HUT67708A

HUT67708A - Antagonists of human gamma interferon

Info

Publication number: HUT67708A
Application number: HU9300900A
Authority: HU
Inventors: Gail Foure Seelig
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1990-09-27
Filing date: 1991-09-25
Publication date: 1995-04-28
Also published as: HU9300900D0; DE69115917D1; IE913378A1; IL99580A0; WO1992006115A1; TW272197B; AU8742991A; AU664540B2; DE69115917T2; JPH05506247A; NZ239954A; CA2092541A1; ATE132162T1; US5451658A; EP0550650B1; ZA917669B; EP0550650A1

Description

A gamma-interferon aktivált helper T sejtek által termelt fehérje, amely antivirális, antiproliferativ és immunmodulátor aktivitást tanúsít. A gamma-interferon antivirális és antiproliferativ aktivitása nagyrészt gátló jellegű, míg az immunmodulátor aktivitás elsődlegesen egyfajta immunfunkciók stimulálásán keresztül fejeződik ki, bár az immunfunkciók gátlásának bekövetkezése is ismert.

Bár nem ismert az a mechanizmus, amellyel a gamma-interferon hatását a sejtekre kifejti, az tudott, hogy specifikus sejtreceptorokhoz kötődik [Langer et al., Immunology Today 9., 393 (1988)]. Auguet és munkatársai klónozták és szekvenálták a gamma-interferon egy receptorának génjét [Cell 55 , 273 (1988)]. A kódolt fehérjének a szekvenciából kikövetkeztetett molekulatömege megegyezett egy korábban humán placentából izolált gamma-interferon molekulatömegével [Calderon et al., Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85, 4837 (1988)].

Úgy gondolják, hogy a gamma-interferon szerepet játszik az autoimmun betegségekben. A magas gamma-interferon szintről pedig azt tartják, hogy stimulálja azokat a makrofágokat, amelyek tévesen emésztik a szklerózis multiplexben szenvedők agyának és gerincagyának mielinjét.

Mivel a gamma-interferon specifikus sejtreceptorokra hat, és szerepet játszik az autoimmun betegségekben és a szklerózis multiplexben, ezért olyan hatóanyagok, amelyek gátolni tudnák ezen interferon kötődését sejtreceptoraihoz, terápiásán felhasználhatók lehetnének.

A találmány legfeljebb 50 aminosavmaradékból álló és az ···· ···· ···· ·· ·· · ··

1. számú szekvencia 15 - 21. és 132 - 137. aminosavmaradékai által meghatározott szubszekvenciák közül egy vagy több aminosav- szubszekvenciát tartalmazó új polipeptideket bocsát rendelkezésünkre. A polipeptidek előnyösen legfeljebb 40 és még előnyösebben legfeljebb 35 aminosavmaradékot tartalmaznak.

Némely polipeptid mindkét szubszekvenciát tartalmazza, a szubszekvenciák 1-től körülbelül 20-ig terjedő aminosavmaradékot tartalmazó kapcsoló peptiddel vannak egymástól elválasztva. Más, mindkét szubszekvenciát tartalmazó polipeptidek esetében a szubszekvenciák diszulfid hidakkal összekapcsolt, két különálló polipeptidben helyezkednek el.

A találmány továbbá antitesteket biztosít számunkra azon polipeptidek ellen, amelyek legfeljebb 50, előnyösen 40 és még előnyösebben 35 aminosavmaradékból állnak, és az 1. számú szekvencia 15 - 21. és 132 - 137. aminosavmaradékai által meghatározott szubszekvenciák közül egy vagy több aminosav-szubszekvenciát tartalmaznak. Ezen antitestekre jellemző a polipeptidekhez és a humán gamma-interferonhoz való specifikus kötődési képesség, és az, hogy képesek meggátolni ezen interferon kötődését a sejtreceptorokhoz.

A találmány továbbá még rendelkezésünkre bocsát anti-idiotipikus antitesteket a fent említett antitestek ellen. Ezek az anti-idiotipikus antitestek szintén gátolják a humán gamma-interferon sejtreceptorokhoz való kötődését.

A találmány szerinti valamennyi antitest lehet vagy antiszérumból származó antitest vagy monoklonális antitest. Ilyen antitestekből készített kötő fragmensek és humanizált vagy • · *

• · «··· ···· másképp tervezetten módosított (engineered) antitestek szintén a találmány tárgyát képezik.

A találmány eljárásokat is szolgáltat számunkra a fent említett polipeptidek és az ilyen típusú interferon sejtreceptorokhoz való kötődését gátló antitestek alkalmazására vonatkozólag.

Az egyik eljárás lényege humán gamma-interferon receptorait hordozó sejteknek az érintkezésbe hozatala azon polipeptid hatásos mennyiségével, amely legfeljebb 50, előnyösen 40 és még előnyösebben 35 aminosavmaradékból áll, és az 1. számú szekvencia 15 - 21. és 132 - 137. aminosavmaradékai által meghatározott szubszekvenciák közül egy vagy több aminosav-szubszekvenciát tartalmaz.

Egy másik eljárás lényege a humán gamma-interferon érintkezésbe hozása azon antitest hatásos mennyiségével, amely specifikusan kötődik a humán gamma-interferonhoz és ahhoz a polipeptidhez, amely legfeljebb 50, előnyösen 40 és még előnyösebben 35 aminosavmaradékból áll, és egy vagy több aminosav-szubszekvenciát tartalmaz az 1. számú szekvencia 15 - 21. és 132 - 137. aminosavmaradékai által meghatározott szubszekvenciák közül.

Egy még további eljárás lényege a humán gamma-interferon receptorait hordozó sejtek érintkezésbe hozása az első, anti-idiotipikus, a második antitest elleni antitest hatásos menynyiségével. A második antitest specifikusan kötődik a humán gamma-interferonhoz és ahhoz a polipeptidhez, amely legfeljebb 50, előnyösen 40 és még előnyösebben 35 aminosavmaradékból áll, • · ««·· ···· ······ * .

• · · ♦· ♦ _ · • ····· · ’ _ 5 — ·♦······* ·· és egy vagy több aminosav-szubszekvenciát tartalmaz az 1. számú szekvencia 15 - 21. és 132 - 137. aminosavmaradékai által meghatározott szubszekvenciák közül.

Terápiás alkalmazásukon kívül a találmány szerinti polipeptidek, antitestek és eljárások felhasználhatók a gamma-interferon különböző sejttípusokhoz való kötődési mechanizmusának in vitro tanulmányozására és más gamma-interferon antagonisták és agonisták kiszűrésére is.

Az ábrák rövid magyarázata.

A találmány könnyebben megérthető, ha utalunk a kísérő ábrákra, amelyek a következők:

Az l.A. és l.B. ábra grafikus ábrázolás a ¹²⁵I-jelzett humán-gamma-interferon D Daudi sejtekhez való kötődésének olyan polipeptidek által való gátlásáról, amelyek aminosavszekvenciái a 2.számú szekvencia (l.A.ábra) és a 3.számú szekvencia (l.B.ábra) által meghatározottak. Mindkét ábra a specifikusan kötött radioaktivitás százalékát mutatja a polipeptid-koncentráció függvényében.

A 2.ábra grafikus ábrázolás a ¹²⁵I-jelzett humán-gamma -interferon D Daudi sejtekhez való kötődésének olyan antiszérum által való gátlásáról, amely az l.A. ábra szövegében említett polipeptid elleni antiszérum. Az ábra a specifikusan kötött radioaktivitás százalékát mutatja az antiszérum menynyiségének függvényében.

A 3.ábra grafikus ábrázolás a rekombináns humán-gamma-interferon D által COLO-205 sejteken kiváltott II.osztályú fő hisztokompatibitási antigén indukciójának egy olyan poli···« ···· _ θ _ ·······♦· ·· peptid által való gátlásáról, amelynek aminosavszekvenciája a 10.számú szekvencia által meghatározott. A konstans 150 pM interferon koncentráció jelenlétében észlelt százalékos gátlást a polipeptid koncentráció függvényében mutatja az ábra.

A leírásban idézett összes irodalmi hivatkozást referenciaként tekintjük. Az összes közölt aminosavszekvencia a normál konvenció szerinti, azaz az amino-terminális balodalon, a karboxil-terminális a jobboldalon található. A standard hárombetűs aminosavmaradék-rövidítéseket használjuk a szekvenciák leírásában. Az itt használt értelemben az Aib rövidítés vagy 2- vagy 3-amino-izovajsavat jelöl.

A humán gamma-interferon specifikus inhibitorainak kutatása során meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy bizonyos polipeptidek, amelyek aminosavszekvenciája megegyezik az ép, érett humán gamma-interferon specifikus régóinak aminosavszekvenciáj ával, hatásos inhibitorai a gamma-interferon sejtreceptoraihoz való kötődésének. Ezeknek a polipeptideknek az antagonista hatásait a polipeptideket ¹²⁵I-jelzett humán gamma-interferont és ezen interferonra specifikus receptokkal rendelkező sejteket felhasználó radioligand-receptor meghatározási rendszereben vizsgálva szemléltettük. A találmány ilyen polipeptideket szolgáltat számunkra.

A találmány olyan antitesteket is boztosít számunkra, amelyek gátolják a humán gamma-interferon sejtreceptoraihoz való kötődését azáltal, hogy (a) vagy kombinálódnak ezen interferon azon régióival, amelyek nyilvánvalóan szerepet játszanak a receptorokkal való kapcsolat kialakításában, vagy (b) utá*··· ···· nozzák magát a gamma-interferont, ezáltal versengve vele a receptorokhoz való kötődésért. Mindezek eredményeképpen gátolják az interferon biológiai aktivitását is.

A leírásban használt értelemben a humán gamma-interferon eg yolyan fehérjét jelent, amelynek (a) aminosavszekvenciája alapjában véve azonos a szekvencialistában 1.számú szekvenciaként meghatározott érett, humán gamma-interferon A szekvenciájával, és (b) biológiai aktivitása olyan, mint a természetes gamma-interferoné.

Ennek megfelelően az alább említett polipeptidek aminosavszekvenciája leírható az érett, humán gamma-interferon aminosavszekvenciájában szereplő megfelelő aminosavmaradékok szekvenciáival kifejezve. Az 1.helyzetben, az amino-terminálison cisztein maradékot és a 146.helyzetben a karboxi-terminálison glutamin maradékot, stb. tartalmazó érett, humán gamma-interferon aminosavszekvenciáját az 1.számú szekvencia írja le.

Az aminoszekvenciák lényegi azonossága azt jelenti, hogy más gamma-interferon szekvenciáját az 1.számú szekvenciával meghatározott szekvenciával összehasonlítva az azonos lesz, vagy egy vagy több olyan aminosav-eltérésben (deléció, addíció, szusztitúció) különbözik, amely alapjában véve nem rontja le a biológiai aktivitást. Például a gamma-interferon d, amelyből hiányzik az 1.számú szekvenciával meghatározott interferon első három amino-terminális aminosavmaradéka (Cys-Tyr-Cys), alapjában véve azonos a találmány szövegezése szerint. Hasonlóképpen azonosak azok a természetes humán gammainterferonok is, amelyekből az ilyen amino-terminális amino«··· ···· » ·· savmaradékok hiányoznak, és ezen kívül a karboxi-terminálison mikroheterogenitást mutatnak [Seeeling et al., Biochemistry 27, 1981 (1988)].

Ahogy fentebb kifejtettük, a találmány szerinti polipeptidek egy vagy több szubszekvenciát tartalmaznak a szubszekvenciáknak az 1.számú szekvencia 15 - 21. és 132 - 137.aminosavmaradékai által meghatározott csoportjából. Az előnyös polipeptidek mindkettőt tartalmazzák. Ez a két szubszekvencia a humán gamma-interferon fontos mag (core) régiója, amelyről úgy véljük, hogy valamilyen módon szerepet játszik a receptorkötésben és/vagy ezen interferon biológiai aktivitásában. A polipeptidek tartalmazhatnak ezeken a mag (core) régiókon kívül további határoló (flanking) szekvenciákat, amelyek aminosavszekvenciája megegyezik a humán gamma-interferonban a mag régiókat határoló aminosavszekvenciákkal.

Például egy előnyben részesített, a 10.számú szekvenciával meghatározott aminosavszekvenciájú polipeptid két szubszekvenciát tartalmaz, amelyek egyikét az 1.számú szekvencia 15 - 29. aminoisavmaradékainakj szekvenciája határozza mneg. A másik szubszekvencia ebben a polipeptidben az 1.számú szekvencia 130 - 138. aminosavmaradékainak szekvenciája által meghatározott szekvenciarész.

Abban az esetben, ha a találmány szerinti polipeptidek mindkét mag régiót tartalmazzák (további határoló szekvenciákkal együtt vagy anélkül), a régiók két módon hozhatók egymás szomszédságába, Az egyik előnyös megoldás esetében a régiók kovalensen, peptidkötéssel, egy közbeeső kapcsoló peptid

·. ». r« ··>· ···* • ·' * * * «·»·» ♦ » «£.· *·<* *·*’ · ·♦ (linker peptid) segítségével kapcsolódnak egymáshoz. Ez a kapcsoló peptid 1-től körülbelül 20-ig, előnyösen körülbelül 3tól körülbelül 8-ig terjedő számú aminosavmaradékot tartalmazhat. A kapcsoló peptid aminmosavmaradékai véletlenszerűen (random) választhatók ki a 22 közismert aminosav közül, bár a Gly, Alá, Aib, Leu és Ile által akotott csoportból választott amino savmaradékok előnyben részesülnek a véletlenszerűen kiválasztott szekvenciakapcsolókban (linkerekben) való felhasználás esetében.

A véletlenszerűen kiválasztott aminosavmaradékok helyett a kapcsoló peptid (linker peptid) tartalmazhat 1-től körülbelül 20-ig, előnyösen körülbelül 3-tól körülbelül 8-ig terjedő számú aminosavmaradékot, amelyek szekvenciája megfelel a humán gamma-interferonban a két mag régió közötti szubszekvencia aminosavszekvenciájának. Például a 10.számú szekvencia által meghatározott előnyös kivitelezés esetében a két régiót egy olyan kapcsoló peptid köti össze, amelynek szekvenciája az 1.számú szekvencia 111 - 118.aminosavmaradékai által meghatározott szekvenciának felel meg.

A találmány szerinti kapcsolópeptid hajlékonyságot kölcsönöz a molekulának, így az interferon szekveciáihoz hasonló régióknak olyan térbeli kapcsolata lehet, amely megközelíti az ép, humán gamma-interferon megfelelő szekvenciáinak térbeli kapcsolatát. Természetesen a szakterületen járatosak nagyra értékelnék, ha ezt a kapcsolást meg lehetne valósítani más, aminosavmaradékoktól eltérő egységeket tartalmazó linkerekkel is. Például az affinitáskromatográfiában általánosan használt, • · · · ···· jól ismert linkerek nagyrésze használható lehet helyettük, feltéve, hogy a linkerek hajlékonysága és hossza hasonló a polipeptid-linkerekéhez. Ilyen funkcionálisan egyenértékű, alternatív linkerek isemrt módszerekkel csatlakoztathatók a molekula polipeptid szegmenseihez.

Az előbb említett polipeptidekben a mag (core) régiók sorrendje (további alapvető szekvenciákkal együtt vagy azok nélkül) nem alapvatő jelentőségű. Az a régió, amely a humán gamma-interferon amino-terminális régiójában helyezkedik el, lehet a polipeptid amino-terminálisán és fordítva is, bár az előbbi elrendezés előnyös.

Néhány, egy vagy mindkét mag (core) régiót tartalmazó előnyös polipeptid aminosavszekvenciáját a szekvencia lista 2., 3. és 10. számú szekvenciája határozza meg.

Egy alternatív kivitelezési mód esetében a két mag (core) régió (további alapvető szekvenciákkal együtt vagy azok nélkül) két olyan polipeptid felhasználásával hozható egymás közelébe, amelyek mindegyike a mag (core) régiók egyikét tartalmazza. Ez úgy oldható meg, hogy a polipeptidek mindegyikébe a mag (core) régión kívül eső területre cisztein maradékot építünk be, és a polipeptideket diszulfid kötésekkel kapcsoljuk össze.

Az itt használt értelemben a polipeptid kifejezés a polipeptidek mindkét kivitelezési módozatára vonatkozik, arra is, amelyben a mag (core) régiók eg ykapcsoló peptid révén kerülnek egymás közelségébe, és arra is, amelyben a két polipeptidlánc diszulfid hidakkal kapcsolódik egymáshoz.

Bár a találmány szerinti polipeptidek viszonylagosan csak t ·· · ···· kevés számú aminosavmaradékot tartalmaznak az érett, humán gamma-interferon aminosavmaradékainak teljes számához képest, mindazonáltal specifikus, kompetitív inhibitorai az ép interferon sejtreceptorokhoz való kötődésének. Mint azt alább láthatjuk, a 125i-jelzett humán gamma-interferon D Daudi sejtekhez való specifikus kötődésének 80%-át képesek ezen polipeptidek hatástalanítani .

Hangsúlyoznunk kell, hogy a találmány szerinti polipeptidek bármely olyan sejthez kötődni fognak, amelynek vannak gamma-interferon receptorai, úgymint B sejtekhez, T sejtekhez, eozinofilokhoz, simaizom-sejtekhez, promielocitákhoz, makrofágokhoz, eritroid sejtekhez, monocitákhoz és granulocitákhoz. Pusztán kényelmi okoból Daudi sejteket, egy Burkitt limfómás betegből származó jól jellemzett B-limfoblaszt sejtvonalat, amely az American Type Culture Collection (ATCC) intézménytől szerezhető be a CCL 213 nyilvántartási számon, használtunk az alábbiakban annak bemutatására, hogyan gátolható a ^2^1-jelzett gamma-interferon sejtreceptorokhoz való kötődése. Más ejtvonalak is felhasználhatók erre a célra, úgymint az U-937 humán hisztiocitás limfóma sejtvonal (ATCC CRL 1953).

A polipeptidek alkalmas módszerekkel szintetizálhatok, például kizárólagosan szilárd fázisú szintézissel, részlegesen szilárd fázisú módszerekkel, fragmens kondenzációs vagy klasszikus, oldatban végzett szintézissel. A polipeptidek előállításánál a Merrifield által leírt szilárd fázisú peptidszintézist [J.Am. Chem.Soc. 85. 2149 (1963)] részesítettük előnyben. A szintézist alfa-amino-terminálison védett aminosavakkal végeztük. A ···· ···· • ·

- 12 - ........ · *··* labilis oldalláncokat tartalmazó trifunkcionális aminosavakat megfelelő csoportokkal szintén védtük annak érdekében, hogy megakadályozzuk a polipeptidek összeállítása során bekövetkező nemkívánatos kémiai reakciókat. Az alfa-amino védőcsoportok szelektíve eltávolíthatók, hogy az amino-terminálison további reakciók lefolytatására legyen lehetőség. Az alfa-amino védőcsoportok eltávolításának feltételei olyanok, hogy az oldalláncokat védő csoportok nem hasadnak le.

Az alfa-amino védőcsoportok azok az ismert csoportok, amelyek a lépésről lépésre (stepwise) történő polipeptid szintézis területén használatosak. Ezek közé tartoznak az acil típusú védőcsoportok (például formil-, trifluor-acetil-, acetil-csoport), aromás uretán típusú védőcsoportok [például (benzil-oxi)-karbonil- (Cbz), szubsztituált (benzil-oxi)-karbonilés (9-fluorenil-metoxi)-karbonil-csoport (Fmoc)], alifás uretán típusú védőcsoportok [például terc-butoxi-karbonil- (Boc), izopropoxi-karbonil-, ciklohexiloxi-karbonil-csoport] és alkil típusú védőcsoportok (például benzil-, trifenil-metil-csoport). Az előnyben részesített védőcsoport a Boc-csoport. A Tyr oldalláncát védő csoportok közé tartoznak a tetrahidropiranil-, a terc-butil-, a tritil-, a benzil-, a Cbz, a (4-bróm-benzil-oxi)-karbonil- (4-Br-Cbz) és a 2,6-diklór-benzil-csoportok. A Tyr oldalláncát védő csoportok közül a 2,6-diklór-benzil-csoport az előnyös. Az Asp oldalláncát védő csoportok közé tartoznak a benzil-, a 2,6-diklór-benzil-, a metil-, az etil- és a ciklohexil-csoportok. Az Asp oldalláncát védő csoportok közül a ciklohexil-csoport az előnyben részesített. A • ·

- 13 - ...........

Thr és Ser oldalláncait védő csoportok közé tartoznak az acetil-, a benzoil-, a tritil-, a tetrahidropiranil-, a benzil-, a 2,6-diklór-benzil- és a Cbz-csoportok. Az Thr és Ser oldalláncait védő csoportok közül a benzilcsoport az előnyös. Az Arg oldalláncát védő csoportok közé tartoznak a nitro-, a tozil- (Tos), a Cbz, az (adamantil-oxi)-karbonil- és a Boc-csoportok. Az Arg oldalláncát védő csoportok közül a Tos az előnyös. A Lys oldalláncbeli aminocsöpörtját Cbz, 2-Cl-Cbz, Tos vagy Boc csoportokkal lehet védeni. A Lys oldalláncát védő csoportok közül a 2-Cl-Cbz csoport az előnyben részesített.

A kiválasztott oldallánc-védőcsoportoknak a kapcsolás során sértetleneknek kell maradniuk, valamint az amino-terminális védőcsoport eltávolítása során vagy a kapcsolási reakciók körülményei között sem szabad eltávolításuknak bekövetkeznie. Ezenkívül az oldallánc-védőcsoportoknak a szintézis végeztével eltávolíthatóknak kell lenniük, méghozzá olyan reakciófeltételek mellett, hogy a kész polipeptid ne változzon meg.

A szilárd fázisú szintézis rendszerint a karboxil-végről indul a védett alfa-aminocsoporttal (és esetleg védett oldallánccal) rendelkező aminosavnak egy alkalmas szilárd hordozóhoz történő kötésével. Észter-kötés alakul ki, amikor a kapcsolás klór-metil- vagy hidroxi-metil-gyantához történik, és a létrejövő polipeptid a C-terminálison szabad karboxil-csoportot fog tartalmazni. Alternatív esetben, amikor benzhidril-amin vagy p-metil-benzhidril-amin gyantát használunk, amidkötés alakul ki, és a létrejövő polipeptid karboxamid-csoportot fog tartalmazni a C-terminálison. Ezek a gyanták a keres• 4 • · · · ····

- 14 - ...........

kedelemben beszerezhetők, előállításukat Stewart és munkatársai írták le [Solid Phase Peptide Synthesis (2^nd Edition), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984].

A védett alfa-aminocsoporttal (és szükség esetén védett oldallánccal) rendelkező C-terminális aminosav kapcsolása a benzhidril-amin gyantához különböző aktiváló ágensek, például diciklohexil-karbodiimid (DCC), N,N'-diizopropil-karbodiimid és karbonil-diimidazol alkalmazásával történik. A hordozó gyantához való kapcsolást követően az alfa-amino védőcsoport eltávolítása trifluor-ecetsav (TFA) vagy sósav (HC1) és dioxán elegyének használatával történik 0°C és 25°C közötti hőmérsékleten. Metionin (Met) beépítése után dimetil-szulfidot adunk a TFA-hoz, hogy visszaszorítsuk a lehetséges S-alkilezést. Az alfa-amino védőcsoport eltávolítása után a fennmaradó védett aminosavakat lépésről lépésre a kívánt sorrendben kapcsoljuk össze, hogy a kívánt szekvenciát elérjük. A kapcsolási reakcióhoz különböző aktiváló ágensek használhatók, például DCC, N,N'-diizopropil-karbodiimid, [(benztriazol-l-il)-oxi]-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-hexafluorofoszfát (BOP) és DCC/hidroxi-benztriazol (DCC/HOBt). A védett aminosavak mindegyikét feleslegben (>2,0 ekvivalens) használjuk a kapcsolás során, amely rendszerint N-metil-pirrolidonban (NMP), N,N-dimetil-formamidban (DMF), metilén -dikloridban vagy ezek elegyében történik. Minden egyes lépésnél ellenőrizzük a kapcsolási reakció teljességének mértékét, például a Kaiser és munkatársai által leírt ninhidrin reakcióval [Anal.Biochem. 34, 595 (1970)]. Olyan ese···· ·»·· • *

- 15 ’.

tekben, ha nem teljes kapcoslást észlelünk, a kapcsolási reakcót megismételjük. A kapcsolási reakciók kereskedelmi forgalomban kapható készülékekkel automatikusan is kivitelezhe tők.

A kívánt polipeptid teljes összeállítása után a polipeptid-gyanta kötést elhasítjuk valamilyen reagenssel, például folyékony hidrogén-fluoriddal (HF) 0°C-on 1-2 órát tartó reakcióval, amely lehasítja a polipeptidet a gyantáról, és eltávolítja az összes oldallánc-védőcsoportot is. A folyékony hidrogén-fluoriddal együtt rendszerint valamilyen gyökfogót (scavenger) is használunk, például anizolt, hogy megelőzzük a polipeptidben jelenlévő aminosavmaradékok alkileződését a hasítás során keletkező kationokkal. Kívánt esetben a polipeptid-gyantáról a hasítást megelőzően TFA/ditio-etán segítségével a védőcsoportok eltávolíthatók.

A szilárd hordozón végrehajtott oldallánc/oldallánc ciklizálás olyan védelmi séma használatát igényli, amely lehetővé teszi a savas tulajdonságú aminosavak (például Asp) és a bázikus tulajdonságú aminosavak (például Lys) oldallánc-védőcsoportjainak szelektív hasítását. Az Asp oldalláncának védőcsoportjaként a [(9-fluorenil)-metil]- (Fm), míg a Lys oldalláncúnak védőcsoportjaként a {[(9-fluorenil)-metoxi]-karbonil}- (Fmoc) használható erre a célra. Ezekben az esetekben, a Boc által védett polipeptid-gyanta oldallánc-védőcsoportjai piperidinnel DMF-ben szelektíven eltávolíthatók. A ciklizálás a szilárd hordozón különböző aktiváló ágensek használatával érhető el, melyek közé a DCC, DCC/HOBt vagy BOP tartoznak. A · · · · · · · ·····« « · • · * ·· * · _ _ ...... ^β··’ · *··* ciklizált polipeptid-gyantán végrehajtott HF reakció a fent leírt módon történik.

Rekombináns DNS technikát is használhatunk a polipeptidek előállítására. Az ismert genetikai kódot (ha az adott gazdaszervezetben bekövetkező hatékonyabb kifejeződéshez szükséges, akkor meghosszabbítva) használhatjuk a kívánt aminosav szekvenciát kódoló oligonukleotidok szintéziséhez. Matteucci és munkatársai foszforamidit szilárd fázisú eljárása [J.Am. Chem.Soc. 103. 3185 (1981)], Yoo és munkatársainak eljárása [J.Bioi.Chem. 764, 17078 (1989)] vagy más jól ismert eljárások használhatók ilyen szintézishez. A szintézis eredményeként kapott oligonukleotidok az arra alkalmas vektorba beépíthetők, és a vektorral kompatibilis gazdaszervezetben kifej ezhetők.

A találmány szerinti polipeptidek HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia), gélszúrés, ioncserélő és megoszlásos kromatográfia, ellenáramú megoszlás vagy más ismert eljárások felhasználásával tisztíthatok.

A találmány szerinti polipeptidek elleni antitestek standard eljárások használatával készíthetők. Az itt használt értelemben az antitest szó vonatkozik mind a poliklonális, mind a monoklonális antitestekre.

A poliklonális antitestek úgy termelhetők, hogy egy gazdaállatot, például a nyulat, patkányt, kecskét, birkát, egeret, stb. immunizálunk a polipeptidek egyikével. A kezdeti injekció után előnyösen egy vagy több emlékeztető injekciót adunk, hogy megemeljük az antitest titerét. Utána vért csapó17 ······ · · • · ♦ · · Λ · • ♦ * · » · ·· lünk az állatból, és szérumot készítünk, amelyet standard eljárással tesztelünk, például az enzim-kapcsolt immunoszorbens kimutatással ( ELISA ), amelyben antigénként a polipeptidet használjuk.

Előnyös, ha a polipeptidek immunogenitását az immunizálás előtt megnöveljük a polipeptidek valamilyen adjuvánssal való kombinálásával és/vagy nagyobb formába való átalakításával.

Az állatok vakcinálására alkalmas adjuvánsok az Adjuváns 65 (amely földimogyoróolajat, mannid-monooleátot és alumínium-monosztearátot tartalmaz), a komplett vagy inkomplett Freund adjuváns, ásványi gélek, például az alumínium-hidroxid, alumínium-foszfát és timsó, olyan felületaktív anyagok, mint a hexadecil-amin, az oktadecil-amin, a lizolecitin, a (dimetil-dioktadecil-ammónium)-bromid, az N,N-dioktadecil-N,N-bisz(2-hidroxi-metil)-propán-diamin, a metoxi-hexadecil-glicerin és a pluron poliolok, olyan polianionok, mint a pirán, a dextrán-szulfát, a poli IC, poliakrilsav és a karbopol, olyan peptidek, mint a muramil-dipeptid, a dimetil-glicin és a tuftsin (Thr-Lys-Pro-Arg) és olaj emulziók, de nem csupán ezekre korlátozódnak. A polipeptideket lehet liposzómákba vagy más mikrohordozókba zártan is beadni.

A polipeptidek immunogenitása erősíthető keresztkötéssel is vagy valamilyen immunogén hordozó molekulához (olyan makromolekula, melyhez a találmány szerinti polipeptid kovalensen kapcsolható, és rendelkezik azzal a tulajdonsággal, hogy függetlenül kivált immunológiai választ a gazdaállatban) való kapcsolással. A keresztkötés vagy a hordozó molekulához való kap·· 44 ·> »··· ···· ♦ ···♦· · · • · 4 4 4 4 « _ ₁₈ _ .:.. ’..· *..· : ·..· csolás azért lehet szükséges, mert a kis polipeptidek olykor úgy működnek, mint a haptének (olyan molekulák, melyek képesek specifikusan kötődni az antitestekhez, de nem képesek kiváltani az antitest termelést, azaz nem immunogének). Ezen polipeptideknek az immunogén hordozó molekulához való kapcsolása a fragmenseket azáltal teszi immunogénné, amit általában hordozó hatásként (carrier effect) ismerünk.

Az alkalmas hordozó molekulák közé tartoznak például proteinek és természetes vagy szintetikus polimer vegyületek, így polipeptidek, poliszacharidok, lipopoliszacharidok, stb. Egy alkalmas hordozó a Quil A.-nak nevezett glikozid, amelyet Morein és munkatársai írtak le [Natúré, 308, 457 (1984)]. Különösen előnyösek a fehérje hordozó molekulák, amilyenek például a tapadó tengeri csiga hemocianin (keyhole limpet hemocyanin) és az emlős szérum fehérjék, úgymint a humán vagy szarvasmarha gammaglobulin, a humán, szarvasmarha vagy nyúl szérumalbumin vagy ezen fehérjék metilezett vagy más származékai, de nem csak ezekre korlátozódnak. A szakterületen jártasak részére más fehérje hordozók is nyilvánvalók. Előnyös, de nem szükségszerű, ha a fehérje hordozó idegen azon gazda szervezet számára, amelyben a polipeptidek elleni antitestek termelődnek.

A hordozó molekulához való kovalens kapcsolás a szakterületen jól ismert eljárások használatával kivitelezhető, amelyek közül a konkrét választást a felhasznált hordozó molekula természete fogja diktálni. Amikor az immunogén hordozó molekula egy fehérje, akkor a találmány szerinti polipeptidek például vízoldható karbodiimidek, így DCC vagy glutáraldehid segítségével kapcsolha tók.

·· ··«· ···· ······ · · • ♦ · ·· 4 «

Az ilyen kapcsoló ágensek használhatók a polipeptidek önmagukkal való keresztkötéseinek kialakításához is, amikor külön hordozó molekulát nem használunk. Az ilyen, aggregátumokhoz vezető keresztkapcsolás szintén növelheti az immunogenitást.

Az így immunizált állatok által termelt szérum közvetlenül felhasználható. Alternatív esetben, az IgG frakció elválasztható a szérumból standard eljárások alkalmazásával, például plazmaforézissel vagy adszorpciós kromatográfiával olyan IgG-specifikus adszorbensek használatával, mint az immobilizált Protein A.

Monoklonális antitestek, olyan standard eljárások alkalmazásával készíthetőek, mint például a Kohler és munkatársai által leírt eljárás [Natúré 256, 495 (1975); Eur. J. Immunoi. 6., 511 (1976)]. Lényegében véve egy állatot a fent leírtak szerint immunizálunk, hogy antitestet szekretáló szomatikus sejteket termeljen. Ezeket a sejteket azután, mielóma sejtekkel végzett fúzióhoz eltávolítjuk az immunizált állatból.

Az antitest termelésének lehetőségével rendelkező szomatikus sejtek, különösen a B sejtek, alkalmasak a mielóma sejtvonallal való fúzióra. Ezeket a szomatikus sejteket az előzetesen indukált (primerolt) állatok nyirokcsomóiból, lépőből és perifériás véréből nyerjük.

A hibridóma sejteket létrehozó fúziós eljárás céljára limfómás tumorokból specializált mielóma sejtvonalakat fejlesztettek ki [Kohler and Milstein, Eur. J. Immunoi. 6, 511 (1976); Shulman et al., Natúré 276, 269 (1978); Volk et al., J. Virol. 42, 220 (1982)]. Ezen sejtvonalak kifejlesztését legalább három szempont indokolta. Az első, hogy megkönnyítse a fuzionált hibridóma sej·· ·· ·· ···· ···« ····«· · · > · · ·· · ·

- 20 - *”* *”* ’ ’··’ tek szelektálását a nem fuzionált és hasonlóképpen önmagukat korlátlanul szaporító mielóma sejtektől. Rendszerint ez olyan enzimhiányos mielóma sejtek használatával valósítható meg, amely enzimhiány képtelenné teszi őket arra, hogy bizonyos szelektív, a hibridóma sejtek növekedését fenttartó táptalajon növekedjenek. A második szempont a limfómás tumorsejtek velejáró, azon képességéből ered, hogy termelik saját antitestjeiket. A monoklonális technika használatának célja, hogy olyan korlátlan élettartamú fuzionált hibrid sejtvonalakat kapjunk, amelyek a hibridóma szomatikus sejtkomponensének genetikai kontrollja alatt termelik a kívánt, egyedi antitesteket. A hibridóma sejtek tumorsejt antitestjeinek termelését megakadályozandó olyan mielóma sejtvonalakat használunk, amelyek nem képesek a könnyű vagy nehéz immunglobulin láncok termelésére, vagy fogyatékos az antitest szekretáló mechanizmusuk. A harmadik szempont ezen sejtvonalak kiválasztásánál a fúzióra való alkalmasságuk és rátermettségük.

Számos mielóma sejtvonal használható fuzionált hibrid sejtek készítésére, beleértve például a P3X63-Ag8, a P3/NSl-Ag4-l (NS-1), az Sp2/0-Agl4 és az S194/5.XXO.BU.1 sejtvonalakat. A P3X63-Ag8 és NS-1 sejtvonalakat Kohler és Milstein írták le [Eur. J.Immunoi. 6, 511 (1976)]. Shulman'és munkatársai fejlesztették ki az Sp2/0-Agl4 mielóma sejtvonalat [Natúré 276, 269 (1978)]. Az S194/5.XXO.Bu.1 sejtvonal leírása Trowbridgetől származik [J.Exp.Med. 148, 313 (1979)].

Az antitestet termelő lép és nyirokcsomó sejtekből és mielóma sejtekből álló hibridóma sejteket létrehozó eljárások rend·· *·· ···· _ 2 2, — ···♦ ·· ♦· · ♦· szerint a szomatikus sejteknek mielóma sejtekkel 10:1 arányban való összekeverését jelentik (bár az arány változhat körülbelül 20:1-től körülbelül 1:1-ig ) olyan ágens vagy ágensek (kémiai, virális vagy elektromos) jelenlétében, amelyek elősegítik a sejtmembránok fúzióját. A fúziós eljárást Kohler és Milstein (lásd fentebb) , Gefter és munkatársai [Somatic Cell Génét. , 3., 231 (1977)] és Volk és munkatársai [J.Virol. 42, 220 (1982)] írták le. Ezen kutatók által használt fúziót elősegítő ágensek a Sendai vírus és a polietilén-glikol (PEG) voltak.

A fúziós eljárás nagyon kis hatékonysággal szolgáltat életképes hibrid sejteket (például, amikor lépsejteket használunk a szomatikus sejtek forrásaként, csak egy hibrid sejt nyerhető nagyjából minden 1 x 10^ lépsejtből), ezért elengedhetetlen, hogy lehetőség legyen a fuzionált hibrid sejteknek a fuzionálatlanul maradó sejtektől, főleg a fuzionálatlan mielóma sejtektől való szelekciójára. A kívánt antitestet termelő hibridóma sejtek detektálásának a lehetősége a többi, létrejött fuzionált hibrid sejt között szintén elengedhetetlen.

Általában, a fuzionált hibrid sejtek szelekciója a sejteknek olyan táptalajon való tenyésztésével valósítható meg, amely táptalaj fenttartja a hiridóma sejtek, de megakadályozza a nem fuzionált mielóma sejtek növekedését, amelyek normálisan korlátlanul osztódnának. A fúzióra használt szomatikus sejtek nem rendelkeznek hosszútávú életképességgel az in vitro tenyészetekben, ezért nem vetnek okoznak problémát. A találmány esetében, például a felhasznált mielóma sejteknek hiányzott a hipoxantin-foszforibozil-transzferáz enzimjük ( HPRT-negatív sejtek ). A szelek·« ·· t* ···· ·«· ···*·· · · • · · ·· · · ció ezekkel a sejtekkel szemben hipoxantin/aminopterin/timidin (HAT) tartalmú táptalajban történt, amelyben a fúzionált hibrid sejtek a lépsejtek HPRT-pozitív genotípusa következtében élnek meg. Különböző genetikai hiányosságokkal ( drog érzékenységek, stb.) rendelkező mielóma sejtek használata arra a célra, hogy szelektálni tudjunk ellenük a táptalajban, amely fenntartja a genotípusosan kompetens hibrid sejtek növekedését, szintén lehetséges .

Néhány hét szükséges a fúzionált hibrid sejtek szelektív tenyésztéséhez. Ezen időtartam kezdetén elengedhetelen azoknak a hibrid sejteknek a meghatározása, amelyek a kívánt antitestet termelik, hogy a későbbiekben majd klónozhatok és termelhetők legyenek. Általában a kapott hibrid sejteknek körülbelül 10 %-a termeli a kívánt antitestet, bár a körülbelül 1-től körülbelül 30 %-ig terjedő ingadozás sem rendkívüli. Az antitestet termelő hibrid, sejtek detektálása elvégezhető a számos standard kimutatási eljárás bármelyikével, beleértve az enzim-kapcsolt immuno-meghatározási és a radioimmuno meghatározási technikákat, amelyek az irodalomban megtalálhatók [lásd például Kennet et al. (szerk.), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biologocal Analysis, 376-384, Plenum Press, New York (1980)].

Mindegyik sejtvonal szaporítható a két standard eljárás valamelyikével, ha egyszer a kívánt, fúzionált hibrid sejteket már szelektáltuk, és egyedi antitest-termelő sejtvonalakba klónoztuk. A hibrid sejtek szuszpenziója szövettanilag öszszeférhető (hisztokompatibilis) állatba injektálható. Az in ···« jektált állat olyan tumorokat fog kifejleszteni, melyek a fuzionált, hibrid sejtek által termelt specifikus, monoklonális antitesteket fogják kiválasztani. Az állat testfolyadékait, úgymint a szérumot és az ascites folyadékot lecsapolhatjuk, hogy magas koncentrációjú monoklonális antitesteket nyerjünk. Más módszer szerint az egyedi sejtvonalak in vitro körülmények között, laboratóriumi szövettenyésztő edényekben szaporíthatok. Az egyedi, specifikus, monoklonális antitesteket magas koncentrációban tartalmazó táptalaj dekantálással, szűréssel vagy centrifugálással szüretelhető le.

A találmány szerinti anti-idiotipikus antitestek a találmány szerinti egyes polipeptidekben jelenlévő gamma-interferon antigén determinánsokra specifikus antitestek elleni antitestek. Az ilyen anti-idiotipikus antitestek utánozzák az eredeti antigén determinánsokat, vagy úgy hatnak, mint az eredeti antigén determinánsok (lásd például a 4,731,237 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást; Reagan et al.). Ezekről az antitestekről feltételezik, hogy magához a gamma interferonhoz hasonlóan specifikusan és közvetlenül kötődnek a gamma interferon receptorokhoz.

Ilyen anti-idiotipikus antitestek úgy készíthetők, hogy valamilyen állatot egy találmány szerinti polipeptid elleni (poliklonális vagy monoklonális) antitesttel vakcinálunk. Azután ezek teljes poliklonális antiszérumként vagy ennek egy IgG vagy más frakciójaként vagy a fent leírt módon klónozott hibridómák által termelt monoklonális antitestekként nyerhe tők.

• ·· ···

A találmány szerinti polipeptidek. és antitestek antagonista hatásai egy rutin vizsgálattal könnyen kimutathatók, amely vizsgálat az alábbiakban leírt, a Daudi sejteket felhasználó radioligand-receptor meghatározási rendszer. Az ebben a rendszerben használható rekombináns, humán, gamma interferon standard, rekombináns módszerekkel előállítható, és kereskedelmi forgalomban is beszerezhető, például a Genzyme Corp., Boston, MA. cégtől. Ezen interferon könnyen jelezhető ^új-dal, például a laktoperoxidáz módszer [Dávid et al., Biochemistry, 13, 1014 (1974)] vagy Bolton és munkatársai módszere [Biochem. J. 133, 529 (1973)] alkalmazásával.

A találmány tárgyát képezik a fent említett poliklonális és monoklonális antitestek kötő fragmentumai is, úgymint a Fab, F(ab')2, Fv stb. Ezen fragmentumokhoz hagyományos technikákkal juthatunk, például — de semmiképp sem korlátozólag említve — az ép antitestek papainnal vagy pepszinnel végzett emésztésével. Természetesen a találmány szerinti monoklonális antitesteket kiválasztó hibridómákból előállított DNS manipulálható az ismert rekombináns DNS technikák használatával, és így kiméra antitestek vagy ezek fragmentumai állíthatók elő. Az antitestek humanizáltak is lehetnek, ahogy azt Verhoeyen és munkatársai [Science 239, 1534 (1988)], Reichmann és munkatársai [Natúré 332, 323 (1988)] és Jones és munkatársai [Natúré 321, 522 (1986)] leírj ák.

Olyan gyógyszerkészítmények is előállíthatok, amelyek a találmány szerinti egy vagy több polipeptid vagy antitest hatásos mennyiségét és egy fiziológiásán elfogadható hordozót tartalmaz• Λ nak. A szakterületen járatosak számára ilyen hordozók jól ismertek. A polipeptidek és a proteinek közvetlenül vagy valamilyen készítmény formájában adhatók autoimmun betegségben, szklerózis multiplexben vagy más gamma interferon által közvetített betegségben szenvedő humán paciensnek.

A találmány szerinti polipeptid vagy antitest helyes dózisának meghatározása egy adott helyzetre a szakterületen járatos személy köteles tudásához tartozik. Általában a kezelést kisebb, az optimálisnál alacsonyabb dózisokkal kezdjük. Azután a dózist kis mennyiségek hozzáadásával egészen addig növeljük, amíg az adott körülmények között az optimális hatást el nem érjük. Kívánt esetben, egyszerűség kedvéért a teljes napi dózis felosztható, és a nap folyamán részletekben adható be.

A találmány szerinti polipeptidek és proteinek és a gyógyszerészetileg elfogadható sóik beadási mennyiségét és gyakoriságát a kezelő személyzet döntésének megfelelően állítják be, figyelembe véve olyan faktorokat, mint a kor, a beteg állapota és testtömege, valamint a kezelt kórtünet(ek) súlyossága.

Amennyiben másképp nem adjuk meg, az alábbiakban a szilárd keverékekben levő szilárd alkotók, a folyadékokban levő folyadék alkotórészek és a folyadékokban levő szilárd alkotók eseteiben a százalékos arányokat tömeg/tömeg, térfogat/térfogat és tömeg/térfogat alapon adjuk meg.

Fehérje analízis.

A fehérje meghatározásokat Lowry és munkatársai módszerével [J.Bioi.Chem. 193, 265 (1951)] végeztük standardként szarvasmarha szérumalbumint használva.

»4 »· *4*· (·4·

4 • · « »4 4 · * 44444 4 4

2/- ·»»« et »» » 4 ·

Ο A polipeptidek és fehérjék forrásai.

Az érett, humán gamma interferon A különböző régióinak szekvenciájával megegyező aminosavszekvenciájú polipeptideket Merrifield szilárd-fázisú eljárásával [ J. Am. Chem. Soc. .85, 2149 (1963)] szintetizáltuk. A terc-butoxi-karbonil amino-védőcsoportot, szimmetrikus anhidrideket és egy Applied Biosystems Model 430A szilárd-fázisú peptidszintetizátort használtunk. A védőcsoportok eltávolítását követően a polipeptideket hidrogén-fluoriddal hasítottuk le a gyantáról. A gyantáról való hasítást követően kinyert nyers polipeptideket fordított (reverz) fázisú HPLC-vel, egy Rainin Dynamax C-8 oszlopon (12 μπι részecskeméret, 30 nm (300 Ángström pórusméret, 4,6 x 250 mm) vizsgáltuk.

Ezen a módon a következő polipeptideket állítottuk elő:

Lys-Lys-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu (15-21-Gly-Gly-Gly-132-138; 2.számú szekvencia),

Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met (132-137; 3.számú szekvencia), Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys (1-9; 4.számú szekvencia), Asp-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr-Phe-Asn (Asp-7-19; 5.számú szekvencia),

Leu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu-Leu-Ser-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Gly (116-130; 6.számú szekvencia),

Leu-Ser-Pro-Alá-Alá-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met (123-137; 7.számú szekvencia),

Gly-Ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-Asp-Arg-Lys-Ile-Cys (34-47-Cys; 8.számú szekvencia),

Val-Gln-Arg-Lys-Ala-Ile-His-Glu-Leu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu (108-122; 9.számú szekvencia), ·· ·· ·* ·♦«· ···* ···♦«« « X ♦ · · »· · · • ♦ ·*«.· fr · «··· ·» ·« · «·

Lys-Lys-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn-Gly-Lys-Alá-Ile-His-Glu-Leu-Ile-Gin-Gly-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu (15-29, 111-118, 130-138; 10.számú szekvencia).

A fent bemutatott valamennyi polipeptid szekvenciáját követően zárójelben megadjuk a humán gamma interferon A (lásd 1. számú szekvencia) megfelelő savmaradékait, amelyen az adott szekvencia alapul, továbbá a megfelelő szekvencia számát, amellyel a polipeptidet a leírás végén megadott szekvencialistában jelöljük. Megjegyzendő, hogy néhány esetben a szekvenciák további aminosavmaradékokat is tartalmaznak, ahogy azt jelezzük.

A rekombináns, humán gamma interferon A-t és D-t transzformált E.coli sejtek segítségével állítottuk elő, és lényegében a 4,751,078 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közöltek szerint tisztítottuk.

Antiszérumok előállítása

Polipeptid elleni antitestek

A különböző polipeptidek 0,5 - 1,0 mg-nyi mennyiségeit tar-, talmazó 500 μΐ térfogatú 7,1 pH-jú vizes oldatokat azonos térfogatú Freund-féle komplett adjuvánssal emulgeáltunk, és intradermálisan új-zélandi fehér (New Zealand White) nyulakba (Hazelton Labs) injektáltunk (0,1 ml esetenként). Szükség esetén Freund-féle inkomplett adjuvánsban 0,25-től 0,5 mg-ig terjedő mennyiségű polipeptidet tartalmazó emlékeztető injekciókat adtunk körülbelül 4 hetes intervallumokban, ha a szérum minták antigénként a polipeptideket és gamma interferont alkalmazó ELISA vizsgálata alapján indokoltnak láttuk.

·* «· ·« ·Φ·· ·♦·· ·«··«< * ♦ • · · · ·

A hézagos (discontinous) polipeptid elleni antitesteket 8,9 pH-jú 1,5 M glicin pufferrel egyensúlyozott Protein A-Sepharose oszlopon végzett adszorpcióval tisztítottuk. Az SDS (nátrium-lauril-szulfát) poliakrilamid-gélelektroforézis [Laemmli, Natúré 227, 680 (1970)] kimutatta, hogy így az antitest-termelés során 95%-ban tiszta IgG-t kaptunk.

Anti-idiotipikus antitestek.

A hézagos polipeptid elleni tisztított, nyúl IgG antitesteket használtuk a Balb/c egerek ( Charles River Labs ) immunizálására. Az egereket intraperitonálisan adott 0,5 ml prisztánnal (2,6,10,14-tetrametil-pentadekán; Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) indukáltuk (primeroltuk) 6 nappal az immunizálást megelőzően, amelyet hasonló módon, az IgG protein 87 pgját 125 pl foszfátpufferben és 125 pl Freund-féle komplett adjuvánsban tartalmazó oldattal végeztünk. Az 50%-os Freund-féle inkomplett adjuvánsban körülbelül 50 pg fehérjét tartalmazó emlékeztető injekciókat 2-3 hetes időközönként adtuk, ha az az ELISA analízisek alapján szükséges volt.

A nyúl antiszérum ELISA analízisét szobahőmérsékleten végeztük. Egy 96 vájatos mikrotitráló lemez (Nunc) vájatait az antigénnel bevontuk, vájatonként 100 μΐ-nyi 0,25 pg antigént tartalmazó oldatot töltve a vájatokba 1 órára, szobahőmérsékleten. A lemezt 5-ször mostuk 7,5 pH-jú trisz-szel [trisz(hidroxi-metil) -amino-metán] pufférőit, 0,05% Tween 20-at (polioxietilén-szorbitán-monolaurát) tartalmazó sóoldattal (TBS). A lemezt 1 órán keresztül 1%-os szarvasmarha szérumalbuminnal blokkoltuk, majd 5-ször mostuk TBS-sel, és ismét mostuk 5-ször TBS-sel.

<· 99 9··· ♦·· • · · · · • · ·· · * · · • 9 99 9 99

A mosott lemez vájatait a vizsgálandó antiszérummal fedtük 1 óra hosszat, majd 5-ször mostuk TBS-sel, és a vájatokba ezután torma 2,5 mg peroxidázzal konjugált kecske anti-nyúl IgG-t tettünk. További 1 órás inkubáció után a lemezt 5-ször mostuk TBS-sel, majd az egyes vájatokba vagy 2,2'-azino-bisz(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav)-at (ABTS) vagy 3,3',5,5'tetrametil-benzidint (TMB) és hidrogén-peroxidot adva előhívtuk. A színreakciót 10 perc elteltével leállítottuk TMB esetében kénsavat, ABTS esetében pedig nátrium-lauril-szulfátot (SDS) tartalmazó oldat hozzáadásával, és a mintákat Molecular Devices ELISA leolvasó segítségével ABTS esetében 405 nm-en, míg TMB esetében 450 nm-en kiértékeltük.

Az egér szérum ELISA vizsgálatát lényegében ugyanezen a módon hajtottuk végre azzal az eltéréssel, hogy kimutató reagensként peroxidázzal jelzett, kecske, anti-egér IgG-t használtunk.

A rekombináns, humán gamma interferon jelzése.

A rekombináns, humán gamma interferon D-t E.coli lizátumból tisztítottuk homogenitásig lényegében a 4,751,078 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közöltek szerint, bár hasonló interferon kereskedelmileg beszerezhető olyan forrásokból, mint például a Genzyme Corp., Boston, MA.

Az interferont ¹²⁵I-dal jeleztük lényegében úgy, ahogy azt Bolton és munkatársai leírták [Biochem. J. 133, 529 (1973)], 125i_ot és a New England Nuclear, Boston, MA-tól származó Bolton-Hunter reagenst használva. 2 gCi (2200 Ci/mmol) Bolton-Hunter reagens (New England Nuclear, Boston, MA.) vízmentes benzollal készített oldatát gyenge nitrogénáramban beszárítottuk. Utána 50 μΐ 8,0 pH-jú 50 mM nátrium-foszfát pufferben oldva 5 μg gamma interferont adtunk a reakcióedénybe. A reakcielegyet szobahőmérsékleten 2 órán át hagytuk állni, majd utána az el nem reagált Bolton-Hunter reagenst 50 μΐ-nyi 8,0 pH-jú 50 mM nátrium-foszfát-oldattal készített 1 M glicin-oldattal elbontottuk.

A radioaktívan jelzett fehérjét az el nem reagált jelölő reagenstől 0,5% zselatint tartalmazó 7,2 pH-jú 0,05 M nátrium-foszfát-oldattal egyensúlyozott 10 ml-es PD-10 Sephadex G-25 oszlopon (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ.) gélszűréssel választottuk el. 1 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, és az aliquotokat gamma számlálóval mértük. A jelzett protein az oszlop üres térfogatában (3-4 ml) eluálódik, míg az el nem reagált reagens később (6-8 ml).

A jelzett interferon fajlagos radioaktivitása tipikusan 50 - 200 μCi/μg. Az autoradiográfiát követő SDS poliakrilamid-gélelektroforézis vizsgálat kimutatta, hogy a jelzett protein olyan egyedi csíkként vándorol, melynek mozgékonysága lényegében megegyezik a jelzetlen gamma interferon mozgékonyságával.

A ¹²³I-jelzett humán gamma interferon D Daudi sejtekhez való kötődésének gátlása.

A Daudi sejtek törzstenyészeteit olyan RPMI 1640 táptalajon tenyésztettük, amely 100 egység/ml penicillint, 100 μα/ιηΐ sztreptomicint, 2 mM glutamint és 20% hővel inaktivált borjú magzat szérumot tartalmazott. A sejteket T-75 jelű palackokban (50 ml/palack) tenyésztettük 4 χ 10⁵ sejt/ml induló sejt·«· ····

4· «· ·· · ·*··«* · · • · * ·· · « • ···«· ·· _ 31 - ···· ·· ·· · ·· számmal, és 2 napos intervallumonként megosztottuk a tenyészetet (vagy hétvégén át tartó 3 napos tenyésztés esetén 2,5 x 10^ sejt/ml induló sejtszámot alkalmaztunk). A tenyészetek a növekedés során 4°C-on tarthatók fenn.

A sejteket vizsgálat céljára 4°C-on 3 percig tartó 300 x gnél végzett centrifugálással szüreteltük le. Az elhasznált táptalajt elöntöttük, és a sejtekből álló csapadékot jéghideg kötő pufferben [RPMI 1640, 10% hővel inaktivált borjú magzat szérum, 15 mM HEPES ( [4-(2-hidroxi-etil)-piperazin-1-il]-etán ), 0,02% nátrium-azid] szuszpendáltuk. A sejteket hemocitométerrel megszámoltuk, életképességüket a tripánkék kizárásának százalékával meghatároztuk [Animál Cell Culture: A Practical Approach, 1986, R.I. Freshney (szerk.), IRL Press, Ltd., 76-77.old.], és a sejteket 2 χ 10⁶ sejt/ml sejtszámmal hideg kötő pufferben szuszpendáltuk.

A polipeptidekkel és a nyúl antiszérummal végzett kötési vizsgálatokat 1 ml-es térfogatban, Sarstedt 1,5 ml-es, csavaros tetejű, kúpos csöveket felhasználva hajtottuk végre. Az összes komponenst a hideg kötő pufferrel hígítottuk, és a következő sorrendben adagoltuk:

450 μΐ ismeretlen minta (vagy csak kontroll kötő puffer) μΐ ¹²⁵I-jelzett gamma interferon D (10^ cpm )

500 μΐ sejtszuszpenzió (10⁶ élő sejt ).

A továbbiakban 1 μg proteint tartalmazó 10 μΐ jelzetlen gamma interferon A oldatot adtunk néhány kontroll csőhöz azért, hogy a jelzett interferon nemspecifikus kötődésének szintjét meghatározzuk. A radioaktivitás ezen mennyiségét az összes ra32 dioaktivitási mérésből levonjuk.

Miután mindegyik csőbe bemértük az összes komponenst, a csöveket lezártuk, gyorsan megfordítottuk őket, hogy a teljes belső felületük nedves legyen, és hidegszobában, 2 órán keresztül Adams Nutator rázógépen inkubáltuk őket. Ezen inkubációt követően, a felülúszó folyadékot, vigyázva — hogy egyetlen sejtet se távolitsunk el — mindegyik csőből leszívtuk.

Mindegyik csőhöz 100 μΐ jéghideg kötő puffért adtunk, a sejtek alkotta csapadékot 200 μΐ-es Gilson Pipetman alkalmazásával felszuszpendáltuk, és óvatosan alumínium centrifuga állványban elhelyezkedő, 600 μΐ térfogatú, kúpos Sarstedt csövekben levő, 400 μΐ mennyiségű, jéghideg, foszfáttal pufférőit sóoldatban (PBS) 5% szacharózt tartalmazó oldat tetejére rétegeztük. A mintákat 4°C-on 5 percen át 1000 x g-vel centrifugáltuk.

A sejtvesztést elkerülendő, a felülúszó folyadékokat óvatosan leszívtuk, és a csöveket 12 x 75 mm-es, gamma számláló használatához alkalmas csövekbe helyeztük.

A kötés polipeptidek által való gátlása.

A 2.számú és 3. számú szekvenciák által meghatározott aminosavszekvenciáj ú polipeptideket teszteltük a fent leírt receptor kötési vizsgálatban, melynek eredményeit az 1. ábra szemlélteti.

Látható, hogy mind a 2. számú szekvenciával definiált polipeptid (A tábla), mind a másik polipeptid (B tábla) gátolja a ¹²^i-jelzett humán gamma interferon D Daudi sejtek receptoraihoz való kötődését. Az elsőként említett polipeptid volt a hatásosabb kompétitív inhibitor, amint az a 0,145 M és 1,45 M • ·

koncentrációk esetében mutatott körülbelül 15 és 35%-os kötési gátlásokból látható.

A kötés antitestek által való gátlása.

A fent említett valamennyi polipeptid ellen készített nyúl poliklonális antiszérumot leteszteltük arra vonatkozólag, hogy képes-e kötődni a polipeptidekhez és a humán gamma interferon Ahoz, valamint arra, hogy képes-e gátolni a humán gamma interferon D Daudi sejtekhez való specifikus kötődését. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja be.

1. táblázat

A polipeptid szekvencia száma

Az antiszérumok jellemzése 125i_interferőn Specifikus kötődés¹³) kötődés gátlása polipeptidhez ^interferon A-hoz %-ban^a)

2	86	+	+
3	-	-	-
4	11	+	-
5	76	+	+
6	14	+	-
7	65	+	+
8	16	+	+ /-
9	33	+	+

a) Százalékos kötődési gátlás a ¹²⁵I-jelzett, humán gamma interferon D mindenféle inhibitor hiányában bekövetkező specifikus kötődésének százalékában kifejezve.

b) Pozitív kötődési válaszokként (+) lettek meghatározva azok az ELISA eredmények, amelyekben a válaszok a háttér felett nagyobbak voltak, mint 0,15 optikai denzitás (O.D.) egység. A +/jelölési mód azokat a válaszokat jelöli, amelyek a háttér fölött 0,0 és 0,15 O.D. egység között voltak.

• · ·

Az 1.táblázat adatai azt mutatják, hogy azon polipeptidek elleni antitestek, amelyek aminosavszekvenciája megfelel az érett, humán gamma interferon A 7-19. (egy további N-terminális aszpartát maradékkal), 123-137. és 5-21./132-138. (3 áthidaló glicin maradékkal) aminosavmaradékai szekvenciájának (5., 7. és

2. számú polipeptidek), mind antagonistái voltak a jelzett interferon Daudi sejtreceptorokhoz való specifikus kötődésének. Mind a három antiszérum olyan antitesteket tartalmazott, amelyek — mint azt ELISA vizsgálattal kimutattuk — specifikusan kötődtek mind a polipeptidekhez, amelyek ellen termelődtek, mind a gamma interferon A-hoz. A 132-137 polipeptid (3. számú szekvencia) ellen nem termelődtek antitestek, talán azéet, mert túl kicsi volt ahhoz, hogy egy hordozó (carrier) molekulához való konjugálódás nélkül is immunogén legyen.

A nyúl preimmun szérum egyáltalán nem reagált a vizsgálatok során. Amint azt a 2. ábrán láthatjuk, a 2. számú szekvenciával meghatározott polipeptid elleni antiszérum majdnem teljesen megszüntette a jelzett gamma interferon D Daudi sejtekhez való specifikus kötődését olyan koncentrációknál, amikor az inkubáló elegyben a szérum koncentrációja körülbelül 25 μΙ/ml fölött volt. Körülbelül 50% kötési gátlás volt megfigyelhető, amikor az antiszérum koncentrációja csak 1 μΐ/ml volt.

A 2. számú szekvencia által definiált polipeptid elleni IgG antitest frakció felhasználásával készített anti-idiotipikus antiszérum szintén szignifikáns receptor kötési gátlást mutatott, amint azt a 2. táblázatban láthatjuk.

2. táblázat

A ¹²⁵l-jelzett humán gamma interferon Daudi sejtekhez való kötődésének gátlása anti-idiotipikus antiszérum által

Vérvétel·³) Specifikus kötődési gátlás %-banb) első 16 első 31 első 38 második 44

a) A bemutatott adatok azok az eredmények, amelyeket a fent leírt módon immunizált egerekből 16 héttel az első injekció után (első vérvétel) és további 17 hét elteltével (második vérvétel) vett antiszérum használatával kaptunk. A három egér második vérvételének eredményét egyesítettük, így kaptuk a bemutatott eredményt.

b) Az eredményeket kontroll preimmun szérum használatával normalizáltuk.

A 2. táblázatban bemutatott adatok 50 - 100 μΐ egér szérum 105 cpm ¹²^i-jelzett gamma interferonnal 10 és 1,5 x 10^ élő Daudi sejttel lényegében az előbb leírtak szerint végzett inkubálásának eredményei. Az adatok azt mutatják, hogy az anti-idiotipikus antiszérum inhibitor képessége megnövekedett az immunizálás előrehaladtával (azaz, a második véreztetés erősebb gátlást eredményezett, mint az első).

A gamma interferon biológiai hatásainak gátlása.

Annak a bizonyítására, hogy a találmány szerinti polipeptidek szintén előidéznek biológiai hatásokat, egy reprezentatív polipeptid hatását egy interferon-érzékeny biológiai rendszer···· · · · · ben vizsgáltuk.

Reagensek és sejtek.

A körülbelül 5 x 10^ egység/mg fajlagos aktivitású rekombináns, humán gamma interferon D-t transzformált E.coliból standard eljárások felhasználásával állítottuk elő.

Humán adenokarcinómából származó COLO-205 sejteket (ATCC CLL 222) használtunk a fő hisztokompatibilitási antigének II. osztályának (HLA-DR) interferon által kiváltott indukciójának mérésére. Az antigének jelenlétét a sejteken ELISA eljárás segítségével, monoklonális, egér, anti-HLA-DR-nek (Becton-Dickinson Katalógus 7360-as szám) peroxidáz-jelzett kecske anti-egér IgG-vel együtt való alkalmazásával mutattuk ki. A 2,2'-azino-bisz(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav) (ABTS; Kirkegaard & Perry Labs., Inc., Gaithersburg, MD) alkalmazásával kapott színt 405 nm-en spektrofotometriásán mértük.

A HLA-DR indukció gátlása.

A gamma interferon által kiváltott HLA-DR indukció vizsgálatára Bio-ELISA eljárást használtunk lényegében úgy, ahogy azt Gibson és munkatársai leírták [J.Immunoi.Meth., 125, 103 (1989)]. COLO-205 sejteket T-75 palackokban, 10% borjú magzat szérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban (szövettenyésztő táptalaj) folyamatos szövettenyészetté növesztettünk. A sejteket tripszinnel kezeltük, majd 96 vájatos szövettenyésztő lemezek vájataiba vájatonként 10⁵ sejtet oltottunk 0,1 ml szövettenyésztő táptalajban. A sejteket hagytuk a váljatok aljára letapadni 37°C-on éjszakán át 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában inkubálva.

Kontrollként szolgáló szövettenyésztő táptalajt és a 10.

·· ·« ·· ··· »··« ··»*«· · · • · · ·· · · — 37 ~ ···· ·· ·· · ·· számú szekvenciával meghatározott polipeptid szövettenyésztő táptalajban való különböző hígításait, állandó, 150 pM koncentrációjú interferon jelenlétében 0,1 ml térfogatban adagoltuk a vájatokba, majd 1 órán keresztül 37°C-on inkubáltunk.

Az inkubációt követően a táptalajt minden vájatból eltávolítottuk, és a vájatokat 3-szór mostuk szövettenyésztő táptalajjal. A szövettenyésztő táptalaj 0,1 ml-es alikvot mennyiségeit adagoltuk a vájatokba, majd a lemezeket 48 órán keresztül 37°Con inkubáltuk, hogy a sejtekhez kötődött interferon által indukált HLA-DR antigén expressziót elérjük.

A vájatokat 0,2 ml PBS-sel [0,02 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid; pH = 7,4) mostuk, majd a sejteket jéghideg, vízmentes etanollal 2 percen keresztül fixáltuk. Az alkohol eltávolítása után a vájatokat egyszer mostuk 0,2 ml PBS-sel. Utána mindegyik vájatba 50 μΐ-nyi 0,5 % szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó PBS-sel 1:50 arányban hígított, monoklonális egér anti-HLA-DR antitestet adtunk, majd a lemezeket 1 órán keresztül szobahőmérsékeleten inkubáltuk.

A reagens fölöslegét a váj átok háromszori 0,2 ml-nyi PBSsel végzett mosásával távolítottuk el, és ezután 0,1 ml 1:5000 hígítást peroxidáz-jelzett kecske anti-egér IgG-t adtunk minden egyes vájatba. A lemezeket 1 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk. Miután minden egyes vájatot háromszor mostunk PBSsel, ABTS hozzáadásával 5-10 perc alatt szobahőmérésékleten kifejlesztjük a színt. Az abszorbanciát 405 nm-en ELISA lemez leolvasóval mértük.

A COLO-205 sejteken kiváltott gamma interferon indukált ·· ·· ·· ···· ···· ····«· · · ,····· · · — 38 — ···· ·· ·· · ··

HLA-DR expressziónak a 10. számú szekvenciával meghatározott polipeptid által való gátlásának mérési eredményeit a 3.ábrán láthatjuk. Látható, hogy a 7-től 100 μΜ-ig növekvő koncentrációjú polipeptid fokozatosan egyre jobban gátolja az antigén indukciót konstans 150 pM interferon koncentráció mellett.

A szakterületen járatosak számára nyilvánvaló, hogy a találmány számos módosítása és variációja végrehajtható anélkül, hogy eltérnénk annak szellemétől és oltalmi körétől. Az itt leírt specifikus megvalósítások csak szemléltető példákként szolgálnak, és a találmányt csak a mellékelt igénypontok által meghatározott oltalmi kör korlátozza.

A továbbiakban táblázatosán közöljük a leírásban említett szekveciák adatait a szekvencialistákban.

·«·· ····

- 39 Szekvencialisták.

Az 1. számú szekvencia:

A szekvencia jellemzői:

Hossza: 146 aminosav

Jellege: aminosav

Topológiája: lineáris

A molekula jellege: peptid

A szekvencia leírása (1. számú szekvencia):

Cys 1

Tyr

Cys

Gin

Asp 5

Pro

Tyr Val

Lys

Glu 10

Alá

Glu

Asn

Leu

Lys 15

Lys

Tyr

Phe

Asn

Alá

Gly

His

Ser

Asp

Val

Alá

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

20

25

30

Leu

Gly

Ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

35

40

45

Gin

Ser

Gin

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

50

55

60

Asp

Gin

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

65

70

75

80

Asn

Val

Lys

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Arg

Asp

Phe

Glu

85

90

95

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Alá

100

105

110

Ile

His

Glu

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Alá

Glu

Leu

Ser

Pro

Alá

Lys

115

120

125

Thr

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Alá

130

135

140

Ser Gin

145 • · •· · ····

A 2. számú szekvencia:

A szekvencia jellemzői:

Hossza: 17 aminosav

Jellege: aminosav

Topológiája: lineáris

A molekula jellege: peptid

A szekvencia leírása (2. számú szekvencia):

Lys Lys Tyr Phe Asn Alá Gly Gly Gly Gly Arg Lys Arg Ser Gin Met

10 15

Leu

A 3. számú szekvencia:

A szekvencia jellemzői:

Hossza: 6 aminosav

Jellege: aminosav

Topológiája: lineáris

A molekula jellege: peptid

A szekvencia leírása (3. számú szekvencia):

Arg Lys Arg Ser Gin Met ·« • «•a < »*«

A 4. számú szekvencia:

A szekvencia jellemzői:

Hossza: 9 aminosav

Jellege: aminosav

Topológiája: lineáris

A molekula jellege: peptid

A szekvencia leírása (4. számú szekvencia):

Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys

5

Az 5. számú szekvencia:

A szekvencia jellemzői:

Hossza: 14 aminosav

Jellege: aminosav

Topológiája: lineáris

A molekula jellege: peptid

A szekvencia leírása (5. számú szekvencia):

Asp Tyr Val Lys Glu Alá Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn ·· ·· ·« ··«·*· · · • * · · a a · •ö·« ···· • ··· ·· · · · ··

A 6. számú szekvencia:

A szekvencia jellemzői:

Hossza: 15 aminosav

Jellege: aminosav

Topológiája: lineáris

A molekula jellege: peptid

A szekvencia leírása (6. számú szekvencia):

Leu Ile Gin Val Met Alá Glu Leu Ser Pro Alá Alá Lys Thr Gly

10 15

A 7. számú szekvencia:

A szekvencia jellemzői:

Hossza: 15 aminosav

Jellege: aminosav

Topológiája: lineáris

A molekula jellege: peptid

A szekvencia leírása (7. számú szekvencia):

Leu Ser Pro Alá Alá Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met • ·* • ·· · *·

A 8. számú szekvencia:

A szekvencia jellemzői:

Hossza: 15 aminosav

Jellege: aminosav

Topológiája: lineáris

A molekula jellege: peptid

A szekvencia leírása (8. számú szekvencia):

Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Cys

10 15

A 9. számú szekvencia:

A szekvencia jellemzői:

Hossza: 15 aminosav

Jellege: aminosav

Topológiája: lineáris

A molekula jellege: peptid

A szekvencia leírása (9.számú szekvencia):

Val Gin Arg Lys Alá Ile His Glu Leu Ile Gin Val Met Alá Glu ···· ····

A 10. számú szekvencia:

A szekvencia jellemzői:

Hossza: 32 aminosav

Jellege: aminosav

Topológiája: lineáris

A molekula jellege: peptid

A szekvencia leírása (10. számú szekvencia):

Lys

Tyr

Phe

Asn

Alá

Gly

His

Ser

Asp

Val

Alá

Asp

Asn

Gly

Lys

1

5

10

15

Alá

Ile

His

Glu

Leu

Ile

Gin

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Claims

1. Legfeljebb 50 aminosavmaradékot tartalmazó polipeptid, amely az 1. számú szekvencia 15 - 21. és 132 - 137. aminosavmaradékai által meghatározott szubszekvenciákból álló csoportból egy vagy több aminosav szubszekvenciát tartalmaz.

2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, melynek aminosavszekvenciája a 2. számú szekvencia, a 3. számú szekvencia vagy a 10. számú szekvencia által meghatározott.

3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti polipeptid elleni antitest vagy antitest kötő fragmense.

4. A 3. igénypont szerinti antitest elleni anti-idiotipikus antitest vagy antitest kötő fragmense.

5. Eljárás a humán-gamma interferon sejtreceptorokhoz való kötődésének gátlására, azzal jellemezve, hogy a humán gamma-interferon receptorait hordozó sejteket egy 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid, egy 3. igénypont szerinti antitest vagy kötő fragmens vagy egy 4. igénypont szerinti anti-idiotipikus antitest vagy kötő fragmens hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe.

6. Gyógyszerkészítmény a gamma-interferon által közvetített betegségek kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy fiziológiásán elfogadható hordozót és egy 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid, egy 3. igénypont szerinti antitest vagy kötő fragmens vagy egy 4. igénypont szerinti anti-idiotipikus antitest vagy kötő fragmens hatásos mennyiségét tartalmazza.

7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid, egy 3.

·· «· ·· • · * · · · • · · ·· • · · · · ··*· ·· ·· igénypont szerinti antitest vagy kötő fragmens vagy egy 4. igénypont szerinti anti-idiotipikus antitest vagy kötő fragmens alkalmazása a gamma-interferon által közvetített betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására.

8. Eljárás gamma-interferon által közvetített betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy fiziológiásán elfogadható hordozót és egy 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid, egy 3. igénypont szerinti antitest vagy kötő fragmens vagy egy 4. igénypont szerinti anti-idiotipikus antitest vagy kötő fragmens hatásos menynyiségét összekeverjük.

9. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid, egy 3. igénypont szerinti antitest vagy kötő fragmens vagy egy 4. igénypont szerinti anti-idiotipikus antitest vagy kötő fragmens alkalmazása gamma-interferon által közvetített betegségek kezelésére .

10. Eljárás a gamma-interferon által közvetített betegségek kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid, egy 3. igénypont szerinti antitest vagy kötő fragmens vagy egy 4. igénypont szerinti anti-idiotipikus antitest vagy kötő fragmens hatásos mennyiségét adjuk be ezen betegségben szenvedő paciensnek.