que l'éluat mélangé s'écoule dans le filtre dans la direction d'écoulement antérieure. Cette étape permet d'obtenir une purification de l'acide nucléique amplifié, par exemple pour améliorer 15 un résultat de détection ultérieur. Des solutions de précipitation, adaptées sont l'isothiocyanate de guanidine (GIT) et/ou l'éthanol. Le mélange dans un système micro-fluidique peut être effectué au moyen de perles magnétiques et/ou de structures de mélange par exemple avec des tampons de lavage. 20 En variante, on peut également envisager une purification des acides nucléiques par chromatographie. I1 est en outre en variante possible d'introduire l'éluat sur un nouveau filtre. Cette étape est significative dans le cas de certaines utilisations, par exemple lorsque des exigences particulières concernant 25 la pureté de l'ADN doivent être satisfaites. Comme il a déjà été mentionné, le filtre peut renfermer un matériau en vrac ou une phase stationnaire. Dans un tel cas, il est de préférence prévu que l'acide nucléique amplifié dans l'étape 5) soit extrait du filtre par rinçage avec une solution de précipitation, que 30 l'éluat soit mélangé dans un système micro-fluidique puis à nouveau ajouté sur le filtre. La solution de précipitation s'écoule alors au travers de la phase stationnaire dans une direction opposée à la direction de circulation antérieure, tandis que l'éluat mélangé s'écoule dans la phase stationnaire dans la direction d'écoulement antérieure. Un choix adapté

12 de la phase stationnaire, permet ainsi d'effectuer une purification par chromatographie. L'invention a également pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé susmentionné qui est réalisé sous la forme d'un système de "laboratoire sur puce". Ce dispositif permet la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention à partir de volumes échantillons macroscopiques dans un système g-TAS. I1 est ainsi possible d'obtenir, malgré des volumes échantillons importants, avec une concentration élevée en composés échantillons à enrichir une miniaturisation pouvant également être mise en oeuvre en économisant du temps et des coûts. Description des dessins D'autres avantages et modes de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention seront illustrés par les figures annexées et les exemples de réalisation décrits ci-dessous. Ces figures et exemples de réalisation n'ont bien entendu qu'un caractère illustratif et ne sont pas de nature à limiter l'invention de quelque manière que ce soit.

Selon les figures, on a utilisé les références suivantes : - la figure 1 représente schématiquement la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, - la figure 2 représente un système de séparation avec un filtre de fibres 201 traversé latéralement, - la figure 3 représente un système de séparation avec un filtre 301 traversé transversalement, - la figure 4 représente le résultat d'essai de l'échantillon 1 selon l'exemple de mise en oeuvre amorces marquées -filtre-PCR 107 cellules 25 gl, - la figure 5 représente le résultat d'essai de l'échantillon 2 selon l'exemple de réalisation référencé amorces marquées -filtre-PCR 107 cellules 25 gl, - la figure 6 représente le résultat d'essai pour le test de détermination de la limite de détection,

13 - la figure 7 représente le modèle dhybridation des échantillons 1 à 3 des figures 1 à 3 selon l'exemple de réalisation. La figure 1 illustre schématiquement le déroulement du procédé conforme à l'invention en utilisant un système de séparation.

L'échantillon biologique par exemple de l'urine avec les germes qui y sont renfermés, par exemple des bactéries E-coli est appliqué sur un filtre. L'acide nucléique à amplifier est l'ADN et l'amplification est effectuée par PCR. Dans l'étape A, on transfère un volume échantillon macroscopique (10 ml) d'une suspension de bactéries 102 avec 104 à 107 bactéries/ml sous une pression maximum de 0,5 bar pendant 10 minutes (donc 1 ml/min) sur un filtre, ici un coussin de fibres de silice 101. Les bactéries E-coli sont retenues sur le coussin de fibres de silice avec un taux de séparation de 95 % - 99 % de sorte que la suspension 103 ne renferme ensuite essentiellement plus de bactéries 102. Ensuite, dans l'étape B, on lave le filtre 101 avec 100-500 µl de tampon de PCR pour obtenir des conditions optima pour la PCR. Dans l'étape C on ajoute la solution de PCR-ici 30 µl de PCR-Mastermix renfermant des dNTPs, un tampon, de la Taq-polymérase, des amorces et du PEG et on commence les cycles de la PCR. Pendant la PCR, la première étape de dénaturation conduit à la lyse des bactéries E-coli 102. L'étape D représente la première partie de la purification - la précipitation - de l'ADN amplifié qui s'effectue dans une direction opposée à la direction d'écoulement antérieure. L'éluat est mélangé, dans un système micro- fluidique, à l'aide d'un mélangeur schématisé par la flèche 104 et est à nouveau introduit sur le filtre. Dans la dernière étape E, l'ADN précipité est à nouveau introduit sur le filtre 101 dans la direction de l'écoulement. Après rinçage avec des tampons de lavage qui sont transférés dans un bac à déchets schématisé par la référence 105 sur la figure l'ADN purifié est élué dans 50 µl de tampon d'hybridation (schématisé par la flèche référencée 106). Ensuite, l'ADN peut être utilisé pour effectuer une hybridation. La figure 2 représente un système de séparation avec un filtre de fibres 201 traversé latéralement. La flèche 204 désigne la direction d'écoulement de l'échantillon lors de séparation sur le filtre

14 conformément à l'étape 3) du procédé conforme à l'invention. Le système de séparation dispose d'une entrée 205 et d'une sortie 206 pour l'échantillon et les réactifs. Dans un tel système de séparation équipé d'un filtre de fibres 201 traversé latéralement, l'échantillon biologique, par exemple un échantillon de salive infecté par des cellules virales est injecté dans le système de séparation au niveau de l'entrée 205 puis transféré dans la direction d'écoulement 204 sur ou au travers du filtre 201 ; les cellules sont retenues par ce filtre 201. La partie restante de l'échantillon de salive quitte le système de séparation par la sortie 206. Les cellules virales infectantes sont enrichies ou concentrées. Dans l'étape suivante (non représentée) on ajoute des réactifs d'amplification, y compris des amorces spécifiques et une substance qui bloque le filtre 201. On amplifie ensuite l'acide nucléique viral libéré à l'aide des amorces adaptées spécifiques à cet acide nucléique viral, sur ou dans le filtre 201 ; dans la première étape d'amplification, l'extraction de l'acide nucléique, ici une lyse cellulaire est effectuée. La figure 3 représente un système de séparation équipé d'un filtre 301 traversé transversalement.

La flèche 304 indique la direction d'écoulement de l'échantillon lors de la séparation sur le filtre conformément à l'étape 3) du procédé conforme à l'invention. Le système de séparation dispose d'une entrée 305 et d'une sortie 306 pour l'échantillon et les réactifs. Dans un tel système de séparation équipé d'un filtre 301 traversé transversalement, les cellules, par exemple des staphylocoques dorés provenant d'un échantillon de BAL sont introduites par l'entrée 305 dans le système de séparation. Les bactéries sont ensuite transférées transversalement dans le sens d'écoulement 304 dans ou sur le filtre 301 ; les bactéries sont retenues par ce filtre 301. La partie restante de l'échantillon BAL quitte le système de séparation par la sortie 306. Les bactéries sont ainsi enrichies ou concentrées. Dans l'étape suivante (non représentée) les bactéries sont lysées. L'addition des réactifs d'amplification permet d'amplifier l'acide nucléique des bactéries dans le filtre 301. 15 Essai 1 Cet essai permet de déterminer si l'on peut éviter de devoir mettre en oeuvre une étape d'extraction ou de lyse séparée, si la PCR peut être effectuée sur le filtre et est possible à la fin d'une hybridation réussie. Pour la PCR sur le filtre on a utilisé une amorce anti sens marquée à son extrémité 5' par la molécule fluorescente Cyanine 3. L'essai a été effectué avec 107 cellules E-coli centrifugées sur un demi-filtre concassé du kit Qiagen QIAamp® Mini Spin (6.000 Upm, 15 sec). Ensuite, les petits morceaux de filtre ont été transférés dans un appareillage de PCR et la préparation de PCR (avec de la BSA) a été ajoutée.

Tableau 1 : Préparation de PCR Réactif 1 x préparation 3 x préparation Concentration finale Amorce sens (2µM) 2,5 µL 7,5 µL 0,2 mM Amorce anti sens (2µM) 2,5 µL 7,5 µL 0,2 mM Mélange dNTP (2,5 mM) 1 µL 3 µL 0,12 mM Tagpolymérase (5U/µL) 0,5 µL 1,5 µL 0,1 U/µL Taq tampon (10x) 2,5 µL 7,5 µL lx MgC12 (25 mM) 1,5 µL 42,5 µL 1,5 mM BSA (20 mg/mL) 6,25 µL 18,75 µL 5 mg/mL HPLC-H2O 8,25 µL 24,75 µL Volumes totaux 25 µL 75 µL Tableau 2 : Programme de la PCR Etape Température Durée 1 - Dénaturation intiale 95°C 5 min 2 - Dénaturation 95°C 30 sec 3 - Appariement des amorces 55°C 1 min 4 - Elongation des amorces 72°C 1 min 30.cycles : Etapes 2 à 4 5 - Elongation terminale 725°C 10 min15 La solution de PCR a été centrifugée à 6.000 Upm pendant 15 secondes hors du filtre. On a ensuite ajouté à la solution obtenue la préparation d'hybridation.

Tableau 3 : Préparation d'hybridation Réactif lx préparation 3x préparation Concentration finale H2O 16 µL 48 µL 20x SSPE 21 µL 63 µL 6x 50x solution de Denhardt 7 µL 21 µL 5x Hyb-Con (0,001 pmol/µL) 1 µL 3 µL 0,001 pmol Produit de la PCR (25 µL) (75 µL) Volumes totaux 70 µL 2101 µL Contrôle de l'hybridation (Hyb-Con) Le contrôle de l'hybridation consiste en une séquence d'Arabidopsis thaliana et est complémentaire du contrôle d'hybridation positive immobilisé. Cet ADN de contrôle est modifié par de la Biotine. Le contrôle d'hybridation positive donne toujours un signal lorsque les conditions d'hybridation sont bonnes. Mise en oeuvre de l'hybridation - Mise en réaction de chacune des solutions de PCR (environ 25 µl) 15 avec 45 µl de mélange maître d'hybridation. - Chauffage des échantillons à 95°C pendant 10 min, puis immédiatement sur de la glace. - Collage du Gène Frames. - Pipetage de la préparation d'hybridation. 20 - Séparation de la lame de recouvrement en faisant attention aux bulles d'air. - Hybridation à 55°C et 1.400 Upm pendant une heure sur le thermomixer. Après l'hybridation, les slides sont lavés et le Gene 25 Frames et les slides sont enlevés par traction dans environ 300 mL de solution de lavage 1 (2 x SSC 0,2 % SDS). On effectue ensuite, trois étapes d'incubation avant de sécher les slides par soufflage d'azote et de les analyser.

Résultats La figure 4 représente le résultat d'exploitation pour l'échantillon 1 - amorces marquées - filtre-PCR 107 cellules 25 µl. On a représenté en abscisse des tests réalisés avec différentes sondes. Dans le premier champ on a représenté les intensités d'une sonde hybridée constituée des nucléotides complémentaires des bases 237 - 252 ; en position 248 (bactérie de type sauvage : C, bactérie résistante aux fluoroquinolones : T ou G) les quatre bases ont varié. Seul l'appariement C manifeste pour le type sauvage une intensité élevée. Dans le bloc voisin, dans le cas de sondes qui reflètent les bases 254 à 273 à proximité de l'extrémité 5', dans les positions 259 et 260, les quatre bases ont varié ; deux mutations neutres en position 255 (SM : C et SM : T) ont également été observées. Dans le type sauvage, il y a dans les positions 259 et 260 les bases G et A. Au contraire dans le cas de bactéries résistantes aux quinolones il y a, dans ces positions A, T ou C ou encore G ou T. Pour le type sauvage, on a trouvé de bonnes sélectivités pour l'appariement parfait par rapport à un mésappariement indépendamment de la mutation neutre en position 255.

Si au contraire les bases 259 et 260 étaient auparavant au milieu de la sonde ou à l'extrémité 3' de celle-ci, on a trouvé une sélectivité nettement plus faible. Dans ce cas, des mutations en position 260 avec SM255 : C ne peuvent plus être différenciées de façon sûre. La figure 5 représente les résultats de l'essai pour l'échantillon 2 - amorces marquées filtre-PCR 107 cellules 25 µl. Comme la figure 1, cette figure représente les résultats d'exploitation pour une bactérie résistante aux quinolones avec les bases 248 : C, 259 : G et 260 : A. Là encore, la sélectivité s'est révélée adaptée à une détection sure si les bases 259 et 260 sont situées à l'extrémité 5' de la sonde alors qu'au contraire des sondes présentant de telles mutations au niveau de leur partie médiane ou de leur extrémité 3' ne se sont pas révélées adaptées. La figure 6 représente le résultat de l'essai pour le test de détermination de la limite de détection. 17

18 De manière similaire à la figure 5, cette figure représente les résultats d'exploitation d'une série de tests avec une très faible concentration en bactéries. La concentration en bactéries est ici située dans une plage comprise entre 103 à 104/ml et correspond ainsi à la limite de détection inférieure importante du point de vue du diagnostic. La figure 7 représente les cartes d'hybridation des échantillons 1 à 3 des figures 4 à 6 ; la figure 7A correspond à la carte d'hybridation de l'échantillon 1, la figure 7B à la carte dhybridation de l'échantillon 2 et la figure 7C à la carte d'hybridation pour le test de détermination de la limite de détection. Ces résultats montrent principalement que l'on peut éviter la mise en oeuvre d'une étape d'extraction ou de lyse séparée et que la PCR peut être effectuée sur le filtre, une hybridation réussie étant possible à la fin.

Essai 2 Lors de cet essai, des bactéries E-coli ayant un diamètre d'environ 1 µm ont été séparées sur un filtre de fibres ayant un diamètre de fibres de 0,1 - 10 µm et une porosité de 90 - 96 %. Le taux de séparation s'élève clairement au dessus de 90 %.

On montre ainsi que des filtres de fibres, en particulier de fibres de silice ou de verre conduisent à un taux de séparation extrêmement élevé en règle générale, clairement au dessus de 95 0/0 pour des taux de flux très élevés et des résistances à l'écoulement faibles. Le mécanisme de filtration peut être imputé à des interactions polaires des bactéries avec la surface du filtre ainsi qu'à l'effet de criblage.30

Claims (9)

1. REVENDICATIONS1» Procédé de concentration de composés échantillons et de multiplication des acides nucléiques renfermés dans ces composés échantillons à partir d'un échantillon biologique comportant les étapes suivantes : 1) préparation d'un échantillon biologique (102) sous forme liquide,
2. 2) introduction de cet échantillon dans un système de séparation comportant au moins un filtre (201),
3. 3) enrichissement des composés échantillons renfermés dans 10 l'échantillon par séparation de ces composés échantillons sur le filtre (201),
4. 4) addition de réactifs d'amplification, et
5. 5) amplification directe d'au moins un acide nucléique renfermé dans les composés échantillons. 15 2» Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'amplification dans l'étape 5) est effectuée par PCR et comporte au moins les étapes partielles suivantes : 20 5.1) modification du filtre, extraction des acides nucléiques et dénaturation du ou des acide(s) nucléique(s), 5.2) appariement des amorces, et 5.3) élongation des amorces. 25 3» Procédé conforme à la revendication 2, caractérisé en ce que la modification du filtre (201) dans l'étape 5.1) est effectuée par addition de polymères bloquant le filtre (201) dans l'étape 4), ces polymères étant choisis dans le groupe formé par les protéines ou albumines solubles, 30 de préférence la BSA ou les polymères synthétiques de préférence le PEG ou le PPG. 4» Procédé conforme à l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que 35 le filtre (201) est parcouru latéralement dans l'étape 3). » Procédé conforme à l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le filtre (201) est choisi dans le groupe formé par : les filtres de fibres, de préférence les filtres de fibres renfermant de la s silice et de façon particulièrement préférentielle les filtres de fibres de verre, les filtres à diaphragmes, et les échangeurs d'ions, de préférence les échangeurs d'anions.
6. 6» Procédé conforme à l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que entre l'étape 3) et l'étape 4) on effectue une ouverture enzymatique, thermique, chimique et/ou mécanique du composé échantillon.
7. 7» Procédé conforme à la revendication 6, caractérisé en ce que le ou les acide(s) nucléique(s) libéré(s) par la dénaturation du composé échantillon est (sont) purifié(s) avant l'amplification dans l'étape 5).
8. 8» Procédé conforme à l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'acide nucléique amplifié dans l'étape 5) est élué de façon à être extrait du filtre (201).
9. 9» Procédé conforme à l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'acide nucléique amplifié dans l'étape 5) est extrait du filtre (201) par rinçage avec une solution de précipitation, l'éluat est mélangé dans un système micro-fluidique et est à nouveau ajouté sur le filtre, la solution de précipitation traversant de préférence le filtre (201) dans une direction opposée à la direction de traversée antérieure (204), et l'éluat mélangé traversant de préférence le filtre (201) dans la direction d'écoulement antérieure (204). 21 10» Dispositif pour la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu' il est réalisé sous la forme d'un système "Laboratoire sur puce".5