CN105517718A - 磷灰石原位恢复 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了再生磷灰石表面(例如在目标分析物的纯化之后)的方法。

Description

磷灰石原位恢复
相关申请的交叉参考
本申请要求于2014年6月23日提交的美国临时申请第62/015,894号和2014年11月19日提交的美国临时申请第62/082,017号的优先权，两者的全部内容通过引用纳入本文。
背景
在其它磷灰石固体表面之中，将磷灰石固体支持面，包括羟基磷灰石、陶瓷磷灰石、氟磷灰石和氟强化磷灰石(fluorideenhancedapatite)，用于各种目标分析物的纯化。磷灰石常用于生物分析物纯化，所述生物分析物包括蛋白质、碳水化合物、多核苷酸和病毒颗粒。磷灰石具有作为纯化支持物的独特性质，因为其在单一支持物中提供金属亲和离子交换形式。磷灰石纯化通常可以两种方式进行：(i)流动通过纯化；和(ii)结合和洗脱纯化。
通常，对于流动通过纯化，操作人员(a)在合适的缓冲液中平衡柱；(b)在一定条件下向柱中加入样品，在所述条件中杂质与所述柱结合而目标分子流动通过并被收集；(c)用清洁/剥离溶液(例如高摩尔浓度磷酸盐溶液)清洁或剥离所述柱以去除吸附的生物化合物；以及(d)用强碱性氢氧化物溶液再生或消毒所述柱从而可以重新使用所述柱。在一些情况下，在所述强碱性氢氧化物溶液之后使用低摩尔浓度的冲洗液，以用于长期保存或重新平衡。
通常，对于结合和洗脱纯化，操作人员(a)在合适的缓冲液中平衡柱；(b)在一定条件下向所述柱中加入样品，在所述条件中目标分子与所述柱结合；(c)任选地用一种或多种溶液清洗所述柱；(d)洗脱所述目标分子(例如用高摩尔浓度磷酸盐溶液和/或碱性卤化物溶液)；(e)用清洁溶液(例如高摩尔浓度磷酸盐溶液)清洁或剥离所述柱以去除吸附的生物化合物；以及(f)用强碱性氢氧化物溶液再生或消毒所述柱从而可以重新使用所述柱。在一些情况下，在所述强碱性氢氧化物溶液之后使用低摩尔浓度的冲洗液，以用于长期保存或重新平衡。
这些传统的磷灰石纯化方法的缺点在于差的再现性和/或过早的磷灰石劣化。在一些情况下，这样的劣化是由于在暴露于平衡、加载或色谱缓冲液的过程中在磷灰石表面水合氢离子(H3O+)的累积。水合氢离子的累积可在暴露于pH等于或低于8.0的碱金属盐的过程中发生。水合氢离子的累积也可在暴露于pH小于约6.5的磷酸盐缓冲液的过程中发生。其它缓冲组合物也可引起水合氢离子累积。当暴露于后续缓冲液，例如洗脱缓冲液(例如在结合和洗脱纯化过程中)或清洁/剥离缓冲液(例如流动通过纯化之后)时这些水合氢离子随后解吸。所述解吸导致树脂随时间劣化，导致树脂质量损失和/或树脂的颗粒强度降低。
发明内容
本发明人发现，在由样品纯化目标分子的色谱过程中或之后的磷灰石固体表面的劣化可通过用缓冲的钙溶液处理磷灰石固体表面，接着用磷酸盐缓冲的溶液处理，接着用碱性氢氧化物处理而令人惊讶地减少、消除或逆转。所述缓冲的钙溶液、磷酸盐缓冲的溶液和碱性氢氧化物可接下来应用于结合和洗脱或流动通过纯化过程。
在一个实施方式中，用磷灰石固体表面纯化目标分析物的方法包括(a)将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接触，从而将所述目标分析从一种或多种污染物中分离；(b)收集所述目标分析物；以及(c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括：(i)将所述磷灰石固体表面与包含浓度至少为约1mM的钙离子和含有伯胺、仲胺和叔胺的非两性离子缓冲剂的缓冲的钙溶液接触，其中所述缓冲的钙溶液的pH至少为约7；(ii)将所述磷灰石固体表面与pH至少为约6.5的磷酸盐缓冲的溶液接触；以及(iii)将所述磷灰石固体表面与含有碱性氢氧化物的溶液接触。在一个实施方式中，(c)(i)中的缓冲剂是Tris缓冲剂。
在一个实施方式中，所述方法(a)包括将所述目标分析物与所述磷灰石固体表面结合，以及(b)包括从所述磷灰石固体表面洗脱所述目标分析物。在一些实施方式中，所述方法(a)包括将至少50％的所述目标分析物与所述磷灰石固体表面结合，以及(b)包括从所述磷灰石固体表面洗脱所述目标分析物。在另一个实施方式中，所述方法(a)包括将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接触，从而将所述目标分析物流动通过所述磷灰石固体表面，以及(b)包括在流动通过物中收集所述目标分析物。在一些实施方式中，所述方法(a)包括将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接触，从而将至少50％的所述目标分析物流动通过所述磷灰石固体表面，以及(b)包括在流动通过物中收集所述目标分析物。
在一个实施方式中，所述钙离子浓度低于约50mM，低于约25mM，低于约15mM，或低于约5mM。在一些实施方式中，所述钙离子浓度为至少约1mM或至少约25mM。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液包含至少一种选自下组的组分：氯化钙、硝酸钙、硫酸钙和乳酸钙。在一个实施方式中，所述缓冲的钙溶液的pH至少为约7。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的pH为约7至约9。在另一个实施方式中，所述磷酸盐缓冲的溶液是含有约0.05M至约1.0M磷酸盐、pH为约6.5至约9的溶液。在一些情况中，所述磷酸盐缓冲的溶液包含400mM磷酸盐，pH为7.0。在一些情况中，所述磷酸盐缓冲的溶液包含500mM磷酸盐，pH为7.0。
在一个实施方式中，所述氢氧化物包括碱性氢氧化物。在一些情况中，所述碱性氢氧化物包括氢氧化钠或氢氧化钾。在一个实施方式中，所述再生逆转、减少或消除了在蛋白质纯化或柱清洁步骤中发生的所述柱的降解。在另一个实施方式中，所述再生将磷灰石固体表面的强度增加了至少约1％、5％、10％、15％、20％或更多。
在一个实施方式中，所述再生在洗脱吸附的生物化合物的磷酸盐清洁/剥离步骤之前进行或替代上述步骤进行。在一些情况中，所述再生步骤在洗脱目标分析物之后进行。在一些情况中，所述再生步骤在流动通过目标分析物之后进行。
在一个实施方式中，将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐，pH值至少为约6.5的溶液接触的(c)(ii)步骤还包括：将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐浓度为10mM或低于约10mM，pH至少为约6.5或7的溶液接触；随后将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐浓度至少为约100mM、200mM、400mM或500mM，pH至少为约6.5的溶液接触。
在一些实施方式中，所述方法还包括在再生步骤前用清洗溶液清洗所述磷灰石固体表面，所述清洗溶液包含磷酸盐浓度为10mM，或低于约10mM，pH至少为约6.5。
在一个实施方式中，所述再生由(i)、清洗、(ii)和(iii)组成。
定义
“磷灰石”是指通式为Ca5(PO4)3(X)的磷酸盐和钙的矿物，其中X为带负电荷的离子。通常X是F、Cl或OH。不过磷灰石的结构和化学性质允许有多种替代，包括替代结构中Ca的各种金属阳离子(例如K、Na、Mn、Ni、Cu、Co、Zn、Sr、Ba、Pb、Cd、Sb、Y、U或各种稀土元素中的一种或多种)，以及替代结构中PO4 -3的阴离子复合物(例如AsO4 -3、SO4 -2、CO3 -2、SiO4 -4等)。
“羟基磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6(OH)2的不可溶的磷酸钙的羟基化矿物的混合式固体支持物。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。羟基磷灰石是市售可得的，其可有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。复合材料形式包括包埋在琼脂糖或其它珠的孔内的，或沉积在膜表面上的羟基磷灰石微晶。
“氟磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6F2的不可溶的磷酸钙的加氟(fluoridated)矿物的混合式支持物。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。氟化磷灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。
“磷灰石固体表面”是指稠合的纳米晶体(陶瓷磷灰石)、微晶或化合的磷灰石的微晶。磷灰石固体表面包括但不限于羟基磷灰石或氟磷灰石。陶瓷磷灰石包括但不限于陶瓷羟基磷灰石(例如CHTTM、CaPure-HATM(托索生物科学集团(TosohBioscienceLLC))、陶瓷氟磷灰石或陶瓷羟基氟磷灰石(MPCTM)。陶瓷磷灰石是磷灰石矿物的一种形式，其中纳米晶体团聚成颗粒并在高温下熔凝以形成适用于色谱应用的稳定的陶瓷微球。化合的微晶包括但不限于HA(珀尔公司(PallCorp.))。微晶包括但不限于Bio-GelHTP、HT、DNA级HT(伯乐公司(Bio-Rad))和HypatiteC(克拉克森色谱公司(ClarksonChromatography))。
“样品”是指含有感兴趣的目标分子或颗粒的任何组合物。样品可以未纯化或部分纯化。样品可包括生物来源的样品，包括但不限于：血液或血液组分(包括但不限于血清)、尿液、唾液、排泄物以及组织和组织提取物培养物。样品还可包括合成来源的生物分子，包括但不限于肽。样品可来源于未纯化的、部分纯化的或纯化的细胞裂解物或用过的细胞生长介质。
“目标分子”或“目标分析物”是指样品中待检测的分子或分析物。在一些实施方式中，该目标分子是肽、蛋白质(如抗体、酶、生长调节剂、凝血因子或磷蛋白)、多核苷酸(例如DNA(如dsDNA或ssDNA)；RNA(如mRNA或miRNA)；或DNA-RNA杂交体)、适体、粘合素(affimer)、肽核酸、碳水化合物、病毒、病毒样颗粒、药物化合物、代谢物或细胞。
使用后出现的树脂劣化可造成树脂颗粒失去其强度，并因而断裂成导致柱内部分或全部阻塞的较小颗粒。劣化也可以磷灰石的化学降解形式出现，造成出现质量损失，这可转而导致柱体积损失、颗粒强度损失、颗粒断裂增加或其组合。在本发明的一些实施方式中，这样的影响通过本发明部分或全部逆转。可通过实践本发明而实现的劣化的逆转可导致较低的树脂质量损失速率、较低的颗粒强度减弱速率，或同时导致上述两者。在许多情况中，劣化的逆转可伴随树脂质量增加、颗粒强度增加或两者均有。
可通过例如称重干燥的磷灰石样品，例如清洗掉缓冲液组分和吸附的生物化合物后的样品，来测定磷灰石固体表面的质量。可通过例如测量对搅动力(例如搅拌)、超声处理或压缩(例如单轴压缩力的应用)的耐受性来测定磷灰石介质强度。可通过处理后的磷灰石固体表面的检查以测量细小物质的生成来测定对超声处理或搅动力的耐受性。可通过测量将给定质量的磷灰石压缩到设定的恒定终端力所需的力并测定压缩距离来测量对压缩的耐受性。可相对于没有经受过磷灰石纯化(即使用磷灰石的目标分子的纯化)或磷灰石再生过程的样品来测定磷灰石劣化或降解。
“碱性氢氧化物”是指包含元素周期表第1族中任何阳离子元素(包括例如锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)、铯(Cs)和钫(Fr))的碱金属氢氧化物。因此，示例性的碱性氢氧化物包括但不限于NaOH、LiOH和KOH。“碱性氢氧化物”也可指其它阳离子氢氧化物，例如氢氧化铵。
本文所述方法中用作恢复材料的钙离子可通过氢氧化钙或可溶性钙盐(通常是可溶于水的盐)提供。卤化钙、硝酸钙、硫酸钙和乳酸钙是可采用的钙盐的例子。示例性的卤化钙是氯化钙。
如本文所述，文中缓冲的钙溶液中的术语“缓冲剂”、“缓冲的”等是指在特定条件下与钙相容(例如基本不与钙相互反应或在混合物中沉淀)的缓冲液，并且用于将水溶液的pH稳定在特定值上或特定值附近，或在特定范围内的目的。同样地，通常，缓冲的钙溶液中的“缓冲剂”不可以是水。在一些实施方式中，缓冲的钙溶液中的“缓冲剂”是磷酸盐。在一些实施方式中，缓冲的钙溶液中的“缓冲剂”是Tris。在一些实施方式中，在原位再生方案(例如在洗脱或目标分析物流动通过之后(例如立即)，或在洗脱或目标分析物流动通过和清洗之后(例如立即))中采用的缓冲的钙溶液中的“缓冲剂”不含有碱金属盐(例如氯化钠)，或者含有少于约0.1、0.05或0.01M碱金属盐。
磷酸盐可在用于磷灰石平衡、色谱、洗脱、清洁/剥离、或磷灰石再生的各种缓冲液中使用。磷酸盐可由任何可溶性的磷酸盐供给，通常是溶于水的盐。例子是碱金属或碱土金属磷酸盐，而磷酸钠或磷酸钾是特别适宜的例子。碱金属磷酸盐或碱土金属磷酸盐可以一元碱、二元碱或三元碱形式或其组合形式使用。
文中所用的术语“一个”、“这个”和“所述”是指一个或多个。如本文中所用，术语“约”是指所列的数字以及所列数字10％范围内的任何值。因此，约“5”是指在4.5-5.5之间的任何值，包括4.5和5.5。
发明详述
I.引言
传统的磷灰石蛋白质纯化过程通常不能保护磷灰石固体表面不劣化，也不能寻求防止劣化。为了防止劣化的方法包括采用一种或多种常用离子(例如美国专利申请第13/205,354号)，或采用高pH的磷酸盐溶液(例如美国专利申请第10/327495号)。在通常用于所述磷灰石固体表面组分的缓冲剂中存在离子类物质(常用离子)可抑制从磷灰石固体表面浸出组分。因此，在磷灰石平衡、加载、流动通过、洗脱、或清洁/剥离过程中，钙和/或磷酸盐缓冲液通常是优选的。高pH值磷酸盐溶液可作为常用离子起作用，并且最小化了潜在破坏的pH偏移。
其它寻求防止劣化的方法包括在磷灰石纯化过程中在聚集的水合氢离子从磷灰石固体表面释放之前中和累积的水合氢离子。中和可用强碱进行，例如碱性氢氧化物(例如美国专利申请第13/363,670号)。中和也可用碱性氨基化合物或磺化的胺基(sulphonatedamine)化合物进行(例如美国专利申请第13/006,022号)。在磷灰石表面上水合氢离子的聚集可在平衡、加载、流动通过、和清洗步骤中由于各种机理发生。
具体地，碱金属盐的存在可增加或促进水合氢离子从磷灰石表面释放。足够浓度(例如100mM、200mM、300mM、400mM或更高)的高pH的磷酸盐溶液(例如pH为约6.5或更高的磷酸盐溶液)可提供缓冲能力以减弱在水合氢离子释放过程中常发生的pH偏移，因而减少磷灰石的酸溶解。碱金属盐与具有合适pH和浓度的磷酸盐缓冲液同时使用通常将质量损失减少至显著程度。不过，介质强度仍然会明显下降。累积的水合氢离子的中和可减少累积的水合氢离子的量，从而在后续步骤中减少降解。
本发明基于令人吃惊的发现，即磷灰石固体表面可通过用缓冲的钙再生溶液处理来显著再生。通常，所述缓冲的钙溶液在目标分子被纯化和收集后应用。在一些情况中，随后用清洗溶液清洗所述缓冲的钙溶液。在一些实施方式中，随后将所述磷灰石固体表面清洁/剥离(例如用高摩尔浓度磷酸盐缓冲液，例如100、200、300、400或500mM磷酸盐或更高)。在一些情况中，随后用碱性氢氧化物溶液(例如用浓度为0.1、0.5或1M的碱性氢氧化物)处理所述磷灰石。在一些情况中，随后用碱性氢氧化物浓度低于前述碱性氢氧化物溶液的溶液处理所述磷灰石。
本文所述的再生方法(例如将磷灰石与缓冲的钙溶液接触，随后与磷酸盐缓冲的溶液接触，随后与碱性氢氧化物接触)提供了明显且令人惊讶的再生程度。这样明显且令人吃惊的再生程度可表示为降解的减少、消除或逆转，通过磷灰石质量的变化(例如损失)或磷灰石强度损失来测量。在一些情况中，再生可表示为在色谱拆分或选择性的损失中的保持或减少。在一些情况中，本文所述的再生方法可与一种或多种减少或防止降解的方法(例如上文中所述的那些)联用。
II.方法
本文所述的是通过用缓冲的钙溶液处理磷灰石固体表面，随后用磷酸盐缓冲溶液处理，随后用碱性氢氧化物处理来减少、消除或逆转磷灰石劣化的磷灰石再生方法。所述缓冲的钙溶液、磷酸盐缓冲的溶液和碱性氢氧化物可接下来应用于结合和洗脱或流动通过纯化过程。
在一些实施方式中，将样品与磷灰石固体表面(例如平衡的磷灰石固体表面)接触，收集目标分子(例如在流动通过纯化过程中，或在洗脱之后)，并通过将所述磷灰石固体表面与缓冲的钙溶液接触，随后与磷酸盐缓冲溶液接触，随后与碱性氢氧化物接触来再生所述磷灰石。在一些情况中，所述磷灰石固体表面在进行本文所述的一个或多个再生步骤之前已多次用于目标分析物纯化。在一些采用结合和洗脱纯化过程的实施方式中，至少50％、65％、75％、85％或90％或更多的目标分子在收集所述目标分子之前(即洗脱之前)与所述磷灰石固体表面结合。在一些采用流动通过纯化过程的实施方式中，至少50％、65％、75％、85％或90％或更多的目标分子流动通过所述磷灰石固体表面并被收集。
在一些实施方式中，所述磷灰石固体表面在再生前不清洗或冲洗。在其它实施方式中，所述磷灰石固体表面在再生前清洗或冲洗。在一些情况中，用清洗溶液冲洗所述树脂以去除任何过量的磷酸根离子。本领域技术人员可容易地选择合适的清洗缓冲液。通常，所述清洗缓冲液可以具有基本不浸出磷灰石表面组分、不释放累积的水合氢离子或不形成不希望的沉淀的pH值、组成和浓度。例如，所述清洗缓冲液可以是与前述和后续缓冲液相容的，从而当混合时不产生沉淀。合适的清洗缓冲液可包括通常用于磷灰石的平衡、加载、或流动通过的缓冲液组合物。在一些情况中，用低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐的浓度小于约100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固体表面。清洗缓冲液的pH可至少为约，5、5.1、5.2、5.3,或5.4，至少为约5.5，至少为约6，或至少为约6.5、7或8。示例性的清洗缓冲液pH至少为6.5或至少为7.0。在一些情况中，进行水清洗，并且水的量可广泛变化。典型的水清洗至少为约0.2树脂体积，在大多数情况下水清洗为约0.2-1.5树脂体积，或为约0.2-2树脂体积。
随后可再生所述磷灰石固体表面。在一些情况中，可在例如洗脱之后或流动通过之后再生所述磷灰石固体表面。在一些情况中，可在清洗之后(例如在施加水缓冲液以去除流动通过或洗脱缓冲液之后)再生所述磷灰石固体表面。
A.缓冲的钙溶液
以用缓冲的钙溶液接触所述磷灰石固体表面开始所述再生。虽然，磷灰石固体表面的再生倾向于采用未缓冲的钙溶液，但是本发明人发现采用缓冲的钙溶液似乎能显著且令人惊讶地提高获得的再生程度。所述缓冲的钙溶液的钙离子浓度和通过树脂的缓冲的钙溶液的量可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在使用磷灰石的过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何量。
不希望受理论限制，相信缓冲的钙溶液与磷灰石固体表面相互反应以在所述磷灰石固体表面上形成松散结合(例如非共价结合)的钙层。在一些情况中，所述钙层替代了一些或全部(或更多)的在之前纯化步骤中的钙损失。因此，钙离子的量、体积、浓度等，或会减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中发生的树脂劣化的缓冲的钙溶液的任何其它组分或方面，可以是允许足够形成松散结合的钙层的量。
通常，钙离子浓度选择低于在缓冲的钙溶液的pH值和温度下钙离子的极限溶解度。此外，所述浓度可以基于缓冲的钙溶液中存在或不存在其它组分或其它组分(例如选择的缓冲剂)的浓度而改变，或基于任何前述缓冲液的所选组成改变。在本文概念的某些实施方式中，钙离子浓度为从约5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.5mM、7,mM、8mM、9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.5mM或11mM至约15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、75mM、100mM或250mM时会获得最佳结果。在某些实施方式中，在所述缓冲的钙溶液中的钙离子浓度为约5mM至约10mM、约5mM至约25mM、约20mM至约100mM、或从约25mM至约50-75mM，包括5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.5mM、7,mM、8mM、9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.5mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、110mM、150mM、200mM、300mM或更高。
为了获得恢复所需的溶液体积可根据钙离子浓度改变，但在大多数情况中，可由约1.0-10.0树脂体积的溶液获得最佳结果，在很多情况中，可用约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或约2树脂体积来获得最佳结果。在一些情况中，所述体积可达约6树脂体积，包括2、3、4或5或10树脂体积。在一些情况中，所述体积小于3柱体积。在一些情况中，可以小于1个树脂体积(例如小于约0.9、0.7、0.5体积)的体积使用高钙离子浓度。
多种缓冲剂都适用于用于磷灰石再生的缓冲的钙溶液。在一些实施方式中，用于在溶液中不明显形成金属络合物(例如在缓冲溶液的pH值下不形成与钙的络合物)的缓冲的钙溶液的缓冲剂可包含缓冲的钙溶液的缓冲剂组分。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂含有伯胺、仲胺或叔胺且不是两性离子缓冲剂。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂含有伯胺、仲胺或叔胺和羟甲基。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂是Tris(即氨基丁三醇或三(羟甲基)氨基甲烷)。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂是二(2-羟乙基)-氨基-三(羟甲基)-甲烷)、或1,3-二(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷、三乙胺、三乙醇胺或三甲基胺。
缓冲的钙溶液中的缓冲剂浓度可改变，但通常会选择的浓度至少与溶液的钙离子浓度一样高。此外，所述浓度可基于选择的缓冲剂，或任何前述缓冲液的所选组成改变。因此，所述缓冲剂浓度与钙离子浓度之比通常至少为约0.2，例如0.2、0.5、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，也选择所述缓冲剂浓度，从而使其低于缓冲剂的溶解度极限。在一些情况中，优选的缓冲剂包括那些具有高溶解度极限的缓冲剂。
缓冲的钙溶液的pH可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何量。此外，所述pH可基于选择的磷灰石固体表面、选择的缓冲剂、选择的一种或多种组分的浓度、或选择的任何前述缓冲液的组成改变。通常，所述pH为，或至少为约5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、6、6.2、6.5、7、7.5、8、8.5或9。在一些实施方式中，所述pH为，或至少为约5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5或9。在一些实施方式中，所述pH为5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5或9。在一些实施方式中，所述pH为5.1、5.2、5.3或5.4。在一些情况中，所述pH为5.3。在一些情况中，所述pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9。在一些情况中，所述pH为7.0。在一些情况中，所述pH为8.0。在一些情况中，所述pH为9.0。在一些情况中，所述pH为5.6。在一些情况中，所述pH为6.2。在一些情况中，所述pH为5.4。
在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲液是磷酸盐缓冲液。在这些情况下，可选择所述钙和磷酸盐的浓度以及溶液的pH以提供再生，同时避免沉淀形成，或避免过饱和溶液。例如，磷酸盐缓冲的钙溶液的pH可选择足够低(例如，pH值为约，或低于约6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1或5)。在一些情况中，所述pH为5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。在一些情况中，所述pH为5.3。作为另一实施例，磷酸盐缓冲的钙溶液的钙浓度可为约，或低于约50mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、7mM、6mM、5.9mM、5.8mM、5.7mM、5.6mM、5.5mM、5.4mM、5.3mM、5.2mM、5.1mM或5mM。在一些情况中，所述磷酸盐缓冲的溶液的钙浓度为，或为约15mM、14mM、13mM、12mM、11mM、10.5mM、10.4mM、10.3mM、10.2mM、10.1mM、10mM或9.5mM。在一些情况下，所述钙浓度为10或10.2mM。在一些情况下，所述钙浓度为10mM。作为另一实施例，磷酸盐缓冲的钙溶液的磷酸盐浓度可为约，或低于约50mM、40mM、35mM、30mM、29mM、28mM、27mM、26mM、25mM、24mM、23mM、21mM、20mM、18mM、17mM、16mM或15mM。在一些情况下，磷酸盐缓冲的钙溶液的使用提供了具有或不具有前述或后续高摩尔浓度的(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1M)磷酸盐缓冲步骤的再生。
在一些实施方式中，所述磷灰石固体表面在柱中，例如色谱柱或膜固定器，所述缓冲的钙溶液可以一定流速施加到所述磷灰石固体表面上。所述流速可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何速率。合适的流速，包括在磷灰石的平衡、加载、洗脱、清洁/剥离、消毒或冲洗过程中通常使用的速率。示例性的流速为400厘米/小时。在一些情况中，所述流速基本低于400厘米/小时(例如，300、200、100或50厘米/小时或更低)。低流速的使用可允许磷灰石固体表面与缓冲的钙溶液之间的接触时间更长。当钙或缓冲剂的浓度较低或缓冲的钙溶液的体积较小时，可特别优选低流速。当缓冲的钙溶液或前述溶液是粘性的或所述柱被吸附的生物化合物污染时，也可优选低流速。或者，所述流速可高于400厘米/小时(例如500、600、700或8000厘米/小时或更高)。在一些情况下，钙的松散结合层的形成是快速的，高流速有利于减少磷灰石再生所需的时间。
在一些实施方式中，以批次形式将所述磷灰石固体表面与缓冲的钙溶液接触。在批次形式中，可通过将所述缓冲的钙溶液倒入所述磷灰石固体表面的浆料或悬浮液中，或将所述磷灰石固体表面的浆料倒入所述缓冲的钙溶液中来施加缓冲的钙溶液。所述接触时间可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何时间。
在一些实施方式中，随后清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。本领域技术人员可容易地选择合适的清洗缓冲液。在一些情况中，在独立再生处理之间用清洗溶液处理所述树脂以去除任何过量的钙、磷酸盐或氢氧根离子。通常，所述清洗缓冲液可以具有基本不浸出磷灰石表面组分、不释放累积的水合氢离子或不形成不希望的沉淀的pH值、组成和浓度。例如，所述清洗缓冲液可以是与前述和后续缓冲液相容的，从而当混合时不产生沉淀。如另一个实施例，可选择所述清洗缓冲液，从而不浸出在将所述磷灰石固体表面与所述缓冲的钙溶液接触过程中形成的任何松散结合的钙层。合适的清洗缓冲液可包括通常用于磷灰石的平衡、加载、或流动通过的缓冲组合物。在一些情况中，用低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐的浓度小于约100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固体表面。清洗缓冲液的pH可至少为约5，至少为约5.5，至少为约6，或至少为约6.5、7或8。在一些情况中，进行水清洗，并且水的量可广泛变化。典型的水清洗至少为约0.2树脂体积，在大多数情况下水清洗为约0.2-1.5树脂体积，或为约0.2-2树脂体积。
B.磷酸盐缓冲的溶液
当将所述磷灰石与缓冲的钙溶液接触后，可将所述磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液接触。在一些情况中，在缓冲的钙溶液和含磷酸盐的缓冲液之间可施加插入的清洗步骤。在一些实施方式中，用磷酸盐溶液清洁所述磷灰石表面以去除残留的蛋白质和污染物。所述含磷酸盐的缓冲液的磷酸盐浓度和通过树脂的含磷酸盐的缓冲液的量可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用的过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何量。不希望受理论限制，相信含磷酸盐的缓冲液与磷灰石固体表面，或与在与缓冲的钙溶液接触过程中形成的松散结合的钙层相互反应，以在磷灰石固体表面上形成松散结合(例如非共价结合)的磷酸盐层。在一些情况中，所述磷酸盐层替代了一些或全部(或更多)的在之前纯化步骤中的磷酸盐损失。因此，磷酸盐的量、体积、浓度等，或会减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中发生的树脂劣化的含磷酸盐的缓冲液的任何其它组分或方面，可以是允许足够形成松散结合的磷酸盐层的量。
含磷酸盐的缓冲液的磷酸盐浓度通常选择低于在缓冲液的pH和温度下磷酸盐的溶解度极限。此外，所述浓度可基于缓冲液其它组分的存在或不存在，或任何前述缓冲液的所选组成而改变。在此概念的某些实施方式中，采用以下磷酸盐浓度将获得最佳结果：从约5mM至约1、1.5或2M；约20mM至约1.5M；或约25mM至约1M；或约50mM至约1M；包括至少约，或约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM,30mM、40mM、50mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、150mM、200mM、300mM、500mM、750mM、1M或更高。在一些情况中，所述磷酸盐浓度为5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、150mM、200mM、300mM、500mM、750mM、1M或更高。在一些情况中，所述磷酸盐浓度从或从约0.1M或0.2M至或至约0.4M、0.5M、或1M。在一些情况中，将所述柱与低浓度磷酸盐缓冲液(例如2、5、10、15、20或25mM)接触，随后与高浓度磷酸盐缓冲液(例如30、50、75、100、250、500、750、1000、1500或2000mM)接触。在一些情况中，在高浓度磷酸盐缓冲液之前使用低浓度磷酸盐缓冲液可避免缓冲的钙溶液和高浓度磷酸盐缓冲液之间潜在的不相容性(例如沉淀)。
在一些实施方式中，所述含磷酸盐的缓冲液包含碱金属盐。在一个实施方式中，所述含磷酸盐的缓冲液包含低浓度的氯化钠，例如约100mM至约200mM的氯化钠。在一些情况中，所述含磷酸盐的缓冲液包含100mM、150mM或200mM氯化钠。
所述含磷酸盐的缓冲液的pH和通过树脂的含磷酸盐的缓冲液的量可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在使用磷灰石的过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何pH。适用于用含磷酸盐的缓冲液进行磷灰石再生的示例性的pH包括以下任何pH：至少为约5、至少为约5.5、至少为约6、至少为约6.5、至少为约7、至少为约7.5、至少为约8、或至少为约8.5或更高。在一些情况中，含磷酸盐的缓冲液的pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10或更高。
为了获得所述恢复所需溶液的体积可根据磷酸根离子浓度改变，但在大多数情况中，采用约1.0至约10.0树脂体积的溶液会获得最佳结果，在很多情况中，可用约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或约2树脂体积来获得最佳结果。所述体积可达约6树脂体积，包括2、3、4或5树脂体积。在一些情况中，可以小于1个树脂体积(例如小于约0.9、0.7、0.5体积)的体积使用高磷酸盐浓度。
在一些实施方式中，所述磷灰石固体表面在柱中，例如色谱柱或膜固定器，所述含磷酸盐的缓冲液可以一定流速施加到所述磷灰石固体表面上。所述流速可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何速率。合适的流速，包括在磷灰石的平衡、加载、洗脱、清洁/剥离、消毒或冲洗过程中通常使用的速率。示例性的流速为400厘米/小时。在一些情况中，所述流速基本低于400厘米/小时(例如，300、200、100或50厘米/小时或更低)。低流速的使用可允许磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液之间的接触时间更长。当磷酸盐的浓度较低或含磷酸盐的缓冲液的体积较小时，可特别优选低流速。当含磷酸盐的缓冲液或前述溶液是粘性的或所述柱被吸附的生物化合物污染时，也可优选低流速。或者，所述流速可高于400厘米/小时。在一些情况下，磷酸盐的松散结合层的形成是快速的，高流速有利于减少磷灰石再生所需的时间。
在一些实施方式中，在间歇的形式中，将所述磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液接触。在间歇形式中，可通过将所述含磷酸盐的缓冲液倒入所述磷灰石固体表面的浆料或悬浮液中，或将所述磷灰石固体表面的浆料倒入所述含磷酸盐的缓冲液中来施加含磷酸盐的缓冲液。所述接触时间可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何时间。
在一些实施方式中，随后清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。在其它实施方式中，用含磷酸盐的缓冲液再生处理后不再清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。本领域技术人员可容易地选择合适的清洗缓冲液。在一些情况中，用清洗溶液处理所述树脂以去除任何过量的磷酸根离子。通常，所述清洗缓冲液具有基本不浸出磷灰石表面组分、不释放累积的水合氢离子或不形成不希望的沉淀的pH值、组成和浓度。例如，所述清洗缓冲液可以是与前述和后续缓冲液相容的，从而当混合时不产生沉淀。如另一个实施例，可选择所述清洗缓冲液，从而不浸出在将所述磷灰石固体表面与所述缓冲的钙溶液接触过程中形成的任何松散结合的钙层。合适的清洗缓冲液可包括通常用于磷灰石的平衡、加载、或流动通过的缓冲液组合物。在一些情况中，用低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐的浓度小于约100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固体表面。清洗缓冲液的pH可至少为约5，至少为约5.5，至少为约6，或至少为约6.5、7或8。在一些情况中，进行水清洗，并且水的量可广泛变化。典型的水清洗至少为约0.2树脂体积，在大多数情况下水清洗为约0.2至约1.5树脂体积，或为约0.2至约2树脂体积。
在一些实施方式中，可通过在进行一个或多个步骤的含磷酸盐的缓冲液处理之后或之前进行一个或多个步骤的缓冲的钙溶液处理来获得优选的再生程度。在一些情况中，在一个或多个多步骤的缓冲的钙溶液处理或含磷酸盐的缓冲液处理之前或之后进行清洗。
在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液处理和/或含磷酸盐的缓冲液处理在目标分析物的洗脱或流动通过后进行。例如，磷灰石表面可与目标分析物平衡、接触，所述目标分析物可在流动通过过程中洗脱或收集，随后可进行再生方案。如本文所述，示例性的再生方案可包括但不限于将缓冲的钙溶液与所述磷灰石固体表面接触，随后将磷酸盐缓冲液与所述磷灰石固体表面接触的那些。当所述磷灰石与缓冲的钙和磷酸盐再生溶液接触后，可施加碱性氢氧化物处理。
C.氢氧化物
将氢氧根离子处理作为所述磷灰石固体表面再生的最后处理步骤施加。可使用任何可溶形式的氢氧根离子，优选使用水溶性的形式。在一些情况中，碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂是特别合适的。在一些情况中，可使用碱性氢氧化物溶液，例如氢氧化铵。在一些实施方式中，可使用至少一种碱金属氢氧化物和/或一种碱性氢氧化物。如在钙离子和磷酸根离子的情况中一样，氢氧根离子溶液的浓度和量可改变。不希望受理论限制，相信氢氧化物与磷灰石固体表面，或与在与缓冲的钙溶液和/或含磷酸盐的缓冲液接触的过程中形成的松散结合的(例如非共价结合)钙层、磷酸盐层或钙和磷酸盐层相互反应，以将松散结合的(例如非共价结合)矿物质转换为磷灰石，从而提供再生的表面。在一些情况中，所述再生的表面替代了一些或全部(或更多)的在之前纯化步骤中的钙、磷酸盐或磷酸钙损失。因此，会减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中发生的树脂劣化的氢氧化物的量、体积、浓度等，可以是允许足够将松散结合的钙、磷酸盐或磷酸钙转换至磷灰石的量。所述氢氧根离子也可清洁残留蛋白质和污染物的树脂，并还可作为消毒或储存溶液。
氢氧根离子的浓度可从约0.005或0.01M至约5M；约0.1M至约4.0M，在很多情况中为约0.3M至约3.0M，包括0.2M、0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、2.0M或2.5M。含氢氧根离子的处理溶液的合适的体积为约1.0至约20.0树脂体积，在很多情况中为约1.5至约10.0树脂体积，包括2、3、4、5、6、7、8或9体积。在一些情况中，可以小于1个树脂体积(例如小于约0.9、0.7、0.5体积)的体积使用高氢氧化物浓度。
氢氧化物处理后，所述树脂可用合适的缓冲液清洗或平衡。在一些情况中，将所述树脂平衡或清洗，随后用加载缓冲液平衡。例如，所述树脂可用10mM磷酸盐缓冲液，pH6.5平衡，以平衡用于随后蛋白质纯化的柱。在一些情况中，对所述树脂用储存缓冲液平衡或清洗并随后平衡。例如，可将所述树脂用0.1MNaOH平衡，随后储存。
实施例
仅以说明的形式而非限制的形式提供以下实施例。本领域技术人员不难了解，可改变或调整各种非关键参数而获得基本相同或相似的结果。
以下实施例中使用的所有柱均长5厘米、内径为2.2厘米、内部柱体积为19mL。为了填充每个柱，将11.97克40微米的陶瓷I型羟基磷灰石颗粒悬浮在0.2MNaPO4中，pH7。将所述浆料转移至空的柱中，所述柱通过敲击和从底部真空抽吸来填充。通过每个柱的移动相流速为28.5毫升/分钟(450厘米/小时)。移动相从每个柱的顶部进入。
实施例1
该实施例说明了在原位再生方案中结合了Tris缓冲的钙再生溶液的结果。将所述磷灰石树脂暴露于模拟在结合和洗脱蛋白质分离中遇到的条件的一系列循环中，但不加载和洗脱蛋白质。在此实施例中，结合和洗脱纯化方案的洗脱步骤采用在磷酸盐缓冲的盐水溶液中高浓度的磷酸盐。
在下述表I至IV中列举了所述实验的说明和条件。进行一系列16个连续循环，各循环由各表中所列的步骤组成。表I模拟了没有柱恢复的对照纯化方案。表II-IV是在步骤7中采用在Tris缓冲的钙再生溶液中增加的Tris浓度(即在表II、表III和表IV中分别为20mMTris、50mMTris和100mMTris)的恢复方案。同样，表II和III中的恢复方案采用10mMCaCl2，表IV中的恢复方案在Tris缓冲的钙再生溶液中采用50mMCaCl2。
表I
对照处理方案
表II
柱恢复方案
表III
柱恢复方案
表IV
柱恢复方案
对表I-IV中所述的每个方案，在第一次循环之前和最后一次循环之后测量树脂的颗粒质量和颗粒强度。使用单轴约束体积压缩(UCBC)测定颗粒强度。注意，在表IV的方案中使用的树脂样品通过与表I-III中的树脂样品不同的UCBC方法进行测试。表V列举了表I-IV中所述的方案的结果。
表V
结果
表V中的结果表明，用对照方案处理的树脂经历了降解，这由质量和颗粒强度的损失证明。与对照方案相比，从使用表II-IV中的柱恢复方案的柱中获得的羟基磷灰石在质量和颗粒强度方面增加。注意，由于使用不同的UCBC方法测定由表IV方案得到的树脂的颗粒强度，不能将其与由其它方案得到的树脂可颗粒的颗粒强度作直接比较。这些结果表明，如通过质量和颗粒强度的增加所证明的，采用Tris缓冲的钙溶液，接着施加磷酸盐缓冲液，随后施加氢氧化物的方案提供了令人惊讶的再生程度。当在再生方案后进行高浓度磷酸盐的洗脱步骤时，该结果也显示了令人惊讶的再生程度。
实施例2
该实施例说明了在原位再生方案中结合了Tris缓冲的钙再生溶液的结果。将所述磷灰石树脂暴露于模拟在结合和洗脱蛋白质分离中遇到的条件的一系列循环中，但不加载和洗脱蛋白质。在此实施例中，所述结合和洗脱纯化方案在洗脱步骤中采用碱金属盐。
在下述表VI至IX中列举了所述实验的说明和条件。进行一系列16个连续循环，各循环由各表中所列的步骤组成。表VI模拟了没有柱恢复的对照纯化方案。表VII-IX是在步骤7中采用在Tris缓冲的钙再生溶液中增加的Tris浓度(即在表VII、表VIII和表IX中分别为20mMTris、50mMTris和100mMTris)的恢复方案。同样，表VII-IX中的所有恢复方案在Tris缓冲的钙再生溶液中采用10mMCaCl2。
表VI
对照处理方案
表VII
柱恢复方案
表VIII
柱恢复方案
表IX
柱恢复方案
在第一次循环之前和最后一次循环之后测量表VI-IX中所述的每个方案的颗粒质量和颗粒强度。使用单轴约束体积压缩测定颗粒强度。表X列举了表VI-IX中所述的方案的结果。
表X
结果
表X中的结果表明，用对照方案处理的树脂经历了降解，这由质量和颗粒强度的损失证明。与表VI中的对照方案相比，从采用表VII-IX的恢复方案的柱中得到的羟基磷灰石显示质量增加。与对照方案相比，只有从采用具有100mMTris(表IX)的恢复方案的柱得到羟基磷灰石显示了颗粒强度的增加。当在具有高浓度的Tris缓冲的钙溶液的缓冲方案后用高浓度的碱金属盐进行洗脱步骤时，表X中的结果表明了令人惊讶的再生程度。
实施例3
该实施例说明了在原位再生方案中结合了Tris缓冲的钙再生溶液的结果。将所述磷灰石树脂暴露于模拟在流动通过纯化方案中遇到的条件的一系列循环中，但不加载蛋白质。在此实施例中，在流动通过步骤中使用磷酸盐缓冲的氯化钠溶液。
在下述表XI至XIV中列举了所述实验的说明和条件。进行一系列16个连续循环，各循环由各表中所列的步骤组成。表XI模拟了没有柱恢复的对照纯化方案。表XII-XIV是在步骤7中采用在Tris缓冲的钙再生溶液中增加的Tris浓度(即在表XII、表XIII和表IV中分别为20mMTris、50mMTris和100mMTris)的恢复方案。表XII-XIV中的所有恢复方案在Tris缓冲的钙再生溶液中采用10mMCaCl2。
表XI
对照处理方案
表XII
柱恢复方案
表XIII
柱恢复方案
表XIV
柱恢复方案
表XV
结果
表XV中的结果表明，用对照方案处理的树脂经历了降解，这由质量和颗粒强度的损失证明。与对照方案(表XI)相比，从使用表XII-XIV中的柱恢复方案的柱中获得的羟基磷灰石在质量和颗粒强度方面增加。这些结果表明，在流动通过纯化方案后，Tris缓冲的钙溶液的使用，随后磷酸盐缓冲液的应用，随后氢氧化物的应用提供了令人惊讶的再生程度。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。

Claims (23)

1.一种用磷灰石固体表面纯化目标分析物的方法，所述方法包括：
(a)将所述磷灰石固体表面与目标分析物接触，从而将所述目标分析物从一种或多种污染物中分离；
(b)收集所述目标分析物；以及
(c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括：
(i)将所述磷灰石固体表面与包含浓度至少为约1mM的钙离子和含有伯胺、仲胺或叔胺的非两性离子缓冲剂的缓冲的钙溶液接触，所述缓冲的钙溶液pH至少为约7；
(ii)在pH至少为约6.5时，将所述磷灰石固体表面与磷酸盐缓冲的溶液接触；以及
(iii)将所述磷灰石固体表面与含有碱性氢氧化物的溶液接触。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法(a)包括将所述目标分析物与所述磷灰石固体表面结合，以及(b)包括从所述磷灰石固体表面洗脱所述目标分析物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法(a)包括将至少50％的所述目标分析物与所述磷灰石固体表面结合，以及(b)包括从所述磷灰石固体表面洗脱所述目标分析物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法(a)包括将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接触，从而将所述目标分析物流动通过所述磷灰石固体表面，以及(b)包括在流动通过物中收集所述目标分析物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法(a)包括将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接触，从而将至少50％的所述目标分析物流动通过所述磷灰石固体表面，以及(b)包括在流动通过物中收集所述目标分析物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，在(c)(i)中的缓冲剂是含Tris的缓冲剂。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，(c)(i)中的钙离子浓度低于约50mM，低于约25mM，或低于约15mM，或低于约5mM。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，(c)(i)中的钙离子浓度为至少约1mM，至少约10mM，或至少约25mM。
9.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲的钙溶液包含至少一种选自下组的组分：氯化钙、硝酸钙、硫酸钙和乳酸钙。
10.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲的钙溶液的pH至少为约7。
11.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲的钙溶液的pH为约7至约9。
12.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲的溶液包含pH为约6.5至约9、含有约0.05M至约1.0M磷酸盐的溶液。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲的溶液包含400mM磷酸盐，pH为约7.0。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲的溶液包含500mM磷酸盐，pH为约7.0。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性氢氧化物是至少一种选自下组的碱性氢氧化物：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化铵。
16.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述再生逆转、减少或消除了在目标分析物纯化过程中或柱清洁步骤中发生的柱的降解。
17.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述再生将所述磷灰石固体表面的强度增加了至少约1％、5％、10％、15％、20％或更多。
18.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述再生在洗脱吸附的生物化合物的磷酸盐清洁/剥离步骤之前进行或替代上述步骤进行。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述再生步骤在结合的目标分析物洗脱之后进行。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述再生步骤在目标分析物流动通过之后进行。
21.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，用含有磷酸盐，pH至少为约6.5的溶液接触所述磷灰石固体表面的(c)(ii)步骤还包括：
用含有磷酸盐浓度为10mM，或小于约10mM，pH至少为约6.5的溶液接触所述磷灰石固体表面；以及
随后用含有磷酸盐浓度至少为约100mM，pH至少为约6.5的溶液接触所述磷灰石固体表面。
22.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在再生步骤前用清洗溶液清洗所述磷灰石固体表面，所述清洗溶液包含磷酸盐浓度为25mM，或低于约25mM，pH至少为约6.5。
23.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述再生由(i)、清洗、(ii)和(iii)组成。
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