CN105407917A - 磷灰石原位恢复 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了再生磷灰石表面(例如在目标分析物的纯化之后)的方法。

Description

磷灰石原位恢复
相关申请的交叉参考
本申请要求于2014年6月23日提交的美国临时申请第62/015,894号和2014年11月19日提交的美国临时申请第62/082,017号的优先权，两者的全部内容通过引用纳入本文。
背景技术
在其它磷灰石固体表面之中，将磷灰石固体支持面，包括羟基磷灰石、陶瓷磷灰石、氟磷灰石和氟强化磷灰石(fluorideenhancedapatite)，用于各种目标分析物的纯化。磷灰石最常用于生物分析物纯化，所述生物分析物包括蛋白质、碳水化合物、多核苷酸和病毒颗粒。磷灰石具有作为纯化支持物的独特性质，因为其在单一支持物中提供亲和性、阳离子和阴离子交换形式。磷灰石纯化通常可以两种方式进行：(i)流动通过纯化；和(ii)结合和洗脱纯化。
通常，对于流动通过纯化，操作人员(a)在合适的缓冲液中平衡柱；(b)在一定条件下向柱中加入样品，在所述条件中杂质与所述柱结合而目标分子流动通过并被收集；(c)用清洁/剥离溶液(例如高摩尔浓度磷酸盐溶液)清洁或剥离所述柱以去除吸附的生物化合物；以及(d)用强碱性氢氧化物溶液再生或消毒所述柱从而可以重新使用所述柱。在一些情况下，用低摩尔浓度的清洗液替代所述强碱性氢氧化物溶液，以用于长期保存或重新平衡。
通常，对于结合和洗脱纯化，操作人员(a)在合适的缓冲液中平衡柱；(b)在一定条件下向所述柱中加入样品，在所述条件中目标分子与所述柱结合；(c)洗脱所述目标分子(例如用高摩尔浓度磷酸盐溶液和/或碱性卤化物溶液)；(d)用清洁溶液(例如高摩尔浓度磷酸盐溶液)清洁或剥离所述柱以去除吸附的生物化合物；以及(e)用强碱性氢氧化物溶液再生或消毒所述柱从而可以重新使用所述柱。在一些情况下，用低摩尔浓度的清洗液替代所述强碱性氢氧化物溶液，以用于长期保存或重新平衡。
这些常规的磷灰石纯化方法的缺点在于差的再现性和/或过早的磷灰石劣化。在一些情况下，该劣化是由于在暴露于平衡、加载或色谱缓冲液的过程中磷灰石表面水合氢离子(H3O+)的累积。水合氢离子的累积可在暴露于pH等于或低于8.0的碱金属盐的过程中发生。水合氢离子的累积也可在暴露于pH小于约6.5的磷酸盐缓冲液的过程中发生。其它缓冲组合物也可引起水合氢离子累积。随后，当暴露于后续缓冲液，例如洗脱缓冲液(例如在结合和洗脱纯化过程中)或清洁/剥离缓冲液(例如流动通过纯化之后)时，这些水合氢离子解吸。所述解吸导致树脂随时间劣化，导致树脂质量损失和/或树脂的颗粒强度降低。
发明内容
本发明人发现，在由样品纯化目标分子的色谱过程中或之后,可通过用缓冲的钙溶液处理磷灰石固体表面，接着用磷酸盐缓冲的溶液处理，接着用碱性氢氧化物处理而明显减少、消除或逆转磷灰石固体表面的劣化。所述缓冲的钙溶液、磷酸盐缓冲溶液和碱性氢氧化物可接下来应用于结合和洗脱或流动通过纯化过程。
在一个方面，本发明提供一种用磷灰石固体表面纯化目标分析物的方法，所述方法包括：(a)用目标分析物接触磷灰石固体表面，从而将目标分析物与一种或多种污染物分离；(b)收集所述目标分析物；以及(c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括：(i)用缓冲的钙溶液(包含浓度至少约为5mM的钙离子和缓冲剂)接触所述磷灰石固体表面，其中缓冲剂浓度与钙离子浓度的比例至少为约1、1.5或2，所述溶液的pH至少为约5、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5；(ii)用pH至少为约6.5的磷酸盐缓冲溶液与所述磷灰石固体表面接触；以及(iii)用含有氢氧化物的溶液接触所述磷灰石固体表面。在一个实施方式中，所述缓冲剂是两性离子缓冲剂。在一个实施方式中，所述缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。
在一个实施方式中，本发明提供一种用磷灰石固体表面纯化目标分析物的方法，所述方法包括：(a)用目标分析物接触磷灰石固体表面，从而从一种或多种污染物中分离目标分析物；(b)收集所述目标分析物；以及(c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括：(i)用缓冲钙溶液(包含浓度至少约为10mM的钙离子和两性离子缓冲剂)接触所述磷灰石固体表面，其中两性离子缓冲剂浓度与钙离子浓度的比例至少为约2，所述溶液的pH至少为约6.5；(ii)用pH至少为约6.5的磷酸盐缓冲溶液与所述磷灰石固体表面接触；以及(iii)用含有氢氧化物的溶液接触所述磷灰石固体表面。
在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其中所述方法(a)包括将所述目标分析物与磷灰石固体表面结合，以及(b)包括从所述磷灰石固体表面洗脱所述目标分析物。在另一个实施方式中，所述方法(a)包括将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接触，从而将所述目标分析物流动通过所述磷灰石固体表面，以及(b)包括在流动通过物中收集所述目标分析物。
在一些情况中，所述两性离子缓冲剂是含磺酸的缓冲剂。在一些情况中，所述含磺酸的缓冲剂是MES、PIPES、ACES、MOPSO、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPS、TAPSO、POPSO或HEPPSO、EPPS、CAPS、CAPSO或CHES。在一些情况中，所述含磺酸的缓冲剂是MES。
在一个实施方式中，所述钙离子至少为约1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM(例如10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.4mM或10.5mM),20mM、25mM或至少为约50mM。在另一个实施方式中，缓冲剂浓度(例如两性离子缓冲剂浓度)与钙离子浓度的比例至少为约2.5、3或4。在另一个实施方式中，所述缓冲的钙溶液包含氯化钙或硝酸钙。在另一个实施方式中，所述磷酸盐缓冲溶液包含含有约0.1M或0.2M至10M磷酸盐，或0.1M或0.2M至0.5M磷酸盐，pH为约6.5-8的溶液，。在一些情况中，所述磷酸盐缓冲溶液包含400mM磷酸盐，pH为7.0。
在一个实施方式中，所述氢氧化物包括碱性氢氧化物。在一些情况中，所述碱性氢氧化物包括氢氧化钠或氢氧化钾。在一个实施方式中，所述再生逆转或消除了在蛋白质纯化或柱清洁步骤中发生的所述柱的降解。在另一个实施方式中，所述再生将磷灰石固体表面的强度增加了至少约1％、5％、10％、15％、20％或更多。
在一个实施方式中，所述再生在洗脱吸附的生物化合物的磷酸盐清洁/剥离步骤之前进行或替代上述步骤进行。在一些情况中，所述再生步骤在洗脱目标分析物之后进行。
在一个实施方式中，所述(ii)将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐，pH至少为约6.5的溶液接触的步骤还包括：将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐浓度为10mM或低于约10mM，pH至少为约6.5或7的溶液接触；随后将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐浓度至少为约100mM、200mM、400mM或500mM，pH至少为约6.5或7的溶液接触。
在一个实施方式中，所述再生包括(i)、清洗、(ii)和(iii)。
附图说明
图1：显示了进行实施例7，表X的磷灰石纯化表征的结果。
图2：显示了所示原位再生溶液的应用之后，进行实施例7，表X的纯化表征的结果。
图3：显示了所示原位再生溶液的应用之后，进行实施例7，表X的纯化表征的结果。
图4：显示了所示原位再生溶液的应用之后，进行实施例7，表X的纯化表征的结果。
图5：显示了所示原位再生溶液的应用之后，进行实施例7，表X的纯化表征的结果。
定义
“磷灰石”是指通式为Ca5(PO4)3(X)的磷酸盐和钙的矿物，其中X为带负电荷的离子。通常X是F、Cl或OH。不过磷灰石的结构和化学性质允许有多种替代，包括替代结构中Ca的各种金属阳离子(例如K、Na、Mn、Ni、Cu、Co、Zn、Sr、Ba、Pb、Cd、Sb、Y、U或各种稀土元素中的一种或多种)，以及替代结构中PO4 -3的阴离子复合物(例如AsO4 -3、SO4 -2、CO3 -2、SiO4 -4等)。
“羟基磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6(OH)2的不可溶的磷酸钙的羟基化矿物的混合式固体支持物。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。羟基磷灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。复合材料形式包含包埋在琼脂糖或其它珠的孔内的羟基磷灰石微晶。
“氟磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6F2的不可溶的磷酸钙的加氟(fluoridated)矿物的混合式支持物。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。氟化磷灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。
“磷灰石固体表面”是指稠合的纳米晶体(陶瓷磷灰石)、微晶或化合的磷灰石的微晶。磷灰石固体表面包括但不限于羟基磷灰石或氟磷灰石。陶瓷磷灰石包括但不限于陶瓷羟基磷灰石(例如CHTTM)或陶瓷氟磷灰石。陶瓷磷灰石是磷灰石矿物的一种形式，其中纳米晶体团聚成颗粒并在高温下熔凝以形成适用于色谱应用的稳定的陶瓷微球。化合的微晶包括但不限于HA(珀尔公司(PallCorp.))。微晶包括但不限于Bio-GelHTP、HT、DNA级HT(伯乐公司(Bio-Rad))和HypatiteC(克拉克森色谱公司(ClarksonChromatography))。
“样品”是指含有感兴趣的目标分子或颗粒的任何组合物。样品可以未纯化或部分纯化。样品可包括生物来源的样品，包括但不限于：血液或血液组分(包括但不限于血清)、尿液、唾液、排泄物以及组织。样品可来源于未纯化的、部分纯化的或纯化的细胞裂解物或用过的细胞生长介质。
使用后出现的树脂劣化可造成树脂颗粒失去其强度，并因而断裂成导致柱内阻塞的较小颗粒。劣化也可以磷灰石的化学破损形式出现，造成质量损失，这可转而导致出现柱体积损失、颗粒强度损失、颗粒断裂增加或其组合。在本发明的一些实施方式中，通过本发明逆转这类作用。可通过实践本发明而实现的劣化的逆转可导致较低的树脂质量损失速率、较低的颗粒强度减弱速率，或同时导致上述两者。在许多情况中，劣化的逆转可伴随树脂质量增加、颗粒强度增加或两者均有。
可通过例如称重干燥的磷灰石样品，例如清洗掉缓冲液组分和吸附的生物化合物后的样品，来测定磷灰石固体表面的质量。可通过例如测量耐搅动力(例如搅拌)、耐超声处理或耐压缩(例如单轴压缩力的应用)来测定磷灰石介质强度。可通过检查处理后的磷灰石固体表面以测量细小物质的生成来测定对超声处理或搅动力的耐受性。可通过测量将给定质量的磷灰石压缩到设定的恒定终端力所需的力并测定压缩距离来测量耐压缩性。可相对于没有经受过磷灰石纯化(例如使用磷灰石的目标分子的纯化)或磷灰石再生过程的样品来测定磷灰石劣化或降解。
“碱性氢氧化物”是指包含元素周期表第1族中任何阳离子元素(包括例如锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)、铯(Cs)和钫(Fr))的碱金属氢氧化物。因此，示例性的碱性氢氧化物包括但不限于NaOH、LiOH和KOH。
两性离子缓冲剂是一种可同时含有带正电荷和带负电荷的缓冲剂。示例性的两性离子缓冲剂可包括但不限于含有磺酸基团的缓冲剂。如本文中所用的，“磺酸”是指具有通式RS(＝O)2–OH的有机硫化合物组中的一种，其中R是有机基团(例如烷基或烯基或芳基)，S(＝O)2–OH基团是磺酰基氢氧化物。
包含磺酸基团的示例性的两性离子缓冲剂可包括但不限于氨基烷基磺酸(aminoalkanesulfonicacids)。示例性的氨基烷基磺酸可包括但不限于在氨基和磺酸基团之间具有最少2个碳的氨基烷基磺酸。包含磺酸基团的示例性的两性离子缓冲剂可包括但不限于N,N-二烷基氨基甲磺酸(N,N-dialkylaminomethanesulfonicacids)。
包含磺酸基团的示例性的两性离子缓冲液可包括但不限于：MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、ACES(2-(氨基甲酰甲烷氨基)乙磺酸)、MOPSO(3-吗啉代-2-羟基丙磺酸)、MOPS(3-吗啉代丙烷-1-磺酸)、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸),HEPES(2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)、DIPSO(3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟丙磺酸)、TAPS(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]丙-1-磺酸)、TAPSO(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]-2-羟丙-1-磺酸)、POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟丙磺酸))或HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟丙磺酸))、EPPS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(3-丙磺酸))、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸)、CHES(2-(环己基氨基)乙磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)、TABS(N-三(羟甲基-4-氨基丁磺酸)，或AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)。
本文所述方法中用作恢复材料的钙离子可通过氢氧化钙或可溶性钙盐(通常是可溶于水的盐)提供。卤化钙和硝酸钙是可采用的钙盐的例子。示例性的卤化钙是氯化钙。在一些情况中，当在流动通过纯化过程中的色谱缓冲液中或在结合和洗脱纯化过程中的洗脱缓冲液中含有碱金属氯化物时，氯化钙是优选的。
如本文所述，文中缓冲的钙溶液中的术语“缓冲剂”、“缓冲的”等是指在特定条件下与钙相容(例如基本不与钙相互反应或在混合物中沉淀)的缓冲剂，并且用于将水溶液的pH稳定在特定值上或特定值附近，或在特定范围内的目的。同样地，通常，缓冲的钙溶液中的“缓冲剂”不可以是水。在一些实施方式中，缓冲的钙溶液中的“缓冲剂”不是磷酸盐。在一些实施方式中，缓冲的钙溶液中的“缓冲剂”是磷酸盐。在一些实施方式中，在原位再生方案(例如在洗脱或目标分析物流动通过之后(例如之后立即)，或在洗脱或目标分析物流动通过和清洗之后(例如之后立即))中采用的缓冲的钙溶液中的“缓冲剂”不含有碱金属盐(例如氯化钠)，或者含有少于约0.1、0.05或0.01M碱金属盐。
磷酸盐可在用于磷灰石平衡、色谱、洗脱、清洁/剥离、或磷灰石再生的各种缓冲液中使用。磷酸盐可由任何可溶性的磷酸盐供给，通常是溶于水的盐。例子是碱金属或碱土金属磷酸盐，而磷酸钠或磷酸钾是特别适宜的例子。碱金属磷酸盐或碱土金属的磷酸盐可以一元碱和二元碱形式或它们的组合形式使用。
如本文中所用，术语“约”是指所列的数字以及所列数字10％范围内的任何值。因此，“约5”是指在4.5-5.5之间的任何值，包括4.5和5.5。
发明详述
I.引言
传统的磷灰石蛋白质纯化过程通常不能保护磷灰石固体表面不劣化，也不能试图防止劣化。为了防止劣化的方法包括采用一种或多种常用离子(例如美国专利申请第13/205,354号)，或采用高pH的磷酸盐溶液(例如美国专利申请第10/327495号)。通常用于所述磷灰石固体表面组分的缓冲液中存在的离子类物质(常用离子)可抑制从磷灰石固体表面浸出组分。因此，在磷灰石平衡、加载、流动通过、洗脱、或清洁/剥离过程中，钙和/或磷酸盐缓冲液通常是优选的。高pH磷酸盐溶液可作为常用离子起作用，并且最小化潜在的破坏pH偏移。
其它寻求防止劣化的方法包括在磷灰石纯化过程中，在聚集的水合氢离子从磷灰石固体表面释放之前，中和聚集的水合氢离子。中和可用强碱进行，例如碱性氢氧化物(例如美国专利申请第13/363,670号)。中和也可用碱性氨基化合物或磺化的胺基(sulphonatedamine)化合物进行(例如美国专利申请第13/006,022号)。在磷灰石表面上水合氢离子的聚集可在平衡、加载、流动通过、和清洗步骤中由于各种机理发生。
具体地，碱金属盐的存在可增加或促进水合氢离子的累积。足够浓度(例如100mM、200mM、300mM、400mM或更高)的高pH的磷酸盐溶液(例如pH为约6.5或更高的磷酸盐溶液)可提供缓冲能力以减弱在水合氢离子释放过程中常发生的pH偏移，因而减少磷灰石的酸溶解。碱金属盐与具有合适pH和浓度的磷酸盐缓冲液同时使用通常将质量损失减少至显著程度。不过，介质强度仍然会明显下降。累积的水合氢离子的中和可减少累积的水合氢离子的量，从而在后续磷酸盐缓冲液清洗阶段中减少降解。
本发明基于令人吃惊的发现，即磷灰石固体表面可通过用缓冲的钙再生溶液处理来显著再生。通常，所述缓冲的钙溶液在目标分子被纯化和收集后应用。在一些情况中，所述缓冲的钙溶液在磷灰石固体表面被清洁/剥离(例如用高摩尔浓度的磷酸盐缓冲液，例如100、200、300、400或500mM或更高的磷酸盐)和/或消毒(例如用浓度为约0.1、0.5或1M的碱性氢氧化物)后应用。所述缓冲的钙溶液可任选地被清洗掉。在一些情况中，随后用磷酸盐缓冲的溶液(例如不含有钙的磷酸盐缓冲的溶液)处理所述磷灰石。在一些情况中，在缓冲的钙溶液之后应用的磷酸盐缓冲的溶液含有比缓冲的钙溶液浓度高的磷酸盐。在一些情况中，所述缓冲的钙再生溶液和所述磷酸盐缓冲再生溶液的顺序可以交换。
将磷酸盐缓冲溶液与磷灰石固体表面接触后，所述磷灰石固体表面可进一步用氢氧化物处理。本文中所述的再生过程(例如将磷灰石与缓冲的钙溶液接触，随后与磷酸盐缓冲溶液接触，随后与碱性氢氧化物接触；或者将磷灰石与磷酸盐缓冲溶液接触，随后与缓冲的钙溶液接触，随后与碱性氢氧化物接触)提供了明显且令人吃惊的再生程度。这样明显且令人吃惊的再生程度可表示为降解的减少、消除或逆转，通过磷灰石质量的变化(例如损失)或磷灰石强度损失来测量。在一些情况中，再生可表示为色谱分辨率或选择性的保持或其损失减少。在一些情况中，本文所述的再生方法可与一种或多种减少或防止降解的方法(例如上文中所述的那些)联用。
可用混合物中不同组分的停留体积的比例(例如对死体积进行调节)来测定选择性。可用混合物中不同组分的两个色谱峰的最高点到在基线处所述峰宽度的平均值之间的距离的比例来测定分辨率。在一些情况中，这些组分是蛋白质色谱标准品。示例性的蛋白质色谱标准品包括但不限于卵清蛋白、肌红蛋白、α胰凝乳蛋白酶原a(alphachymotrypsinogena)、或细胞色素c。
II.方法
本文所述的是通过用缓冲的钙溶液处理磷灰石固体表面，随后用磷酸盐缓冲溶液处理，随后用碱性氢氧化物处理来减少、消除或逆转磷灰石劣化的磷灰石再生方法。所述缓冲钙溶液、磷酸盐缓冲溶液和碱性氢氧化物可接下来应用于结合和洗脱或流动通过纯化过程。
在一些实施方式中，将样品与磷灰石固体表面(例如平衡的磷灰石固体表面)接触，收集目标分子(例如在流动通过纯化过程中，或在洗脱之后)，并通过将所述磷灰石固体表面与缓冲的钙溶液接触，随后与磷酸盐缓冲溶液接触，随后与碱性氢氧化物接触来再生所述磷灰石。在一些情况中，所述磷灰石固体表面在进行本文所述的一个或多个再生步骤之前已多次用于目标分析物纯化。
在一些实施方式中，在再生前清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。在其它实施方式中，在再生前不清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。在一些情况中，用清洗溶液处理所述树脂以去除任何过量的钙、磷酸根或氢氧根离子。本领域技术人员可容易地选择合适的清洗缓冲液。通常，所述清洗缓冲液可以具有基本不浸出磷灰石表面组分、不释放累积的水合氢离子或不形成不希望的沉淀的pH值、组成和浓度。例如，所述清洗缓冲液可以是与前述和后续缓冲液相容的，从而当混合时不产生沉淀。合适的清洗缓冲液可包括通常用于磷灰石的平衡、加载、或流动通过的缓冲组合物。在一些情况中，用低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐的浓度小于约100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固体表面。清洗缓冲液的pH可至少为约，5、5.1、5.2、5.3,或5.4，至少为约5.5，至少为约6，或至少为约6.5、7或8。示例性的清洗缓冲液的pH为5.5、6或6.5。在一些情况中，进行水清洗，并且水的量可广泛变化。典型的水清洗至少为约0.2树脂体积，在大多数情况下水清洗为约0.2-1.5树脂体积，或为约0.2-2树脂体积。
随后可再生所述磷灰石固体表面。在一些情况中，可在例如洗脱之后、流动通过之后、中和之后、清洁/剥离之后、冲洗之后或储存之后再生所述磷灰石固体表面。在一些情况中，可在清洗之后(例如施加清洗缓冲液以去除流动通过、洗脱、中和、冲洗、储存或清洁/剥离缓冲液之后)再生所述磷灰石固体表面。
缓冲的钙溶液
以用缓冲的钙溶液接触所述磷灰石固体表面开始所述再生。虽然，磷灰石固体表面的再生倾向于采用未缓冲的钙溶液，但是本发明人发现采用缓冲的钙溶液似乎能显著且令人惊讶地提高获得的再生程度。所述缓冲的钙溶液的钙离子浓度和通过树脂的缓冲的钙溶液的量可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在使用磷灰石的过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的所述树脂的劣化的任何量。
不希望受理论限制，相信缓冲的钙溶液与磷灰石固体表面相互反应以在磷灰石固体表面上形成松散的结合(例如非共价结合)的钙层。在一些情况中，所述钙层替代了一些或全部(或更多)的在之前纯化步骤中的钙损失。因此，钙离子的量、体积、浓度等，或会减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中发生的树脂劣化的缓冲的钙溶液的任何其它组分或方面，可以是允许足够形成松散结合的钙层的量。
通常，所述钙离子浓度选择低于在缓冲的钙溶液的pH和温度下钙离子的极限溶解度。此外，所述浓度可以基于缓冲的钙溶液中存在或不存在其它组分或其它组分(例如选择的缓冲剂)的浓度而改变，或基于任何前述缓冲液的所选组成改变。在本文概念的某些实施方式中，钙离子浓度为从约5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.5mM、7,mM、8mM、9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.5mM或11mM至约15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、75mM、100mM或250mM时会获得最佳结果。在某些实施方式中，在所述缓冲的钙溶液中的钙离子浓度为约5-10mM、约5-25mM、约20-100mM、或从约25mM至约50-75mM，包括5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.5mM、7,mM、8mM、9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.5mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、110mM、150mM、200mM、300mM或更高。
为了获得所述恢复所需溶液的体积可根据钙离子浓度改变，但在大多数情况中，可由约1.0-10.0树脂体积的溶液获得最佳结果，在很多情况中，可用约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或约2树脂体积来获得最佳结果。在一些情况中，所述体积可达约6树脂体积，包括2、3、4或5树脂体积。在一些情况中，所述体积小于3柱体积。在一些情况中，可使用的高钙离子浓度的体积小于一个树脂体积(例如小于约0.9、0.7、0.5体积)。
各种缓冲液都适用于用于磷灰石再生的缓冲的钙溶液。在一些实施方式中，用于在溶液中不明显形成金属络合物(例如在缓冲溶液的pH下不形成与钙的络合物)的缓冲的钙溶液的缓冲剂可包含缓冲的钙溶液的缓冲组分。在一些实施方式中，不含有伯胺或仲胺(即R2-N，其中R不是H)的缓冲剂可包含缓冲的钙溶液的缓冲组分。在一些实施方式中，优选两性离子缓冲剂。在一些实施方式中，优选含有磺酸部分的缓冲剂(例如两性离子缓冲剂)。在一些实施方式中，优选含有磺酸和叔胺(即R3-N，其中R不是H)的缓冲剂。示例性的适用于作为缓冲的钙溶液中的缓冲剂的两性离子缓冲剂包括但不限于以下物质：MES、PIPES、ACES、MOPSO、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPS、TAPSO、POPSO或HEPPSO、EPPS、CAPS、CAPSO、CHES、MOBS、TABS或AMPSO。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂含有伯胺、仲胺或叔胺。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂含有伯胺、仲胺或叔胺以及一个或多个羧酸酯/盐基团或羟甲基。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂是N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸、N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸、或氨基丁三醇。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂是二(2-羟乙基)-氨基-三(羟甲基)-甲烷)、或1,3-二(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷。
缓冲的钙溶液中的缓冲剂浓度可改变，但通常会选择的浓度至少与溶液的钙离子浓度一样高。此外，所述浓度可基于选择的缓冲剂，或任何前述缓冲剂的选择的组成改变。因此，缓冲剂浓度与钙离子浓度之比通常至少为约1，例如1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，也选择所述缓冲剂浓度，从而使其低于缓冲剂的溶解度极限。在一些情况中，优选的缓冲剂包括那些具有高溶解度极限的缓冲剂。
缓冲的钙溶液的pH可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何量。此外，所述pH可基于选择的磷灰石固体表面、选择的缓冲剂、选择的一种或多种组分的浓度、或选择的任何前述缓冲液的组成改变。通常，所述pH为，或至少为约5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、6、6.2、6.5、7、7.5或8。在一些实施方式中，所述pH为，或至少为约5.5、6、6.5、7、7.5或8。在一些实施方式中，所述pH为5.5、6、6.5、7、7.5或8。在一些实施方式中，所述pH为5.1、5.2、5.3或5.4。在一些情况中，所述pH为5.3。在一些情况中，所述pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。在一些情况中，所述pH为7.0。在一些情况中，所述pH为5.6。在一些情况中，所述pH为6.2。在一些情况中，所述pH为5.4。
在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。在这些情况下，可选择所述钙浓度和磷酸根浓度以及溶液的pH以提供再生，同时避免沉淀形成，或避免过饱和溶液。例如，磷酸盐缓冲的钙溶液的pH可选择足够低(例如，pH为约，或低于约6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1或5)。在一些情况中，所述pH为5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。在一些情况中，所述pH为5.3。作为另一实施例，磷酸盐缓冲的钙溶液的钙浓度可为约，或低于约50mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、7mM、6mM、5.9mM、5.8mM、5.7mM、5.6mM、5.5mM、5.4mM、5.3mM、5.2mM、5.1mM或5mM。在一些情况下，所述磷酸盐缓冲的溶液的钙浓度为，或约为15mM、14mM、13mM、12mM、11mM、10.5mM、10.4mM、10.3mM、10.2mM、10.1mM、10mM或9.5mM。在一些情况下，所述钙浓度为10或10.2mM。在一些情况下，所述钙浓度为10mM。作为另一实施例，磷酸盐缓冲的钙溶液的磷酸根浓度可为约，或低于约50mM、40mM、35mM、30mM、29mM、28mM、27mM、26mM、25mM、24mM、23mM、21mM、20mM、18mM、17mM、16mM或15mM。在一些情况下，使用磷酸盐缓冲的缓冲的钙溶液提供了具有或不具有前述或后续高摩尔浓度的(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1M)磷酸盐缓冲步骤的再生。
在一些实施方式中，所述磷灰石固体表面在柱中，例如色谱柱，所述缓冲的钙溶液可以一定流速施加到所述磷灰石固体表面上。所述流速可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何速率。合适的流速，包括在磷灰石的平衡、加载、洗脱、清洁/剥离、消毒或冲洗过程中通常使用的速率。示例性的流速为400厘米/小时。在一些情况中，所述流速基本低于400厘米/小时(例如，300、200、100或50厘米/小时或更低)。低流速的使用可允许磷灰石固体表面与缓冲的钙溶液之间的接触时间更长。当钙或缓冲剂的浓度较低或缓冲的钙溶液的体积较小时，可特别优选低流速。当缓冲的钙溶液或前述溶液是粘性的或所述柱被吸附的生物化合物污染时，也可优选低流速。或者，所述流速可高于400厘米/小时。在一些情况下，钙的松散结合层的形成是快速的，高流速有利于减少磷灰石再生所需的时间。
在一些实施方式中，以批次形式将所述磷灰石固体表面与缓冲的钙溶液接触。在批次形式中，可通过将所述缓冲的钙溶液倒在所述磷灰石固体表面上，或将所述磷灰石固体表面的浆料倒入缓冲的钙溶液中来施加缓冲的钙溶液。所述接触时间可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何时间。
在一些实施方式中，随后清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。本领域技术人员可容易地选择合适的清洗缓冲液。在一些情况中，在独立再生处理之间用清洗溶液处理所述树脂以去除任何过量的钙、磷酸盐或氢氧根离子。通常，所述清洗缓冲液可以具有基本不浸出磷灰石表面组分、不释放累积的水合氢离子或不形成不希望的沉淀的pH值、组成和浓度。例如，所述清洗缓冲液可以是与前述和后续缓冲液相容的，从而当混合时不产生沉淀。如另一个实施例，可选择所述清洗缓冲液，从而不浸出在将所述磷灰石固体表面与所述缓冲的钙溶液接触过程中形成的任何松散结合的钙层。合适的清洗缓冲液可包括通常用于磷灰石的平衡、加载、或流动通过的缓冲组合物。在一些情况中，用低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐的浓度小于约100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固体表面。清洗缓冲液的pH可至少为约5，至少为约5.5，至少为约6，或至少为约6.5、7或8。在一些情况中，进行水清洗，并且水的量可广泛变化。典型的水清洗至少为约0.2树脂体积，在大多数情况下水清洗为约0.2-1.5树脂体积，或为约0.2-2树脂体积。
B.磷酸盐缓冲的溶液
当将所述磷灰石与缓冲的钙溶液接触后，可将所述磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液接触。或者，在所述磷灰石与缓冲的钙溶液接触之前，可将含磷酸盐的缓冲液与磷灰石接触。在一些情况中，在缓冲的钙溶液和含磷酸盐的缓冲液之间可施加插入的清洗步骤。所述含磷酸盐的缓冲液的磷酸盐浓度和通过树脂的含磷酸盐的缓冲液的量可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在使用磷灰石的过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何量。不希望受理论限制，相信含磷酸盐的缓冲液与磷灰石固体表面，或与在与缓冲的钙溶液接触过程中形成的松散结合的钙层相互反应，以在磷灰石固体表面上形成松散结合(例如非共价结合)的磷酸盐层。在一些情况中，所述磷酸盐层替代了一些或全部(或更多)的之前纯化步骤中的磷酸盐损失。因此，磷酸盐的量、体积、浓度等，或会减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中发生的树脂劣化的含磷酸盐的缓冲液的任何其它组分或方面，可以是允许足够形成松散结合的磷酸盐层的量。
含有磷酸盐的缓冲液的磷酸盐浓度通常选择低于在缓冲液的pH和温度下磷酸盐的溶解度极限。此外，所述浓度可基于缓冲液其它组分的存在或不存在，或任何前述缓冲液选择的组成而改变。在此概念的某些实施方式中，采用以下磷酸盐浓度将获得最佳结果：从约10mM至约1、1.5或2M；约20mM-1.5M；或约25mM-1M；或约50mM-1M；包括至少约，或约10mM、15mM、20mM、25mM,30mM、40mM、50mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、150mM、200mM、300mM、500mM、750mM、1M或更高。在一些情况中，所述磷酸盐浓度为10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、150mM、200mM、300mM、500mM、750mM、1M或更高。在一些情况中，所述磷酸盐浓度从或从约0.1或2M至或至约0.4M、0.5M、或1M。在一些情况中，将所述柱与低浓度磷酸盐缓冲液(例如2、5、10、15、20或25mM)接触，随后与高浓度磷酸盐缓冲液(例如30、50、75、100、250、500、750、1,000、1,500或2,000mM)接触。在一些情况中，在高浓度磷酸盐缓冲液之后使用低浓度磷酸盐缓冲液可避免缓冲的钙溶液和高浓度磷酸盐缓冲液之间潜在的不相容性(例如沉淀)。
所述含磷酸盐的缓冲液的pH和通过树脂的含磷酸盐的缓冲液的量可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在使用磷灰石的过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的所述树脂的劣化的任何pH。适用于采用含有磷酸盐的缓冲液的磷灰石再生的示例性的pH包括以下任何pH：至少为约5、至少为约5.5、至少为约6、至少为约6.5、至少为约7、至少为约7.5、至少为约8、或至少为约8.5或更高。在一些情况中，含磷酸盐的缓冲液的pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10或更高。
为了获得所述恢复所需溶液的体积可根据磷酸根离子浓度改变，但在大多数情况中，可采用约1.0-10.0树脂体积的溶液会获得最佳结果，在很多情况中，可用约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或约2树脂体积来获得最佳结果。所述体积可达约6树脂体积，包括2、3、4或5树脂体积。在一些情况中，可使用的高磷酸盐浓度的体积小于1个树脂体积(例如小于约0.9、0.7、0.5体积)。
在一些实施方式中，所述磷灰石固体表面在柱中，例如色谱柱，所述含磷酸盐的缓冲液可以一定流速施加到所述磷灰石固体表面上。所述流速可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何速率。合适的流速，包括在磷灰石的平衡、加载、洗脱、清洁/剥离、消毒或冲洗过程中通常使用的速率。示例性的流速为400厘米/小时。在一些情况中，所述流速基本低于400厘米/小时(例如，300、200、100或50厘米/小时或更低)。低流速的使用可允许磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液之间的接触时间更长。当磷酸盐的浓度较低或含磷酸盐的缓冲液的体积较小时，可特别优选低流速。当含磷酸盐的缓冲液或前述溶液是粘性的或所述柱被吸附的生物化合物污染时，也可优选低流速。或者，所述流速可高于400厘米/小时。在一些情况下，磷酸盐的松散结合层的形成是快速的，高流速有利于减少磷灰石再生所需的时间。
在一些实施方式中，以批次形式将所述磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液接触。在批次形式中，可通过将所述含磷酸盐的缓冲液倒在所述磷灰石固体表面上，或将所述磷灰石固体表面的浆料倒入含磷酸盐的缓冲液中来施加含磷酸盐的缓冲液。所述接触时间可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何时间。
在一些实施方式中，随后清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。在其它实施方式中，用含磷酸盐的缓冲液再生处理后不再清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。本领域技术人员可容易地选择合适的清洗缓冲液。在一些情况中，用清洗溶液处理所述树脂以去除任何过量的钙、磷酸盐或氢氧根离子。通常，所述清洗缓冲液可以具有基本不浸出磷灰石表面组分、不释放累积的水合氢离子或不形成不希望的沉淀的pH值、组成和浓度。例如，所述清洗缓冲液可以是与前述和后续缓冲液相容的，从而在混合时不产生沉淀。如另一个实施例，可选择所述清洗缓冲液，从而不浸出在将所述磷灰石固体表面与所述缓冲的钙溶液接触过程中形成的任何松散结合的钙层。合适的清洗缓冲液可包括通常用于磷灰石的平衡、加载、或流动通过的缓冲液组合物。在一些情况中，用低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐的浓度小于约100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固体表面。清洗缓冲液的pH可至少为约5，至少为约5.5，至少为约6，或至少为约6.5、7或8。在一些情况中，进行水清洗，并且水的量可广泛变化。典型的水清洗至少为约0.2树脂体积，在大多数情况下水清洗为约0.2-1.5树脂体积，或为约0.2-2树脂体积。
可通过在含磷酸盐的缓冲液处理之前用缓冲的钙溶液处理，或通过在缓冲的钙溶液处理之前用含磷酸盐的缓冲液处理来实现一定程度的树脂再生。在一些实施方式中，可通过首先施加缓冲的钙溶液处理，随后施加含磷酸盐的缓冲液处理来实现较大程度的再生。在一些实施方式中，可通过在进行一个或多个步骤的含磷酸盐的缓冲液处理之后或之前进行一个或多个步骤的缓冲的钙溶液处理来实现优选的再生程度。在一些情况中，在一个或多个多步骤的缓冲的钙溶液处理或含磷酸盐的缓冲液处理之前或之后进行清洗。
在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液处理和/或含磷酸盐的缓冲液处理在目标分析物的洗脱或流动通过后进行。例如，磷灰石表面可与目标分析物平衡、接触，所述目标分析物可在流动通过过程中洗脱或收集，随后可进行再生方案。如本文所述，示例性的再生方案可包括但不限于将缓冲的钙溶液与所述磷灰石固体表面接触，随后将磷酸盐缓冲液与所述磷灰石固体表面接触的那些。示例性的再生方案还可包括但不限于将磷酸盐再生缓冲液与所述磷灰石固体表面接触，随后将缓冲的钙再生溶液与所述磷灰石固体表面接触的那些。当所述磷灰石与缓冲的钙和磷酸盐再生溶液接触后，可施加碱性氢氧化物处理。
C.氢氧化物
施加氢氧根离子处理作为所述磷灰石固体表面再生的最后处理步骤。可使用任何可溶形式的氢氧根离子，优选使用水溶性的形式。在一些情况中，碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠或氢氧化钾是特别合适的。如在钙离子和磷酸根离子的情况中一样，氢氧根离子溶液的浓度和量可改变。不希望受理论限制，相信氢氧化物与磷灰石固体表面，或与在与缓冲的钙溶液和/或含磷酸盐的缓冲液接触的过程中形成的松散结合的(例如非共价结合)钙层、磷酸盐层或钙和磷酸盐层相互反应，以将松散结合的(例如非共价结合)矿物质转换为磷灰石，从而提供再生的表面。在一些情况中，所述再生的表面替代了一些或全部(或更多)的在之前纯化步骤中的钙、磷酸盐或磷酸钙损失。因此，会减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中发生的树脂劣化的氢氧化物的量、体积、浓度等，可以是允许足够将松散结合的钙、磷酸盐或磷酸钙转换至磷灰石的量。所述氢氧根离子也可清除污染物和残留蛋白质的树脂，并还可作为消毒或储存溶液。
氢氧根离子的浓度可从约0.005或0.01M至约5M；约0.1-4.0M，在很多情况中为约0.3-3.0M，包括0.2M、0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、2.0M或2.5M。含氢氧根离子的处理溶液的合适的体积为约1.0-20.0树脂体积，在很多情况中为约1.5-10.0树脂体积，包括2、3、4、5、6、7、8或9体积。在一些情况中，可使用的高氢氧化物浓度的体积小于一个树脂体积(例如小于约0.9、0.7、0.5体积)。
氢氧化物处理后，所述树脂可用合适的缓冲液清洗或平衡。在一些情况中，用加载缓冲液将所述树脂平衡或清洗，随后平衡。例如，所述树脂可用10mM磷酸盐缓冲液，pH6.5平衡，以平衡用于蛋白质纯化的柱。在一些情况中，将所述树脂平衡或清洗，随后用储存缓冲液平衡。例如，可将所述树脂用0.1MNaOH、10mM磷酸盐缓冲液平衡，随后储存。
实施例
仅以说明的形式而非限制的形式提供以下实施例。本领域技术人员不难了解，可改变或调整各种非关键参数而获得基本相同或相似的结果。
实施例1－对照实验
该实施例说明了羟基磷灰石树脂在将所述树脂暴露在模拟在蛋白质分离时遇到的那些条件中的一系列循环之后的劣化情况(但不加载并洗脱蛋白质)。所述实验在柱中进行，所述柱长为20厘米，内径为2.2厘米，内部体积为76mL，填充物是40微米的陶瓷I型羟基磷灰石颗粒，重约48克，得到的通过所述柱的移动相流速为250厘米/小时。进行一系列25个连续循环，每个循环由以下8个步骤组成：
表I
分离和柱恢复的模拟循环的处理方案
在该方案中，步骤2是用于降低步骤8的碱处理之后的柱pH的调整步骤；而步骤3和4将该柱暴露在一般在柱平衡、样品加载和洗脱过程中出现的条件中。在第一次循环之前和最末次循环之后，在所述柱的三个部分(顶部25％，中部50％以及底部25％(所述移动相在柱的顶部进入))的每一个部分中，进行颗粒质量和颗粒强度的测量(通过单轴约束体积压缩，“UCBC”进行)。结果列于下述表II。
表II
对于分离和柱恢复的模拟循环的三个柱位置处的固相质量和强度的变化
表II中的数据表明，通过质量显著损失和颗粒强度显著下降证明该树脂经历了化学改变。总质量损失为6.89％，在所述柱整个高度中大致均匀。顶部和底部处的颗粒强度下降最大，但总体上也在整个柱中延伸。
实施例2
该实施例说明了包括不缓冲所述钙再生溶液的原位再生方案的结果所述实验在柱中进行，所述柱长为40厘米，内径为1.6厘米，内部体积为80.42mL，填充物是40微米的陶瓷I型羟基磷灰石颗粒，重约51克，得到的通过所述柱的移动相流速为200厘米/小时。进行一系列25个连续循环，每个循环由以下11个步骤组成：
表III
分离和柱恢复的模拟循环的处理方案
在表III中，稀释MES是指MES浓度至少为约10mM、15mM或20mMMES，并少于约25mM或30mMMES。稀释Tris是指Tris浓度至少为约2mM、3mM、4mM、5mM、10mM或15mMTris，并且少于约20mM或25mMTris。
如实施例1所示，进行25次循环，并在第一次循环之前和最末次循环之后测量颗粒质量和颗粒强度。该测试表明，在25次循环过程中，整个柱的颗粒质量增加了7.18％，颗粒强度减少了20％。因此，虽然与实施例1相比，质量的增加和颗粒强度的较小损失证明获得了一些再生，但所述磷灰石仍然明显降解。
实施例3
该实施例说明了包括缓冲的钙再生溶液的原位再生方案的结果。所述实验在柱中进行，所述柱长为20厘米，内径为2.2厘米，内部体积为76.03mL，填充物是40微米的陶瓷I型羟基磷灰石颗粒，重约48克，得到的通过所述柱的移动相流速为250厘米/小时。进行一系列25个连续循环，每个循环由以下9个步骤组成：
表IV
处理方案
与未使用的羟基磷灰石对照相比，用表IV中的方案进行25个循环后从柱中得到的羟基磷灰石，获得了4.74％的质量，颗粒强度增加了30％。这些结果表明，如通过质量增加并且颗粒强度显著增强所证明的，采用缓冲的钙溶液，接着施加磷酸盐缓冲液，随后施加氢氧化物的方案提供了显著且令人惊讶的再生程度。
实施例4
该实施例说明了将包括缓冲的钙再生溶液的原位再生方案结合入采用碱金属盐步骤梯度洗脱的基于磷灰石的纯化方案中的结果。所述实验在柱中进行，所述柱长为20厘米，内径为2.2厘米，内部体积为76.03mL，填充物是40微米的陶瓷I型羟基磷灰石颗粒，重约48克，得到的通过所述柱的移动相流速为400厘米/小时。进行一系列30个连续循环，每个循环由以下8个步骤组成：
表V
处理方案
与未使用的羟基磷灰石对照相比，用表V中的方案进行30个循环后从柱中得到的羟基磷灰石获得了20.8％的质量，颗粒强度增加了13％。这些结果表明，即使在洗脱步骤中使用了高浓度碱金属盐，采用缓冲的钙溶液仍提供了显著的且令人惊讶的再生程度。
实施例5
该实施例说明了将包括缓冲的钙再生溶液的原位再生方案结合入采用碱金属盐步骤梯度洗脱的基于磷灰石的纯化方案中的结果。所述实验在柱中进行，所述柱长为20厘米，内径为1.6厘米，内部体积为40.21mL，填充物是40微米的陶瓷I型羟基磷灰石颗粒，重约25克，得到的通过所述柱的移动相流速为400厘米/小时。进行一系列25个连续循环，每个循环由以下8个步骤组成：
表VI
处理方案
与未使用的羟基磷灰石对照相比，用表VI中的方案进行25个循环后从柱中得到的羟基磷灰石获得了12.6％的质量，颗粒强度增加了12％。该结果表明，即使在洗脱步骤中采用高浓度碱金属盐，仍然获得了显著的再生。此外，使用小体积(1.1柱体积)的缓冲的钙溶液获得了显著的再生。
实施例6
该实施例说明了将包括缓冲的钙再生溶液的原位再生方案结合入基于碱金属盐补充的磷酸盐梯度的基于磷灰石的纯化方案中的结果。所述实验在柱中进行，所述柱长为40厘米，内径为2.2厘米，内部体积为152.05mL，填充物是40微米的陶瓷I型羟基磷灰石颗粒，重约96克，得到的通过所述柱的移动相流速为350厘米/小时。进行一系列30个连续循环，每个循环由以下11个步骤组成：
表VII
处理方案
在表VII中，稀释MES是指MES浓度至少为约10mM、15mM或20mMMES，并少于约25mM或30mMMES。稀释Tris是指Tris浓度至少为约2mM、3mM、4mM、5mM、10mM或15mMTris，并且少于约20mM或25mMTris。
与未使用的羟基磷灰石对照相比，用表VII中的方案进行30个循环后从柱中得到的羟基磷灰石获得了18％的质量，颗粒强度增加了45％。同样的，通过获得磷灰石质量和磷灰石颗粒强度证明了所述方案提供了显著且令人惊讶的磷灰石再生程度。
实施例7
该实施例说明了将包括缓冲的钙再生溶液的原位再生方案结合入基于磷酸盐梯度的基于磷灰石的纯化方案中的结果。所述实验在填充有40微米陶瓷I型羟基磷灰石颗粒的柱中进行，得到通过所述柱的移动相流速为250厘米/小时。进行一系列连续循环，每个循环包括在表VIII中所列的步骤。
表VIII
处理方案
步骤 方案试剂 柱体积
1 平衡1 5.0
2 平衡2 3.0
3 取样 7.0
4 清洗 3.0
5 梯度10-90％0.1M NaCl>0.1M NaCl/磷酸盐溶液 10.0
6 清洗 2.0
7 连接冲洗 0.4
8 钙原位再生溶液 变化
9 连接冲洗 0.4
10 400mM NaPi,pH 7.0 2.0
11 1M NaOH 2.0
对于表IX中所述的每个实验，表VIII中所列的“钙ISR溶液”是变化的。
表IX
钙ISR(原位再生)
表X提供了在四个大量1型CHT，40微米对照介质上的标准蛋白质的相关选择性测试的更多实验细节。
表X
相关选择的方案
进行表X的纯化方案所得到的结果示于图1。随后用含有50mM钙和100mMMES的缓冲的再生溶液，或含有50mM钙的未缓冲的钙再生溶液循环所述磷灰石介质。α-胰凝乳蛋白酶原A的相对选择性在通过用100mMMES溶液在pH为7.0时缓冲的50mM钙来循环的介质上变化(红色)，如图2所示。同样如图2所示，虽然相对于对照注意到分辨率的损失(绿色)，但所述选择性在用未缓冲的原位再生(ISR)溶液循环之后保持(黑色虚线)。
图3显示了当通过用100mMMES在pH为6.2时缓冲的25mM氯化钙ISR溶液循环时，保持α-胰凝乳蛋白酶原A的相对选择性。pH为6.2或5.6时，会影响肌红蛋白和α-胰凝乳蛋白酶原A之间的分辨率，而非其相对选择性。其相对选择性与不存在缓冲的ISR溶液的基线方案的树脂(5897-045BL)(紫色)、对照树脂(绿色)和未缓冲的ISR树脂(5897-072/对照17)(黑色虚线)相似。损失了通过用100mMMES在pH为7.0时缓冲的50mM钙的ISR溶液循环的树脂的相对选择性(红色)。
图4显示，与对照(绿色)相似地，当在循环过程中缓冲的ISR溶液中的钙浓度减少至10mM(桔色)或25mM(浅蓝色)时，保持α-胰凝乳蛋白酶原A的相对选择性，同时用100mMMES将缓冲液保持在pH为7.0。这不是在同样的缓冲条件下50mM钙溶液的情况(红色)。肌红蛋白和α-胰凝乳蛋白酶原A之间的分辨率降低至用未缓冲的ISR能观察到(黑色虚线)，但保持各自的选择性。
图5显示，所述相对选择性不受通过用20mMMES或23mM磷酸盐在pH为5.40时缓冲的含有低浓度钙(5.74mM)的再生溶液进行的循环的影响(浅蓝色)。此外，含有23mM磷酸盐的10.2mM钙保持了选择性，但降低了分辨率(浅蓝色虚线)。这些条件都可与用100mMMES在pH为5.6时缓冲的25mM钙(蓝色)和未缓冲的ISR(黑色虚线)比较。
如表XI所示，所有通过原位再生(ISR)进行的循环实验都增加了磷灰石介质的质量。基线介质(5897-045BL)的质量下降。除了5897-017/对照17，对于其它实验，介质强度的损失不会下降到以N/mm显示的值以下。
表XI
结果
该结果显示，缓冲的钙溶液的钙浓度和pH影响了标准蛋白质的相对选择性。当缓冲的钙溶液具有例如pH至少为约5.3、钙浓度至少为约5mM且磷酸盐或两性离子缓冲液浓度为约20-100mM时可获得可接受的性能。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。

Claims (22)

1.一种用磷灰石固体表面纯化目标分析物的方法，所述方法包括：
(a)将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接触，从而将所述目标分析物从一种或多种污染物中分离；
(b)收集所述目标分析物；以及
(c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括：
(i)将所述磷灰石固体表面与包含浓度至少为约5mM的钙离子以及两性离子缓冲剂的缓冲的钙溶液接触，所述两性离子缓冲剂浓度与所述钙离子浓度的比例至少为约2，所述缓冲的钙溶液的pH至少为约5；
(ii)将所述磷灰石固体表面与pH至少为约6.5的磷酸盐缓冲的溶液接触；以及
(iii)将所述磷灰石固体表面与含有氢氧化物的溶液接触。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法(a)包括将所述目标分析物与所述磷灰石固体表面结合，以及(b)包括从所述磷灰石固体表面洗脱所述目标分析物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法(a)包括将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接触，从而将所述目标分析物流动通过所述磷灰石固体表面，以及(b)包括在流动通过物中收集所述目标分析物。
4.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述两性离子缓冲剂是含有磺酸的缓冲剂。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含磺酸的缓冲剂是MES、PIPES、ACES、MOPSO、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPS、TAPSO、POPSO或HEPPSO、EPPS、CAPS、CAPSO或CHES。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含磺酸的缓冲剂是MES。
7.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述钙离子浓度小于约50mM，小于约25mM，或小于约15mM。
8.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述钙离子浓度至少为约25mM，或至少为约50mM。
9.如权利要求1、7或8中任一项所述的方法，其特征在于，所述两性离子缓冲剂浓度与所述钙离子浓度的比例至少为约2.5、3或4。
10.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲的钙溶液包含氯化钙或硝酸钙。
11.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲的钙溶液的pH至少为约5.3。
12.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲的钙溶液的pH为约5.3-7。
13.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲的溶液包含pH为约6.5至约8、含有约0.1至约1.0M磷酸盐的溶液。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲的溶液包含400mM磷酸盐，pH为7.0。
15.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述氢氧化物包括碱性氢氧化物。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述碱性氢氧化物包括氢氧化钠或氢氧化钾。
17.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述再生逆转或消除了在蛋白质纯化过程中或柱清洁步骤中发生的柱的降解。
18.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述再生将所述磷灰石固体表面的强度增加了至少约1％、5％、10％、15％、20％或更多。
19.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述再生在洗脱吸附的生物化合物的磷酸盐清洁/剥离步骤之前进行或替代上述步骤进行。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述再生步骤在目标分析物洗脱之后进行。
21.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述(ii)用含有磷酸盐，pH至少为约6.5的溶液接触所述磷灰石固体表面的步骤还包括：
用含有磷酸盐浓度为10mM，或小于约10mM，pH至少为约6.5的溶液接触所述磷灰石固体表面；以及
随后用含有磷酸盐浓度至少为约100mM，pH至少为约6.5的溶液接触所述磷灰石固体表面。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述再生由(i)、清洗、(ii)和(iii)组成。
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