KR20150112978A - 단백질 제제 내의 응집체 함량을 감소시키기 위한 혼합 다관능 금속 친화성 표면들 - Google Patents

단백질 제제 내의 응집체 함량을 감소시키기 위한 혼합 다관능 금속 친화성 표면들 Download PDF

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Abstract

단백질 제제의 응집체 함량을 감소시키기 위한 조성물은 금속 친화성 관능성을 보유하는 제1 표면-결합 리간드를 갖는 제1 기질을 포함하고, 금속 친화성 관능성은 실질적으로 금속이 없으며, 제1 표면-결합 리간드와 다른 추가 표면-결합 리간드를 포함하고, 추가 표면-결합 리간드는 금속 친화성 관능성과 반대가 아닌 응집체 전하를 가지며, 선택적으로 추가 표면-결합 리간드는 추가 기질 상에 제공되어, 조성물은 제1 기질 및 추가 기질의 혼합물을 포함한다.

Description

단백질 제제 내의 응집체 함량을 감소시키기 위한 혼합 다관능 금속 친화성 표면들{MIXED MULTIFUNCTIONAL METAL AFFINITY SURFACES FOR REDUCING AGGREGATE CONTENT IN PROTEIN PREPARATIONS}
본 출원은 2013년 2월 6일자로 출원된 미국 출원 제61/761,653호에 대해 우선권을 주장하며, 이는 본 출원에 참조로서 병합된다.
본 발명은 단백질, 특히 항체의 정제를 위한 물질들에 관한 것이다. 보다 상세하게는 특히 뉴클레오솜, 히스톤 및 DNA와 같은 호스트 세포 크로마틴 잔여물을 포함하는 응집체들의 함량을 감소시키기 위한 물질들에 관한 것이다.
비자연적 헤테로-응집체들이 호스트 세포-유도 오염물들 및 재조합 단백질들 사이에서 인 비트로 세포 배양 방법들에 의해 자발적으로 형성됨이 밝혀져왔다(Shukla et al., Biotechnol. Progr. (2008) 24:1115-1121; Luhrs et al., J. Chromatogr. B (2009) 877:1543-1552; Mechetner et al., J. Chromatogr. B (2011) 879:2583-2594; Gagnon et al., J. Chromatogr. A, (2011) 1218:2405-2412; Gagnon, Bioprocessing J. (2010) 9(4):14-24). 이러한 헤테로-응집체들은 두 측면에서 비자연적인것으로 간주될 수 있다: 1) 구성(constituent) 오염물들은 비-인간 호스트 세포들이 용해 사멸될 때 살아있는 비-인간 호스트 세포들에 의해 분비되거나 세포 배지 내로 방출되어, 빈번히 비-인간 원천이다. 살아있는 인간에 있어서, 이러한 비-인간 오염물들은 존재하지 않는다; 그리고 2) 구성 오염물들은 죽은 세포 구성들이 빠르게 제거되는 인간 인 비보 시스템에 비해 고 농도로 축적된다. 이에 따라, 재조합 생성물들은 일반적으로 살아있는 시스템에서는 발생하지 않는 농도에서 고농도의 강하게 상호작용하는 오염물들에 노출된다. 반면, 재조합 단백질의 고발현 레벨은 이들을 이러한 비-인간 오염물들에의 비-특이적 연관을 위한 적절한 기질로서 만들어주며, 원하지않는 다양한 조성의 헤테로-응집체들의 형성을 유발한다.
헤테로-응집체들의 오염성 단백질 함량은 상기 오염성 단백질의 직접 타겟팅을 통해 어느 정도 밝혀졌으며(Shukla et al. 및 Gagnon et al. supra), 상기 오염성 단백질의 원인이 되는 상응하는 DNA 성분의 타겟팅을 통해서 간접적으로도 밝혀졌다(Luhrs et al. 및 Gagnon supra). 일부 복합체들이 분리될 때 항체 응집체 레벨의 감소가 나타났다(Shukla et al., Mechetner et al., 및 Gagnon supra). 음이온 교환기의 항체-오염물 복합체들의 레벨을 감소시키는 능력이 개시되었으나(Luhrs et al. 및 Gagnon et al. supra), 헤테로-응집체들을 완전히 제거가능한 음이온 교환 처리는 나타나지 않았다. 크기 배제, 양이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피들이 헤테로-응집체들을 감소시키려는 시도의 일환으로 활용되었으나, 이러한 기술들은 일반적으로 음이온 교환보다 열등하다(Gagnon et al. supra).
항체들과 안정한 회합을 형성하는 오염물들의 특정 소스는 항상 공지된 것은 아니다(예를 들면, Shukla et al. supra 참조). 주목받지 못했던 DNA 오염물들이 다른 가능한 오염물들의 특정 소스로 일부 노력들이 주목되어왔다(Gagnon et al. 및 Gagnon supra). 호스트 오염물들의 항체 제제 내에서 응집체들과의 연관을 보여주는 일부 노력들은 특히 크로마틴 이화생성물(catabolites)을 포함하는 오염물들 상에 특히 집중되었다(Luhrs et al., Mechetner et al. supra). 이러한 예들에서, 응집은 직접적으로 히스톤 및 DNA와 같은 크로마틴 이화생성물에 대한 항체의 면역특이성을 통해 중재될 수 있다. 크로마틴 이화생성물들은 또한 비-특이적 상호작용을 통해 항체들과 안정한 복합체를 형성할 수 있음이 밝혀져왔다. 따라서, 크로마틴 이화생성물을 포함하지 않는 항원에 대한 공지된 면역특이성들을 갖는 모노클로날 항체들이 죽은 호스트 세포들의 핵으로부터 유래된 다양한 뉴클레오솜, 히스톤 및 DNA 내용을 갖는 고도로 안정한 응집체들을 형성할 수 있다(Gan et al, J. Chromatogr. A 1291 (2013) 33-40). 특히, 크로마틴 이화생성물들은 높은 고분자량(HMW) 응집체들에서 고도로 나타남이 밝혀졌다. HMW 응집체들은 치료-중화 항체들의 형성의 촉진에 이들이 관여하는 것으로 의심되므로 특별한 관심대상이다. HMW 응집체들은 일반적으로 관심 항체의 작은 배수체보다 큰 사이즈의 응집체로 정의된다. 예를 들면, 2-항체 회합체는 HMW 응집체들로 고려되지 않으며, 대부분의 4-항체 회합체들도 마찬가지이다. 그러나, 약 8 내지 약 10 또는 그 이상의 항체들에 상응하는 것과 같은 훨씬 더 큰 사이즈의 응집체들은 일반적으로 HMW 응집체들로 분류될 수 있다.
헤테로-응집체들을 분리하는 것으로 기대되는 제제들로 항체 제제들을 처리하는 것은 효과가 낮음이 증명되었다. 예를 들면, 고농도의 우레아, 염 또는 이 둘의 조합을 사용하는 것은 실질적으로 IgM-오염물 헤테로-응집체들을 분리시키지 못한다(Gagnon et al. supra). 우레아, 알코올 및 계면활성제의 예비-용출 세척을 포함하는 단백질 A 친화도 크로마토그래피는 단백질 G 친화도 크로마토그래피와 결합된 우레아, 염 및 EDTA 예비-용출 세척(Mechetner et al. supra)에서처럼 세척이 없는 것보다 보다 효과적인 헤테로-응집체 레벨 감소를 보여주었다(Shukla et al. supra). 우레아의 예비-용출 세척을 포함한 음이온 교환 크로마토그래피는 우레아 세척이 없는 경우보다 효과적으로 헤테로-응집체를 감소시키는 것으로 나타났다(Gagnon et al. supra). 양이온 교환 크로마토그래피는 또한 세척이 없는 경우보다 예비-용출 EDTA로 보다 효과적으로 헤테로-응집체들을 제거하는 것으로 나타났다(Gagnon et al. supra). 마지막으로, 우레아 및/또는 염의 예비-용출 세척을 포함한 히드록시애퍼타이트(hydroxyapatite)는 또한 이러한 세척이 없는 경우보다 효과적으로 헤테로-응집체들을 제거하였다(Gagnon supra). 이러한 관찰에도 불구하고, 일반적으로, 크로마토그래피 칼럼에 결합된 항체들의 예비-용출 세척에서 분리 제제의 사용은 단지 미약하게 성공적이었다.
고정화된 TREN(트리스(2-아미노에틸)아민)은 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 수행 목적으로 공지되어 있으며, 상업적으로 사용가능하다. 여기서 상기 고정화된 TREN은 최초 금속 이온과 로딩되어, 생분자들이 TREN-결합 금속 이온과의 접촉에 의해 포획되고, 이어서 상기 금속 이온으로부터 타겟 생분자를 분리시킴으로써 회수된다. 이미노디아세트산(iminodiacetic acid: IDA) 및 니트릴로아세트산(nitriloacetic acid: NTA)과 같은 TREN외에 IMAC 리간드들은 또한 IMAC 수행을 위한 목적으로 공지 및 상업적으로 활용되며, 상기 리간드는 최초 금속 이온과 로딩되어, 생분자들은 리간드-결합 금속 이온과 접촉에 의해 포획되고, 이어서 상기 금속 이온으로부터 타겟 생분자를 분리시킴으로써 회수된다.
본 발명은 단백질 제제 내의 응집체 함량을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
일부 측면들에 있어서, 본 출원에 개시된 실시예들은 단백질 제제의 응집체 함량을 감소시키기 위한 조성물들과 관련되며, 상기 조성물은 금속 친화성 관능성을 보유하는 제1 표면-결합 리간드를 포함하는 제1 기질(substrate)을 포함하고, 상기 금속 친화성 관능성은 실질적으로 금속(금속 이온)이 없으며, 상기 제1 표면-결합 리간드와 다른 추가 표면-결합 리간드를 포함하며, 상기 추가 표면-결합 리간드는 상기 금속 친화성 관능성과 반대가 아닌 응집체 전하를 가지며, 선택적으로 상기 추가적 표면-결합 리간드는 추가 기질 상에 제공되며, 상기 조성물은 상기 제1 기질 및 상기 추가 기질의 혼합물을 포함한다.
음성 넷(net) 전하를 갖는 금속 친화성 리간드 및 음성 넷 전하 또는 넷 전하가 없는 적어도 하나의 추가 리간드를 보유한 고체 물질들을 포함하거나, 또는 이와는 달리 양성 넷 전하를 갖는 금속 친화성 리간드 및 양성 넷 전하 또는 전하가 없는 적어도 하나의 추가 리간드를 보유한 고체 물질들을 포함하는 본 출원에 개시된 조성물들은 단백질 제제들 내의 고분자량(HMW) 응집체들 및 보다 작은 응집체들의 함량을 실질적으로 감소시키는 능력을 가짐이 놀랍게도 발견되었다. 본 발명의 특정 실시예들은 상기 단백질 제제에 추가되었을 수 있는 다가 이온들 및 항바이러스 화합물들과 같은 제제들을 제거하는 추가적 능력을 갖는다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 반대 전하가 아닌 각 리간드들이 동일한 표면, 또는 다른 표면들, 또는 이들의 혼합물 상에 존재할 수 있는 장치를 제공한다. 이러한 리간드들은 이에 제한되는 것은 아니나, 소수성, 파이-파이 결합, 수소 결합, 및 금속 친화성을 포함하는 추가적인 화학적인 관능성을 보유하거나 이에 결합된다. 고체 표면들은 미립자, 섬유, 다공성-멤브레인 또는 모놀리스 구조일 수 있으며, 복수의 구조 타입들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 반대 전하가 아닌 상기 각 리간드들은 전술한 임의의 구조 타입을 포함하는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 분리된 표면들 상에 존재할 수 있다. 복수의 표면들이 활용되는 경우, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 관능성들이 각 표면에 대해 임의의 수의 리간드들에 의해 제공될 수 있다. 단일 리간드가 또한 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 관능성들을 제공할 수 있다. 예를 들면, 단일 리간드가 금속 친화성 및 수소 결합 관능성, 또는 금속 친화성 및 소수성 관능성, 또는 금속 친화성 및 파이-파이 결합 관능성 등과 같은 2개의 관능성들을 제공할 수 있다. 유사하게, 단일 리간드는 또한 금속 친화성, 소수성 관능성 및 파이-파이 결합 관능성과 같은 3개의 관능성들을 제공할 수 있다. 통상의 기술자라면 관능성들의 임의의 원하는 타입들 및 수들을 조합하고 이들을 임의의 수의 리간들 및 이러한 리간드들을 보유하는 임의의 수의 표면들에 분포시키는 능력을 인식할 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 장치는 적용된 샘플과 반대 전하가 아닌 각각이 리간드들의 접촉이 실질적으로 동시에 일어나도록 구성된다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 복수의 표면들이 활용되며, 이들은 균일하게 혼합되거나 그래디언트(gradient) 혼합물 내에 나타날 수 있다.
다른 실시예들에 있어서, 상기 장치는 적용된 샘플과 반대 전하가 아닌 각각의 리간드들의 접촉이 순차적으로 일어나도록 구성될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 순차적 접촉은 복수의 표면들의 사용에 의해 촉진될 수 있으며, 이러한 복수의 표면들은 공간적으로 분리될 수 있다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 순차적 접촉은 상기 샘플을 먼저 일 표면에 접촉시키고, 이어서 다른 표면에 접촉시킴에 의해 촉진될 수 있다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 순차적 접촉은 공간적 및 시간적 분리 양자에 의해 촉진될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에 있어서, 단백질 제제 내의 응집체 함량 농도 감소를 포함하는, 단백질의 정제를 위한 조성물 및 장치를 제공한다. 특정 실시예들에 있어서, 단백질 제제의 응집체 함량 감소를 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 금속 친화성 관능성을 보유하는 제1 표면-결합 리간드 및 상기 제1 표면-결합 리간드의 상기 금속 친화성 관능성과 반대가 아닌 응집체 전하를 갖는 적어도 하나의 추가 표면-결합 리간드를 포함한다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드 및 추가 표면-결합 리간드는 각각 기질에 공유적으로 결합한다. 상기 제1 표면-결합 리간드 및 상기 추가 표면-결합 리간드는 동일한 기질에 각각 공유적으로 결합할 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드 및 상기 추가 표면-결합 리간드는 각각 다른 기질들에 공유적으로 결합할 수 있다. 상기 기질은 입자일 수 있으며, 특정 실시예들에 있어서, 상기 입자는 다공성 또는 비-다공성일 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 기질은 단백질 제제 내의 단백질의 진입을 허용하기에 충분히 큰 기공들을 갖는 다공성 입자이다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 기공들은 단백질 제제의 단백질의 진입을 허용하기에 지나치게 작다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 기질은 약 10nm 및 약 100nm 사이, 10nm 미만, 또는 약 100nm를 초과하는 평균 기공 사이즈를 갖는 다공성 입자이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 기질은 멤브레인, 모놀리스, 또는 고체 또는 다공성 벽 중공(hollow) 섬유이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드가 부착되는 상기 기질은 추가 표면-결합 리간드가 부착되는 기질과 다른 종류이다. 예를 들면, 하나의 기질은 입자이며, 다른 기질은 모놀리스, 멤브레인 또는 섬유, 다공성-벽 중공 섬유, 이들의 복수의 또는 화합물 구성일 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드 및 추가 표면-결합 리간드는 상이하다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 멀티덴테이트 금속 킬레이팅 모이어티(multidentate metal chelating moiety)이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 음전하성의 응집체 전하를 갖는다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 양전하성의 응집체 전하를 갖는다. 특정 실시예들에 있어서, 추가 표면-결합 리간드는 금속 친화성 관능성을 보유한다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 추가 표면-결합 리간드는 멀티덴테이트 금속 킬레이팅 모이어티이다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 양전하성이며, 표면은 그 표면의 응집체 전하가 양전하성인 경우 이에 결합된 추가 화학적 모이어티들을 갖는다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 일 이상의 상기 추가 화학적 모이어티들은 상기 응집체 전하가 양성으로 유지되는 한 반대 전하(음성)을 가질 수 있다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 음전하성이며, 표면은 그 표면의 응집체 전하가 음전하성인 경우, 이에 결합된 추가 화학적 모이어티들을 갖는다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 일 이상의 상기 추가 화학적 모이어티들은 상기 응집체 전하가 음성으로 유지되는 한 반대 전하(양성)을 갖는다. 특정 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 기질들은 상기 제1 표면-결합 리간드 또는 추가 표면-결합 리간드에 부가하여 일 이상의 화학적 모이어티들을 가지며, 이러한 추가 화학적 모이어티들은 조성물이 단백질 제제의 단백질과의 수소 결합, 소수성 상호작용, 금속 친화성 또는 파이-파이 결합에 참여하는 능력을 향상시킨다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 음전하성이며, 이미노디아세트산(2-(카르복시메틸아미노)아세트산)(EDTA), 에틸렌 글리콜(아미노에틸에테르)디아세트산(EGTA), 니트릴로아세트산(2,2',2''-니트릴로트리아세트산)(NTA), 아스파르트산, 또는 글루탐산이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 양전하성이며, 트리스(2-아미노에틸)아민 또는 데스페리옥사민(desferioxamine)이다.
특정 실시예들에 있어서, 상술한 실시예들에서 설명한 표면-결합 화학적 모이어티들은 폴리머 구조내에 직접 병합되거나 물리적 표면이 합성될 동안에 폴리머 내에 병합될 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 크로마토그래피를 위해 구성된 장치를 제공한다. 특정 실시예들에 있어서, 상지 장치는 기질 또는 제1 표면-결합 리간드 및 추가 표면-결합 리간드가 부착된 기질을 함유하는 하우징으로 구성된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 장치는 일 이상의 다공성 멤브레인을 포함하며, 이러한 적어도 하나의 멤브레인은 상기 제1 표면-결합 리간드 및 추가 표면-결합 리간드가 부착되는 기질이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 멤브레인은 다공성-뱍 중공 섬유들의 형태이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 장치는 섬유들의 다공성 망상 배열을 포함하며, 이러한 섬유들은 상기 제1 표면-결합 리간드 및 추가 표면-결합 리간드가 부착되는 기질이다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 장치는 다공성 멤브레인들 사이에 샌드위치된 다공성 또는 비-다공성 입자들, 또는 모놀리스, 또는 프릿(frits)을 포함한다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 상기 제1 표면-결합 리간드 또는 추가 표면-결합 리간드가 부착되는 기질이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드 및 추가 표면-결합 리간드는 또한 상기 멤브레인 또는 모놀리스에 부착될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 장치는 직물 또는 비정질 섬유 필터들 사이에 샌드위치된 다공성 또는 비-다공성 입자들을 포함할 수 있다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 상기 제1 표면-결합 리간드 또는 추가 표면-결합 리간드가 부착되는 기질이며, 상기 섬유 필터들은 실질적으로 불활성이다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 섬유 필터들은 또한 일 이상의 표면-결합 리간드들을 보유할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 장치는 직물 또는 결정형 프릿들 사이에 샌드위치된 다공성 또는 비-디공성 입자들을 포함하며, 상기 프릿은 실질적으로 불활성이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 프릿들은 일 이상의 표면-결합 리간드를 보유할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 장치는 망상 고분자 네트워크 내에 내장된 다공성 또는 비-다공성 입자들을 함유한다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 입자들은 상기 제1 표면-결합 리간드 또는 제2 표면 결합 리간드가 결합되는 기질이며, 상기 망상 고분자 네트워크는 실질적으로 불활성이다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 망상 고분자 네트워크는 또한 일 이상의 표면-결합 리간드들을 보유한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 장치에 있어서 상기 제1 표면-결합 리간드가 결합되는 기질 및 추가 표면-결합 리간드가 결합되는 기질 모두 입자들이며, 상기 입자들은 멤브레인들, 모놀리스들, 망상 고분자 네트워크, 직물 또는 비정질 섬유 필터들, 결정 프릿들 또는 이들의 조합 사이에 한정된다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 장치의 일 이상의 성분들의 화학적 표면은 상대적으로 불활성이며 또는 상대적으로 낮은 표면 영역이어서 상기 장치의 화학적 관능성에 유의한 기여를 제공하지 않는다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상대적으로 불활성이거나 상대적으로 낮은 표면 영역인 화학적 표면은 구조적 안정성을 생성하거나, 액체 플로우를 유도하거나, 또는 단백질 제제 내의 불용성 물질들을 물리적으로 차단, 트랩 또는 흡수하여 이들이 장치의 효과적인 사용을 방해하는 것을 방지하도록 구성된다.
일부 실시예들에 있어서, 제1 표면-결합 리간드 및 추가 리간드의 비율은 약 1:99 내지 약 99:1 범위일 수 있다. 통상의 기술자라면 대부분의 임의의 비율이 특정 적용예에 대해 적절함을 이해할 것이다. 실용적으로, 일부 실시예들에 있어서, 제2 표면 대비 제1 표면의 비율을 최적화하는 것은 제1 및 제2 성분들의 동등한 1:1 비율을 채용함으로써 시작하고 이러한 개시점으로부터 비율들을 변경함으로써 상기 비율을 체계적으로 최적화할 수 있다.
리간드들이 복수의 타입의 물질들 상에 존재하는 일부 실시예들에 있어서, 각 물질들의 분포 비율은 다양할 수 있다. 통상의 기술자라면 대부분의 임의의 비율 및/또는 분포가 특정 적용예에 대해 적절함을 이해할 것이다.
용어들이 본 발명의 보다 용이한 이해를 위해 제공된다. 추가적인 정의는 상세한 설명을 통해 제공된다.
"응집체(Aggregate(s))"는 생리학적 조건에서 안정한 2 이상의 분자들의 회합체를 지칭하며, 넓은 범위의 pH 및 전도도 조건에서 안정하게 유지될 수 있다. 응집체들은 빈번히 단백질, 핵산, 또는 지질과 같은 적어도 하나의 생분자 및 다른 분자 또는 금속 이온을 포함한다. 상기 회합체는 임의의 타입의 또는 임의의 조합의 화학적 상호작용을 통해 발생한다. 항체들의 응집체들은 두 카테고리로 분류될 수 있다: "호모응집체(Homoaggregates)"는 2 이상의 항체 분자의 안정한 회합체를 지칭한다; "헤테로-응집체(Hetero-aggregates)는 일 이상의 항체 분자와 일 이상의 비-항체 분자들의 안정한 회합체를 지칭한다. 상기 비-항체 성분은 뉴클레오티드, 엔도톡신, 금속 이온, 단백질, 지질, 또는 세포 배양 미디어 성분으로 구성된 그룹으로부터의 일 이상의 개체로 구성될 수 있다.
"항체(Antibody)" 는 면역글로불린, 복합체 또는 이의 절편 형태를 지칭한다. 상기 용어는 이에 제한되는 것은 아니나, 인간 또는 다른 포유류 세포주들로부터 유도된 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 계통의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들을 포함하며, 인간화, 인간, 단일-사슬, 키메릭, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이, 이식 및 인 비트로 생성 항체들과 같은 천연 또는 유전적으로 변이된 형태를 포함한다."항체"는 또한 이에 제한되는 것은 아니나, 면역글로불린 모이어티를 함유하는 융합 단백질들을 포함하는 복합체 형태를 포함할 수 있다. "항체"는 또한 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, Fc 및 다른 조성과 같은 항체 절편을 포함할 수 있으며, 이들은 항원-결합 기능을 보유할 수도 안할 수도 있다.
"엔도톡신(endotoxin)" 은 용균시 세포로부터 방출되는 그람-음성 박테리아의 외부 멤브레인 내에 존재하는 독성 열-안정적인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide) 물질을 지칭한다. 엔도톡신은 일반적으로 이들의 높은 함량의 포스페이트 및 카르복실 잔여물들 때문에 산성이며, 지질-A 영역의 지방산 함량때문에 매우 소수성을 갖는다. 엔도톡신들은 수소 결합의 강한 기회를 제공한다.
"기질(substrate)" 또는"고체 물질"은 천연 상태에서 미립자, 결정, 고분자, 섬유, 다공성-중공 섬유, 모놀리스, 멤브레인일 수 있는 불용성 유기 또는 무기 고체를 지칭한다. 이는 비-다공성 또는 다공성 입자들, 다공성 멤브레인, 다공성 필터, 또는 다공성 모놀리스로 구성될 수 있다. 미립자의 경우, 입자들은 대략 구형이거나 구형이 아닐 수 있으며, 100 nm 미만으로부터 100 미크론 이상까지의 범위의 사이즈를 가질 수 있다. 다공성 입자들의 평균 기공 사이즈는 10 nm(마이크로기공)에서부터 100 nm 초과(마크로기공) 범위일 수 있다. 멤브레인에서 평균 기공 사이즈는 100 nm 미만으로부터 1 미크론을 초과하는 범위일 수 있다. 멤브레인 또는 모놀리스 내의 평균 채널 사이즈는 1 미크론 미만에서부터 10 미크론 초과 범위일 수 있다. 상기 고체 물질은 예를 들면, 입자들이 망상 매트릭스내에 내장되거나, 멤브레인들 사이에서 샌드위치되거나, 양자 모두인 화합물 구조를 더 포함할 수 있다.
"금속 친화성 관능성(Metal affinity functionality)"은 고체 표면에 고정되어 바람직하게는 1:1 방식으로 금속 이온과 결합하는 화학적 모이어티의 능력을 지칭한다. 이러한 모이어티들은 금속 이온과 배위 결합을 형성할 수 있으며, 이러한 특정 모이어티들은 바이덴테이트(bidentate) 또는 멀티덴테이트(multidentate)일 수 있다. 이러한 능력을 갖는 음전하성 모이어티들의 비제한적 예들은 이미노디아세트산 (2-(카르복시메틸아미노)아세트산), 디에틸아민 트리아민 펜트아세트산, 및 니트릴로아세트산(2,2',2''-니트릴로트리아세트산)을 포함한다. 이러한 능력을 갖는 양전하성 화합물의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라민, 테트라에틸렌펜트아민, 폴리프로필렌이민 테트라아민 및 데스페리옥사민을 포함한다.
"양전하 표면(Electropositive surface)"은 양전하가 지배적인 기질 또는 고체 물질의 표면을 지칭한다. 표면의 양전하성은 비제한적인 예로서 아미노, 에틸렌디아미노, 디에틸아미노에틸, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌이민과 같은 약한 음이온 교환 그룹, 사차 아미노 그룹과 같은 강한 음이온 교환 그룹, 폴리리신, 폴리아르기닌, 또는 트리스(2-아미노에틸)아민과 같은 약-강 교환기의 조합, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라민, 테트라에틸렌펜트아민, 폴리프로필렌이민 테트라아민, PAMAM 덴드리머(에틸렌디아민 코어), 또는 이들의 조합을 포함하는 화학 그룹들에 의해 부여될 수 있다. 양으로 하전된 표면 상에 혼합 화학 성질을 생성하는 이차 관능성은 음 또는 양으로 하전된 그룹, 소수성 그룹, 파이-파이 결합 그룹, 수소-결합 그룹, 또는 금속-킬레이팅 그룹으로 구성될 수 있다. 상기 이차 관능성은 제조 물질들 또는 입자들이 합성되는 공정의 비의도된 부산물로서 양전하성 표면 상에 존재하거나, 의도된 디자인에 의해 존재할 수 있다. 이차 관능성의 농도는 입자들의 mL 당 1 밀리당량 미만에서부터 mL 당 100 밀리당량을 초과할 수 있다.
"음전하 표면(Electronegative surface)"은 음전하가 지배적인 기질 또는 고체 물질의 표면을 지칭한다. 표면의 음전하성은 비제한적인 예로서, 카르복실, 아미노카르복실(이미노디아세틱 또는 니트릴로아세틱), 또는 포스포릴과 같은 소위 약한 양이온 교환기, 또는 설포(sulfo) 그룹들(예를 들면, 설포, 설포메틸, 설포에틸, 설포프로필)과 같은 강한 교환기를 포함하는 화학적 그룹들에 의해 부여될 수 있다. 음으로 하전된 표면 상에 혼합 화학 성질을 생성하는 이차 관능성은 음 또는 양으로 하전된 그룹, 소수성 그룹, 파이-파이 결합 그룹, 수소-결합 그룹 또는 금속-킬레이팅 그룹들로 구성될 수 있다. 상기 이차 관능성은 입자들이 합성되는 제조 공정의 비의도된 부산물로서 음전하성 표면 상에 존재하거나, 의도된 디자인에 의해 존재할 수 있다. 이차 관능성의 농도는 입자들의 mL 당 1 밀리당량 미만에서부터 mL 당 100 밀리당량을 초과할 수 있다.
"폴리뉴클레오티드(Polynucleotide)"는 사슬 내에 공유 결합된 다중 뉴클레오티드 모노머들로 구성된 바이오고분자를 지칭한다. DNA(deoxyribonucleic acid) 및 RNA(ribonucleic acid)는 폴리뉴클레오티드의 예이다, 폴리뉴클레오티드는 수소 결합 형성에 대한 강한 경향성을 가질 수 있다.
"단백질"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 보통 황을 함유하는 복잡한 유기 마크로분자 그룹을 지칭하며, 주로 펩티드 결합에 의해 연결된 일 이상의 아미노산 사슬로 구성된다. 단백질은 천연 또는 재조합 유래일 수 있다. 단백질은 예를 들면, 글리코실레이션(glycosylation), 페길레이션(pegylation), 또는 다른 화학적 모이어티들과 융합을 통해 비-아미노산 모이어티들로 변성될 수 있다. 단백질의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 항체, 클로팅 인자(clotting factors), 효소 및 펩티드 호르몬을 포함한다.
"단백질 제제(Protein preparation)"는 대부분 세포-함유 세포 배양 수확물, (실질적으로)세포-프리 세포 배양 상청액과 같은 관심 대상 단백질을 함유하는 용액, 또는 정제 단계로부터의 관심 대상 단백질을 함유하는 용액의 수용성의 또는 대부분 수용성의 용액을 지칭한다.
"바이러스"또는 "비리온"은 살아있는 호스트, 주로 박테리아, 식물 및 동물들 내에서만 복제하는 한외현미경적(ultramicroscopic)(대략 20 내지 300 nm 직경), 대사적으로 불활성, 감염성 제제를 지칭하며; RNA 또는 DNA 코어, 단백질 코팅, 및 보다 복잡한 타입들에서는 외피로 구성된다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명을 실행하는데 사용되는 고체 물질들은 이에 제한되는 것은 아니나, 크로마토그래피 실행을 위해 일반적으로 채용되는 다공성 마이크로입자들과 같은 천연 또는 합성 유래의 불용성 입자들을 포함할 수 있다. 이러한 입자들은 이에 제한되는 것은 아니나 항체들과 같은 단백질의 확산성 진입을 허용하는 대형 기공을 포함할 수 있다; 또는 염, 당, 및 헤테로-응집체-분해 제제들과 같은 작은 화학종들의 확산성 진입을 허용하는 소형 기공을 포함할 수 있으나, 항체와 같은 단백질의 진입을 허용하기에는 지나치게 작을 수 있다. 상기 고체 물질들은 이와는 달리, 비-다공성 입자들, 멤브레인 또는 모놀리스, 다공성-벽 중공 섬유들을 포함하는 섬유들, 다공성 멤브레인, 및/또는 상술한 요소들의 조합을 채용하는 화합물 구조를 포함할 수 있다
양전하성 그룹들은 소위 강한 음이온 교화기 및/또는 소위 약한 음이온 교환기를 포함할 수 있다. 용어 강한 음이온 교환기는 사차 아민과 같은 작용기를 포함하며, 이는 pH 12를 넘는 pKa를 갖는다. 용어 약한 음이온 교환기는 디에틸아미노에틸 및 에틸렌디아민과 같은 작용기들을 지칭하는 것으로 이해되며, 12보다 낮은 pKa를 갖는다. 약한 또는 혼합된 강-약 음이온 교환의 양전하성 그룹들이 포함될 수 있다. 금속 배위 성능을 갖는 이러한 혼합된 약-강 음이온 교환기의 비제한적인 예는 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)이며, 이는 고체 상에 고정되어 일차, 이차, 및 삼차 아미노 그룹들을 함유할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 이미 표면 상에 고정화된 TREN은 TREN 그룹들의 추가 층을 이미-고정화된 TREN 그룹들에 부착하기 위해 이차 화학적 변성을 경험하며, 이에 따라 표면으로부터 더 연장되는 TREN 덴드리머를 생성할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, TREN 그룹들의 또 다른 층이 TREN 그룹들의 제2 층에 첨가되어 3-층 TREN 덴드리머를 형성하고, 이 과정이 반복될 수 있다.
음전하성 그룹들은 소위 강한 양이온 교환기들 또는 소위 약한 양이온 교환기들을 포함할 수 있다. 용어 강한 양이온 교환기는 3 미만의 pKa를 갖는 설페이트 또는 설포 함유 모이어티들을 포함하는 것으로 이해된다. 용어 약한 양이온 교환기는 3을 넘는 pKa를 갖는 카르복시 및/또는 포스포 그룹들을 함유하는 모이어티들을 포함하는 것으로 이해된다. 2개의 카르복실 그룹들과 아미노 그룹의 조합과 같은 쌍극자 성질(중성 pH에서)의 지배적인 음전하성 그룹들이 포함될 수 있다. 이러한 그룹들의 비제한적인 예들은 이미노디아세틱(IDA), 에틸렌 글리콜(아미노에틸에테르) 디아세트산(EGTA), 및 니트릴로아세트산(NTA) 그룹들을 포함한다.
양전하성 또는 음전하성 물질들의 표면들은 또한 지방족 및/또는 방향족 성질의 소수성 그룹들을 병합할 수 있으며, 후자가 소위 파이-파이 결합에 참여하는 능력 때문에 선호될 수 있다. 혼합 화학 성질이 단일 복합 화학적 그룹에, 단일 타입의 표면 상의 상이한 성질의 분리된 화학적 그룹들에, 상이한 표면들 상에 또는 이들의 조합에 존재할 수 있다. 일 이상의 음전하성 금속 친화성 및/또는 일 이상의 양전하성 금속 친화성 그룹들이 동시에 사용될 수 있으며, 이들은 이들이 포함되는 물리적 형태에 있어서 상이할 수 있다. 상이한 개별 성질의 화학적 관능성들이 특정 샘플 조성의 필요에 따라 커스터마이징된 다양한 비율들로 사용될 수 있다. 예를 들면, 정화된 세포 배양 상청액의 처리를 위한 조합들은 과량의 양전하성 표면들을 포함할 수 있으며, 반면 에타크리딘, 메틸렌 블루, 세틸트리메틸암모늄, 클로르헥시딘 또는 폴리에틸렌이민과 같은 용해성 제제들로 이미 처리된 상청액의 처리를 위한 조합들은 과량의 음전하성 표면들을 포함할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 음전하성 및/또는 전하-중성 입자들과 조합되고 이들은 함께 혼합되어, 추가적으로 중성 입자들에 의해 혼합 및/또는 밀봉되고, 중성 입자들에 내장되고, 또는 자체로 음전하성인 물질들로 밀봉되거나 내장된 음전하성 금속 친화성 관능성을 갖는 입자들을 제공할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 본 발명은 양전하성 및/또는 전하-중성 입자들과 조합되고 이들은 함께 혼합되어, 추가적으로 중성 입자들에 의해 혼합 및/또는 밀봉되고, 중성 입자들에 내장되고, 또는 자체로 양전하성인 물질들로 밀봉되거나 내장된 양전하성 금속 친화성 관능성을 갖는 입자들을 제공할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 음전하성 또는 전하-중성 금속 친화성 관능성을 갖는 입자들과 조합되고 이들은 함께 혼합되어, 추가적으로 중성 입자들에 의해 혼합 및/또는 밀봉되고, 중성 입자들에 내장되고, 또는 자체로 음전하성 및/또는 양전하성인 물질들로 밀봉되거나 내장된 음전하성 금속 친화성 관능성을 갖는 입자들을 제공할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니나 소수성 상호작용, 파이-파이 결합, 수소 결합, 및 금속 친화성에 참여하는 능력을 포함하는 추가적인 화학적 관능성들을 포함하는 음전하성 및/또는 전하-중성 표면들을 제공할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 상이한 사이즈 및/또는 상이한 기공률을 가질 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니나, 멤브레인, 섬유 및 모놀리스를 포함하는, 다른 물리적 형태의 반대로 하전되지 않은(not-oppositely-charged) 물질들 사이에 혼합 및/또는 밀봉될 수 있는 입자들을 제공할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 일 이상의 기질들 상의 제1 및 추가 관능성들의 상이한 비율들이 선택되어 상이한 조성의 단백질 제제들의 필요를 수용할 수 있다.
통상의 기술자라면, 단백질 제제 내의 호모응집체들 및 헤테로-응집체들의 함량을 감소시키는데 유용할 뿐만 아니라, 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 단백질 제제로부터의 호스트 세포 단백질, 폴리뉴클레오티드, 엔도톡신 및 바이러스의 함량을 실질적으로 감소시키는데 유용할 수 있음을 이해할 것이다. 주된 관능성이, 예를 들면 소수성 및 수소 결합과 같은 추가 관능성들을 수반하는 경우, 본 발명은 또한 재생가능한 목적 달성을 위한 다운스트림 정제 방법들의 능력을 제한하는 세포 배양 미디어 성분들 및 첨가물들의 함량을 감소시킬 수 있다. 또한, 통상의 기술자라면 본 발명의 일부 실시예들이 상대적으로 크루드 피드(crude feed) 스트림에 적용되었을 때 실질적 가치를 가진다고 하더라도, 특정 실시예들에 있어서, 실질적으로 정제된 샘플에 적용되었을 때도 중요한 가치를 제공할 수 있음을 이해할 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 고체 물질들이 세정되고 사용 후 재생되는 조성물 또는 장치들을 제공할 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 이들은 일회용으로 구성될 수도 있다.
본 발명의 추가적인 목적 및 이점들은 후술하는 상세한 설명 부분에 제공되며, 부분적으로는 상세한 설명으로부터 자명하며, 또는 본 발명의 실행을 통해 학습될 수 있다. 본 발명의 목적 및 이점들은 청구항에 지정된 구성 및 조합을 통해 구현 및 획득될 수 있다.
전술한 일반적 설명 및 후술하는 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적인 것이며, 청구되는 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다.
실험예
실험예 1
HER2 항원에 특이적인 IgG 모노클로날 항체 약 1 g/L을 함유한 1 L 세포 배양 수확물을 1% 알란토인으로 처리하였다. 전도도는 약 13 mS/cm, pH는 약 6.8이었다. 첨가물들은 침강을 가속시키는 효과가 있었다. 고체 물질들은 여과를 통해 제거되었으며, 클리어한 항체-함유 여과물을 잔류시켰다. 항체 회수는 약 99%이었다. 아가로오스 다공성 입자-기반 양전하성 금속 친화성 물질인 BioWorks TREN hi-sub 20 mL가 칼럼(1.6 x 10 cm) 내에 충진되고, 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.0로 평형화되었다. 정화된 여과물은 선 유속 200 cm/hr로 칼럼을 통과시켰다. 최초 수확물은 20% 응집체 이상을 함유하였고, 특히 적어도 10%의 고분자량 응집체들을 함유하였다. 처리된 샘플은 0.05% 미만의 고분자량 응집체들을 함유하였으며, 총 4% 미만의 응집체들을 포함하였다. 형광 염색 분석에 의해 측정된 DNA는 98% 이상으로 감소하였으나, qPCR은 실제로 99.99% 이상이 감소하였음을 나타냈다. 히스톤 단백질들은 적어도 98% 감소하였으며, Cygnus ELISA로 측정된 일반 호스트 단백질 레벨은 62% 감소하였다, 항체 회수는 99%이었다.
실험예 2
소수성 양전하성 미립자 물질인 Dowex AG1x2 1:1 혼합물로 TREN을 치환한 것을 제외하고는 실험예 1의 과정이 반복되었다. 모든 결과들은 항체 회수가 95%로 감소한 것을 제외하고는 명목상 동일하였으며, 분석 크기 배제 크로마토그래피는 실험예 1 이후 명백한 2개의 강한 소수성 오염물들이 제거되었음을 보여주었다.
실험예 3
세포-함유 수확물이 1% 알란토인에 부가하여 0.05% 옥탄산으로 처리된 것을 제외하고는 실험예 2의 과정이 반복되었다. 호스트 단백질 오염은 70% 이상으로 감소되었으며, 항체 회수는 90%로 감소되었다. 옥탄산은 처리된 샘플에서는 검출불가능했으며, 고체 물질(들)에 결합된 것으로 판단되었다. 응집체들은 3% 미만으로 감소되었다. DNA 및 히스톤 함량은 99% 감소되었다.
실험예 4
NaCl이 전도도 20 mS/cm를 부여하는 농도로 세포-함유 수확물에 첨가되고, pH가 6.0으로 조절된 것을 제외하고는 IgM 모노클로날 항체로 실험예 2의 과정이 반복되었다. 미처리된 수확물의 응집체 함량은 30%보다 컸다. 칼럼은 50 mM MES, 200 mM NaCl, pH 6.0으로 평형화되었다. 99%의 DNA 및 히스톤들이 모든 고분자량 응집체들과 함께 제거되었다. 총 응집체 함량은 약 2%로 감소되었다. 항체 회수는 단지 84%이었다. 총 호스트 단백질은 67% 감소되었다. 실험은 전도도 20 mS/cm를 획득하기 위해 첨가되는 농도를 넘어서 소듐 클로라이드의 50 mM 증분 추가에 상응하는 25 mS/cm 전도도에서 반복되었다. 항체 회수는 98%로 증가되었고, 모든 다른 측정치들은 동일하게 유지되었다. 실험은 전도도 40 mS/cm에서 반복되었다. 호스트 단백질 감소는 약 47%로 줄어들었으나, 모든 다른 성능 측정치들은 불변이었다.
실험예 5
옥탄산을 0.025% 에타크리딘으로 치환하고, 금속 친화성 리간드인 이미노디아세트산(Profinity, Bio-Rad)을 보유한 아크릴레이트-기반 다공성 입자들 및 스티렌 디비닐벤젠 입자들(Chelex 100, Bio-Rad)이 1:1 혼합물로 충진된 칼럼을 사용한 것을 제외하고는 실험예 3의 과정이 반복되었다. 처리된 샘플은 옐로우 컬러가 제거되었으며, 반면 크로마토그래피 미디어는 강한 옐로우였으며, 이는 에타크리딘의 제거를 보여주었다. DNA, 히스톤 및 뉴클레오솜들은 99% 제거되었으며, 항체 회수는 99%이었다. 고분자량 응집체들은 완전히 제거되었으며, 총 응집체들은 2% 미만으로 감소되었다. 분석 SEC는 또한 강한 소수성 오염물들의 제거를 보여주었다. 총 호스트 단백질 오염은 63% 감소하였다.
실험예 6
Profinity 및 Chelex와 1:1:1 비율로 혼합된 음으로 하전된 소수성 상호작용 입자들(Macroprep T-butyl, Bio-Rad)을 포함한 것을 제외하고는 실험예 5의 과정이 반복되었다. 처리된 샘플은 옐로우 컬러가 제거되었으며, 반면 크로마토그래피 미디어는 강한 옐로우였으며, 이는 에타크리딘의 제거를 보여주었다. DNA, 히스톤 및 뉴클레오솜들은 99% 제거되었으며, 항체 회수는 99%이었다. 고분자량 응집체들은 완전히 제거되었으며, 총 응집체들은 2% 미만으로 감소되었다. 분석 SEC는 또한 강한 소수성 오염물들의 제거를 보여주었다. 총 호스트 단백질 오염은 64% 감소하였다.
실험예 7
동적 결합 실험들이 고정화된 단백질 A(rAF protein A Toyopearl 650M, Tosoh) 상에서 수행되어, 원심분리 및 마이크로여과에 의해 정화된 수확물과 실험예 2의 처리를 비교하였다. 마이크로여과된 물질 상에서 동적 결합 용량은 28 mg/mL이었다. 실험예 3으로부터의 물질 상에서 동적 결합 용량은 35 mg/mL이었다. 단백질 A 정제 후의 마이크로여과된 물질의 호스트 단백질 함량은 792 ppm(parts per million)이었다. 실험예 3으로 처리된 물질의 호스트 단백질 함량은 1 ppm 미만이었다.
실험예 8
동작 pH를 8.0으로 증가시키고, 2 parts 물로 샘플을 희석하고 버퍼를 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0를 함유하도록 재형성함에 의해 세포 배양 상청액의 전도도를 4.7로 감소시킨것을 제외하고는 실험예 2의 과정이 재생되었다. 일반 호스트 단백질 감소는 83%로 증가하였으나, 응집체 제거는 실험예 2에서보다 약 50% 덜 효과적이었다.
실험예 9
입자들의 전체 비율을 2%에서 5%로 증가시킨 것을 제외하고는 실험예 2의 과정이 재생되었다. 결과들은 항체 회수가 84%로 감소한 것을 제외하고는 명목상 불변이었다. 총 입자들의 비율이 2%이고, Dowex AG1x2에 의해 나타나는 비율이 각각 25% 및 12.5%로 감소한 후속 실험들에서, 항체 회수는 각각 97 및 98%로 증가하였다. 소수성 오염물들의 제거는 감소된 Dowex 레벨들에서 여전히 효과적이었다. 모든 다른 결과들은 실험예 2와 명목상 동일하였다.
실험예 10
Dowex AG1x2를 UNOsphere Q로 치환한 것을 제외하고는 실험예 2의 과정이 반복되었다. UNOsphere Q는 보다 효과적으로 잔여 에타크리딘을 제거하였다. 다른 결과들은 유사하였다.
실험예 11
카프릴산(caprylic acid)을 0.4%로 증가시키고, 동작 pH를 5.2로 감소시키고, TREN 입자들 추가 전에 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 고체들을 제거하기 전에 4시간 동안 인큐베이션하는 것을 제외하고는 실험예 3의 과정이 반복되었다. 응집체 함량은 0.1% 미만으로 감소하였다. 호스트 단백질은 99.9% 감소하였다.
실험예 12
동작 pH가 5.6인 것을 제외하고는 실험예 12의 물질들 및 공정이 세포 배양 수확물 및 IgM 모노클로날 항체에 적용되었다. 응집체는 비-응집된 항체 대비 최초 22%로부터 0.1% 미만으로 감소되었다. 호스트 단백질들은 98% 이상 감소하였다.
상술한 실시예들은 양으로 하전된 킬레이터와 음으로 하전된 그룹들, 양으로 하전된 킬레이터와 음으로 하전된 킬레이터, 양으로 하전된 그룹들 및 음으로 하전된 킬레이터의 조합으로, 그리고 소수성 상호작용 리간드들과 같은 다른 화학적 반응성들과 조합되어 입자, 모놀리스, 멤브레인 및 섬유들 상에 화학적 그룹들을 적용함을 통상의 기술자라면 이해할 것이다. IgG 및 IgM 항체들을 갖는 이러한 실시예들의 다양성에도 불구하고, 더 많은 조합들이 도출되어, 상이하지만, 본 발명의 필수적 특징들을 구현할 수 있음이 명백하며, 항체들 외에도 많은 종류의 단백질들에 적용되어 상술한 바와 유사한 이점들을 획득할 것으로 기대될 수 있다.
본 발명은 다른 정제 방법들과 조합되어 원하는 레벨의 정제를 획득할 수 있다. 비제한적인 예들은 단백질 A 및 다른 형태의 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화 금속 친화도 크로마토그래피, 및 추가적인 혼합 모드 크로마토그래피 방법들과 같은 항체들의 정제를 위해 공통으로 사용되는 다른 방법들을 포함한다. 다양한 방법들의 적절한 조건들을 개발하고 이를 본 발명에 병합하여 특정 항체의 필요한 정제를 획득하는 것은 통상의 기술자의 이해 범위 내에 있다.
언급된 모든 참조 문헌들은 전체로서 참조로 병합되고, 각 개별 문헌 또는 특허 또는 특허 출원은 특정적으로 그리고 개별적으로 모든 목적을 위해 전체로서 참조로서 병합되는 것처럼 동일한 정도의 모든 목적으로 병합된다. 참조로서 병합된 문헌들 및 특허들 또는 특허 출원들이 본 명세서에 포함된 개시 내용과 모순되는 경우, 명세서는 이러한 모순점에 대해 우위를 가지고 대체하는 것으로 의도된다.
명세서 및 청구항들에 사용된 성분들, 크로마토그래피 조건들 등의 양을 표현하는 모든 숫자들은 용어"약(about)에 의해 모든 경우에서 변형되는 것으로 이해된다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 명세서에 제공되며 청구항에 포함된 수치 변수들은 본 발명에 획득되는 것으로 추구되는 원하는 성능에 따라 변화할 수 있는 대략적인 값들이다.
본 발명의 많은 변형들 및 변경들은 통상의 기술자에게 명백하게 이해되는 바와 같이, 그 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 수행될 수 있다. 개시된 특정 실시예들은 단지 예시적으로 설명된 것이며, 어떤 방식으로든 제한적인 의도는 아니다. 명세서 및 실시예들은 단지 예로서 제공되는 것이며, 본 방법들의 진정한 범위 및 사상은 하기의 청구항들에 의해 나타나는 것으로 의도된다.

Claims (44)

  1. 금속 친화성 관능성을 보유하는 제1 표면-결합 리간드를 포함하는 제1 기질을 포함하며, 상기 금속 친화성 관능성은 실질적으로 금속이 없으며, 상기 제1 표면-결합 리간드와 상이한 추가 표면-결합 리간드를 포함하고, 상기 추가 표면-결합 리간드는 상기 금속 친화성 관능성과 반대가 아닌 응집체 전하를 가지며, 선택적으로 상기 추가 표면-결합 리간드는 추가 기질 상에 제공되며 상기 제1 기질 및 상기 추가 기질의 혼합물을 포함하는 단백질 제제의 응집체 함량 감소를 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드, 상기 추가 표면-결합 리간드, 또는 양자는 멀티덴테이트 금속 킬레이팅 모이어티(multidentate metal chelating moiety)를 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 추가 표면-결합 리간드는 금속 친화성 관능성을 보유하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 음전하성 응집체 전하를 갖는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 기질의 응집체 전하가 음전하성으로 유지되는 경우, 상기 제1 기질은 이에 결합된 추가 화학적 모이어티들을 갖는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 음전하성이며, 이미노디아세트산(2-(카르복시메틸아미노)아세트산), 에틸렌 글리콜(아미노에틸에테르)디아세트산, 니트릴로아세트산(2,2',2''-니트릴로트리아세트산), 아스파르트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 이미노디아세트산(2-(카르복시메틸아미노)아세트산)인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 양전하성인 응집체 전하를 갖는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라민, 테트라에틸렌펜트아민, 폴리프로필렌이민 테트라아민 또는 데스페리옥사민인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 트리스(2-아미노에틸)아민인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제1 기질은 제1 기질의 응집체 전하가 불변인 경우, 이에 결합된 추가 화학적 모이어티를 갖는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 제1 기질 또는 상기 추가 기질은 상기 제1 표면-결합 리간드 및 상기 추가 표면-결합 리간드에 부가된 표면-결합 리간드를 더 포함하며, 상기 부가된 표면-결합 리간드는 상기 단백질 제제의 성분과 수소 결합, 소수성 상호작용 또는 파이-파이 결합에 참여하는 상기 조성물의 능력을 향상시키는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 추가 기질, 또는 양자는 중성 그룹, 음으로 하전된 그룹 또는 이들의 조합과 결합된 일보다 많은 음으로 하전된 금속 킬레이팅 그룹을 포함하는 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 추가 기질, 또는 양자는 중성 그룹, 양으로 하전된 그룹 또는 이들의 조합과 결합된 일보다 많은 양으로 하전된 금속 킬레이팅 그룹을 포함하는 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드 및 상기 추가 표면-결합 리간드는 상기 제1 기질에 공유적으로 부착되는 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드는 상기 제1 기질에 공유적으로 결합되며, 상기 추가 표면-결합 리간드는 상기 선택적인 추가 기질에 공유적으로 부착되는 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 선택적인 추가 기질 또는 양자는 복수의 입자들을 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 복수의 입자들은 비-다공성인 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 복수의 입자들은 다공성인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 복수의 입자들은 상기 단백질 제제로부터의 단백질의 진입을 허용하기에 충분히 큰 기공 사이즈를 갖는 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 복수의 입자들은 상기 단백질 제제로부터의 단백질의 진입을 허용하기에 지나치게 작은 기공 사이즈를 갖는 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 평균 기공 사이즈는 약 10 nm 및 약 100 nm 사이인 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 평균 기공 사이즈는 약 10 nm 미만인 조성물.
  24. 제19항에 있어서, 평균 기공 사이즈는 약 100 nm를 초과하는 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 선택적인 추가 기질 또는 양자는 멤브레인, 또는 모놀리스, 또는 섬유, 또는 중공 섬유를 포함하는 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 장치로서, 상기 장치는 크로마토그래피를 위해 구성된 장치.
  27. 제26항에 있어서, 상기 장치는 상기 제1 기질, 상기 선택적인 추가 기질 또는 양자 모두로 충진된 크로마토그래피 장치인 장치.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 장치의 진입구에서의 상기 조성물은 상기 장치의 배출구에서의 상기 조성물과 다른 장치.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치의 성분의 화학적 표면은 실질적으로 불활성이거나, 상기 장치의 화학적 관능성에 유의한 기여를 하지 않을 정도의 충분히 낮은 표면 영역을 갖는 장치.
  30. 제29항에 있어서, 상기 장치의 상기 성분의 상기 화학적 표면은 (1) 구조적 안정성 생성, (2) 액체 플로우를 통과하도록 유도, 및 (3) 상기 단백질 제제 내의 불용성 물질들을 물리적으로 차단, 포획 또는 흡수하여 상기 장치의 효과적 사용을 방해하는 것을 억제하는 것들 중 일 이상을 허용하도록 구성되는 장치.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 다공성 멤브레인을 포함하며, 상기 다공성 멤브레인은 상기 제1 표면-결합 리간드 또는 제2 표면-결합 리간드가 결합되는 상기 제1 기질인 장치.
  32. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 선택적인 추가 기질 또는 양자는 고체 또는 다공성 벽 중공 섬유를 포함하는 조성물.
  33. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 선택적인 추가 기질 또는 양자는 투과성으로 절단된 섬유 매트(mat)를 포함하는 조성물.
  34. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 선택적인 추가 기질 또는 양자는 정돈되어 감긴, 직조된, 또는 비-직조된 섬유 구조를 포함하는 조성물.
  35. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 선택적인 추가 기질 또는 양자는 투과성으로 절단된 섬유 매트 및 정돈되어 감긴, 직조된 또는 비-직조된 섬유 구조의 조합을 포함하는 조성물.
  36. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 다공성 망상 섬유들을 포함하고, 상기 다공성 망상 섬유들은 중공 다공성-벽 섬유들 또는 비-다공성 섬유들이며, 상기 다공성 망상 섬유들은 상기 제1 표면-결합 리간드 및 제2 표면-결합 리간드가 결합되는 상기 제1 기질인 장치.
  37. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 다공성 멤브레인들 또는 모놀리스들 사이에 샌드위치된 다공성 또는 비-다공성 입자들을 포함하는 장치.
  38. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 다공성 또는 비-다공성 입자들은 상기 제1 표면-결합 리간드 또는 제2 표면-결합 리간드 중 어느 하나가 결합되는 상기 제1 기질이며, 멤브레인 또는 모놀리스는 상기 제1 표면-결합 리간드 및 상기 제2 표면-결합 리간드 중 다른 하나가 결합되는 상기 추가 기질인 장치.
  39. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 직조된 또는 비정질 섬유 필터 사이에 샌드위치되거나, 섬유 매트릭스 내에 내장된 다공성 또는 비-다공성 입자들을 포함하는 장치.
  40. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 입자들은 상기 제1 표면-결합 리간드 또는 제2 표면-결합 리간드 중 어느 하나가 결합되는 상기 제1 기질 또는 상기 선택적인 추가 기질을 포함하며, 섬유 필터들은 상기 제1 표면-결합 리간드 또는 상기 제2 표면 결합-리간드 중 다른 하나가 결합되는 상기 제1 기질 또는 상기 선택적인 추가 기질을 포함하는 장치.
  41. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 직물 또는 결정 프릿들(frits) 사이에 샌드위치된 다공성 또는 비-다공성 입자들을 포함하는 장치.
  42. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 다공성 또는 비-다공성 입자들은 상기 제1 표면-결합 리간드 또는 상기 제2 표면-결합 리간드 중 어느 하나가 결합되는 상기 제1 기질이며, 직물 또는 결정 프릿들은 상기 제1 표면-결합 리간드 및 상기 제2 표면-결합 리간드 중 다른 하나가 결합되는 상기 선택적인 추가 기질인 장치.
  43. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 망상 고분자 네트워크 내에 내장된 다공성 또는 비-다공성 입자들을 포함하는 장치.
  44. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표면-결합 리간드, 제2 표면-결합 리간드 또는 양자는 하이드로젤라틴성 물질을 포함하는 장치.
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