DE69621918T4

DE69621918T4 - Medikamente zur behandlung von autoimmunerkrankungen mit interferon-tau

Info

Publication number: DE69621918T4
Application number: DE69621918T
Authority: DE
Inventors: Jeanne M. Soos; Joel Schiffenbauer; Marcellus Howard JOHNSON
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1995-03-16
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 2004-07-15
Anticipated expiration: 2016-03-16
Also published as: DE69621918T2; DE69621918D1; US6060450A; PT814831E; JP2007314579A; ATE219373T1; DK0814831T3; EP0814831B1; US5906816A; KR100417485B1; KR19980702930A; AU688214B2; JP4121553B2; WO1996028183A1; EP0814831A1; CA2214490A1; ES2177780T3; AU5422396A; JPH11503415A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von IFNτ zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Zuständen, die mit einer Überempfindlichkeit des Immunsystems in Beziehung stehen. Insbesondere betrifft die vorliegende Endung die Behandlung von Autoimmunerkrankungen einschließlich multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Lupus erythematodes und Typ I-Diabetes mellitus.
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Hintergrund der Erfindung
Das Immunsystem ist die Hauptabwehr des Körpers gegen durch eindringende Organismen wie Bakterien, Viren oder Parasiten verursachte Erkrankungen sowie durch abnormales Wachstum der körpereigenen Gewebe verursachte Erkrankungen (d. h. maligne Tumore). Normalerweise ist das Immunsystem in der Lage, die normalen Gewebe des Körpers oder das Selbst von fremdem oder karzinomatösem Gewebe oder dem Nichtselbst zu unterscheiden. Der Erkennungsverlust eines bestimmten Gewebes als Selbst und die folgende, gegen dieses Gewebe gerichtete Immunantwort führt typischerweise zu einer "Autoimmunantwort", die oft schwerwiegende klinische Folgen hat.
Ein spezifisches Beispiel einer solchen Autoimmunerkrankung ist multiple Sklerose (MS), eine fortschreitende Erkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), bei der Myelinbereiche (die schützende Umhüllung von Nervenfasern) im Gehirn und Rückenmark durch das körpereigene Immunsystem zerstört werden. Diese Zerstörung führt zur Vernarbung und Schädigung der darunterliegenden Nervenfasern und kann sich selbst in Form einer Vielzahl von Symptomen manifestieren, abhängig von den Teilen des Gehirns und Rückenmarks, die betroffen sind. Eine Rückenmarksschädigung kann Zittern oder Gefühllosigkeit sowie ein schweres und/oder schwaches Gefühl in den Extremitäten zur Folge haben. Eine Schädigung im Gehirn kann Muskelschwäche, Ermüdung, unregelmäßige Zunahme, Gefühllosigkeit, verwaschene Sprache, Sehstörung, Schwindel und ähnliches zur Folge haben.
Gegenwärtige Therapien für multiple Sklerose schließen Corticosteroid-Arzneistoffe (um die Symptome akuter Anfälle zu lindern) sowie andere Biomoleküle ein. Insbesondere ist beta-Interferon (IFNβ) getestet und von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) als eine MS-Therapie zugelassen worden. Unglücklicherweise werfen die gegenwärtig angewendeten Therapien eine Reihe von Problemen auf. Die Arzneistoffe sind in den für einen maximalen therapeutischen Effekt erforderlichen Dosen oft toxisch. Ferner kann der Körper gegen den Arzneistoff desensibilisiert werden, so daß höhere (und toxischere) Dosen erforderlich sind, um noch eine minimale therapeutische Wirkung aufrechtzuerhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt die Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie MS bereit, das nicht die mit den gegenwärtig angewendeten Therapien verbundenen toxischen Nebenwirkungen aufweist.
Zusammenfassung der Erfindung
Unter einem Gesichtspunkt schließt die vorliegende Erfindung die Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung in einem Individuum, das eine solche Behandlung benötigt, ein. In einer Ausführungsform ist die Autoimmunerkrankung multiple Sklerose. Das Verfahren schließt das Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge von tau-Interferon an das Individuum ein. Das tau-Interferon kann zum Beispiel oral oder durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Oral verabreichtes IFNτ wird bevorzugt von dem Individuum aufgenommen. Das tau-Interferon kann von einem tau-Interferon aus einer beliebigen Spezies, die ein tau-Interferon-Protein exprimiert (z. B. Schaf-, Rind-, Ziegen-, Ochsen-, Ratten-, Maus- oder menschliches tau-Interferon), abgeleitet sein (wobei es eine Aminosäuresequenz aufweist, die diesem tau-Interferon entspricht).
Das tau-Interferon kann aus einer geeigneten Quelle gereinigt, rekombinant hergestellt (d. h. rekombinantes tau-Interferon) oder synthetisch hergestellt werden. Außerdem können tau-Interferon-Polypeptide (typischerweise mit zwischen etwa 15 und 172 Aminosäuren) in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch das Verabreichen eines zweiten Mittels zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung (z. B. multiple Sklerose) vor, gleichzeitig mit oder nach dem Verabreichen von tau-Interferon einschließen. Beispielhafte zweite Mittel oder Medikamente zur Behandlung schließen Beta-Interferon und Corticosteroid-Arzneistoffe ein.
In einer weiteren Ausführungsform schließt die vorliegende Erfindung die Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zur Behandlung von Lupus erythematodes in einem Individuum, das eine solche Behandlung benötigt, ein. Das Verfahren schließt das Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge von tau-Interferon an das Individuum ein.
In einer anderen Ausführungsform schließt die vorliegende Endung die Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zur Behandlung von Typ I-Diabetes in einem Individuum, das eine solche Behandlung benötigt, ein. Das Verfahren schließt das Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge von tau-Interferon an das Individuum ein.
In einer weiteren Ausführungsform schließt die vorliegende Erfindung die Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zur Behandlung von rheumatoider Arthritis in einem Individuum, das eine solche Behandlung benötigt, ein. Das Verfahren schließt das Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge von tau-Interferon an das Individuum ein.
Ferner wird erwartet, daß tau-Interferon zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von entweder einer Allotransplantat- oder Xenotransplantatabstoßung nützlich sein kann.
Unter einem anderen Gesichtspunkt schließt die vorliegende Erfindung eine Verbesserung bei der Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zur Behandlung eines Erkrankungszustandes in einem Säuger (z. B. Hund oder Mensch), der auf eine Behandlung mit tau-Interferon (IFNτ) anspricht, ein. Die Verbesserung umfaßt die orale Verabreichung einer therapeutisch oder pharmazeutisch wirksamen Menge von IFNτ. Das oral verabreichte IFNτ wird bevorzugt von dem Säuger aufgenommen. In einer allgemeinen Ausführungsform wird das IFNτ in einer Dosierung zwischen etwa 1 × 10⁵ und etwa 1 × 10⁸ Einheiten pro Tag, vorzugsweise in einer Dosierung zwischen etwa 1 × 10⁶ und etwa 1 × 10⁷ Einheiten pro Tag oral verabreicht. Das IFNτ kann zum Beispiel SchaI-IFNτ (OvIFNτ), z. B. ein Polypeptid mit der als SEQ ID Nr. 2 dargestellten Sequenz, oder ein menschliches IFNτ (HuIFNτ), z. B. ein Polypeptid mit der als SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellten Sequenz, sein.
In einer Ausführungsform ist der Erkrankungszustand eine Erkrankung des Immunsystems wie eine Autoimmunerkrankung (z. B. multiple Sklerose (MS), Typ I (insulinabhängiger)-Diabetes mellitus, Lupus erythematodes, amyotrophische Lateralsklerose, Crohn-Krankheit, rheumatoide Arthritis, Stomatitis, Asthma, Allergien oder Schuppenflechte). MS ist für eine Behandlung unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren besonders zugänglich.
In einer anderen Ausführungsform ist der Erkrankungszustand eine Zellproliferationsstörung wie eine Krebserkrankung (z. B. Haarzellenleukämie, Kaposi-Sarkom, chronische myeloische Leukämie, multiples Myenom, oberflächliches Blasenkarzinom, Hautkrebs (Basalzellkarzinom und malignes Melanom), Nierenzellkarzinom, Eierstockkrebs, geringgradiges lymphocytisches und kutanes T-Zell-Lymphom und -Gliom).
In einer noch anderen Ausführungsform ist der Erkrankungszustand eine Viruserkrankung (z. B. Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Nicht-A-Nicht-B-Nicht-C-Hepatitis, Epstein-Barr-Virus-Infektion, HIV-Infektion, Herpes-Virus (EB, CML, Herpes simplex), Papillomavirus, Pockenvirus, Picornavirus, Adenovirus, Rhinovirus, HTLV I, HTLV II und menschliches Rotavirus).
Die Erfindung schließt auch die Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zur Verringerung der Schwere oder Häufigkeit eines Rückfalls von multipler Sklerose (MS) in einem Menschen, der an MS leidet, durch orale Verabreichung einer therapeutisch oder pharmazeutisch wirksamen Menge von Interferon-tau (IFNτ) an den Menschen ein. Beispiele von Dosierungen und Quellen für IFNτ sind, wie vorstehend dargestellt.
Unter einem anderen Gesichtspunkt schließt die Erfindung die Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zur Behandlung einer Zellproliferationsstörung in einem Individuum durch orale Verabreichung einer therapeutisch oder pharmazeutisch wirksamen Menge von Interferon-tau (IFNτ) an das Individuum ein. Das oral verabreichte IFNτ wird bevorzugt von dem Individuum aufgenommen. Beispiele von Zellproliferationsstörungen, die für eine Behandlung zugänglich sind, Dosierungen und Quellen für IFNτ sind, wie vorstehend dargestellt.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt schließt die Erfindung die Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zur Behandlung einer Viruserkrankung in einem Individuum durch orale Verabreichung einer therapeutisch oder pharmazeutisch wirksamen Menge von Interferon-tau (IFNτ) an das Individuum ein. Das oral verabreichte IFNτ wird bevorzugt von dem Individuum aufgenommen. Beispiele von Viruserkrankungen, die für eine Behandlung zugänglich sind, Dosierungen und Quellen für IFNτ sind, wie vorstehend dargestellt.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt schließt die Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zur Erhöhung der Fruchtbarkeit in einem weiblichen Säuger (z. B. Hund oder Mensch) durch orale Verabreichung einer therapeutisch oder pharmazeutisch wirksamen Menge von Interferon-tau (IFNτ) an den Säuger ein. Beispiele von Dosierungen und Quellen für IFNτ sind, wie vorstehend dargestellt.
Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden beim Lesen der folgenden ausführlichen Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen deutlicher.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt einen Vergleich der Toxizität von IFNβ und IFNτ.
2 zeigt die mittlere Schwere einer experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE) in mit MBP immunisierten New Zealand White (NZW)-Mäusen in Anwesenheit und Abwesenheit von IFNτ.
3 zeigt die Wirkungen von IFNτ auf die Proliferation von Milzzellen aus mit MBP immunisierten NZW-Mäusen.
Die 4A, 4B, 4C, 4D, 4E und 4F sind graphische Darstellungen einer Superantigen-Reaktivierung von EAE in Anwesenheit und Abwesenheit von IFNτ.
5 zeigt die Wirkungen von IFNτ auf die Vβ-spezifische T-Zell-Aktivierung.
6 zeigt die Menge von OvIFNτ in Seren von NZW-Mäusen nach der Verabreichung durch entweder orale Fütterung (ausgefüllte Balken) oder ip-Injektion (nicht ausgefüllt Balken), wie unter Verwendung eines Anti-Virustests gemessen wurde.
Die 7A, 7B und 7C zeigen die Verhinderung einer chronisch rezidivierenden experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE) in SJL-Mäusen durch oral verabreichtes (7C) und ip-injiziertes (7B) IFNτ im Vergleich zu Mäusen, die keine Behandlung erhielten (7A).
Die 8A, 8B und 8C zeigen Schnitte des Rückenmarks einer Maus, gefärbt mit Kresylviolett zum Nachweis einer Lymphocyteninfiltration, aus EAE-induzierten Tieren, die entweder keine IFNτ-Behandlung (8A), eine OvIFNτ-Behandlung durch ip-Injektion (8B) oder eine OvIFNτ-Behandlung durch orale Fütterung (8C) erhielten.
9 zeigt die Induktion von IL-10 durch entweder eine Einfachdosis- oder eine längere IFNτ-Behandlung, verabreicht durch ip-Injektion oder orale Fütterung.
10 zeigt Rückfälle von EAE in SJL-Mäusen nach dem Absetzen der IFNτ-Behandlung.
11 zeigt einen ELISA-Nachweis von anti-OvIFNτ-Antikörpern in den Seren von mit OvIFNτ behandelten Mäusen nach der ip-Injektion oder oralen Fütterung von OvIFNτ.
Kurze Beschreibung der Sequenzen
SEQ ID Nr. 1 ist die Nucleotidsequenz eines synthetischen Gens, das SchaI-Interferon-τ (OvIFNτ) codiert. Die codierte Aminosäuresequenz ist ebenfalls gezeigt.
SEQ ID Nr. 2 ist eine Aminosäuresequenz eines reifen OvIFNτ-Proteins.
SEQ ID Nr. 3 ist eine synthetische Nucleotidsequenz, die ein reifes menschliches Interferon-τ (HuIFNτ)-Protein codiert.
SEQ ID Nr. 4 ist eine Aminosäuresequenz für ein reifes HuIFNτ1-Protein.
SEQ ID Nr. 5 ist die Nucleotidsequenz, mit Ausnahme der Leadersequenz, des genomischen DNA-Clons HuIFNτ3, der ein natürliches HuIFNτ-Gen ist.
SEQ ID Nr. 6 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz eines von HuIFNτ3 codierten reifen menschlichen IFNτ-Proteins, das durch die als SEQ ID Nr. 5 dargestellte Sequenz codiert wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Interferon-τ betrifft jede Familie von Interferon-Proteinen, die mindestens eine Eigenschaft aus jeder der folgenden zwei Gruppen von Eigenschaften aufweist: (i) (a) antiluteolytische Eigenschaften, (b) antivirale Eigenschaften, (c) antizelluläre Proliferationseigenschaften; und (ii) etwa 45% bis 68% Aminosäurehomologie zu α-Interferonen und mehr als 70% Aminosäurehomologie zu bekannten IFNτ-Sequenzen (z. B. Ott et al., 1991; Helmer et al., 1987; Imakawa et al., 1989; Whaley et al., 1994; Bazer et al., 1994). Die Aminosäurehomologie kann zum Beispiel unter Verwendung des LALIGN-Programms mit Standardparametern bestimmt werden. Dieses Programm ist in der FASTA-Version 1.7-Folge von Sequenzvergleichsprogrammen zu finden (Pearson und Lipman, 1988; Pearson, 1990; Programm erhältlich von William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, VA). IFNτ kann aus einer Reihe von Quellen einschließlich Kuh, Schaf, Ochse und Menschen erhalten werden.
Ein Interferon-τ-Polypeptid ist ein Polypeptid mit zwischen etwa 15 und 172 Aminosäuren, das von einer die Interferon-τ-Aminosäuren codierenden Sequenz abgeleitet ist, wobei die Aminosäuren 15 bis 172 in dem nativen Interferon-τ zusammenhängend sind. Solche Bereiche der Aminosäuren 15 bis 172 können auch zu Polypeptiden zusammengesetzt werden, worin zwei oder mehrere solche Interferon-τ-Bereiche verbunden sind, die in dem nativen Protein normalerweise nicht zusammen hängen.
Behandlung einer Erkrankung betrifft auf die Verabreichung eines therapeutischen Stoffes, der in der Linderung der Symptome der Erkrankung und/oder der Verringerung der Schwere der Erkrankung wirksam ist.
II. Überblick über die Erfindung
Zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente zeigen, daß IFNτ in der Verhinderung der Entwicklung einer experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE; Zamvil und Steinman, 1990) wirksam ist, ein Tiermodell für eine Antigen-induzierte Autoimmunität, das häufig studiert worden ist, um Einblick in multiple Sklerose (MS) zu gewinnen. IFNτ ist in diesen Experimenten mindestens so wirksam wie IFNβ, das vor kurzem durch die FDA zur Behandlung von MS zugelassen worden ist. Die Experimente zeigen ferner, daß IFNτ eine geringere Toxizität als IFNβ aufweist und daß mit IFNτ behandelte Mäuse keine Leukopenie, eine mit der IFNβ-Behandlung verbundene unerwünschte Nebenwirkung, entwickeln.
Außerdem haben zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente gezeigt, daß oral verabreichtes IFNτ nahezu so wirksam wie injiziertes IFNτ bei der Behandlung von EAE ist, aber erheblich geringere anti-IFNτ-Antikörpertiter in den behandelten Tieren ergibt. Dieser unerwartete Vorteil hat eine geringere Wahrscheinlichkeit von Nebenwirkungen infolge einer Immunantwort des Wirts gegen IFNτ zur Folge.
Vor kurzem ist gezeigt worden, daß Superantigene mit Rückfällen bei EAE verbunden sein können, die solchen ähnlich sind, welche "spontan" bei MS-Patienten auftreten. Weitere zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente zeigen, daß IFNτ die Superantigen-Reaktivierung von EAE blockiert und daß die Hemmwirkung von IFNτ auf die Induktion von EAE und die Reaktivierung durch ein Superantigen mit der Suppression des basischen Myelinproteins (MBP) und der Superantigen-Aktivierung von T-Zellen sowie der supprimierten Induktion von destruktiven Cytokinen wie der Tumornekrosefaktor verbunden ist. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß IFNτ, sowohl injiziert als auch oral verabreicht, bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie MS mit einer geringeren Toxizität und weniger Nebenwirkungen, als sie bei IFNβ auftreten sehr wirksam sein kann.
III. Interferon-τ
Das erste zu identifizierende IFNτ war SchaI-IFNτ (OvIFNτ). Mehrere Isoformen des 18–19 kDa-Proteins wurden in Homogenaten des Empfängnisprodukts (der Embryo und umgebende Hüllen) identifiziert (Martal et al., 1979). Später wurde ein in das Empfängnisprodukt-Kulturmedium freigesetztes Protein mit einem niedrigen Molekulargewicht gereinigt, für das gezeigt wurde, daß es sowohl hitzeempfindlich als auch protease-sensitiv ist (Godkin et al., 1982). OvIFNτ wurde ursprünglich als SchaI-Trophoblastenprotein-1 (oTP-1) bezeichnet, da es das wichtigste sekretorische Protein war, daß anfänglich vom Trophektoderm des Empfängnisprodukts eines SchaIs während der kritischen Periode der mütterlichen Erkennung beim SchaI produziert wird. Spätere Experimente haben ermittelt, daß OvIFNτ ein Schwangerschaftserkennungshormon ist, das zur Festsetzung der physiologischen Antwort auf die Schwangerschaft bei Wiederkäuern wie SchaI und Kuh notwendig ist (Bazer und Johnson, 1991).
IFNτs mit ähnlichen Eigenschaften und Aktivitäten sind aus anderen Wiederkäuerarten einschließlich Kuh und Ziege isoliert worden (Bartol et al., 1985; und Gnatek et al., 1989). Antiseren gegen alle IFNτs sind kreuzreaktiv. Dies ist nicht unerwartet, da die artspezifischen Formen von IFNτ untereinander eine engere Homologie als zu IFNαs aus den identischen Arten aufweisen (Roberts et al., 1992).
Das Kuhprotein (BoIFNτ; Helmer et al., 1987; Imakawa et al., 1989) hat ähnliche Funktionen wie OvIFNτ bei der mütterlichen Schwangerschaftserkennung. Ferner hat es einen hohen Aminosäure- und Nucleotidsequenz-Homologiegrad mit OvIFNτ gemeinsam. Die Nucleinsäuresequenzhomologie zwischen OvIFNτ und BoIFNτ beträgt 76,3% für die nicht-codierende 5'-Region, 89,7% für die codierende Region und 91,9% für die nicht-codierende 3'-Region. Die Aminosäuresequenzhomologie beträgt 80,4%.
Eine durch das Absuchen einer SchaI-Blastocyten-Genbank mit einem synthetischen Oligonucleotid, das die N-terminale Aminosäuresequenz repräsentiert, als Sonde erhaltene IFNτ-cDNA (Imakawa et al., 1989) weist eine vorhergesagte Aminosäuresequenz auf, die eine Homologie von 45–55% zu IFNαs aus Mensch, Maus, Ratte und Schwein und eine Homologie von 70% zu Rinder-IFNαII, das nun als IFNΩ bezeichnet wird, aufweist. Mehrere cDNA-Sequenzen sind beschrieben worden, die verschiedene Isoformen darstellen können (Stewart et al., 1989; Klemann et al., 1990; und Charlier M. et al., 1991). Alle sind ungefähr 1 kb groß mit einem offenen Leseraster von 585 Basen, das eine 23 Aminosäuren umfassende Leadersequenz und ein 172 Aminosäuren umfassendes reifes Protein codiert. Die vorhergesagte Struktur von IFNτ in Form eines Bündels aus vier Helices mit angefügten Amino- und Carboxyl-Termini bestätigt weiterhin seine Klassifizierung als ein Typ I-IFN (Jarpe et al., 1994).
Tabelle 1 Überblick über die Interferone
Obwohl IFNτ viele der klassischerweise mit Typ I-IFNs assoziierten Aktivitäten zeigt (vgl. vorstehend Tabelle 1), bestehen erhebliche Unterschiede zwischen ihm und den anderen Typ I-IFNs. Der auffallendste Unterschied ist seine vorstehend ausführlich beschriebene Rolle bei der Schwangerschaft. Unterschiedlich ist auch die virale Induktion. Alle Typ I-IFNs, ausgenommen IFNτ, werden ohne weiteres durch ein Virus und dsRNA induziert (Roberts et al., 1992). Die induzierte IFNα- und IFNβ-Expression ist vorübergehend und dauert ungefähr einige Stunden. Im Gegensatz dazu wird die IFNτ-Synthese nach der Induktion über einen Zeitraum von Tagen aufrechterhalten (Godkin et al., 1992). Auf einer pro-Zelle-Basis wird 300mal mehr IFNτ als andere Typ I-IFNs produziert (Cross und Roberts, 1991).
Andere Unterschiede können in den regulatorischen Regionen des IFNτ-Gens vorliegen. Zum Beispiel hatte die Transfektion der menschlichen Trophoblasten-Zelllinie JAR mit dem Gen für Rinder-IFNτ eine antivirale Aktivität zur Folge, während die Transfektion mit dem Rinder-IFNΩ-Gen nicht dazu in der Lage war. Dies setzt einzigartige trans-wirksame Faktoren voraus, die an der IFNτ-Genexpression beteiligt sind. Im Einklang damit steht die Beobachtung, daß, obwohl die proximale Promotorregion (von 126 bis zum Startpunkt der Transkription) von IFNτ in hohem Grade homolog zu der von IFNα und IFNβ ist, die Region von –126 bis –450 nicht homolog ist und nur die IFNτ-Expression verstärkt (Cross und Roberts, 1991). Folglich scheinen andere regulatorische Faktoren an der IFNτ-Expression im Vergleich zu den anderen Typ I-IFNs beteiligt zu sein.
Die IFNτ-Expression kann sich auch zwischen Arten unterscheiden. Zum Beispiel, obwohl die IFNτ-Expression auf ein bestimmtes Stadium (vorwiegend die Tage 13–21) der Entwicklung des Empfängnisprodukts bei Wiederkäuern beschränkt ist (Godkin et al., 1982), legen vorläufige Studien nahe, daß die menschliche Form von IFNτ während der ganzen Schwangerschaft konstitutiv exprimiert wird (Whaley et al., 1994).
A. Isolierung von IFNτ
Das OvIFNτ-Protein kann aus Empfängnisprodukten isoliert werden, die aus schwangeren SchaIen gewonnen und in vitro in einem modifizierten Essentiellen Minimalmedium (MEM) gezüchtet wurden, wie von Godkin et al. (1982) und Vallet et al. (1987) beschrieben wurde. Das IFNτ kann aus den Empfängnisprodukt-Kulturen durch Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration gereinigt werden. Die Homogenität des isolierten IFNτ kann durch eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE; Maniatis et al., 1982; Ausubel et al., 1988) beurteilt werden, und die Bestimmung der Proteinkonzentration in gereinigten IFNτ-Proben kann unter Verwendung des Bicinchonin-Tests (BCA) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Smith et al., 1985) durchgeführt werden.
B. Rekombinante Herstellung von IFNτ
Rekombinantes IFNτ-Protein kann aus einem beliebigen ausgewählten IFNτ-Polynucleotidfragment unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems wie Bakterien- oder Hefezellen hergestellt werden. Die Isolierung von IFNτ-Nucleotid- und -Polypeptidsequenzen ist bei Bazer et al. (1994) beschrieben. Zum Beispiel beschreiben Bazer et al. die Identifizierung und Isolierung eines menschlichen IFNτ-Gens. Eine synthetische Nucleotidsequenz, die ein reifes menschliches Interferon-τ (HuIFNτ)-Protein codiert, ist hier als SEQ ID Nr. 3 dargestellt. SEQ ID Nr. 4 ist die entsprechende Aminosäuresequenz für ein reifes HuIFNτ1-Protein. SEQ ID Nr. 5 ist die Nucleotidsequenz des genomischen DNA-Clons HuIFNτ3, das ein natürliches HuIFNτ-Gen ist, ohne Leadersequenz, und SEQ ID Nr. 6 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz eines reifen menschlichen IFNτ-Proteins, das durch die als SEQ ID Nr. 5 dargestellte Sequenz codiert wird.
Zur Herstellung eines IFNτ-Expressionsvektors wird eine IFNτ codierende Sequenz (z. B. SEQ ID Nr. 1) in einen Expressionsvektor, z. B. ein bakterieller Expressionsvektor, eingebracht und gemäß Standardverfahren exprimiert. Beispiele geeigneter Vektoren schließen Lambda gt11 (Promega, Madison, WI)-; pGEX (Smith et al., 1985)-; pGEMEX (Promega)-; und pBS (Stratagene, La Jolla, CA)-Vektoren ein. Andere bakterielle Expressionsvektoren, enthaltend geeignete Promotoren wie den T7-RNA-Polymerase-Promotor oder den tac-Promotor, können auch verwendet werden. Die Clonierung des synthetischen OvIFNτ-Polynucleotids in einen modifizierten pIN III omp-A-Expressionsvektor ist in Material und Methoden beschrieben.
Für die hier beschriebenen Experimente wurde die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte OvIFNτ codierende Sequenz in einen zur Transformation von Hefezellen geeigneten Vektor cloniert, der den durch Methanol regulierten Alkoholoxidase (AOX)-Promotor und eine Pho1-Signalsequenz enthält. Der Vektor wurde zur Transformation von P. pastoris-Wirtszellen verwendet, und transformierte Zellen wurden verwendet, um das Protein gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, San Diego, CA) zu exprimieren.
Andere Hefevektoren, die zur Expression von IFNτ zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, schließen 2 Mikron-Plasmidvektoren (Ludwig et al., 1993), Hefe integrierende Plasmide (YIps; z. B. Shaw et al., 1988), YEP-Vektoren (Shen et al., 1986), Hefecentromer-Plasmide (YCps; z. B. Ernst, 1986) und andere Vektoren mit einer regulierbaren Expression (Hitzeman et al., 1988; Rutter et al., 1988; Oeda et al., 1988) ein. Vorzugsweise schließen die Vektoren eine Expressionskassette ein, die einen wirksamen Hefepromotor wie den MFα1-Promotor (Ernst, 1986; Bayne et al., 1988), GADPH-Promotor (Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; Wu et al., 1991) oder den mit Galactose induzierbaren GAL10-Promotor (Ludwig et al., 1993; Feher et al., 1989; Shen et al., 1986) enthalten. Der Hefe-Transformationswirt ist typischerweise Saccharomyces cerevisiae, jedoch kann, wie vorstehend veranschaulicht, auch eine andere zur Transformation geeignete Hefe verwendet werden (z. B. Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris und ähnliche).
Ferner kann eine ein IFNτ-Polypeptid codierende DNA in einen beliebigen, im Handel erhältlichen Vektoren cloniert werden, um die Expression des Polypeptids in dem geeigneten Wirtssystem zu bewirken. Diese Systeme schließen die vorstehend beschriebenen Bakterien- und Hefe-Expressionssysteme sowie die folgenden ein: Baculovirus-Expression (Reilly et al., 1992; Beames et al., 1991, Clontech, Palo Alto, CA); Expression in Pflanzenzellen, Expression in transgenen Pflanzen (z. B. Gelvin und Schilperoot) und Expression in Säugerzellen (Clontech, Palo Alto, CA; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). Die rekombinanten Polypeptide können als Fusionsproteine oder als native Proteine exprimiert werden. Eine Reihe von Merkmalen kann in die Expressionsvektoren eingebaut werden, wie Leadersequenzen, welche die Sekretion der exprmierten Sequenzen in das Kulturmedium begünstigen. Die rekombinant hergestellten Polypeptide werden typischerweise aus lysierten Zellen oder Kulturmedien isoliert. Die Reinigung kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren einschließlich Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie durchgeführt werden. Die Immunaffinitätschromatographie kann, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von Antikörpern, die basierend auf den IFNτ-Polypeptiden erzeugt wurden, angewendet werden.
Zusätzlich zu rekombinanten Verfahren können IFNτ-Proteine oder -Polypeptide aus ausgewählten Zellen durch Verfahren auf Affinitätsbasis, wie unter Verwendung von geeigneten Antikörpern, isoliert werden. Ferner können IFNτ-Peptide unter Anwendung von Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, chemisch synthetisiert werden.
C. IFNτ weist keine Toxizität auf
Typ I-IFNs (IFNα und IFNβ) sowie Typ II-IFNs (IFNγ) zeigen eine erhebliche Cytotoxizität (Degre, 1974; Fent und Zbinden, 1987). Die durch diese IFNs ausgeübten schädlichen, toxischen Wirkungen sind während klinischer Prüfungen und bei der Patientenbehandlung beobachtet worden und schließen grippeähnliche Symptome wie Fieber, Schüttelfrost und Teilnahmslosigkeit, Herzjagen, Brechreiz, Gewichtsverlust, Leukopenie und Neutropenie ein (Degre, 1974; Fent und Zbinden, 1987).
Zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte und nachstehend in Beispiel 1 ausführlich beschriebene Experimente legen nahe, daß IFNτ eine erheblich geringere Cytotoxizität als die vorstehend aufgeführten IFNs aufweist. Die Cytotoxizität wurde in vivo (Beispiel 1A) unter Verwendung von Leukocytenzahl (White Blood Cell Counts, WBC), Lymphocyten-Prozentsatz und Gesamtkörpergewicht von New Zealand White (NZW)-Mäusen, denen die verschiedenen IFNs injiziert wurden, beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt und in Tabelle 2a zusammengefaßt. Zwölf Stunden nach der Injektion mit 10⁵ E von murinem Interferon alpha (MuIFNα), von dem bereits gezeigt wurde, daß es einen höheren Toxizitätsgrad induziert als IFNβ, zeigten die Mäuse verringerte Leukocytenzahlen, Lymphopenie und einen erheblichen Gewichtsverlust. Keine dieser toxizitätsbedingten Wirkungen wurde bei Tieren beobachtet, denen OvIFNτ injiziert wurde. Die in den Toxizitätsstudien verwendeten Konzentrationen von OvIFNτ entsprachen denjenigen, für die gezeigt wurde, daß sie in der Verhinderung von EAE wirksam sind (nachstehend in Beispiel 2 ausführlich beschrieben).
Die Cytotoxizität wurde auch in vitro beurteilt (Beispiel 1B). Die Lebensfähigkeit von L929-Zellen, die IFNτ in Konzentrationen so hoch wie 200.000 E/ml ausgesetzt wurden, blieb nahe den Kontrollwerten, während IFNβ toxische Wirkungen bei Konzentrationen von nur 7000 E/ml zeigte (1). Für IFNτ wurde auch eine fehlende Toxizität festgestellt, wenn es in einer Reihe von tumorbildenden Zelllinien getestet wurde, obwohl es die Zellreplikation hemmte. Die Ergebnisse dieser und weiterer Studien, welche die Toxizität von IFNτ mit den Toxizitäten von IFNβ und IFNα in Tiermodellen sowie in der Gewebekultur vergleichen (Bazer und Johnson, 1991; Johnson et al., 1994; Bazer et al., 1989; und Soos und Johnson, 1995), sind nachstehend in Tabelle 2a zusammengefaßt.
Tabelle 2a Parameter, welche veranschaulichen, daß IFNτ nicht toxisch ist, wohl aber die IFNs α und β toxisch sind
In Gegenwart von IFNs gezüchtete MDBK-Zellen zeigten eine verminderte Lebensfähigkeit, wenn sie in Gegenwart von IFNα (50.000 E/ml IFN) gezüchtet wurden, aber nicht, wenn sie in Gegenwart von IFNτ gezüchtet wurden (Pontzer et al., 1991). Ähnliche Ergebnisse wurden mit der menschlichen WISH-Zelllinie erhalten. Die Vergleiche der durch IFNτ und andere IFNs induzierten Toxizität (oder das Fehlen davon) wurden unter Verwendung von menschlichen peripheren mononucleären Zellen (HPMC) und HIV-infizierten HPMCs durchgeführt. IFNτ zeigte keine toxischen Wirkungen auf gezüchtete HPMCs, während sowohl IFNα als auch IFNβ die Zelllebensfähigkeit bei 50.000 E/ml verminderten (Soos und Johnson, 1995). Mit HIV-1 infizierte menschliche Lymphocyten und mit HIV infizierte Lymphocyten der Katze zeigten auch keine verminderte Lebensfähigkeit in Gegenwart von IFNτ (Bazer et al., 1989). Diese Erkenntnisse zeigen, daß die aus Beobachtungen unter Verwendung von immortalisierten Zelllinien abgeleitete fehlende Toxizität von IFNτ auch auf menschliche periphere Blutzellen übertragen werden kann. Die in Tabelle 2a zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß injiziertes IFNτ eine geringe oder keine Toxizität zu haben scheint, wenn es sowohl in vitro als auch in vivo getestet wird, verglichen mit injiziertem IFNα, IFNβ und IFNγ.
Weitere zur Unterstützung der vorliegenden Endung durchgeführten Experimente verglichen die durch die Lymphocytendepression im peripheren Blut gemessene Toxizität von oral verabreichtem und injiziertem OvIFNτ mit der der oral verabreichten und injizierten IFNs α und β. Blut wurde aus dem Schwanz gewonnen, und die Leukocytenzahlen (WBCs) wurde unter Verwendung eines Hämocytometers ausgezählt. Differential-WBC-Zählungen wurden mit Wright-Giemsa gefärbten Blutausstrichen durchgeführt.
Die Ergebnisse sind nachstehend in den Tabellen 2b, 2c und 2d aufgeführt. Signifikante Toxizitätsgrade wurde bei Mäusen nachgewiesen, an die entweder IFN α oder β verfüttert wurde, während keine signifikante Lymphocytendepression bei Mäusen nachgewiesen wurde, an die 10⁵, 2 × 10⁵ oder 5 × 10⁵ E OvIFNτ oder PBS allein verfüttert wurden. Diese Daten legen nahe, daß oral verabreichtes OvIFNτ (wie injiziertes OvIFNτ) eine signifikant verringerte Toxizität im Hinblick auf andere Typ I-IFNs aufweist.
Tabellen 2b–2d Vergleich der IFNs τ, β und α hinsichtlich der Toxizität nach oraler Fütterung Tabelle 2b
Tabelle 2c
Tabelle 2d
IV. IFNτ als Behandlung für Autoimmunerkrankungen
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren können verwendet werden, um eine Vielzahl von Erkrankungen, die mit dem Immunsystem in Beziehung stehen und durch eine hyper- oder hypoaktive Immunsystemfunktion gekennzeichnet sind, zu behandeln und auf diese Weise zu lindern. Solche Erkrankungen schließen Hyperallergenitäts- und Autoimmunerkrankungen wie multiple Sklerose, Typ I-(insulinabhängiger) Diabetes mellitus, Lupus erythematodes, amyotrophische Lateralsklerose, Crohn-Krankheit, rheumatoide Arthritis, Stomatitis, Asthma, Allergien, Schuppenflechte und ähnliche ein.
A. IFNτ-Behandlung bei EAE, einem Tiermodell für multiple Sklerose
1. OvIFNτ hemmt die Entwicklung von EAE, einem Tiermodell für multiple Sklerose
Die Wirksamkeit von IFNτ bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen kann in Nagern mit experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE), einem Tiermodell für eine Antigen-induzierte Autoimmunität, das häufig studiert wird, um Einsicht in menschliche multiple Sklerose (MS) zu gewinnen, beurteilt werden. EAE ist eine demyelinisierende Auto immunerkrankung, die durch Immunisierung von anfälligen Maus-, Ratten- oder Meerschweinchenstämmen mit basischem Myelinprotein (MBP) oder mit Encephalitis auslösenden Peptidfragmenten induziert wird. Die genetische Anfälligkeit in den Modelltierstämmen basiert zum Teil auf der Fähigkeit von Encephalitis auslösenden Peptiden, an bestimmte Klasse II-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC-II)-Moleküle zu binden (Fritz et al., 1983; Wraith et al., 1989). Insbesondere sind Mäuse mit dem H-2^u-Haplotyp anfällig für EAE. Anfällige Mäusestämme schließen PL/J-Mäuse (Klein et al., 1983), (PL/J × SJL)F₁-Mäuse (Zamvil et al., 1990; Wraith et al.), B10.PL-Mäuse (Figuero et al., 1982), NZW-Mäuse (Kotzin et al., 1987) und (NZB × NZW)F1-Mäuse (Kotzin et al.) ein.
Für gamma-Interferon (IFNγ) und Beta-Interferon (IFNβ) ist gezeigt worden, daß sie bei der Behandlung von multipler Sklerose wirksam sind (Johnson et al., 1994; IFNβ Multiple Sclerosis Study Group, 1993). Tatsächlich ist IFNβ durch die FDA als ein Therapeutikum für multiple Sklerose zugelassen worden. Obwohl β-IFN gegen MS wirksam ist, weist es eine relativ hohe Toxizität und als Ergebnis davon eine Vielzahl von unerwünschten Nebenwirkungen auf. Wie vorstehend beschrieben, weist jedoch IFNτ eine erheblich geringere Toxizität als andere Interferone auf und kann daher weniger unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen.
In zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführten und in Beispiel 2 ausführlich beschriebenen Experimenten wurde IFNτ auf seine Fähigkeit getestet, die Induktion von EAE zu verhindern. EAE wurde in New Zealand White (NZW)-Mäusen durch Immunisierung mit dem basischen Myelinprotein (bMBP) des Rindes induziert. Die Mäuse erhielten intraperitoneal (ip) eine Injektion mit entweder einer Einfachdosis von rekombinantem SchaI-IFN-tau (OvIFNτ) oder murinem IFN-beta (MuIFNβ) am Tag der Immunisierung oder 3 Dosen von OvIFNτ oder MuIFNβ 48 Stunden vor, am Tag der und 48 Stunden nach der Immunisierung mit MBP.
Die Ergebnisse der Experimente sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Der zeitliche Verlauf der mittleren Schwere von EAE ist in 2 dargestellt. Die Symbole sind wie folgt:
Δ – Kontrolltier; ⊕ – Einfachdosis von OvIFNτ; ⎕ – 3 Dosen von OvIFNτ.
Alle Tiere, die am Tag der Immunisierung eine Injektion erhielten (sowohl scheininfiziert als auch IFN-injiziert) entwickelten eine EAE, aber die Schwere war vermindert, und der durchschnittliche Tag des Ausbruchs war in sowohl den mit OvIFNτ (23,8 ± 0,5 Tage) als auch den mit MuIFNβ (23,5 ± 0,6 Tage) behandelten Tieren im Verhältnis zu den Kontrolltieren (16,2 ± 0,8 Tage) verzögert.
Die unter Verwendung des 3 Dosen-Protokolls erhaltenen Ergebnisse sind bemerkenswerter. Sieben der neun Kontrolltiere entwickelten im Durchschnitt 15,2 Tage nach der Immunisierung eine EAE. Im Gegensatz dazu entwickelte keines der neun Tiere, die mit OvIFNτ behandelt wurden, die Krankheit, und eines von neun Tieren, die mit MuIFNβ behandelt wurden, erlag der EAE (22 Tage nach der Immunisierung).
Die Daten zeigen, daß IFNτ eine wirksame Immuntherapie zur Verhinderung von EAE ist und als eine Behandlung in diesem Modell für eine Autoimmunerkrankung genauso wirksam wie MuIFNβ ist. Zusammengenommen mit der geringeren Toxizität von IFNτ im Verhältnis zu IFNβ legen die Daten nahe, daß der Behandlung von Individuen mit einer Autoimmunerkrankung (wie multiple Sklerose) mit IFNτ der Vorzug gegeben werden kann und daß sie wirksamer als die Behandlung mit IFNβ sein kann.
2. OvIFNτ hemmt die T-Zell-Proliferation
Die Wirkungen von IFNτ auf die Proliferation von Milzzellen aus mit MBP immunisierten NZW-Mäusen, die mit MBP in vitro stimuliert worden waren, wurden beurteilt. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Die Proliferation als Antwort auf MBP war besonders stark und konnte durch IFNτ in einer dosisabhängigen Weise verringert werden, was zeigt, daß IFNτ eine antiproliferative Aktivität gegen T-Zellen aufweist, die für das Autoartigen MBP spezifisch sind. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Beobachtung, daß IFNτ die Symptome einer MBP-induzierten EAE hemmt oder beseitigt, da von der Hemmung solcher T-Zellen erwartet würde, daß die Stärke der Autoimmunantwort verringert wird.
3. OvIFNτ hemmt die Superantigen-Reaktivierung von EAE
Es kann oft beobachtet werden, daß die Symptomatik von MS in einer rezidivierenden-remittierenden Art und Weise auftritt. Diese Form von MS besteht aus dem Auftreten der klinischen Symptome von MS, gefolgt von Perioden einer vorübergehenden Besserung. Wie Rückfälle und Verschlimmerungen eintreten und was die Reaktivierung einer Autoimmunerkrankung verursacht, ist ein Thema vieler Spekulationen gewesen. Es ist vorgeschlagen worden, daß Umwelteinflüsse zu Verschlimmerungen einer Autoimmunerkrankung beitragen können oder sogar dafür verantwortlich sind. Solche Einflüsse schließen möglicher weise infektiöse Krankheitserreger sowie Faktoren mit einer immunstimulatorischen Aktivität ein. Eine Klasse von Proteinen, die in unserer Umgebung allgegenwärtig sind, sind die mikrobiellen Superantigene.
Mikrobielle Superantigene sind Toxine, die durch eine Vielzahl von Bakterien, Viren und anderen Organismen wie Mycoplasma produziert werden und die eine äußerst wirksame immunstimulatorische Aktivität besitzen (Langford et al., 1978; Carlsson und Sjogren, 1985; und Johnson und Magazine, 1988). Sie sind für eine Reihe von Krankheiten einschließlich Lebensmittelvergiftung und Toxinschocksyndrom verantwortlich (Bergdoll et al., 1981). Eine solche starke Immunstimulation durch Superantigene basiert auf ihrer Fähigkeit, Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse II-Moleküle einzuschalten und dann als ein binärer Komplex an den T-Zell-Rezeptor in einer für die variable Region der β-Kette (Vβ) spezifischen An und Weise zu binden (Johnson et al., 1991; Janeway et al., 1989; White et al., 1989; Carlsson et al., 1988; und Fleischer und Schrezenmeier, 1988). Diese Bindung löst eine T-Zell-Aktivierung aus, was die Proliferation von soviel wie 20% eines T-Zell-Vorrats zur Folge hat (Johnson et al., 1991).
Die Superantigen induzierte T-Zell-Proliferation ist von einem hohen Ausmaß an Cytokinproduktion einschließlich von Interleukin-2 (IL-2), IFNγ und Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) begleitet. Von den Cytokinen, deren Produktion durch die Superantigen-Stimulation induziert wird, sind IFNγ und TNFα mit der Vermittlung einer Autoimmunpathogenese in Zusammenhang gebracht worden. Für IFNγ ist gezeigt worden, daß es Verschlimmerungen von MS in klinischen Prüfungen verursacht (Panitch et al., 1987a; Panitch et al., 1987b). Es ist gezeigt worden, daß die Produktion von TNFα eine Voraussetzung für die Encephalitis auslösende Wirkung bestimmter T-Zelllinien ist, die zur adoptiven Übertragung von EAE verwendet werden (Powell et al., 1990) sowie den Tod von Myelin produzierenden Oligodendrocyten in vitro verursachen (Selmaj und Raine, 1988).
Zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente zeigten, daß die durch das Staphylococcus-Enterotoxin B (SEB) induzierte Cytokinproduktion durch IFNτ auch verändert wird. Milzzellen aus mit MBP immunisierten Mäusen wurden mit SEB in vitro in Anwesenheit oder Abwesenheit von IFNτ stimuliert, und die Überstände wurden auf eine TNFα- und IFNγ-Produktion untersucht. Die Zugabe von IFNτ zu mit SEB stimulierten Kulturen verringerte die Produktion von sowohl TNFα als auch IFNγ signifikant. Im Hinblick auf das Vorstehende stehen diese Ergebnisse im Einklang mit der Fähigkeit von IFNτ, die Schwere von EAE zu vermindern, und legen nahe, daß IFNτ Verschlimmerungen von MS vermindern kann.
Eine als ein klinischer Rückfall von EAE festgestellte Verschlimmerung wurde zuerst durch die Verabreichung eines mikrobiellen Superantigens gezeigt. In dem PL/J-Stamm klingen akute Schübe von EAE üblicherweise ab, und es ist gezeigt worden, daß keine klinischen Rückfälle auftreten (Fritz et al., 1983). Nach dem Abklingen aller klinischen Symptome einer durch die Immunisierung mit MBP induzierten EAE wurde für die Verabreichung von entweder den Staphylococcus aureus-Enterotoxin (SE)-Superantigenen, SEB oder Staphylococcus-Enterotoxin A (SEA) gezeigt, daß sie die Reaktivierung der Erkrankung bewirken (Schiffenbauer et al., 1993). Mehrere Schübe einer Krankheitsverschlimmerung über einen Zeitraum von vier Monaten wurden auch nachgewiesen, bei denen die EAE reaktiviert werden konnte und aufgrund mehrerer Injektionen von SEB abklang (Schiffenbauer et al., 1993). Es ist ebenfalls gezeigt worden, daß die Reaktivierung von EAE durch SEB in anderen anfälligen Stämmen einschließlich NZW auftritt. SEB kann die Erkrankung auch reaktivieren, wenn ein acetyliertes, aminoterminales Peptid von MBP als Immunogen verwendet wird (Brocke et al., 1993).
Zusätzlich zur Reaktivierung von EAE kann SEB auch eine EAE verhindern, wenn es vor der Immunisierung mit MBP verabreicht wird (Soos et al., 1993; und Kalman et al., 1993). Die Anergie und/oder der Verlust der Vβ8⁺-T-Zell-Untergruppe, die für die anfängliche Induktion von EAE verantwortlich ist, scheint der Mechanismus für diesen Schutz zu sein. Das zielgerechte Angehen einer Vβ-spezifischen T-Zell-Population sieht jedoch keinen absoluten Schutz vor der Entwicklung von EAE vor. Wenn Mäuse, die durch eine SEB-Vorbehandlung vor der Entwicklung von EAE geschützt sind, SEA (das eine andere Vβ-T-Zell-Spezifität als SEB aufweist) ausgesetzt werden, erfolgt eine Induktion von EAE. Diese SEA-induzierte EAE ist durch eine schwere Lähmung und ein beschleunigtes Ausbrechen von klinischen Symptomen gekennzeichnet. Folglich bringen die Wirkungen von mikrobiellen Superantigenen eine sehr große Komplexität in Modelle einer Autoimmunerkrankung wie EAE ein, ähnlich der Komplexität der bei MS beobachteten Krankheitsentwicklung.
Die Wirkung einer OvIFNτ-Behandlung auf durch ein Superantigen induzierte Verschlimmerungen einer EAE wird in Beispiel 4 bei NZW-Mäusen beurteilt. Die Untersuchungen sind auch mit PL/J-Mäusen durchgeführt worden. Die Behandlung mit OvIFNτ bei einer Verabreichung in 3 Dosen von 10⁵ E (48 Stunden vor der SEB-Injektion, am Tag der SEB-Injektion und 48 Stunden nach der SEB-Injektion) blockierte die EAE-Reaktivierung durch das Superantigen. Im Vergleich dazu zeigten unbehandelte Kontrollgruppen eine Superantigen-Reaktivierung von EAE, die im Einklang mit vorhergehenden Studien steht (Schiffenbauer et al., 1993).
Die Beobachtung, daß OvIFNτ Superantigen-induzierte Verschlimmerungen von EAE blockieren kann, kann eine Folgeerscheinung der Verringerung der Krankheitsverschlimmerungen bei MS-Patienten sein, die einer Behandlung mit IFNβ1b unterzogen wurden. Eine Zusammenfassung der Studien, die zeigen, daß OvIFNτ die Entwicklung und Superantigen-Reaktivierung von EAE verhindern kann, ist in Tabelle 5 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß IFNτ auch die Wirkungen von Umweltfaktoren auf den Verlauf einer Autoimmunerkrankung wie MS verändern kann.
Weitere zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente haben ferner gezeigt, daß eine zweite Immunisierung mit MBP die EAE nicht reaktivieren kann und daß eine Injektion von Superantigenen einen ersten Schub einer klinischen Erkrankung in PL/J-Mäusen induzieren kann, die mit MBP immunisiert worden waren, aber keine EAE entwickelten. Die Experimente zeigen ferner, daß diese Induktion durch die Behandlung mit IFNτ blockiert werden kann und daß IFNτ Superantigen induzierte Verschlimmerungen von EAE blockieren kann, ähnlich den verringerten Verschlimmerungen der Erkrankung, die in mit IFNβ1b behandelten MS-Patienten beobachtet wurden.
4. IFNτ hemmt die Vβ-spezifische T-Zell-Aktivierung
Die Wirkung einer IFNτ-Behandlung einer SEB-induzierten Vermehrung von Vβ-spezifischen T-Zellen in vitro wurde beurteilt, wie in Beispiel 5 beschrieben ist. Die FACS-Analyse Vβ-spezifischer T-Zellen wurde mit NZW-Mäusen durchgeführt, die keine Behandlung (naive Mäuse), eine SEB-Injektion oder eine Injektion mit IFNτ und SEB erhielten. Die Analysen wurden 72 Stunden nach den Injektionen durchgeführt.
Die Ergebnisse beispielhafter Experimente sind in 5 gezeigt. Nicht ausgefüllte Balken stellen naive Tiere dar; ausgefüllte Balken stellen Tiere mit einer SEB-Injektion dar; und schraffierte Balken stellen Tiere mit einer Injektion von IFNτ und SEB dar. Naive NZW-Mäuse wiesen 5,1 ± 0,1% Vβ8⁺CD4⁺-T-Zellen auf, die sich nach der Injektion von SEB auf 10,2 ± 0,2% vermehrten. Wenn der SEB-Injektion eine IFNτ-Injektion vorherging, wurde die Vermehrung der Vβ8⁺CD4⁺-T-Untergruppe auf 7,6 ± 0,2% begrenzt. Eine teilweise Hem mung von Vβ7⁺- und Vβ11⁺-T-Zellen, für die SEB auch spezifisch ist, wurde ebenfalls beobachtet.
Diese Daten zeigen, daß die Behandlung mit IFNτ die SEB-induzierte Vermehrung von Vβ-T-Zellen in vivo zum Teil hemmen kann, und sie stützen ferner die Beobachtung, daß IFNτ die Schwere einer MBP-induzierten EAE vermindert.
B. Andere Modelle einer Autoimmunerkrankung
Zusätzlich zu EAE können andere Tiermodelle einer Autoimmunerkrankung verwendet werden, um die therapeutischen Wirkungen von IFNτ zu beurteilen. Zum Beispiel sind bestimmte Mäusestämme besonders anfällig für murinen systemischen Lupus erythematodes, eine Erkrankung, die dem systemischen Lupus erythematodes bei Menschen entspricht. Insbesondere zeigt die MRL-lpr/lpr-Lupus-Maus (Singer et al., 1986) viele derselben immunologischen Merkmale von menschlichem systemischem Lupus erythematodes. Die Tiere weisen eine Vergrößerung lymphatischer Organe und eine erhöhte T-Zell-Proliferation auf, wobei die Vβ-Genexpression zugunsten von V_β8.2/8.3-Genen signifikant verschoben ist.
MRL-lpr/lpr-Mäuse können vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten werden. Der Ausbruch einer Erkrankung in den MRL-lpr/lpr-Mäusen ist spontan (in einem Alter von etwa 3 Monaten), so daß die Erkrankung nicht wie im Fall von EAE induziert werden muß. Um die Wirkungen von IFNτ auf das Fortschreiten der Erkrankung zu beurteilen, werden die Tiere mit Injektionen von IFNτ (z. B. wie vorstehend beschrieben) in ausgewählten Intervallen (z. B. einmal alle zwei Wochen) beginnend in einem ausgewählten Alter (z. B. 6 Wochen alt) für eine ausgewählte Dauer (z. B. bis zu einem Alter von 6 Monaten) behandelt.
Die Wirkungen der Therapie können auf mehrere Arten beurteilt werden. Zum Beispiel kann die relative Anzahl von Vβ8⁺-Zellen in der Milz und den Lymphknoten von behandelten und unbehandelten Gruppen von Tieren unter Verwendung der FACS-Analyse bestimmt werden, wie vorstehend beschrieben ist. Eine wirksame Dosis von IFNτ resultiert in einer signifikanten Verringerung der Anzahl an Vβ8⁺-T-Zellen. Ferner können die physischen Symptome der Erkrankung (lymphatische Hyperplasie, Nekrose des Ohrs, Haarausfall) quantitativ bestimmt (Kim et al., 1991) und zwischen behandelten und unbehandelten Gruppen verglichen werden. Die Tiere können auch auf die Verringerung von dsDNA-spezifischen Antikörpern und/oder die Verringerung einer Nierenentzündung mit Proteinurie, wie zum Beispiel bei Kim et al. beschrieben ist, nach der Behandlung mit IFNτ getestet werden.
Ein anderes Tiermodell für eine Autoimmunerkrankung, das zur Beurteilung der therapeutischen Wirkungen von IFNτ verwendet werden kann, ist eine Adjuvans induzierte Arthritis bei Hunden (Kaplan et al., 1993).
V. Wirksamkeit von oral verabreichtem IFNτ
Zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente zeigen, daß oral verabreichte IFNτ-Polypeptidzusammensetzungen bezüglich der Wirksamkeit mit injizierten IFNτ-Zusammensetzungen im Hinblick auf die Behandlung von Erkrankungen oder Erkrankungszuständen, die von einer Behandlung mit IFNτ profitieren, wie Autoimmunerkrankungen (z. B. multiple Sklerose), vergleichbar sind.
Wie nachstehend besprochen, war oral verabreichtes IFNτ nicht nur bei der Behandlung einer Erkrankung, die von einer IFNτ-Behandlung profitiert (EAE), wirksam, sondern die orale Verabreichungsweise ergab unerwartete Vorteile im Verhältnis zur Behandlung mit injizierten IFNτ-Zusammensetzungen. Zum Beispiel hatte oral verabreichtes IFNτ einen erheblich geringeren Spiegel von anti-IFNτ-Antikörpern im Serum von behandelten Individuen zur Folge (vgl. Beispiel 12). Dies ist vorteilhaft, da es daher weniger wahrscheinlich ist, daß das oral verabreichte IFNτ durch eine Immunantwort des Wirts unwirksam gemacht wird (d. h. die Desensibilisierung auf die Behandlung und/oder die Dosismenge wird erheblich verringert), und es ist weniger wahrscheinlich, daß das Individuum, das die Behandlung erhält, als Ergebnis einer solchen Immunantwort an unerwünschten Nebenwirkungen leidet.
Ergebnisse von Experimenten, die diese und verwandte Befunde veranschaulichen, werden nachstehend vorgestellt.
A. Oral verabreichtes IFNτ hemmt die Entwicklung von EAE
Bei in Beispiel 6 ausführlich beschriebenen Experimenten wurde oral verabreichtes und injiziertes IFNτ auf seine Fähigkeit getestet, die Induktion von EAE zu verhindern. EAE wurde in New Zealand White (NZW)-Mäusen durch Immunisierung mit denn basischen Myelinprotein (bMBP) des Rindes induziert. Empfänger-NZW-Mäuse erhielten OvIFNτ durch entweder ip-Injektion oder orale Fütterung 48 Stunden vor der, am Tag der und 48 Stunden nach der Immunisierung mit dem basischen Myelinprotein (bMBP) des Rindes zur Induktion einer experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE).
Sowohl die orale Fütterung als auch die ip-Injektion von OvIFNτ schützte vor EAE (Beispiel 6, Tabelle 6). Alle Tiere, die IFNτ mittels einer ip-Injektion erhielten, und 7 von 9 Tieren, die IFNτ oral erhielten, waren vor Symptomen einer EAE geschützt. Außerdem war der monoclonale anti-OvIFNτ-Antikörper HL127 in der teilweisen Neutralisierung der Fähigkeit des OvIFNτ, eine EAE zu blockieren, wirksam. Diese Experimente zeigen, daß oral verabreichtes IFNτ bei der Behandlung von Symptomen von EAE, ein Tiermodell für multiple Sklerose, wirksam ist.
B. OvIFNτ ist nach oraler Verabreichung in Seren vorhanden
Um zu bestätigen, daß oral verabreichtes IFNτ in den Blutkreislauf eintritt, wurden die Seren von Mäusen, die IFNτ durch ip-Injektion oder durch orale Verabreichung erhielten, unter Verwendung eines Tests auf eine cytophatische Wirkung (antiviral) (Familetti et al., 1981) auf die Anwesenheit von IFNτ getestet, wie in Beispiel 7 beschrieben ist.
Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Spezifische Aktivitäten sind in antiviralen Einheiten/mg Protein ausgedrückt, die aus antiviralen Tests unter Verwendung von MDBK-Zellen erhalten wurden. OvIFNτ wurde während bis zu zwei Stunden nach der oralen Fütterung (ausgefüllte Balken) in Spiegeln von 200 E/ml nachgewiesen. Diese Daten zeigen, daß oral verabreichtes IFNτ in den Blutkreislauf eintritt und im Serum für etwa zwei Stunden nach der Verabreichung verbleibt.
C. OvIFNτ schützt vor einem chronischen Rückfall von EAE
Zusätzlich zur Verhinderung des Ausbruchs von mit EAE assoziierten Symptomen verhindert oral verabreichtes OvIFNτ eine Lähmung in einem chronisch rezidivierenden Modell von EAE, wie in Beispiel 8 ausführlich beschrieben ist. Während 5/5 mit MBP immunisierten (um eine EAE zu induzieren) Mäusen, die keine OvIFNτ-Behandlung erhielten, eine chronisch rezidivierende Lähmung entwickelten, waren 4/5 Tieren, die mit OvIFNτ behandelt wurden (entweder ip-Injektion oder orale Fütterung, verabreicht alle 48 Stunden) vor der Erkrankung völlig geschützt (7B und 7C). Diese Daten bestätigen die vorstehend beschriebenen Ergebnisse weiter und zeigen, daß die orale Verabreichung von IFNτ die Entwicklung einer chronisch rezidivierenden EAE blockieren kann. Die Experimente legen auch nahe, daß die seltene orale Verabreichung von IFNτ wie einmal alle 48 Stunden über einen längeren Zeitraum bei der Behandlung eines Erkrankungszustands, der auf eine Behandlung mit Interferon-tau anspricht, so wirksam wie eine ip-Injektion ist.
D. Histologische Analysen des Rückenmarks aus EAE-Mäusen nach oraler Verabreichung von IFNτ
Die Fähigkeit von OvIFNτ, vor EAE zu schützen, wurde auch durch die Analyse der Wirkung einer OvIFNτ-Behandlung auf zelluläre Folgen der Erkrankung, die sich im Zentralnervensystem (ZNS) als lymphocytäre Läsionen in der weißen Rückenmarkssubstanz manifestieren, untersucht. Die Läsionen weisen auf das Ausmaß der Lymphocyteninfiltration in das ZNS hin. Mit MBP immunisierte Mäuse wurden entweder nicht behandelt (Kontrolle) oder mit OvIFNτ auf oralem oder ip-Weg behandelt, und Schnitte des Rückenmarks im Lendenbereich wurden gefärbt und auf Lymphocyten untersucht, wie in Beispiel 9 beschrieben ist. Lymphocytäre Läsionen waren in der weißen Rückenmarkssubstanz von Kontrolltieren (8A), aber nicht in mit OvIFNτ durch ip-Injektion (8B) oder orale Fütterung (8C) behandelten Tieren vorhanden. Diese Daten zeigen, daß die Schutzwirkung von IFNτ mit der Hemmung der Lymphocyteninfiltration des ZNS verbunden ist. Die Daten zeigen ferner, daß die IFNτ-Behandlung die zelluläre Manifestation der Autoimmunerkrankung hemmt, anstatt einfach die Symptome zu maskieren.
E. Die Einstellung der Behandlung mit OvIFNτ hat eine rezidivierende Lähmung zur Folge Die in Beispiel 11 ausführlich beschriebenen Experimente wurden durchgeführt, um die Art und Dauer der Behandlung zu bestimmen, die in der Verhinderung von EAE in Mäusen, denen MBP injiziert wurde, wirksam ist. Die Mäuse waren vor EAE durch eine OvIFNτ-Behandlung mittels ip-Injektion oder orale Fütterung (alle 48 Stunden) geschützt, solange die Behandlung fortdauerte (58 Tage in Beispiel 11), aber entwickelten Symptome der Erkrankung, nachdem die OvIFNτ-Behandlung eingestellt wurde (10). Diese Ergebnisse legen nahe, daß obwohl IFNτ einen Autoimmunzustand wie EAE (z. B. MS) nicht heilen kann, es eine wirksame Behandlung ist, welche die pathologischen Manifestationen des Zustands hemmt, solange die Behandlung fortgesetzt wird.
F. Die orale Verabreichung von OvIFNτ vermindert die anti-OvIFNτ-Antikörper-Antwort
Wie in Beispiel 12 ausführlich beschrieben ist, ist ein Vorteil einer oral verabreichten (im Gegensatz zu einer injizierten) IFNτ-Behandlung die Verringerung des anti-IFNτ-Antikörpertiters in Individuen, welche die orale Behandlung erhalten. Nach Einstellung der OvIFNτ-Behandlung wurde Mäuse aus jeder Behandlungsgruppe Blut abgenommen, und die Seren wurden in einem ELISA auf die Anwesenheit von anti-OvIFNτ-Antikörpern untersucht. Während Mäuse, die IFNτ mittels ip-Injektion erhielten, erhöhte anti-IFNτ-Antikörperspiegel zeigten, zeigten Tiere, die IFNτ mittels oraler Fütterung erhielten, viel geringere anti-IFNτ-Antikörpertiter (typischerweise um das 3- bis 5fache geringer). Wie erwartet, zeigten Mäuse, die keine OvIFNr-Behandlung erhielten, keine anti-OvIFNτ-Antikörper.
Die Seren wurden auch auf ihre Fähigkeit untersucht, die antivirale Aktivität von OvIFNτ auf die MDBK-Zelllinie zu neutralisieren. Keines der Seren von Mäusen mit entweder ip-Injektion oder oraler Fütterung wies eine neutralisierende Aktivität auf (Tabelle 7). Diese Ergebnisse legen nahe, daß die orale Fütterung von OvIFNτ eine gegen das OvIFNτ-Protein gerichtete Antikörperantwort größtenteils umgeht. Eine solche verminderte Antikörperantwort in oral behandelten Individuen verringert die Wahrscheinlichkeit von unerwünschten Nebenwirkungen einer IFNτ-Behandlung, die mit dem Immunsystem in Beziehung stehen.
VI. Anwendungen
A. IFNτ als eine Behandlung für Erkrankungen des Immunsystems
Erkrankungen, die unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden können, schließen autoimmune, entzündliche, proliferative und hyperproliferative Erkrankungen sowie kutane Manifestationen immunologisch vermittelter Erkrankungen ein. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung von Zuständen vorteilhaft, die mit einer Überempfindlichkeit des Immunsystems in Beziehung stehen. Es gibt vier Typen einer Überempfindlichkeit des Immunsystems (Clayman). Die Typ I- oder sofortige/anaphylaktische Überempfindlichkeit ist auf die Degranulierung von Mastzellen als Antwort auf ein Allergen (z. B. Pollen) zurückzuführen und schließt Asthma, allergische Rhinitis (Heuschnupfen), Nesselsucht (Quaddeln), anaphylaktischen Schock und andere Erkrankungen allergischer Natur ein. Die Typ II- oder autoimmune Überempfindlichkeit ist auf Antikörper zurückzuführen, die gegen erkannte "Antigene" auf den körpereigenen Zellen gerichtet sind. Die Typ III-Überempfindlichkeit ist auf die Bildung von Antigen/Antikörper-Immunkomplexen zurückzuführen, die sich in verschiedenen Geweben ansiedeln und weitere Immunantworten aktivieren, und ist für Zustände wie Serumkrankheit, allergische Alveolitis und die großen Schwellungen, die sich zuweilen nach Auffrischungsimpfungen bilden, verantwortlich. Die Typ IV-Überempfindlichkeit ist auf die Freisetzung von Lymphokinen aus sensibilisierten T-Zellen zurückzuführen, die zu einer entzündlichen Reaktion führt. Beispiele schließen Kontaktdermatitis, den Ausschlag von Masern und "allergische" Reaktionen auf bestimmte Arzneistoffe ein.
Die Mechanismen, durch die bestimmte Bedingungen zu einer Überempfindlichkeit in einigen Individuen führen können, sind im allgemeinen nicht hinreichend verstanden, aber können sowohl genetische als auch exogene Faktoren einschließen. Zum Beispiel können Bakterien, Viren oder Arzneistoffe eine Rolle beim Auslösen einer Autoimmunantwort in einem Individuum spielen, das bereits eine genetische Veranlagung für die Autoimmunerkrankung hat. Es ist vorgeschlagen worden, daß die Häufigkeit einiger Überempfindlichkeitstypen mit anderen korrelieren kann. Zum Beispiel ist vorgeschlagen worden, daß Individuen mit bestimmten häufigen Allergien für Autoimmunerkrankungen anfälliger sind.
Autoimmunerkrankungen können grob in solche, die vorwiegend auf bestimmte Organe oder Gewebe begrenzt sind, und solche, die den gesamten Körper beeinträchtigen, eingeteilt werden. Beispiele organspezifischer Erkrankungen (wobei das Organ betroffen ist) schließen multiple Sklerose (Myelinumhüllung bei Nervenfortsätzen), Typ I-Diabetes mellitus (Bauchspeicheldrüse), Hashimoto-Thyreoiditis (Schilddrüse), perniziöse Anämie (Magen), Addison'-Krankheit (Nebenniere), Myasthenia gravis (Acetylcholin-Rezeptoren an neuromuskulären Verbindungen), rheumatoide Arthritis (Gelenküberzug), Uveitis (Auge), Schuppenflechte (Haut), Guillain-Barre-Syndrom (Nervenzellen) und Graves-Krankheit (Schilddrüse) ein. Systemische Autoimmunerkrankungen schließen systemischen Lupus erythematodes und Dermatomyositis ein.
Andere Beispiele für Überempfindlichkeitserkrankungen schließen Asthma, Ekzem, atopische Dermatitis, Kontaktdermatitis, andere ekzematöse Dermatitiserkrankungen, Seborrhoe, Rhinitis, Lichen planus, Pemplugus, bullöses Pemphigoid, Epidermolysis bullosa Nesselsucht, angioneurotisches Ödem, Gefäßentzündungen, Erytheme, Hauteosinophilämien, Alopecia areata, Atherosklerose, primäre biliäre Zirrhose und nephrotisches Syndrom ein. Damit verbundene Erkrankungen schließen Darmentzündungen wie Zöliakie, Proktitis, eosinophile Gastroenteritis, Mastozytose, entzündliche Darmerkrankung, Crohn'-Krankheit und ulzerative Kolitis sowie mit Nahrungsmitteln in Beziehung stehende Allergien ein.
Autoimmunerkrankungen, die für eine Behandlung unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren besonders zugänglich sind, schließen multiple Sklerose, Typ I (insulinabhängiger)-Diabetes mellitus, Lupus erythematodes, amyotrophe Lateralsklerose, Crohn-Krankheit, rheumatoide Arthritis, Stomatitis, Asthma, Uveitis, Allergien und Schuppenflechte ein.
IFNτ enthaltende Medikamente können verwendet werden, um Symptome von Autoimmunerkrankungen wie die vorstehend besprochenen therapeutisch zu behandeln und auf diese Weise zu lindern. Behandlungen mit solchen Medikamenten sind hier im Hinblick auf die Behandlung von EAE, einem Tiermodell für multiple Sklerose, veranschaulicht.
B. IFNτ als eine Behandlung für Fortpflanzungsstörungen
Obwohl IFNτ basierend auf der Struktur und seinen wirksamen antiviralen Eigenschaften eine gewisse Ähnlichkeit mit der IFNα-Familie aufweist, besitzen die IFNαs nicht die mit IFNτ assoziierten reproduktiven Eigenschaften. Zum Beispiel hatte rekombinantes menschliches IFNα im Vergleich zu IFNτ keine Wirkung auf das Interöstralintervall, auch wenn die zweifache Dosis verabreicht wurde (Davis et al., 1992).
Folglich, obwohl IFNτ einige strukturelle Ähnlichkeiten mit anderen Interferonen aufweist, weist es selbst sehr verschiedene Eigenschaften: zum Beispiel die Fähigkeit, die biochemischen Ereignisse des Östralzyklus signifikant zu beeinflussen.
Die erfindungsgemäßen IFNτ-Zusammensetzungen können bei Verfahren zur Erhöhung der Fruchtbarkeit und Verlängerung der Lebensdauer des Gelbkörpers in weiblichen Säugern verwendet werden, wie allgemein bei Hansen et al. (1991) beschrieben ist. Gemäß der Lehre davon schließen solche Verfahren zur Erhöhung der Fruchtbarkeit die orale Verabreichung eines IFNτ enthaltenden Medikaments in einer therapeutisch oder pharmazeutisch wirksamen Menge ein. Ferner können die Zusammensetzungen in ähnlicher Weise verwendet werden, um das Wachstum und die Entwicklung von uterinen und/oder fötal-plazentalen Geweben zu regulieren. Menschliches IFNτ enthaltende Zusammensetzungen sind zur Behandlung von Menschen besonders nützlich, da mögliche Antigenreaktionen unter Verwendung eines Proteins der gleichen Art weniger wahrscheinlich sind.
C. IFNτ als eine antivirale Behandlung
Die antivirale Aktivität von IFNτ findet breite therapeutische Anwendungen ohne die toxischen Wirkungen, die üblicherweise mit IFNαs assoziiert sind. Wie vorstehend beschrieben, übt IFNτ seine therapeutische Aktivität ohne unerwünschte Wirkungen auf die Zellen aus. Das relative Fehlen einer Cytotoxizität von IFNτ macht es als ein in vivo-Therapeutikum äußerst wertvoll und unterscheidet IFNτ von den meisten anderen bekannten antiviralen Mitteln und allen anderen bekannten Interferonen.
IFNτ enthaltende Formulierungen oder Medikamente können oral verabreicht werden, um die Virusreplikation zu hemmen. Ferner können die Zusammensetzungen bei Verfahren zur Beeinflussung der immunologischen Beziehung zwischen Fötus und Mutter, zum Beispiel bei der Verhinderung der Übertragung von mütterlichen Viren (z. B. HIV) auf den sich entwickelnden Fötus, verwendet werden. Eine menschliches Interferon-τ enthaltende Zusammensetzungen sind zur Behandlung von Menschen besonders nützlich, da mögliche Antigenreaktionen unter Verwendung eines homologen Proteins weniger wahrscheinlich sind.
Beispiele spezifischer Viruserkrankungen, die mit oral verabreichtem IFNτ behandelt werden können, schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Nicht-A-Nicht-B-Nicht-C-Hepatitis, Epstein-Barr-Virus-Infektion, HIV-Infektion, Herpes-Virus (EB, CML, Herpes simplex), Papillomavirus, Pockenvirus, Picornavirus, Adenovirus, Rhinovirus, HTLV I, HTLV II und menschliches Rotavirus ein.
D. IFNτ als eine antiproliferative Behandlung
IFNτ zeigt eine wirksame antizelluläre Proliferationsaktivität. Demgemäß können IFNτ enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen oder Medikamente, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, ohne die mit anderen Interferonen assoziierten negativen Nebenwirkungen, die gegenwärtig bekannt sind, verwendet werden, um das Zellwachstum zu hemmen. Solche Zusammensetzungen oder Formulierungen können auch verwendet werden, um das Tumorwachstum zu hemmen, zu verhindern oder zu verlangsamen.
Beispiele spezifischer Zellproliferationsstörungen, die mit oral verabreichtem IFNτ behandelt werden können, schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Haarzellenleukämie, Kaposi-Sarkom, chronische myeloische Leukämie, multiples Myelom, oberflächliches Blasenkarzinom, Hautkrebs (Basalzellkarzinom und malignes Melanom), Nierenzellkarzinom, Eierstockkrebs, geringgradiges lymphocytisches und kutanes T-Zell-Lymphom und Gliom ein.
Außerdem wird die Entwicklung bestimmter Tumore durch Östrogen vermittelt. Zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente zeigen, daß IFNτ die Anzahl der Östrogenrezeptoren supprimieren kann. Daher können die IFNτ enthaltenden Zusammensetzungen bei der Behandlung oder Verhinderung von Östrogen-abhängigen Tumoren besonders nützlich sein.
E. Veterinäre Anwendungen
Zusätzlich zu den vorstehend ausführlich beschriebenen Anwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren ist erkennbar, daß die Verfahren bei der Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen des Immunsystems, an denen Haus- und Wildtiere leiden, angewendet werden können. Zum Beispiel resultiert Hypothyroidismus bei Hunden typischerweise aus einer fortschreitenden Zerstörung der Schilddrüse, die mit einer lymphocytären Thyreoiditis verbunden sein kann (Kemppainen und Klark, 1994). Man nimmt an, daß lymphocytäre Thyreoiditis, die der Hashimoto-Thyreoiditis bei Menschen ähnlich ist, eine Autoimmunerkrankung ist. Gemäß der hier dargebotenen Anleitung Information kann Hypothyroidismus infolge einer lymphocytären Thyreoiditis bei Hunden, wie vorstehend beschrieben, mit IFNτ enthaltenden Medikamenten behandelt werden.
Ein anderer Typ einer Autoimmunerkrankung bei Hunden, die durch die Behandlung mit IFNτ gelindert werden kann, ist durch eine anti-Kern-Antikörper (ANA)-Positivität, Fieber und eine seronegative Arthritis gekennzeichnet (Day et al., 1985). Immunologisch vermittelte Thrombocytopenie (ITP; Kristensen et al., 1994; Werner et al., 1985), systemischer Lupus erythematodes (Kristensen et al., 1994) und Leukopenie sowie im Coombs-Test hämolytische Anämie (Werner et al., 1985) können auch für eine Behandlung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zugänglich sein.
VII. Verabreichung von IFNτ
A. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Therapeutische Zubereitungen oder Medikamente, enthaltend IFNτ oder verwandte Polypeptide oder Proteine, können gemäß bekannten Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch nützlichen Zusammensetzungen (Medikamenten) formuliert und hergestellt werden.
Interferone oder Interferon-ähnliche Verbindungen umfassende Formulierungen sind bereits beschrieben worden (z. B. Martin, 1976). Im allgemeinen werden die IFNτ enthaltenden Medikamente formuliert, so daß eine wirksame Menge des IFNτ mit einem geeigneten Träger und/oder Excipienten kombiniert wird, um die wirksame Verabreichung der Zusammensetzung zu ermöglichen. IFNτ oder verwandte Polypeptide können an einen Patienten in einer beliebigen pharmazeutisch verträglichen Dosierungsform einschließlich intravenöser, intramuskulärer, intraläsionaler oder subkutaner Injektion verabreicht werden. Genauer können für andere Interferonverbindungen verwendete Zusammensetzungen und Verfahren für die Verabreichung dieser Verbindungen verwendet werden.
Im Fall von Zusammensetzungen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können IFNτ enthaltende Tabletten und Kapseln aus IFNτ (z. B. gefriergetrocknetes IFNτ-Protein) und gegebenenfalls Zusätzen wie pharmazeutisch verträgliche Träger (z. B. Lactose, Maisstärke, leichtes Kieselsäureanhydrid, mikrokristalline Cellulose, Saccharose), Bindemittel (z. B. Stärke in der alpha-Form, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon), Sprengmittel (z. B. Carboxymethylcellulose, Calcium, Stärke, gering substituierte Hydroxypropylcellulose), grenzflächenaktive Mittel (z. B. Tween 80, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymer), Antioxidationsmittel (z. B. L-Cystein, Natriumsulfat, Natriumascorbat), Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talkum) und ähnliche hergestellt werden.
Ferner können IFNτ-Polypeptide mit einem festen, pulverförmigen oder anderen Trägern, zum Beispiel Lactose, Saccharose, Sorbit, Mannit, Stärke wie Kartoffelstärke, Maisstärke, Millopektin, Cellulosederivat oder Gelatine vermischt werden und können auch Gleitmittel wie Magnesium- oder Calciumstearat oder Polyethylenglykolwachse, die für die Bildung von Tabletten verdichtet werden, einschließen. Durch die Verwendung mehrerer Schichten des Trägers oder Verdünnungsmittels können Tabletten hergestellt werden, die durch eine langsame Freisetzung wirksam sind.
Flüssige Zubereitungen zur oralen Verabreichung können in Form von Elixieren, Sirupen oder Suspensionen, zum Beispiel Lösungen, enthaltend etwa 0,1 bis etwa 30 Gew.-% IFNτ, Zucker und ein Gemisch aus Ethanol, Wasser, Glycerin, Propylen, Glykol und gegebenenfalls anderen Zusätzen herkömmlicher Weise, hergestellt werden.
B. Dosierung
Eine oral wirksame, pharmazeutische IFNτ-Zusammensetzung wird in einer therapeutisch wirksamen Menge an ein Individuum verabreicht, das eine Behandlung benötigt. Die Dosis kann sehr variieren und hängt von Faktoren wie der Schwere der Erkrankung, dem Alter und Gewicht des Patienten, anderen Medikamenten, die der Patient nehmen kann, und ähnlichem ab. Diese Menge oder Dosierung wird typischerweise durch den behandelnden Arzt festgelegt. Die Dosierung liegt typischerweise zwischen etwa 1 × 10⁵ und 1 × 10⁸ Einheiten/Tag, vorzugsweise zwischen etwa 1 × 10⁶ und 1 × 10⁷ Einheiten/Tag. Es ist erkennbar, daß IFNτ infolge seiner geringeren Toxizität in höheren Dosen als zum Beispiel IFNβ verabreicht werden kann. Zum Vergleich wurden Patienten mit multipler Sklerose (MS) mit 10⁶ E und 8 × 10⁶ E IFNβ behandelt. Patienten, die 8 × 10⁶ E erhielten, erlitten weniger Rückfälle der Erkrankung als Patienten, die 10⁶ E erhielten. Jedoch zeigten Patienten, welche die höhere Dosis von IFNβ (8 × 10⁶ E) erhielten, auch mehr Nebenwirkungen, die mit der Toxizität von IFNβ assoziiert sind (IFNβ Multiple Sclerosis Study Group). Im Hinblick auf die geringere Toxizität von IFNτ könnten diese stärker wirksamen Dosierungen ohne die damit verbundenen toxischen Nebenwirkungen verabreicht werden.
Erkrankungen, die einen ständig erhöhten IFNτ-Spiegel im Plasma erfordern, profitieren von einer oralen Verabreichung von so häufig wie etwa alle zwei bis vier Stunden oder einer Verabreichung mittels Injektion etwa alle 12–24 Stunden, während andere Erkrankungen wie MS durch die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis in weniger häufigen Intervallen, z. B. einmal alle 48 Stunden, wirksam behandelt werden können. Die Verabreichungsrate einzelner Dosen wird typischerweise durch den behandelnden Arzt eingestellt, um die Verabreichung der geringsten Gesamtdosis zu ermöglichen, während die Schwere der zu behandelnden Erkrankung gelindert wird.
Nachdem eine Besserung des Zustands des Patienten eingetreten ist, wird gegebenenfalls eine Erhaltungsdosis verabreicht. Später kann die Dosierung oder die Häufigkeit der Verabreichung oder beides als Funktion der Symptome auf einen Spiegel verringert werden, bei dem der verbesserte Zustand aufrechterhalten wird.
Die Haut betreffende Autoimmunerkrankungen wie Schuppenflechte können unter Verwendung von IFNτ intraläsional behandelt werden, wobei die Formulierung und Dosis von der Verabreichungsmethode und von der Größe und Schwere der zu behandelnden Läsion abhängen. Bevorzugte Methoden schließen die intradermale und subkutane Injektion ein.
Mehrere Injektionen in große Läsionen können möglich sein, und mehrere Läsionen auf der Haut eines einzigen Patienten können gleichzeitig behandelt werden. Das Verabreichungsschema kann durch einen Fachmann festgelegt werden. Für eine Langzeitwirkung entwickelte Formulierungen können die Häufigkeit der Verabreichung verringern.
Die lokale Behandlung mit den erfindungsgemäßen IFNτ-Polypeptiden ist zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen in bestimmten Organen nützlich. Die Behandlung kann durch intraarterielle Infusion oder intravenöse Injektion erreicht werden. Ein Katheder kann chirurgisch oder angiographisch implantiert werden, um die Behandlung auf das betroffene Organ zu lenken. Ein mit dem Katheder verbundener subkutaner Zugang kann zur anhaltenden Behandlung verwendet werden, oder eine implantierbare, wiederbefüllbare Pumpe kann auch verwendet werden.
Alternativ kann die Zusammensetzung durch direkte Injektion in das betroffene Gewebe verabreicht werden. Zur Behandlung von rheumatoider Arthritis kann die Zusammensetzung zum Beispiel durch direkte Injektion in das betroffene Gelenk verabreicht werden. Der Patient kann in wiederholten Intervallen von mindestens 24 Stunden über einen Zeitraum von mehreren Wochen nach dem Ausbruch von Symptomen der Erkrankung in dem Patienten behandelt werden.
Die systemische Behandlung ist für alle Anwendungen im wesentlichen äquivalent. Die systemische Behandlung unter Verwendung der oralen Verabreichung wird vorstehend besprochen. Mehrere intravenöse oder subkutane Dosen sind auch möglich, und im Fall von implantierbaren Methoden zur Behandlung sind Formulierungen, die für eine Langzeitwirkung entwickelt wurden, besonders nützlich. Patienten können auch unter Verwendung von implantierbaren, subkutanen Zugängen, Reservoiren oder Pumpen behandelt werden. Andere Verfahren zur Verabreichung schließen die Zäpfchen und intravaginale Behandlung ein. Zur Behandlung von systemischem Lupus erythematodes (SLE) oder MS kann die Zusammensetzung zum Beispiel durch orale oder parenterale Verabreichung wie iv-Verabreichung verabreicht werden.
C. Kombinationstherapien
Es ist natürlich selbstverständlich, daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren in Kombination mit anderen Therapien verwendet werden können. Zum Beispiel können MS-Patienten, die keine Besserung bei einer geringen Dosis von IFNβ1b zeigen oder IFNβ1b aufgrund der Toxizität nicht tolerieren können, im Hinblick auf die relativ fehlende Toxizität von IFNτ bei hohen Dosen von einer folgenden oder gleichzeitigen Behandlung mit höheren Dosierungen von IFNτ oder davon abgeleiteten Peptiden profitieren. In dieser Hinsicht kann IFNβ1b als ein "zweites Mittel zur Behandlung" in Betracht gezogen werden. Ferner ist die Entwicklung von neutralisierenden Antikörpern in mit IFNβ1b behandelten Patienten gezeigt worden (Weinstock-Guttman et al., 1995). In Fällen, wo es sich für solche neutralisierenden Antikörper herausstellt, daß sie die Wirksamkeit von IFNβ1b beeinträchtigen, kann IFNτ eine wichtige alternative Therapie sein, da es unwahrscheinlich ist, daß eine Antikörper-Kreuzreaktivität auftritt und daß IFNτ neutralisierende Antikörper erzeugt (vgl. Beispiel 12). Oral verabreichtes IFNτ ist in dieser Hinsicht besonders vorteilhaft, da es eine erheblich geringere anti-IFNτ-Antikörper-Antwort als injiziertes IFNτ hervorruft.
Eine erfindungsgemäß ermöglichte andere Art einer Kombinationstherapie ist die orale Verabreichung eines Antigens, gegen das eine Autoimmunantwort gerichtet ist, in Kombination mit IFNτ. Die orale Verabreichung eines solchen Antigens kann eine Tolerierung zur Folge haben, wodurch die Schwere der Autoimmunerkrankung vermindert wird (für einen Überblick vgl. z. B. Weiner et al., 1994). Man nimmt an, daß das IFNτ eine synergistische Wirkung bei der durch das Antigen induzierten Tolerierung hat, wodurch die Schwere der Autoimmunerkrankung gelindert wird. Zum Beispiel ist für MBP gezeigt worden, daß es EAE unterdrückt (Lider et al., 1989). Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren kann MBP in Kombination mit IFNτ verabreicht werden (als ein "zweites Mittel zur Behandlung"), um multiple Sklerose zu behandeln. Andere Beispiele schließen die Verabreichung von IFNτ mit Kollagen zur Behandlung von rheumatoider Arthritis und mit Polypeptiden des Acetylcholin-Rezeptors zur Behandlung von Mysthenia gravis ein.
Außerdem kann IFNτ mit bekannten immunsuppressiven Mitteln, z. B. Steroide, oral verabreicht werden, um Autoimmunerkrankungen wie multiple Sklerose zu behandeln. Die immunsuppressiven Mittel (betrachtet als "zweite Mittel zur Behandlung") können zusammen mit IFNτ synergistisch wirksam sein und eine wirksamere Behandlung ergeben, als mit einer äquivalenten Dosis von IFNτ oder dem immunsuppressiven Mittel allein erhalten werden könnte.
In ähnlicher Weise kann IFNτ bei einer Behandlung für eine Krebs- oder Viruserkrankung in Verbindung mit z. B. einer therapeutisch wirksamen Menge eines oder mehrerer chemotherapeutischer Mittel wie Busulfan, 5-Fluoruracil (5-FU), Zidovudin (AZT), Leuco vorin, Melphalan, Prednison, Cyclophosphamid, Dacarbazin, Cisplatin und Dipyridamol verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, aber sollen diese in keiner Weise begrenzen.
Material und Methoden
A. Puffer
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)
10 × Stammlösung, 1 Liter:
80 g NaCl
2 g KCl
11,5 g Na₂HPO₄-7H₂O
2 g KH₂PO₄
Arbeitslösung, pH 7,3:
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
4,3 mM Na₂HPO₄-7H₂O
1,4 mM KH₂PO₄
B. Allgemeines ELISA-Protokoll zum Nachweis von Antikörpern
Immulon II-Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen (PGC) wurden mit 5 μg/ml (100 μl pro Vertiefung) Antigen in 0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,5, beschichtet. Die Platten wurden mit Parafilm verschlossen und bei 4°C über Nacht gelagert.
Im Anschluß an die Inkubation wurden die Platten abgesaugt und mit 300 μl 10% NGS blockiert und bei 37°C für 1 h inkubiert. Die Platten wurden dann 5mal mit PBS-0,5% "Tween-20" gewaschen. Die Antiseren wurden in 0,1 M PBS, pH 7,2, verdünnt. Die gewünschte(n) Verdünnungen) der Antiseren (0,1 ml) wurde(n) zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann 5mal mit PBS-0,5% "Tween-20" gewaschen.
Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Ziege-anti-Mensch-Antiserum (Cappel, Durham, NC) wurde 1 : 5000 in PBS verdünnt. 0,1 ml dieser Lösung wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde 30 min bei 37°C inkubiert, dann 5mal mit PBS gewaschen.
Sigma-ABTS (Substrat) wurde unmittelbar vor Zugabe zu der Platte hergestellt. Das Reagens besteht aus 50 m 10,05 M Citronensäure, pH 4,2, 0,078 ml 30%ige Wasserstoffperoxidlösung und 15 mg ABTS. 0,1 ml des Substrats wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, dann 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 0,050 ml 5% SDS (Gew./Vol.) gestoppt. Die relative Absorption wird bei 410 nm bestimmt.
C. Herstellung von OvIFNτ
Ein synthetisches OvIFNτ-Gen wurde unter Anwendung von molekularen Standardverfahren (Ausubel et al., 1988) durch Ligierung von Oligonucleotiden, enthaltend zusammenhängende Teile einer DNA-Sequenz, welche die OvIFNτ-Aminosäuresequenz codiert (Imakawa et al., 1987), hergestellt. Die so erhaltene Sequenz, die das IFNτ-Polynucleotid codiert, überspannt die Positionen 16 bis 531: eine codierende Sequenz von 172 Aminosäuren.
Das synthetische Gen vollständiger Länge, das StuI/SstI-Fragment (540 bp), wurde in einen modifizierten pIN III omp-A-Expressionsvektor cloniert und in einen kompetenten SB221-Stamm von E. coli eingeschleust. Zur Expression des IFNτ-Proteins wurden die den Expressionsvektor tragenden Zellen in Ampicillin enthaltender L-Brühe bis zu einer OD (550 nm) von 0,1–1 gezüchtet, mit IPTG (Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid) für 3 Stunden induziert und durch Zentrifugation geerntet. Lösliches rekombinantes IFNτ wurde aus den Zellen durch Beschallen oder osmotische Fraktionierung freigesetzt.
Zur Expression in Hefe wurde das IFNτ-Gen unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR; Mullis, 1987; Mullis et al., 1987) mit PCR-Primern amplifiziert, die StuI- und SacI-Restriktionsstellen an den 5'- bzw. 3'-Enden enthielten. Die amplifizierten Fragmente wurden mit StuI und SacII gespalten und in die SacII- und SmaI-Stellen von "pBLUESCRIPT+(KS)" ligiert, wobei pBSY-IFNτ erzeugt wurde. Das Plasmid pBSY-IFNτ wurde mit SacII und EcoRV gespalten, und das das synthetische IFNτ-Gen enthaltende Fragment wurde isoliert. Der Hefe-Expressionsvektor pBS24Ub (Sabin et al., 1989; Ecker et al., 1989) wurde mit SaII gespalten. Unter Verwendung der T4-DNA-Polymerase wurden glatte Enden erzeugt. Die Vektor-DNA wurde mit Phenol extrahiert und ethanolgefällt (Sambrook et al., 1989). Das gewonnene Plasmid wurde mit SacII gespalten, durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit dem aus pBSY-IFNτ isolierten SacII-EcoRV-Fragment ligiert. Das so erhaltene rekombinante Plasmid wurde als pBS24Ub-IFNτ bezeichnet.
Das rekombinante Plasmid pBS24Ub-IFNτ wurde in E. coli transformiert. Die IFNτ-Insertion enthaltenden rekombinanten Clone wurden isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert. IFNτ codierende Sequenzen wurden aus pBS24Ub-IFNτ isoliert und in einen Pichia pastoris-Vektor, enthaltend den Alkoholoxidase (AOX1)-Promotor (Invitrogen, San Diego, CA), cloniert. Der Vektor wurde dann zur Transformation von Pichia pastoris GS115 His-Wirtszellen verwendet, und das Protein wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers exprimiert. Das Protein wurde in das Medium sezerniert und durch aufeinanderfolgende DEAE-Cellulose- und Hydroxyapatit-Chromatographie bis zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt, wie durch eine SDS-PAGE und Silberfärbund bestimmt wurde. Das gereinigte Protein wies eine spezifische Aktivität von etwa 0,29 bis etwa 0,44 × 10⁸ E/mg auf, wie durch die antivirale Aktivität bei Madin-Darby-Nieren (MDBK)-Zellen gemessen wurde.
Beispiel 1
Toxizität von IFNβ, IFNγ und IFNτ
A. In vivo-Toxizität – Zellzahlen und Gewichtsänderungen
Die Wirkungen einer in vivo-Behandlung mit IFNτ, IFNβ und IFNα (10⁵ E/Injektion) auf Leukocyten-Gesamtzahlen (WBCs), Lymphocyten-Gesamtzahlen und Gewichtsmessungen in NZW-Mäusen wurden wie folgt beurteilt: Interferone (OvIFNτ, MuIFNβ und MuIFNα wurden intraperitoneal (IP) in einer Konzentration von 10⁵ E in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml in PBS Gruppen von New Zealand White (NZW)-Mäusen (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) injiziert. Drei bis vier Tiere waren in jeder Gruppe eingeschlossen. Die Leukocyten (WBC)-Zahlen wurden vor der Injektion und zu ausgewählten Zeitpunkten danach (typischerweise 12 und 24 Stunden) unter Verwendung eines Hämocytometers und Standardtechniken bestimmt. Differentielle-WBC-Zählungen wurden mit Wright-Giemsa-gefärbten Blutausstrichen durchgeführt. Vor der Injektion lag das Gewicht der Tiere im Bereich von 20 bis 23 g. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Tabelle 3 In vivo-Toxizität von Interferonen, gemessen durch Leukocytenzahl und prozentuale Gewichtsänderung
Keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich WBC-Zahl, Lymphocytenzahl oder Gewichtsänderung wurden zwischen mit IFNτ behandelten und unbehandelten Mäusen beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten mit IFNβ behandelte Mäuse 12 Stunden nach der Injektion eine Depression der Lymphocytenzahl um 31,7%, die für mindestens die nächsten 12 Stunden anhielt. Mit IFNα behandelte Mäuse zeigten 12 Stunden nach der Injektion eine Depression der Lymphocytenzahl um 55,8% und einen signifikanten Gewichtsverlust. Diese Daten zeigen, daß IFNτ im Gegensatz zu IFNβ und IFNα keine Toxizität bei vivo in den vorstehenden Konzentrationen aufweist, wie durch Zählungen peripherer Blutzellen und Gewichtsmessungen bewiesen wurde.
B. In vitro-Toxizität – L929-Zelltest
Die Toxizität einer IFN-Behandlung wurde in vitro unter Verwendung der Maus-L929-Zelllinie gemessen. L929-Zellen wurden mit 6000 E/ml bis 200.000 E/ml von entweder OvIFNτ oder MuIFNβ behandelt. Die Interferone wurden zum Zeitpunkt Null zugegeben, und die Zellen wurden 72 Stunden inkubiert und mit Kristallviolett gefärbt. Der Prozentsatz der lebenden Zellen wurde durch Messen der Absorption bei 405 nm bestimmt.
Beispielhafte Daten sind in 1 gezeigt. Die Werte sind als Prozent Lebensfähigkeit ± Standardabweichung dargestellt, wobei 100 Prozent der Lebensfähigkeit von mit Medium allein behandelten L929-Zellen entspricht. Bei 6000 E/ml zeigten mit IFNβ behandelte Zellen eine Lebensfähigkeit von 77,0 ± 0,6%. Die Lebensfähigkeit von L929-Zellen nahm ab, wenn die Konzentrationen von IFNβ in einer dosisabhängigen Weise erhöht wurden. Im Gegensatz dazu zeigten L929-Zellen keine Abnahme der Lebensfähigkeit bei irgendeiner der getesteten IFNτ-Konzentrationen. Diese Daten zeigen, daß IFNτ anders als IFNβ keine Toxizität in vitro bei hohen Konzentrationen aufweist.
Zusammengenommen zeigen die vorstehend zusammengefaßten Ergebnisse, daß IFNτ in Konzentrationen, bei denen IFNβ eine Toxizität sowohl in vitro als auch in vivo hervorruft, im wesentlichen nicht toxisch ist.
Beispiel 2
IFNτ hemmt die Entwicklung einer experimentellen allergischen Encephalomyelitis
IFNτ wurde auf seine Fähigkeit getestet, die Induktion von EAE zu verhindern. Empfänger-NZW-Mäuse erhielten eine ip-Injektion mit entweder einer Einfachdosis von 10⁵ E/ml rekombinantem IFN-tau aus SchaI (OvIFNτ) oder murinem IFN-beta (MuIFNβ; Lee Biomolecular, San Diego, CA) am Tag der Immunisierung mit dem basischen Myelinprotein aus Rind (bMBP) zur Induktion von EAE oder 3 Dosen von 10⁵ E/ml OvIFNτ oder MuIFNβ 48 Stunden vor der, am Tag der und 48 Stunden nach der Immunisierung mit MBP zur Induktion von EAE.
Zur Induktion von EAE wurden 300 μg bMBP in komplettem Freundschem Adjuvans, enthaltend 8 mg/ml H37Ra, emulgiert und auf jeder Seite der Schwanzbasis injiziert. Am Tag der Immunisierung und 48 Stunden später wurden auch 400 ng Pertussis-Toxin (List Biologicals, Campbell, CA) injiziert. Die Mäuse wurden täglich auf Anzeichen von EAE untersucht, und die Schwere der Erkrankung wurde auf der folgenden Skala eingestuft: 1: Verlust des Schwanzmuskeltonus; 2: Muskelschwäche der hinteren Gliedmaße; 3: Paraparese; 4: Paraplegie; 5: Sterben/Tod.
Tabelle 4 Wirkungen von IFNτ auf die Entwicklung von EAE
Die Ergebnisse der Experimente sind vorstehend in Tabelle 4 zusammengefaßt. Die Daten sind in zwei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe (die ersten drei Reihen) entspricht Experimenten, bei denen das IFN den Versuchstieren am Tag der Immunisierung injiziert wurde. Alle Tiere in dieser Gruppe entwickelten eine EAE, aber der durchschnittliche Tag des Ausbruchs war in sowohl den mit OvIFNτ (23,8 ± 0,5 Tage) als auch den mit MuIFNβ (23,5 ± 0,6 Tage) behandelten Tieren im Verhältnis zu den Kontrolltieren (16,2 ± 0,8 Tage) verschoben. Ferner wurde die mittlere Schwere der Erkrankung, quantitativ bestimmt, wie vorstehend beschrieben, in beiden mit IFN behandelten Gruppen im Verhältnis zu den Kontrollen vermindert. Ähnlich wie bei OvIFNτ bewirkte eine Einfachdosis von 10⁵ E MuIFNβ auch eine 7-tägige Verzögerung bei der Krankheitsentwicklung.
Die Ergebnisse sind für das Mehrfachdosis-Protokoll (Reihen 4–6 von Tabelle 1) auffallender, bei dem drei Dosen von IFN (48 Stunden vor der, am Tag der und 48 Stunden nach der Immunisierung) an die Versuchstiere verabreicht wurden. Während sieben der neun Kontrolltiere im Durchschnitt 15,2 Tage nach der Immunisierung eine EAE entwickelten, entwickelte keines der neun Tiere, die mit OvIFNτ behandelt wurden, die Erkrankung. Von den neun Tieren, die mit MuIFNβ behandelt wurden, erlag eines an EAE 22 Tage nach der Immunisierung.
Der zeitliche Verlauf der mittleren Schwere aus den vorstehend beschriebenen Experimenten ist in 2 dargestellt. Die Daten von Kontrolltieren sind durch (Δ) angegeben, die Daten von Tieren, die mit einer Einfachdosis von OvIFNτ behandelt wurden, sind durch (⊕) angegeben, und die Daten von Tieren, die 3 Dosen von OvIFNτ erhielten, sind durch (⎕) angegeben.
Die Daten zeigen, daß IFNτ eine wirksame Immuntherapie zur Verhinderung von EAE ist und in diesem Modell für eine Autoimmunerkrankung genauso wirksam wie eine Behandlung mit MuIFNβ ist. Zusammengenommen mit der geringeren Toxizität von IFNτ im Verhältnis zu IFNβ legen diese Daten nahe, daß die Behandlung von Individuen mit einer Autoimmunerkrankung (wie multiple Sklerose) mit IFNτ der Vorzug gegeben werden kann und daß sie wirksamer als eine Behandlung mit IFNβ sein kann.
Beispiel 3
IFNτ-Hemmung der T-Zell-Proliferation
Die Wirkungen von IFNτ auf die Proliferation von Milzzellen aus mit MBP immunisierten NZW-Mäusen, die mit MBP in vitro stimuliert worden waren, wurden wie folgt bestimmt. Milzzellen aus mit bMBP immunisierten NZW-Mäusen wurden in 300 μg/ml bMBP in Gegenwart von [³H]-Thymidin und 0, 10, 100 oder 1000 E/ml OvIFNτ gezüchtet. Die Proliferation wurde durch den [³H]-Thymidin-Einbau bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Die Daten sind als mittlere Zählungen pro Minute (CpM) von Proben in dreifacher Ausfertigung dargestellt. Der Hintergrund-CpM-Wert ist von den dargestellten CpM-Werten abgezogen worden. Die Proliferation als Antwort auf MBP war besonders groß und konnte durch IFNτ in einer dosisabhängigen Weise verringert werden. 1000 E/ml IFNτ verringerten die Proliferation auf weniger als die Hälfte des beobachteten Werts als Antwort auf MBP allein.
Diese Ergebnisse zeigen, daß IFNτ eine antiproliferative Aktivität gegen T-Zellen aufweist, die für das Autoantigen MBP spezifisch sind, und stehen im Einklang mit der Beobachtung, daß IFNτ die Symptome einer MBP-induzierten EAE hemmt oder beseitigt.
Beispiel 4
IFNτ verhindert eine Superantigen-Reaktivierung
IFNτ wurde auf seine Fähigkeit untersucht, eine Superantigen-Reaktivierung von EAE in NZW-Mäusen (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) zu verhindern. Schematische Diagramme der in diesen Experimenten befolgten Protokolle sind in den 4A, 4B, 4C, 4D, 4E und 4F gezeigt. Auf diese Figuren wird im Zusammenhang mit dem nachstehend beschriebenen Protokoll verwiesen.
Zur Induktion von EAE wurden 300 μg bMBP und 400 ng Pertussis-Toxin (List Biological Technologies, Campbell, CA) in komplettem Freundschem Adjuvans, enthaltend 8 mg/ml H37Re, emulgiert und auf jeder Seite der Schwanzbasis injiziert (4A). Eine andere Injektion, enthaltend 400 ng Pertussis-Toxin, wurde 48 Stunden später verabreicht. Die Injektionen induzierten eine EAE, die ein Maximum erreichte (4B) und allmählich langsam nachließ, so daß schließlich alle klinischen Symptome einer EAE abklangen ( 4C).
SEB wurde einen Monat nach dem Abklingen der Erkrankung verabreicht ( 4D). Die Mäuse erhielten eine ip-Injektion mit 3 Dosen von 10⁵ E IFNτ 48 Stunden vor der, am Tag der und 48 Stunden nach der Injektion von 40 μg SEB (Toxin Technology, Sarasota, FL) und 400 ng Pertussis-Toxin (List Biological Technologies, Campbell, CA) (in 0,2 ml PBS) zur Superantigen-Reaktivierung. Kontrollmäuse erhielten nur SEB und Pertussis-Toxin. Die IFNτ-Zubereitung war mit der in Beispiel 2 beschriebenen identisch. Die Mäuse wurden täglich auf Anzeichen von EAE untersucht, und die Schwere der Erkrankung wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, eingestuft.
Tabelle 5 IFNτ verhindert eine Superantigen-Reaktivierung von EAE
Die Daten sind vorstehend in Tabelle 5 zusammengefaßt. Von insgesamt neun Kontrollmäusen (erhielten kein IFNτ) entwickelten sechs eine Reaktivierung von EAE. Der durchschnittliche Tag des Ausbruchs betrug 6 ± 1,7 im ersten Experiment und 10 ± 2,5 im zweiten Experiment. Die mittlere Schwere der Erkrankung betrug 1,6 ± 0,5 im ersten Experi ment und 1,4 ± 0,4 im zweiten Experiment. Von den neun Tieren, die mit IFNτ behandelt wurden, entwickelte jedoch keines Symptome der Erkrankung.
Beispiel 5
IFNτ hemmt die Vβ-spezifische T-Zell-Aktivierung
Die Wirkung einer IFNτ-Behandlung einer SEB-induzierten Vermehrung von Vβ-spezifischen T-Zellen in vitro wurde wie folgt beurteilt. FACS-Reagenzien wurden von Pharmingen, San Diego, CA, bezogen. Die FACS-Analyse von Vβ-spezifischen T-Zellen wurde mit naiven NZW-Mäusen oder mit NZW-Mäusen, die eine SEB-Injektion (50 μg) oder eine Injektion mit IFNτ (10⁵ E) und SEB (50 μg) erhielten, durchgeführt. Alle Injektionen erfolgten ip und wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, verabreicht. Die Analysen wurden 72 Stunden nach den Injektionen durchgeführt.
Für die FACS-Analyse wurden ~10⁶ T-Zellen aus den Tieren isoliert und mit Biotin-markierten anti-Vβ-Antikörpern für 45 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit Streptavidin-Phycoerythrin für 15 Minuten inkubiert, gefolgt von einem weiteren Waschschritt und einer 45-minütigen Inkubation mit FITC-markierten anti-CD4-Antikörpern. Die Zellen wurden abermals gewaschen und mit einer FACSort-Vorrichtung (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) in doppelter Ausfertigung als 10.000 Ereignisse pro Probe analysiert.
Die Ergebnisse beispielhafter Experimente sind in 5 gezeigt. Nicht ausgefüllte Balken stellen naive Tiere dar; ausgefüllte Balken stellen Tiere dar, die eine SEB-Injektion erhielten, und schraffierte Balken stellen Tiere dar, die eine Injektion mit IFNτ und SEB erhielten. Die Werte sind als Prozentsatz der positiv gefärbten Zellen ± Standardabweichung dargestellt. Die Werte für die Vβ8⁺CD4⁺-T-Zell-Untergruppe von Tieren, die eine SEB-Injektion und eine Injektion mit IFNτ und SEB erhielten, waren signifikant verschieden, wie durch den Student-t-Test gezeigt wurde (P < 0,02). Naive NZW-Mäuse wiesen 5,1 ± 0,1% Vβ8⁺CD4⁺-T-Zellen auf. Nach der Injektion mit 50 μg SEB vermehrte sich diese Untergruppe auf 10,2 ± 0,2%. Wenn 10⁵ E IFNτ der SEB-Injektion vorausgingen, wurde die Vermehrung der Vβ8⁺CD4⁺-T-Untergruppe auf 7,6 ± 0,2% begrenzt. Die teilweise Hemmung von Vβ7⁺- und Vβ1 1⁺-T-Zellen, für die SEB auch spezifisch ist, wurde ebenfalls beobachtet.
Diese Daten zeigen, daß die Behandlung mit IFNτ die SEB-induzierte Vermehrung von Vβ-T-Zellen in vivo zum Teil hemmen kann, und stützen ferner die Beobachtung, daß IFNτ die Symptome einer MBP-induzierten EAE hemmt oder beseitigt.
Beispiel 6
Oral verabreichtes OvIFNτ blockiert die Entwicklung einer experimentellen allergischen Encephalomyelitis
Oral verabreichtes und injiziertes IFNτ wurde auf seine Fähigkeit getestet, die Induktion von EAE zu verhindern. New Zealand White (NZW)-Empfängermäuse erhielten OvIFNτ (10⁵ E/ml) durch entweder IP-Injektion oder orale Fütterung 48 Stunden vor der, am Tag der und 48 Stunden nach der Immunisierung mit bMBP zur Induktion von EAE. 10⁵ E IFNτ wurden mit PBS bis zu einem Gesamtvolumen von 100 μl gemischt und unter Verwendung einer in die Speiseröhre und in den Magen eingeführten Ernährungssonde verabreicht. Die Verdünnung des IFNτ in PBS wurde unmittelbar vor der Verabreichung durchgeführt.
Zur Induktion von EAE in NZW-Mäusen wurden 300 μg basisches Myelinprotein aus Rind (bMBP) in komplettem Freundschem Adjuvans (CFA), enthaltend 8 mg/ml H37Ra (Mycobacterium tuberculosis, Difco, Detroit, MI), emulgiert und auf beiden Seiten der Schwanzbasis injiziert. Am Tag der Immunisierung und 48 Stunden später wurden auch 400 ng Pertussis-Toxin (List Biological, Campbell, CA) injiziert. Zur Induktion von EAE in SJL/J-Mäusen wurde das gleiche Protokoll, wie beschrieben, verwendet, außer daß die Mäuse 7 Tagen nach der Erstimmunisierung noch einmal immunisiert wurden. Die Mäuse wurden täglich auf Anzeichen von EAE untersucht, und die Schwere der Erkrankung wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, eingestuft.
Der monoclonale anti-OvIFNτ-Antikörper (mAb) HL127 wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die Verhinderung von EAE für die OvIFNτ-Behandlung spezifisch war (der gegen die AS 39-172 von SEQ ID Nr. 2 gerichtete Antikörper HL127 neutralisiert die antivirale Aktivität von OvIFNτ in einem antiviralen Test unter Verwendung der MDBK-Zelllinie). Eine 1 : 10-Verdünnung von HL127 wurde 2 Stunden mit OvIFNτ vor der Verabreichung durch entweder ip-Injektion oder orale Fütterung inkubiert. Gegen IFNτ-Antigene gerichtete Antikörper können unter Verwendung der vorliegenden Information in Kombina tion mit bekannten Techniken zur Antikörperherstellung (z. B. Harlow et al., 1988) erzeugt werden.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 6 gezeigt. Sowohl die orale Fütterung als auch die ip-Injektion von OvIFNτ schützte vor einer akuten Induktion von EAE. Keines der Tiere, die IFNτ mittels einer ip-Injektion erhielten, entwickelte Symptome von EAE, während von den Tieren, die IFNτ oral erhielten, 7 von 9 (78%) geschützt waren. Der Antikörper HL127 war in der teilweisen Neutralisierung der Fähigkeit des OvIFNτ, eine EAE zu blockieren, wirksam. Diese Daten zeigen, daß oral verabreichtes IFNτ für die Behandlung in einem Tiermodell für multiple Sklerose wirksam ist.
Tabelle 6 Die orale Fütterung von OvIFNτ blockiert eine akute EAE und kann durch einen OvIFNτ-spezifischen monoclonalen Antikörper in NZW-Mäusen umgekehrt werden
OvIFNτ (10⁵ E) wurde 48 Stunden vor der Immunisierung mit MBP, am Tag der Immunisierung mit MBP und 48 Stunden nach der Immunisierung mit MBP durch entweder ip-Injektion oder orale Fütterung verabreicht. HL127, ein monoclonaler Antikörper, der für OvIFNτ spezifisch ist, wurde mit OvIFNτ für zwei Stunden vor der Verabreichung inkubiert.
Beispiel 7
Nachweis von OvIFNτ in Seren nach oraler Verabreichung
Die in Seren von Mäusen (wie vorstehend behandelt) nachweisbare Menge an OvIFNτ wurde nach oraler Fütterung (wie vorstehend) oder ip-Injektion von OvIFNτ über die Zeit verglichen. Den Mäusen wurden 3 × 10⁵ E OvIFNτ verabreicht, und ihnen wurde 0,5, 2, 4, 6, 24 und 48 Stunden nach der IFNτ-Verabreichung Blut abgenommen. Die Seren wurden in einem Test auf eine cytophatische Wirkung (Virusplaque) (Familetti et al., 1981) getestet, um die Menge an IFNτ in den Proben zu bestimmen.
Kurz zusammengefaßt wurden Verdünnungen von IFNτ zu MDBK-Zellen zugegeben, die in einer Platte mit flachem Boden mit 96 Vertiefungen zur Konfluenz gezüchtet worden waren, und 18 bis 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das vesikläre Stomatitis-Virus (VSV) wurde zu der Platte für 45 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben. Das Virus wurde entfernt und Methylcellulose wurde zugegeben, und die Platte wurde für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Entfernung der Methylcellulose wurde die Platte zum Sichtbarmachen der Plaques mit Kristallviolett gefärbt. Zur Messung der IFN-Neutralisierung wurde OvIFNτ in einer Konzentration von 500 E/ml für 1 Stunde bei 37°C mit entweder Seren oder HL127 inkubiert. Eine antivirale Einheit rief eine 50%ige Verringerung der Zerstörung der einzelligen Schicht im Verhältnis zu unbehandelten, mit VSV infizierten MDBK-Zellen (Kontrollplatten) hervor. Alle Proben wurden gleichzeitig getestet, um eine Variabilität zwischen den Tests zu eliminieren.
Wie in 6 gezeigt ist, wurde OvIFNτ 0,5 Stunden und 2 Stunden nach der oralen Fütterung (ausgefüllte Balken) in Spiegeln von 200 E/ml nachgewiesen. Zum Vergleich wurden etwas höhere OvIFNτ-Spiegel während eines Zeitraums von über 24 Stunden nach der ip-Injektion nachgewiesen (nicht ausgefüllte Balken). Diese Daten zeigen, daß die vorstehende Dosis von IFNτ im Serum für etwa zwei Stunden nach der oralen Verabreichung nachgewiesen werden kann.
Beispiel 8
Verhinderung eines chronischen Rückfalls von experimenteller allergischer Encephalomyelitis durch oral verabreichtes OvIFNτ
Die Fähigkeit von OvIFNτ, eine Lähmung zu verhindern, wurde unter Verwendung eines chronisch rezidivierenden Modells für EAE untersucht, bei dem mit MBP immunisierte SJL-Mäuse eine chronische Form der Erkrankung entwickeln, bei der das Auftreten von Symptomen in einer rezidivierenden-remittierenden Art und Weise erfolgt (Zamvil und Steinman, 1990).
EAE wurde in SJL-Mäusen im wesentlichen, wie vorstehend, beschrieben induziert. Die Mäuse wurden mit 10⁵ E OvIFNτ durch entweder ip-Injektion oder orale Fütterung am Tag der Immunisierung (Tag 0) und alle 48 Stunden danach für die Dauer des Experiments behandelt. Wie in 7A dargestellt, entwickelten SJL-Mäuse, die mit MBP immunisiert wurden, aber keine OvIFNτ-Behandlung erhielten, eine chronisch rezidivierende Lähmung mit einer Erkrankungshäufigkeit von 5/5, wobei ein Maximum der mittleren Schwere von ~2,5 14 Tage nach Beginn des Experiments auftrat. Im Gegensatz dazu hatte die Behandlung mit OvIFNτ durch entweder ip-Injektion oder orale Fütterung (7B bzw. 7C) einen Schutz vor EAE zur Folge. Die Erkrankungshäufigkeit in beiden OvIFNτ-Behandlungsgruppen war auf 1/5 Tiere bei einer mittleren Schwere von ~1,0 verringert. Diese Daten zeigen, daß die orale Verabreichung von IFNτ die Entwicklung einer chronisch rezidivierenden EAE blockieren kann, und legen nahe, daß oral verabreichtes IFNτ so wirksam wie eine ip-Injektion sein kann, wenn das IFNτ etwa alle 48 Stunden über einen längeren Zeitraum verfüttert wird.
Beispiel 9
Histologische Analyse
Die histologischen Analysen wurden durchgeführt, um das Ausmaß der Lymphocyteninfiltration in das ZNS von mit MBP immunisierten Mäusen zu bestimmen, die mit OvIFNτ auf oralem und ip-Weg behandelt wurden. Die Mäuse wurden mit 4% Paraformaldehyd perfundiert, die Wirbelsäulen wurden entfernt und 2 bis 3 Tage mit Formalin behandelt. Das Rückenmark wurde herauspräpariert und in 0,5% Saccharose über Nacht bei 4°C eingeweicht. Rückenmarksabschnitte wurden eingebettet, und Schnitte wurden mit einem Mikrotom angefertigt. Die Schnitte wurden auf Objektträgern in 4% Paraformaldehyd fixiert und zum Sichtbarmachen der entzündlichen Infiltrate mit Kresylviolett gefärbt.
Die Ergebnisse sind in den 8A, 8B und 8C in einer Endvergrößerung von 222 × gezeigt. Lymphocytäre Läsionen waren in der weißen Rückenmarkssubstanz der Kontrollmäuse vorhanden (8A). Im Gegensatz dazu wurden keine Lymphocyteninfiltrate bei Mäusen nachgewiesen, die mit OvIFNτ durch ip-Injektion ( 8B) oder orale Fütterung (8C) behandelt worden waren. Diese Daten legen nahe, daß die Schutzwirkung von IFNτ mit der Hemmung der Lymphocyteninfiltration des ZNS assoziiert ist.
Beispiel 10
Induktion von IL10 durch Behandlung mit OvIFNτ
Während des Verlauf einer OvIFNτ-Behandlung von SJL-Mäusen zur Verhinderung einer chronisch rezidivierenden EAE wurde den Mäusen Blut entnommen, und die Seren wurden auf das Vorhandensein von Interleukin-10 (IL10) untersucht. Seren von Mäusen, die entweder eine einzige IFNτ (10⁵ E)-Behandlung (durch ip-Injektion oder orale Fütterung), eine längere IFNτ (10⁵ E)-Behandlung (durch ip-Injektion oder orale Behandlung für mehr als 20 Tage) oder keine Behandlung erhielten, wurden mit einem enzymverbundenen Immunadsorptionstest (ELISA) unter Verwendung von IL10-ELISA-Kits (Genzyme, Cambridge, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf IL10 untersucht. Alle Serumproben wurde in doppelter Ausfertigung getestet.
Kein IL10 wurde bei Kontrollmäusen oder bei Mäusen, die eine einzige Behandlung mit OvIFNτ durch entweder ip-Injektion oder orale Fütterung erhielten, nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wiesen SJL-Mäuse, die OvIFNτ durch entweder ip-Injektion oder orale Fütterung alle 48 Stunden für mehr als 20 Tage erhielten, nachweisbare IL10-Spiegel in ihren Seren auf (9). Diese Daten legen nahe, daß die IFNτ-induzierte Produktion von IL10 ein unterstützender Mechanismus sein kann, durch den OvIFNτ die Entwicklung von EAE verhindert.
Beispiel 11
Die Einstellung der Behandlung mit OvIFNτ führt zu einer rezidivierenden Lähmung
SJL-Mäuse, die durch eine OvIFNτ-Behandlung mittels ip-Injektion oder orale Fütterung (alle 48 Stunden) vor EAE geschützt waren, wurden 58 Tage beobachtet; während dieser Zeit wurde keine Krankheitsentwicklung beobachtet. Die Behandlung mit OvIFNτ wurde dann eingestellt, und die Mäuse wurden weitere 22 Tage auf Symptome der Erkrankung überwacht.
Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Die IFNτ-Behandlung ist als Pluszeichen und die Einstellung der IFNτ-Behandlung ist als Minuszeichen unter dem Graph gekennzeichnet. Die Erkrankungshäufigkeit in jeder Behandlungsgruppe war wie folgt: PBS-Kontrolle = 3/4 (Quadrat); ip-Injektion = 3/3 (Dreieck); orale Fütterung = 3/4 (Kreis).
Beide Gruppen von Mäusen, die vorher durch die OvIFNτ-Behandlung vor EAE geschützt worden waren, entwickelten 6 bis 12 Tage nach Einstellung der OvIFNτ-Behand lung Anzeichen einer Lähmung. Diese Daten zeigen, daß die anhaltende Verabreichung von IFNτ durch entweder ip-Injektion oder orale Fütterung für einen anhaltenden Schutz vor EAE in dem chronisch rezidivierenden Modell für EAE wünschenswert ist.
Beispiel 12
Die orale Verabreichung von OvIFNτ verringert die anti-OvIFNτ-Antikörper-Antwort
Nach Einstellung der OvIFNτ-Behandlung in den in Beispiel 11, vorstehend, beschriebenen Experimenten wurde Mäusen aus jeder Behandlungsgruppe Blut entnommen und die Seren wurden auf das Vorhandensein von anti-OvIFNτ-Antikörpern (Ab) untersucht. Das Antigen OvIFNτ wurde an den flachen Boden von Kunststoff-Gewebekulturvertiefungen über Nacht in einer Konzentration von 600 ng/Vertiefung adsorbiert und anschließend bis zur Trockene verdunstet. Die Platten wurden mit 5% Milch (Carnation) in PBS für 2 Stunden behandelt, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, und dann 3mal mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20, gewaschen. Verschiedene Verdünnungen von Seren von Mäusen, die nicht behandelt, mit OvIFNτ durch ip-Injektion behandelt und mit OvIFNτ durch orale Fütterung behandelt worden waren, wurden zugegeben und 3 Stunden inkubiert. Die Bindung wurde mit Ziege-anti-Maus-Lnmunglobulin, gekoppelt mit Meerrettichperoxidase, beurteilt. Die Farbentwicklung wurde bei 492 nm in einem ELISA-Plattenlesegerät (Bio-Rad, Richmond, CA) nach Zugabe von o-Phenylendiamin und H₂O₂ überwacht, und die Umsetzung wurde mit 2 M H₂SO₄ beendet.
Beispielhafte Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Seren von unbehandelten, mit OvIFNτ durch ip-Injektion behandelten und mit OvIFNτ durch orale Fütterung behandelten Mäusen (2 Mäuse/Gruppe) wurden mit einem ELISA unter Verwendung mehrerer Verdünnungen einschließlich 1 : 30 (nicht ausgefüllte Balken) und 1 : 120 (ausgefüllte Balken) untersucht. Mäuse, die OvIFNτ durch orale Fütterung erhielten, zeigten minimale Ab-Spiegel, während Mäuse, die OvIFNτ durch ip-Injektion erhielten, erhöhte anti-OvIFNτ-Ab-Spiegel zeigten. Wie erwartet zeigten Mäuse, die keine OvIFNτ-Behandlung erhielten, keinen anti-OvIFNτ-Ab.
Die Seren wurden auch auf ihre Fähigkeit untersucht, die antivirale Aktivität von OvIFNτ auf MDBK-Zellen zu neutralisieren, wie vorstehend beschrieben ist. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 7 gezeigt. Keines der Seren von Mäusen, denen OvIFNτ entweder ip injiziert oder oral verfüttert wurde, besaß eine neutralisierende Aktivität. Diese Daten legen nahe, daß die orale Behandlung mit IFNτ die gegen das OvIFNτ-Protein gerichtete Ab-Antwort verhindert, die in mit einer ip-Injektion behandelten Individuen beobachtet wird, und daß keine der beiden Behandlungen typischerweise die Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern zur Folge hat.
Tabelle 7 Seren von Mäusen, die mit OvIFNτ durch ip-Injektion oder orale Fütterung behandelt wurden, weisen keine neutralisierende Aktivität auf
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Verfahren und Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist erkennbar, daß verschiedene Modifikationen und Veränderungen vorgenommen werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung von tau-Interferon (IFNτ) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die auf eine Behandlung mit IFNτ anspricht, bei der das Medikament einem Säugerindividuum oral verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Erkrankung' eine Autoimmunerkrankung ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das IFNτ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ovinem IFNτ (OvIFNτ) und bovinem IFNτ.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das OvIFNτ die als SEQ ID Nr. 2 dargestellte Sequenz besitzt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das IFNτ ein rekombinant hergestelltes IFNτ ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Autoimmunerkrankung ausgewählt ist aus Typ-1-Diabetes mellitus, rheumatoide Arthritis, Lupus erythematodes, Schuppenflechte und multipler Sklerose.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Säugerindividuum ein menschliches Individuum ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Interferon-τ in einer Menge zwischen etwa 1 × 10⁵ und etwa 1 × 10⁸ Einheiten IFNτ pro Tag verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Interferon-τ in einer Menge zwischen etwa 1 × 10⁶ und etwa 1 × 10⁷ Einheiten IFNτ pro Tag verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Verabreichung weiterhin die Verabreichung eines zweiten Mittels zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung einschließt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das zweite Mittel ein Corticosteroid ist.