CN108348820A - 磷灰石的表面中和 - Google Patents

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Abstract

本文公开了在例如色谱期间和蛋白质洗脱之前中和磷灰石表面的方法。

Description

磷灰石的表面中和
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年10月28日提交的美国临时专利申请62/247,330的优先权，将其全部内容通过引用纳入本文。
背景
羟基磷灰石和氟磷灰石以及其他磷灰石固体载体用于纯化多种生物分子，包括蛋白质，碳水化合物，多核苷酸和病毒颗粒。
发明内容
本文公开了纯化样品中的目标分子的方法。在一些实施方式中，该方法包括：
(a)用适于在磷灰石固体表面上吸附目标分子的缓冲剂组合物平衡磷灰石固体表面，然后使包含目标分子的样品与磷灰石固体表面接触，由此将目标分子吸附到固体表面；
(b)在步骤(a)之后，使包含吸附的目标分子的固体表面与包含以下物质的溶液接触：
(i)碱性氨基化合物和阳离子胺；
(ii)磺化胺化合物和阳离子胺；或
(iii)磷酸盐和阳离子胺，
其中阳离子胺具有足够的体积和浓度以从磷灰石固体表面置换水合氢离子，并且步骤(b)中的缓冲液具有足够的体积和浓度以中和置换的水合氢离子，其中所述溶液具有足够低的离子强度使得目标分子保持吸附于固体载体，并且其中步骤(a)中的缓冲剂组合物与步骤(b)中的溶液有不同的组成；并且
(c)在步骤(b)之后，通过使固体载体和与步骤(b)中的溶液有不同组成的溶液接触，从中和的固体载体上洗脱目标分子，由此纯化样品中的目标分子。
在一些实施方式中，阳离子胺是铵离子。在一些实施方式中，阳离子胺选自伯胺阳离子，仲胺阳离子，叔胺阳离子和季胺阳离子。在一些实施方式中，阳离子胺的浓度为1-50mM。在一些实施方式中，阳离子胺的浓度为1-25mM。
在一些实施方式中，该方法包括：
(a)用适于在磷灰石固体表面上吸附目标分子的缓冲液组合物平衡磷灰石固体表面，然后使包含目标分子的样品与磷灰石固体表面接触，由此将目标分子吸附到固体表面；
(b)在步骤(a)之后，使包含吸附的目标分子的固体表面与包含磷酸盐和碱金属离子的溶液接触，其中该溶液具有足够的体积和浓度以中和磷灰石固体表面，其中该溶液具有足够低的磷酸盐浓度的离子和离子强度，使得目标分子保持吸附于固体载体，并且其中步骤(a)中的缓冲剂组合物与步骤(b)中的溶液有不同的组成；并且
(c)在步骤(b)之后，通过使固体载体和与步骤(b)中的溶液有不同组成的溶液接触，从中和的固体载体上洗脱目标分子，由此纯化样品中的目标分子。
在一些实施方式中，步骤(b)中的溶液具有6.5-9.0，或7.0-8.5，或7.5-9.0的pH。
在一些实施方式中，磷灰石选自下组：羟基磷灰石，氟磷灰石和羟基氟磷灰石。在一些实施方式中，磷灰石是非陶瓷磷灰石。
在一些实施方式中，目标分子是蛋白质。在一些实施方式中，所述蛋白质是抗体。
在一些实施方式中，该方法还包括权利要求1的步骤(a)和(b)之间或权利要求1的步骤(b)和(c)之间的一个或多个另外的洗涤步骤。在一些实施方式中，一个或多个另外的洗涤步骤从固体表面除去样品的至少一种组分，同时基本上将目标分子保持在固体载体上。在一些实施方式中，所述组分选自下组中的至少一种：内毒素，宿主细胞蛋白，聚集的目标蛋白质或其他聚集体，中性脂质，带电脂质，多糖，沉淀剂，非目标小分子和聚集的目标蛋白质。
在一些实施方式中，磷酸盐的浓度为5-25mM，5-10mM或10-25mM。
在一些实施方式中，碱金属离子的浓度为100mM，80mM，60mM或更低。
在一些实施方式中，所述固体表面是柱并且所述步骤(b)包括使所述固体表面与至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个柱体积的所述溶液接触。
具体实施方式
I.引言
这里描述的本发明部分基于这样的发现：包含氨基化合物，磺化胺化合物或磷酸盐的中和溶液，与阳离子胺或碱金属离子以及任选的碱土金属离子相联合，能有效地中和用于色谱纯化的磷灰石固体表面，而不显著洗脱待在稍后阶段洗脱的目标分子。本申请提供了一种方法，将目标分子(例如，蛋白质或其他分子)吸附到磷灰石固体表面，用中和溶液中和如本文所述的磷灰石表面，然后用单独的溶液或与中和溶液有不同的组成的溶液洗脱目标分子。
中和溶液可以包含氨基化合物，磺酸胺(sulfonate amine)和/或磷酸盐。在合适的条件下，阳离子胺，碱土金属离子或碱金属离子置换磷灰石表面上的水合氢离子，并且氨基化合物，磺酸胺化合物或磷酸盐作为水合氢离子受体起作用，由此除去水合氢离子而不损伤磷灰石固体表面，显著改变溶液的pH，或显著洗脱待纯化的目标化合物。换句话说，本发明提供通过在一定条件下与缓冲液接触进行中和，使得缓冲液可以用阳离子交换磷灰石表面上的水合氢离子，其中水合氢离子被中和溶液的另一组分(即，氨基化合物，磺化胺化合物或磷酸盐)螯合(sequester)。中和表面之后，使用不同的溶液来洗脱目标分子。
II.定义
“中和固体磷灰石表面”是指处理磷灰石表面的表面，使得固体表面含不足以显著影响后续洗脱缓冲液的pH(即导致大于0.2的酸性pH移位)的水合氢离子。
“抗体”是指免疫球蛋白、其复合或其片段形式。该术语可包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外产生的抗体。“抗体”也可包括复合形式，其包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”也可以包括抗体片段，如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它组成，无论它们是否保留抗原结合功能。
“磷灰石固体表面”包括稠合的纳米晶体(陶瓷磷灰石)、微晶或化合的微晶，或大孔球形珠。陶瓷磷灰石包括但不限于陶瓷羟基磷灰石(例如CHTTM)，陶瓷氟磷灰石，或陶瓷羟基氟磷灰石(例如MPCTM)。陶瓷磷灰石是磷灰石矿物的一种形式，其中纳米晶体团聚成颗粒并在高温下熔凝以形成适用于色谱应用的稳定的陶瓷微球。化合的微晶包括但不限于HA(珀尔公司(Pall Corp.))。微晶包括但不限于Bio-Gel HTP、HT、DNA级HT(伯乐公司(Bio-Rad))和Hypatite C(克拉克森色谱公司(Clarkson Chromatography))。羟基磷灰石的大孔球形珠粒包括但不限于CaPure HATM(东曹公司(Tosoh))。
“羟基磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6(OH)2的不可溶的磷酸钙的羟基化矿物的混合式载体。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。羟基磷灰石是市售可得的，其可有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。复合材料形式包含包埋在琼脂糖或其它珠的孔内的羟基磷灰石微晶。
“氟磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6F2的不可溶的磷酸钙的加氟(fluoridated)矿物的混合式载体。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。氟磷灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。
“羟基氟磷灰石”是指混合模式载体，其包含具有结构式Ca10(PO4)6FnOH(2-n)的磷酸钙的不溶性羟基化和氟化矿物，其中n是介于0和2之间但不包括0和2的数字。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。羟基氟磷灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。
“样品”是指含有感兴趣的目标分子或颗粒的任何组合物。样品可以未纯化或部分纯化。样品可包括生物来源的样品，包括但不限于：血液或血液组分(包括但不限于血清)、尿液、唾液、排泄物以及组织。
“碱土金属离子”是指元素周期表IIA族中的任何阳离子元素，包括例如铍(Be)，镁(Mg)，钙(Ca)，锶(Sr)，钡(Ba)和镭(Ra)。从业者将认识到，镁和钙是色谱中最常用的。碱土金属离子可以例如作为与一种或多种离子型抗衡离子(例如，CaCl2等)的盐递送到溶液中。
“碱金属离子”是指元素周期表第1族中任何阳离子元素，包括例如锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)、铯(Cs)和钫(Fr)。从业者将认识到，Na和K是色谱中最常用的。碱金属离子可以例如作为与一种或多种离子抗衡离子(例如，KOH，NaOH，NaCl等)的盐递送到溶液中。
“阳离子胺”是指铵离子(NH4 +)和伯，仲，叔或季胺阳离子。铵离子由氨(NH3)的质子化形成。1，2，3或所有4个氢原子被有机(R)基团取代的铵离子可以分别称为伯胺阳离子(R-NH3 +)，仲胺阳离子(R2-NH2 +)，叔胺阳离子(R3-NH+)或季胺阳离子(NR4 +)。有机(R)基团可以是但不限于烷基(例如，甲基，乙基等)。阳离子胺可以作为与一种或多种离子型抗衡离子(例如(NH4)2Cl，(NH4)2SO4)的盐递送至溶液。
在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。因此，例如，引用包含“结合剂”的系统包括包含一种或多种结合剂的系统。同样，对“底物”的引用包括一种或多种底物。
III.水合氢离子
从磷灰石表面洗脱目标蛋白质质或其他目标分子可以产生明显的水合氢离子释放，这可能对目标分子和/或磷灰石固体表面有害，从而降低了人们重新使用该磷灰石材料的能力。本发明人已经发现，在目标分子吸附到磷灰石固体表面上之后，可以通过使磷灰石表面与阳离子胺，碱土金属或碱金属离子与氨基化合物或磺酸胺化合物的组合接触来置换并中和磷灰石上的水合氢离子，其浓度和离子强度足够低以避免显著洗脱目标分子。
A.概述
最初，含有目标分子的样品被吸附到磷灰石表面，这在色谱领域中是已知的。任选地，磷灰石表面在目标吸附到表面之前预先消毒和/或平衡。任选地，可以在中和步骤之前或之后进行一个或多个洗涤步骤。在一些实施方式中，中和步骤本身也用作洗涤步骤，即基本上从固体载体上除去样品的至少一种组分。可以设计洗涤步骤以去除样品中的一种或多种非目标组分，同时保留目标蛋白质。或者或另外，可采用其他洗涤步骤来解吸内毒素，宿主细胞蛋白质，目标蛋白质聚集体或其他聚集体，中性脂质，多糖，小分子，带电脂质或其他非目标分子中的一种或多种，如来自先前纯化步骤的残留沉淀剂，同时在洗涤期间将目标蛋白质基本上保留(例如，保留至少80％，90％，95％或更多)在固体载体上。
中和包括将包含吸附的目标的磷灰石表面与包含可在6.5-9.0范围内缓冲的缓冲剂(包括但不限于氨基化合物和/或磺酸胺化合物和/或磷酸盐)的溶液在合适的pH(例如，pH 6.5-9.0)和浓度(例如5-500mM或5-100mM)下接触以充当水合氢离子受体，如下面进一步讨论的。在组合中，足够的碱土金属离子(以及任选的碱金属离子)或阳离子胺与磷灰石表面接触以置换磷灰石表面上的水合氢离子。然而，缓冲剂(例如氨基化合物，磺酸胺化合物和/或磷酸盐)的浓度以及阳离子胺或碱金属离子的浓度足够低以防止吸附在磷灰石上的目标分子被洗脱。这样的浓度可以根据吸附在磷灰石上的目标分子而变化，但是在一些实施方式中小于500mM，或小于100mM，或小于50mM，或小于25mM，例如5-100mM，或者10-50mM或10-25mM。此外，可以调节中和溶液的pH，使得缓冲剂充当水合氢离子受体而不显著地从磷灰石表面洗脱目标分子。
磷灰石表面的中和可以很容易地测量。例如，可以在目标分子洗脱期间监测色谱流出物的pH。中性磷灰石表面将导致中和后输入物和流出物之间的pH变化不超过0.1或0.2。例如，如果洗脱缓冲液的输入pH为7.0，如果表面被中和，则洗脱过程中流出物不会降至6.8以下。或者，可以监测流出物中的钙离子以确定表面是否被中和。在释放的游离水合氢离子的存在下，磷灰石释放钙。因此，若流出物中存在的钙比输入缓冲液中多，则表明表面没有被中和。
中和，以及任选的洗涤步骤之后，目标分子被洗脱。例如，通过与中和条件相比改变pH和/或盐条件或另外改变洗涤组合物来实现洗脱。在一些实施方式中，通过改变液相中的盐条件来实现洗脱。例如，在一些实施方式中，液相的盐和/或电导率增加(线性或梯式)至洗脱目标的点。在一些实施方式中，中和溶液中的缓冲剂在洗脱之前基本上被除去。在一些实施方式中，通过使磷灰石表面与不含中和溶液中的缓冲剂的洗脱溶液接触来开始洗脱目标。应该理解的是，可能存在来自中和步骤的残余缓冲剂，但是如果这样的话，由于在洗脱溶液中不存在缓冲剂，其在洗脱过程中浓度会越来越低。
B.示例性的缓冲剂：氨基化合物
氨基化合物是指具有氨基部分，即-NH2部分的化合物。大量的氨基化合物可用作水合氢离子受体，从而中和离子。示例性的氨基化合物包括但不限于组氨酸，精氨酸，Tris((HOCH2)3CNH2)和赖氨酸。在一些实施方式中，精氨酸浓度为5-100mM，例如5-50，5-30或10-30mM。在一些实施方式中，精氨酸溶液的pH为7-9，例如7.5-8.5。
在一些实施方式中，氨基化合物是组氨酸。组氨酸有效地中和磷灰石表面上的水合氢离子。在一些实施方式中，组氨酸溶液具有6.5-9，或7-9，或8.1-9，例如8.2-8.6的pH和5-500mM，例如5-100mM，5-50或5-30mM的浓度。
在一些实施方式中，氨基化合物是Tris。在一些实施方式中，Tris浓度为5-50mM，例如5-30mM，并且足够低以避免显著洗脱目标。在组合中，可以使用一定量的钠离子来置换磷灰石表面的水合氢离子。但是，如别处所述，也可以使用其他碱土金属阳离子。如实施例中所示，在组合中，还可以使用一定量的阳离子胺来置换磷灰石表面的水合氢离子。在一些实施方式中，阳离子胺浓度为1-50mM，例如1-25mM。在一些实施方式中，pH为6.5-9.0，例如6.5-8.5或7.5-9.0。
鉴于本文的公开内容，将理解，根据本发明的方法，其他氨基化合物也可用于中和溶液中以接受来自固体表面的水合氢离子。在一些实施方式中，中和溶液包含两种或更多种不同的氨基化合物作为水合氢受体。
C.示例性缓冲剂：磺化胺
磺化胺(sulphonated amine)化合物是指包含亚砜部分和胺的化合物。胺可以是伯胺，仲胺，叔胺或季胺。亚砜或磺酰基部分可以但不必直接与胺连接。
当在足够高的pH和足够的量下使用时，哌嗪二磺酸酯(PIPES)是有效的中和剂。在一些实施方式中，PIPES的浓度为5-500mM，例如5-100mM，5-50mM。可以使用钠离子源来置换磷灰石表面的水合氢离子。在一些实施方式中，钠浓度为1-20mM，例如1-10mM。但是，如别处所述，也可以使用其他碱土金属阳离子或碱金属阳离子。在一些实施方式中，pH为7-9，例如7.5-8.5。
在一些实施方式中，磺化胺化合物是MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)或HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。在一些实施方式中，MES或HEPES的浓度为5-100mM，例如5-50mM。另外，可以使用钠离子源来置换磷灰石表面的水合氢离子。在一些实施方式中，钠浓度为1-100mM，例如10-80，例如10-50mM。然而，如其他地方所述，也可以使用其他碱土金属或碱金属阳离子，其浓度与上面列出的钠的浓度相同。在一些实施方式中，pH为6.5-9，例如7.5-8.5。
在一些实施方式中，磺化胺化合物是美国专利公开号2009/0264651中描述的那些中的一种，包括但不限于该公开的权利要求12或13中所述的那些。
在一些实施方式中，磺化胺化合物是ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)，MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)或MOPSO(3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸，任选在例如针对上述其它磺化胺描述的条件下进行。
鉴于本文的公开内容，将理解，根据本发明的方法，其他磺化胺化合物也可用于中和溶液中以接受来自固体表面的水合氢离子。在一些实施方式中，中和溶液包含两种或更多种不同的磺化胺化合物作为水合氢受体。在一些实施方式中，中和溶液含有一种或多种氨基化合物和一种或多种磺化胺化合物。
D.示例性缓冲剂：磷酸盐
在一些实施方式中，磷酸盐是有效的中和剂。在一些实施方式中，磷酸盐的浓度为5-25mM，例如5-10mM或10-25mM，并且足够低以避免显著目标洗脱。如实施例所示，可以使用钠离子源来置换磷灰石表面的水合氢离子。在一些实施方式中，钠浓度为1-25mM，例如1-10mM。但是，如别处所述，也可以使用其他碱土金属阳离子或碱金属阳离子。在一些实施方式中，pH为6.5-9.0，例如6.5-8.0。
磷酸盐可由任何可溶性的磷酸盐供给，通常是溶于水的盐。例子是碱金属或碱土金属磷酸盐，而磷酸钠或磷酸钾是特别适宜的例子。碱金属磷酸盐或碱土金属磷酸盐可以一元碱、二元碱或三元碱形式或其组合形式使用。
E.碱土金属离子和碱金属离子
可以使用碱金属阳离子(并且任选还有碱土金属阳离子)来置换磷灰石表面的水合氢离子。水合氢离子随后被中和缓冲液的另一组分螯合。碱金属离子和/或碱土金属离子最初可以与氨基化合物或磺酸盐胺化合物形成盐，或者可以分别加入到中和溶液中，例如以与另一抗衡离子(例如-OH，-Cl等)的盐。
F.阳离子胺
也使用阳离子胺从磷灰石表面置换水合氢离子。水合氢离子随后被中和缓冲液的另一组分螯合。可以将阳离子胺(例如铵离子)单独加入到中和溶液中，例如以与另一抗衡离子(例如-Cl)的盐。
IV.磷灰石
本领域技术人员将认识到，在本发明中可以使用许多类型的磷灰石固体表面。陶瓷羟基磷灰石的市售示例包括但不限于CHT I型和CHT II型。陶瓷氟磷灰石的市售示例包括但不限于CFTTM I型和CFT II型。除非另有说明，否则陶瓷羟基磷灰石和陶瓷氟磷灰石是指任何平均直径，包括但不限于约10，20，40和80微米的大致球形多孔颗粒。本领域技术人员可以确定羟基磷灰石或氟磷灰石选择，类型和平均粒径。根据本发明也可以使用其他非陶瓷类型的磷灰石固体表面(包括以“凝胶”出售的那些)。非陶瓷固体磷灰石的示例包括但不限于化合的微晶(例如HA(珀尔公司(Pall Corp.)))和微晶(例如Bio-GelHTP，HT，DNA-Grade HT(伯乐公司)和Hypatite C(克拉克森色谱公司(ClarksonChromatography)))。
在准备使样品与磷灰石载体接触时，柱内的化学环境通常是平衡的。这可以通过例如使平衡缓冲液流过柱以建立合适的pH；导电性；种类；分子量和其他相关变量来实现。
在一些实施方式中，样品制备物也平衡至与柱平衡缓冲液相容的条件。在一些实施方式中，这涉及在加载之前调节样品制备物的pH。
在一些实施方式中，在柱和样品制备物平衡后，将样品制备物与柱接触。样品制备物可以以例如约50-600cm/hr范围内的线性流速施加。本领域技术人员可以确定合适的流速。
在一些实施方式中，本发明在填充床柱，流化床/膨胀床柱和/或间歇操作中实施，其中载体与样品制备物混合一段时间。在一些实施方式中，将磷灰石载体填充在柱中。在一些实施方式中，磷灰石载体填充在内径至少5mm且高度至少25mm的柱中。
另一个实施方式采用磷灰石载体，其填充在任何尺寸的柱中以支持制备型应用。根据具体应用，柱直径可以是少于1cm到多于1米的范围，且柱高度可以是少于1cm到多于40cm的范围。本领域技术人员可以确定合适的柱尺寸。
使用后，混合模式色谱柱可以选择性清洗，消毒，并存储在合适试剂中，并任选再使用。实际上，本发明的中和溶液的一个益处是可以避免或延迟磷灰石柱的降解。因此，在一些实施方式中，可以使用该柱用于10次或更多次，例如多于20次，多于30次，多于40次或多于50次循环的纯化。
V.使用
本发明的方法可以用于基本纯化复杂样品中的任何目标分子。在一些实施方式中，待纯化的目标分子是生物样品的组分。此类组分的示例包括但不限于蛋白质，脂质，糖，碳水化合物，病毒颗粒，氨基酸，核酸，并且可以包括其组合，例如脂化或糖基化蛋白质或其混合物。在一些实施方式中，应用该方法的样品包括来自天然，合成或重组来源的未纯化或部分纯化的生物分子。未纯化的样品可以来自，例如，血浆，血清，腹水，乳汁，植物提取物，细菌裂解物，酵母裂解物或条件细胞培养基。在一些实施方式中，部分纯化的样品来自已经通过至少一种色谱法，超滤，沉淀，其他分级分离步骤或其任何组合处理的未纯化制备物。示例性的目标分子是抗体(包括但不限于单克隆抗体和/或抗体片段)或其他肽或多肽。一个或多个色谱步骤可采用任何方法，包括但不限于尺寸排阻，亲和，阴离子交换，阳离子交换，蛋白A亲和，疏水相互作用，固定金属亲和色谱或混合模式色谱。一个或多个沉淀步骤可包括，例如，盐或PEG沉淀，或用有机酸、有机碱或其它试剂沉淀。其它分级分离步骤可包括但不限于：结晶、液体：液体分配或膜过滤。超滤可以包括直接浓缩样品和/或渗滤。
实施例
提供以下实施例以说明而非限制所要求的发明。
各种磷灰石层析载体可用于蛋白质纯化。然而，磷灰石载体中蛋白质的吸附和后续洗脱可产生强酸，包括盐酸和硝酸，这些酸已导致载体的化学降解，限制了载体的再使用。
我们已经发现包含缓冲化合物(碱性氨基化合物，氨基磺酸盐化合物或磷酸盐)和碱金属，碱土金属化合物或阳离子胺的溶液分别在磷灰石色谱载体的表面上中和和置换水合氢离子，而不显著洗脱吸附的蛋白质。因此，在蛋白质洗脱过程中，从羟基磷灰石表面释放出更少的水合氢离子，由此产生比其它情况下更温和的条件，避免产生强酸并随后使磷灰石载体降解。
实施例1
如下确定加载后表面中和。在监测pH时，用10倍柱体积的10mM磷酸钠，pH 7.0平衡1.6cm×10cm陶瓷羟基磷灰石柱(Bio-Rad CHT I型)，然后与10个柱体积的包含25mM Tris，25mM氯化铵，pH 8.0的加载后溶液接触。在柱子与加载后溶液接触后，然后用8倍柱体积的包含10mM磷酸盐，0.5M NaCl，pH7.0的洗脱缓冲液洗脱柱。流出物的pH稳定在7.0，这是输入物和流出物之间的0.0的pH变化，表明中和了磷灰石表面。该实验表明Tris有效中和CHT表面上被铵离子置换的水合氢离子。
实施例2
在该实验中，使用25mM磷酸钠，25mM NaCl，pH 7.8作为加载后溶液。在1.6cm×10cm陶瓷羟基磷灰石柱(Bio-Rad CHT I型)与10个柱体积的加载后溶液接触后，然后用8个柱体积的包含10mM磷酸盐，0.5M NaCl，pH 7.0的洗脱缓冲液洗脱柱。流出物的pH稳定在7.0，这是输入物和流出物之间的0.0的pH变化，表明中和了磷灰石表面。该实验表明磷酸盐有效中和CHT表面上被钠离子置换的水合氢离子。
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

Claims (19)

1.一种纯化样品中目标分子的方法，所述方法包括：
(a)用适于在磷灰石固体表面上吸附目标分子的缓冲液组合物平衡磷灰石固体表面，然后使包含目标分子的样品与磷灰石固体表面接触，由此将目标分子吸附到固体表面；
(b)在步骤(a)之后，使包含吸附的目标分子的固体表面与包含以下物质的溶液接触：
(i)碱性氨基化合物和阳离子胺；
(ii)磺化胺化合物和阳离子胺；或
(iii)磷酸盐和阳离子胺，
其中所述阳离子胺具有足够的体积和浓度以从磷灰石固体表面置换水合氢离子，并且步骤(b)中的缓冲剂具有足够的体积和浓度以中和置换的水合氢离子，
其中所述溶液具有足够低的离子强度使得目标分子保持吸附于固体载体，并且
其中步骤(a)中的缓冲剂组合物与步骤(b)中的溶液有不同的组成；并且
(c)在步骤(b)之后，通过使固体载体和与步骤(b)中的溶液有不同组成的溶液接触，从中和的固体载体上洗脱目标分子，由此纯化样品中的目标分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述阳离子胺是铵离子。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述阳离子胺选自伯胺阳离子，仲胺阳离子，叔胺阳离子和季胺阳离子。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述阳离子胺的浓度为1-50mM。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述阳离子胺的浓度为1-25mM。
6.一种纯化样品中目标分子的方法，所述方法包括：
(a)用适于在磷灰石固体表面上吸附目标分子的缓冲液组合物平衡磷灰石固体表面，然后使包含目标分子的样品与磷灰石固体表面接触，由此将目标分子吸附到固体表面；
(b)在步骤(a)之后，使包含吸附的目标分子的固体表面与包含磷酸盐和碱金属离子的溶液接触，其中该溶液具有足够的体积和浓度以中和磷灰石固体表面，其中该溶液具有足够低的磷酸盐浓度和离子强度，使得目标分子保持吸附于固体载体，并且其中步骤(a)中的缓冲剂组合物与步骤(b)中的溶液有不同的组成；并且
(c)在步骤(b)之后，通过使固体载体和与步骤(b)中的溶液有不同组成的溶液接触，从中和的固体载体上洗脱目标分子，由此纯化样品中的目标分子。
7.如权利要求1或6所述的方法，其中步骤(b)中的溶液的pH为6.5-9.0。
8.如权利要求1或6所述的方法，其中步骤(b)中的溶液的pH为7.0-8.5。
9.如权利要求1或6所述的方法，其中步骤(b)中的溶液的pH为7.5-9.0。
10.如权利要求1或6所述的方法，其中所述磷灰石选自羟基磷灰石、氟磷灰石、和羟基氟磷灰石。
11.如权利要求1或6所述的方法，其中所述磷灰石是非陶瓷磷灰石。
12.如权利要求1或6所述的方法，其中所述目标分子是蛋白质。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。
14.如权利要求1或6所述的方法，还包括在权利要求1或6的步骤(a)和(b)之间或者权利要求1或6的步骤(b)和(c)之间的一个或多个另外的洗涤步骤。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述一个或多个另外的洗涤步骤从固体表面除去样品的至少一种组分，同时基本上将目标分子保持在固体载体上。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述组分选自下组中的至少一种：内毒素，宿主细胞蛋白，聚集的目标蛋白质或其他聚集体，中性脂质，带电脂质，多糖，沉淀剂，非目标小分子和聚集的目标蛋白质。
17.如权利要求1或6所述的方法，其中所述磷酸盐的浓度为5-25mM。
18.如权利要求6所述的方法，其中所述碱金属离子的浓度为100mM或更低。
19.如权利要求1或6所述的方法，其中所述固体表面是柱并且步骤(b)包括使所述固体表面与至少1个柱体积的所述溶液接触。
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