KR100417485B1 - 인터페론-τ를사용하는자가면역질환의치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다발성 경화증과 같은 자가면역질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 인터페론-τ를 치료 유효량의 투여량으로, 바람직하게는 경구 투여 또는 주사에 의해 투여하는 방법을 사용한다.

Description

인터페론-τ를 사용하는 자가면역질환의 치료방법 {METHOD FOR TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES USING INTEFERON-TAU}

면역계는 세균, 바이러스 또는 기생충과 같은 침입성 생물체에 의한 질병 뿐만 아니라 신체의 고유 조직의 비정상적인 성장(즉, 암성 종양)에 의한 질병에 대한 신체의 일차 방어이다. 정상적으로, 면역계는 신체의 정상적인 조직, 즉 자기와, 외래 또는 암성 조직, 즉 비자기를 구별할 수 있다. 특정 조직을 자기로서 인식하지 못하여, 이후 상기 조직에 유도된 면역 반응은 일반적으로 흔히 심각한 임상 결과를 나타내는 "자가면역반응"을 초래한다.

이러한 자가면역질환중 하나의 특정 예로는 뇌 및 척수의 미엘린의 반(patches)(신경 섬유의 보호 외피)이 신체의 자기자신의 면역계에 의해 파괴되는 중추 신경계의 진행성 질병인 다발성 경화증(MS)이 있다. 이러한 파괴는 그 아래에 있는 신경 섬유를 상처나게 하고, 손상되게 하며, 뇌 및 척수의 환부에 따라 다양한 증상으로 나타날 수 있다. 척수 손상은 자통(刺痛) 또는 무감각 뿐만 아니라 사지에 나른함 및/또는 무력감을 초래할 수 있다. 뇌의 손상은 근무력, 피로, 불안정한 호전, 무감각, 불명료 언어, 시력 손상 및 현기증 등을 초래할 수 있다.

현재 다발성 경화증 치료에는 코르티코스테로이드 약물(급성 에피소드의 증상을 완화시키기 위해)와 기타 생체 분자가 포함된다. 특히, 베타-인터페론(IFNβ)은 시험에 의해 MS 치료로서 (미) 식품 의약품국(FDA)에 의해 입증되었다. 그러나, 최근 사용되는 치료에는 많은 문제점이 수반된다. 상기 약물은 흔히 최대 치료 효과에 요구되는 투여량에서 독성이 있다. 또한, 신체가 약물에 대해 탈감작되어 최소의 치료 효과를 유지하기 위해서 보다 많은(그리고 보다 독성인) 투여량이 요구될 수 있다.

본 발명은 MS 치료와 같은 자가면역질환을 치료하는 방법으로서, 최근 사용되는 치료와 관련된 독성의 부작용이 없는 치료 방법을 제공한다.

발명의 요약

본 발명의 일면은 이러한 치료가 필요한 환자의 자가면역질환을 치료하는 방법을 포함한다. 하나의 구체예에서, 자가면역질환은 다발성 경화증이다. 상기 방법은 약제학적 유효량의 τ-인터페론을 투여하는 것을 포함한다. τ-인터페론은 예를 들어, 경구적으로, 또는 정맥내 또는 근육내 주사로 투여될 수 있다. 경구적으로 투여되는 IFNτ는 환자에 의해 섭취되는 것이 바람직하다. IFNτ는 τ-인터페론 단백질(예를 들어, 양, 소, 염소, 황소, 래트, 마우스 또는 사람 τ-인터페론)을 발현시키는 종으로부터의 τ-인터페론(이것과 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)으로부터 유도될 수 있다.

τ-인터페론은 적합한 물질로부터 정제되거나, 재조합적으로(즉, 재조합 τ-인터페론) 생성될 수 있으며, 합성적으로 생성될 수 있다. 또한, τ-인터페론 폴리펩티드(일반적으로 약 15 내지 172개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드)가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 τ-인터페론을 투여하기 전에, 동시에 또는 후에 제 2의 자가면역질환(예를 들어, 다발성 경화증) 치료제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 제 2의 치료제 또는 약제의 예로는 β-인터페론 및 코르티코스테로이드 약물이 포함된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 이러한 치료가 필요한 환자의 홍반성 루푸스를 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 환자에게 약제학적 유효량의 τ-인터페론을 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 이러한 치료가 필요한 환자의 제 1형 당뇨병을 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 환자에게 약제학적 유효량의 τ-인터페론을 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 이러한 치료가 필요한 환자의 류마티스 관절염을 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 환자에게 약제학적 유효량의 τ-인터페론을 투여하는 것을 포함한다.

상기 언급된 방법은 또한 경구 투여 또는 주사 이외의 경로, 예를 들어, 국부 도포 또는 동맥내 주사에 의한 투여를 포함할 수 있다. 또한, τ-인터페론이 동종 이식 또는 이종 이식 거부반응의 치료에 유용할 수 있는 것으로 고려된다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 인터페론-τ(IFNτ)에 의한 치료에 반응하는 포유동물(예를 들어, 개 또는 사람)의 질병 상태를 치료하는 방법의 개선을 포함한다. 이 개선점은 치료적 또는 약제학적 유효량의 IFNτ을 경구적으로 투여함을 포함한다. 경구적으로 투여되는 IFNτ는 포유동물에 의해 섭취되는 것이 바람직하다. 일반적인 구체예에서, IFNτ는 일당 약 1 x 10⁵내지 약 1 x 10⁸단위의 투여량으로, 바람직하게는 일당 약 1 x 10⁶내지 약 1 x 10⁷단위의 투여량으로 경구적으로 투여된다. 예를 들어, IFNτ는 양 IFNτ(OvIFNτ)으로서, 예를 들어 서열 번호 2로 표시된 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 사람 IFNτ(HuIFNτ)으로서, 예를 들어, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6으로 표시된 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

하나의 구체예에서, 질병 상태란 자가면역질환(예를 들어, 다발성 경화증(MS), 제 1형(인슐린 의존성) 당뇨병, 홍반성 루푸스, 근위축성 측삭 경화증, 크론병, 류마티스 관절염, 구내염, 천식, 알레르기 또는 건선)과 같은 면역계 질환이다. MS는 특히 본 발명의 방법을 사용하여 치료받을 만하다.

또 다른 구체예에서, 질병 상태란 암(예를 들어, 모발상 세포 백혈병, 카포시 육종, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 표재성 방광암, 피부암(기저 세포 암종 및 악성 흑색종), 신세포암종, 난소암, 저급 림프구성 및 피부 T 세포 림프종, 및 교종)과 같은 세포 증식 질환이다.

또 다른 구체예에서, 질병 상태란 바이러스성 질병(예를 들어, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 비-A, 비-B, 비-C형 간염, 엡스타인-바르 바이러스 감염, HIV 감염, 헤르페스 바이러스(EB, CML, 단순포진), 유두종, 폭스바이러스, 피코르나바이러스, 아데노 바이러스, 리노 바이러스, HTLV I, HTLV II, 및 사람 로타바이러스)이다.

본 발명은 또한 사람에게 치료적 또는 약제학적 유효량의 인터페론-τ(IFNτ)를 경구적으로 투여하므로써, 다발성 경화증을 앓고 있는 사람의 다발성 경화증(MS)의 중증도 또는 재발 빈도를 감소시키는 방법을 포함한다. IFNτ의 투여량 및 공급원의 예는 상기에서 언급되었다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 환자에게 치료적 또는 약제학적 유효량의 인터페론-τ(IFNτ)를 경구적으로 투여하므로써, 환자의 세포 증식 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 경구적으로 투여되는 IFNτ는 환자에 의해 섭취되는 것이 바람직하다. 치료 받기에 적합한 세포 증식 질환의 예, 투여량 및 IFNτ의 공급원이 상기에 언급되어 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 환자에게 치료적 또는 약제학적 유효량의 인터페론-τ(IFNτ)를 경구적으로 투여하므로써, 환자의 바이러스성 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 경구적으로 투여되는 IFNτ는 환자에 의해 섭취되는 것이 바람직하다. 치료 받기에 적합한 바이러스성 질환의 예, 투여량 및 IFNτ의 공급원이 상기에 언급되어 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 암컷 포유동물에게 치료적 또는 약제학적 유효량의 인터페론-τ(IFNτ)를 경구적으로 투여하므로써, 포유동물 암컷(예를 들어, 개 또는 사람)의 번식력을 증진시키는 방법을 포함한다. 투여량 및 IFNτ의 공급원이 상기에 언급되어 있다.

이러한 목적 및 기타 목적, 및 본 발명의 특징이 도면과 함께 하기 상세한 설명으로 보다 상세하게 나타날 것이다.

본 발명은 면역계 과민증과 관련된 질환의 치료제로서의 IFNτ의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 홍반성 루프스 및 제 1형(Type I) 당뇨병을 포함하는 자가면역질환의 치료에 관한 것이다.

참고문헌

도 1은 IFNβ 및 IFNτ의 독성을 비교한 그래프이다.

도 2는 IFNτ의 존재 및 부재하에서 MBP로 면역된 뉴질랜드 화이트(NZW) 마우스의 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)의 평균 중증도를 나타낸 그래프이다.

도 3은 MBP-면역된 NZW 마우스로부터의 비장 세포의 증식에 대한 IFNτ의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 4A, 4B, 4C, 4D, 4E 및 4F는 IFNτ의 존재 및 부재하에서 EAE의 초항원 재활성화를 도시한 것이다.

도 5는 Vβ-특이적 T-세포 활성화에 대한 IFNτ의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 경구 투여(쌍점 막대) 또는 복강내 주사(빈 막대)에 의한 투여후, 항-바이러스 검정을 사용하여 측정된 NZW 마우스 혈청중 OvIFNτ의 양을 나타낸 그래프이다.

도 7A, 7B 및 7C는 처리되지 않은 마우스(도 7A)와 비교하여 경구적으로 투여된(도 7C) 및 복강내 주사된(도 7B) IFNτ에 의해 SJL 마우스에게서 만성적으로 재발하는 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)이 예방되는 것을 나타낸 그래프이다.

도 8A, 8B 및 8C는 IFNτ 미처리(도 8A), 복강내 주사에 의해 OvIFNτ 처리(도 8B), 및 경구 투여에 의해 OvIFNτ 처리된(도 8C) EAE를 유발시킨 동물로부터의 림프구 침윤을 검출하기 위해 크레실 바이올렛으로 염색된 마우스의 척수 절편을 나타낸다.

도 9는 복강내 주사 또는 경구 투여에 의한 1회 또는 장기간 IFNτ 처리로인한 IL-10의 유도를 나타낸 그래프이다.

도 10은 IFNτ 처리를 중단한 후, SJL 마우스에서 재발된 EAE을 나타낸 그래프이다.

도 11은 OvIFNτ의 복강내 주사 또는 경구 투여후에 OvIFNτ 처리된 마우스의 혈청내 항-OvIFNτ 항체의 ELISA 검출을 나타낸 그래프이다.

서열의 간단한 설명

서열 번호 1은 양 인터페론-τ(OvIFNτ)를 코드화하는 합성 유전자의 누클레오티드 서열이다. 또한 코드화된 아미노산 서열이 나타나 있다.

서열 번호 2는 성숙한 OvIFNτ 단백질의 아미노산 서열이다.

서열 번호 3은 성숙한 사람 인터페론-τ(HuIFNτ) 단백질을 코드화하는 합성 누클레오티드 서열이다.

서열 번호 4는 성숙한 HuIFNτ1 단백질의 아미노산 서열이다.

서열 번호 5는 천연 HuIFNτ 유전자인 게놈 DNA 클론 HuIFNτ3의 누클레오티드 서열로서, 리더 서열이 배제된 서열이다.

서열 번호 6은 서열 번호 5로 표시된 서열에 의해 코드화된 HuIFNτ에 의해 코드화된 성숙한 사람 IFNτ 단백질의 예상된 아미노산 서열이다.

I.정의

인터페론-τ는 하기 특성을 갖는 각각의 두 개의 군으로부터 하나 이상의 특성을 갖는 인터페론 단백질류중 하나를 나타낸다: (i)(a) 항-황체용해 특성, (b)항바이러스 특성, (c) 세포 증식 억제 특성, 및 (ii) α-인터페론과의 약 45 내지 68% 아미노산 상동성 및 공지된 IFNτ 서열과의 70%를 넘는 아미노산 상동성[참조예: Ott, et al., 1991; Helmer, et al., 1987; Imakawa, et al., 1989; Whaley, er al., 1994; Bazer, et al., 1994]. 아미노산 상동성은 예를 들어, 디폴트 파라미터를 갖는 LALIGN 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 이 프로그램은 서열 비교 프로그램의 FASTA 버젼 1.7로 발견된다[참조예: Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990; program available from William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, VA]. IFNτ은 암소, 양, 황소 및 사람을 포함하는 많은 공급원으로부터 구할 수 있다.

인터페론-τ 폴리펩티드는 인터페론-τ 아미노산 코딩 서열로부터 유도된 약 15 내지 172개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드이며, 상기 15 내지 172개의 아미노산은 천연 인터페론-τ에서 연속적으로 존재한다. 이러한 15 내지 172개의 아미노산 영역은, 천연 단백질에서 보통 불연속적으로 존재하는 상기 두 개 이상의 인터페론-τ 영역이 결합되는 폴리펩티드로 어셈블링될 수 있다.

질병의 치료는 질병의 증상을 감소시키고, 그리고/또는 질병이 중증도를 경감시키는 데 효과적인 치료제를 투여하는 것을 의미한다.

II.발명의 개요

본 발명을 입증하기 위해 수행된 실험은 IFNτ이 다발성 경화증(MS)을 관찰하는 데 널리 연구되어 온 항원에 의해 유도된 자가면역 동물 모델인 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE; Zamvil and steinman, 1990)을 억제하는 데 효과적임을 나타내고 있다. IFNτ는 MS를 치료하기 위해 FDA에 의해 최근 공인된 IFNβ와 최소한 같은 정도로 이러한 실험에서 효과적이다. 본 실험은 또한 IFNτ가 IFNβ보다 독성이 낮으며, IFNτ로 처리된 마우스는 IFNβ 치료와 관련된 바람직하지 않은 부작용인 백혈구감소증을 발생시키지 않음을 보여준다.

또한, 본 발명을 입증하기 위해 수행된 실험은, EAE를 치료하는 데에 있어서 경구적으로 투여된 IFNτ가 주사된 IFNτ에 필적할 만큼 효과적이지만, 치료된 개체에게서 현저하게 낮은 항-IFNτ 항체 역가를 생성시킨다는 것을 입증하였다. 이러한 예상하지 못했던 이점이 IFNτ에 대한 숙주 면역 반응으로 인한 부작용이 감소되도록 한다.

초항원이 EAE에서 재발할 수 있으며, 이는 MS 환자에서 "자발적으로" 일어나는 것과 유사한 것으로 최근 밝혀졌다. 본 발명을 입증하기 위한 추가의 실험에서, IFNτ가 EAE의 초항원 재활성화를 차단하며, 초항원에 의한 EAE의 유도 및 재활성화에 대한 IFNτ의 억제 효과가 미엘린 염기성 단백질(MBP) 및 T 세포의 초항원 활성화의 억제 뿐만 아니라 종양 괴사 인자와 같은 파괴성 시토킨의 유도 억제에도 관여함을 보여준다. 종합하면, 이러한 결과는 주사 및 경구 투여된 IFNτ는 IFNβ와 관련된 것보다 적은 독성과 부작용을 나타내면서 MS와 같은 자가면역질환을 매우 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 나타낸다.

III.인터페론-τ

동정된 최초의 IFNτ는 양의 IFNτ(OvIFNτ)이었다. 18-19 kDa 단백질의 몇몇 이소형(isoform)이 수태산물(배아 및 주변 막) 균질화물에서 확인되었다[참조예: Martal, et al., 1979]. 이후, 수태산물 배지에 방출된 저분자량 단백질이 정제되었고, 상기 단백질은 열에 불안정하고, 프로테아제에 민감한 것으로 나타났다[참조예: Godkin, et al., 1982]. OvIFNτ는 양에서 모체의 임신 감지의 임계 기간 동안에 양 수태산물의 영양외배엽에 의해 초기에 생성된 1차 분비 단백질이기 때문에, 원래 양의 영양막 단백질-1(oTP-1)로 불리었다. 이후 실험에서 OvIFNτ는 양 및 암소와 같은 반추동물의 임신에 대한 생리학적 반응을 확인하는 데 필수적인 임신 인식 호르몬임인 것으로 입증되었다[참조예: Bazer and Johnson, 1991].

상기와 유사한 특성 및 활성을 갖는 IFNτ가 암소 및 염소를 포함하는 다른 반추종으로부터 단리되었다[참조예: Bartol, et al., 1985; and Gnatek, et al., 1989]. 모든 IFNτ에 대한 항혈청은 교차 반응한다. 이는 IFNτ의 종 특이적 형태가 동일 종으로부터의 IFNα에 대해서 보다 서로에 대해 훨씬 밀접한 상동성을 가지기 때문에 의외의 결과는 아니다[참조예: Roberts, et al., 1992].

암소 단백질(BoIFNτ; Helmer, et al., 1987; Imakawa, et al., 1989)은 모체의 임신 감지에 있어서 OvIFNτ과 유사한 기능을 갖는다. 또한, 상기 단백질은 OvIFNτ과 고도의 아미노산 및 누클레오티드 서열 상동성을 공유한다. OvIFNτ와 BoIFNτ간의 핵산 서열은 5' 비코딩 영역의 경우 76.3%이고, 코딩 영역의 경우 89.7%이고, 3' 비코딩 영역의 경우 91.9%이다. 아미노산 서열 상동성은 80.4%이다.

N-말단 아미노산 서열이 있는 합성 올리고누클레오티드를 갖는 양의 포배 라이브러리를 프로우빙하여 얻어진 IFNτ cDNA(Imakawa, et al., 1987)는 사람, 마우스, 래트 및 돼지로부터의 IFNα와 45-55% 상동이고, 이제는 IFNΩ으로 언급되는 소 IFNαII와 70% 상동인 예상된 아미노산 서열을 갖는다. 수개의 cDNA 서열은 상이한 이소형을 나타낼 수 있는 것으로 보고되어 있다[참조예: Stewart, et al., 1989; Kelmann, et al., 1990; and charlier, M., et al., 1990]. 상기 서열은 모두 23개 아미노산 리더 서열 및 172개 아미노산 성숙 단백질을 코딩하는 585개 염기의 오픈 리딩 프레임을 지닌 약 1kb이다. 아미노 말단과 카르복실 말단을 나란히 갖는 4개의 나선형 다발로서의 IFNτ의 예상 구조는 이것이 제 1형 IFN으로서 분류됨을 지지한다[참조예: Jarpe, et al., 1994].

[표 1]

인터페론의 개요

양상	제 1형	제 2형
형태	α & ω	β	τ	γ
생성원	백혈구	섬유아세포	영양막	림프구
효과:
항바이러스성	+	+	+	+
항증식성	+	+	+	+
임신 표시	-	-	+	-

IFNτ는 제 1형 IFN과 통상적으로 관련된 다수의 활성을 나타내지만(상기 표 1 참조), 기타 제 1형 IFN과는 상당한 차이가 있다. 가장 두드러진 차이는 상기 설명된 임신에서의 이의 역할이다. 또 다른 차이로는 바이러스 유도이다. IFNτ를 제외한 모든 제 1형 IFN는 바이러스 및 dsRNA에 의해 용이하게 유도된다[참조예: Roberts, er al., 1992]. 유도된 IFNα 및 IFNβ 발현은 일시적이며 대략 수 시간 동안 지속된다. 대조적으로, IFNτ 합성은 유도된 경우 수 일 동안 지속된다[참조예: Godkin, et al., 1982]. 하나의 세포를 기준으로 하여, 다른 제 1형 IFN보다 300배 이상의 IFNτ이 생성된다[참조예: Cross and Roberts, 1991].

기타 차이점이 IFNτ 유전자의 조절 영역에 존재할 수 있다. 예를 들어, 사람 영양막 세포주 JAR을 소 IFNτ에 대한 유전자로 트랜스펙션시키면 항바이러스 활성이 유발되지만, 소 IFNΩ 유전자로 트랜스펙션시키면 항바이러스 활성이 유발되지 않았다. 이것은 IFNτ 유전자 발현에 관여하는 특이한 상호작용 (transacting) 인자를 암시한다. 이에 부합하여 IFNτ의 근위 프로모터 영역(126에서 전사 개시 부위까지)은 IFNα 및 IFNβ의 영역과 고도의 상동성을 갖지만, -126 내지 -450 영역은 상동성을 가지지 않아서 IFNτ 발현만을 증진시키는 것으로 관찰된다[참조예: Cross and Roberts, 1991]. 따라서, 다른 제 1형 IFN과 비교하여 상이한 조절 인자가 IFNτ 발현에 관여하는 것으로 여겨진다.

IFNτ 발현은 또한 종에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, IFNτ 발현이 반추동물의 수태산물 발생의 특정 단계(주로 13 내지 21일)에 제한된다고 하더라도, 예비 실험은 IFNτ의 사람형이 임신 기간 전체에 걸쳐서 구성적으로 발현됨을 제시한다[참조예: Whaley, et al., 1994].

A.IFNτ의 단리

OvIFNτ 단백질은 임신한 양으로부터 수집한 수태산물에서 단리되어, 참고문헌[Godkin, et al.,(1982) and Vallet, et alk., (1987)]에 의해 기술된 바와 같은 개질된 최소필수배지(MEM)에서 시험관내에서 배양될 수 있다. 상기 IFNτ은 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과에 의해 수태산물 배양물로부터 정제될 수 있다.단리된 IFNτ의 균일성은 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동[SDS-PAGE; Maniatis, et al., 1982; Ausubel, et al., 1988]에 의해 평가될 수 있으며, 정제된 IFNτ 샘플의 단백질 농도의 측정은 비신코닌 검정(bicinchoninic assay: BCA)을 사용하여 수행될 수 있다[참조예: Pierce Chemical Co., Rockford, Il; Smith, et al., 1985].

B.재조합 IFNτ 생성

재조합 IFNτ 단백질은 세균 세포 및 효모 세포와 같은 적합한 발현 시스템을 사용하여 임의의 선택된 IFNτ 폴리누클레오티드 단편으로부터 생성될 수 있다. IFNτ 누클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 단리는 참고문헌[Bazer, et al.(1994)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 상기 문헌에는 사람 IFNτ 유전자의 확인 및 단리가 기재되어 있다. 성숙한 사람 인터페론-τ(HuIFNτ) 단백질을 코드화하는 합성 누클레오티드 서열은 서열 번호 3로 제시되어 있다. 서열 번호 4는 성숙한 HuIFNτ 단백질에 대한 상응하는 아미노산 서열이다. 서열 번호 5는 천연 HuIFNτ인 게놈 DNA 클론 HuIFNτ의 리더 서열이 배제된 누클레오티드 서열이고, 서열 번호 6은 서열 번호 5로 제시된 서열에 의해 코드화된 성숙한 사람 IFNτ 단백질의 예상된 아미노산 서열이다.

IFNτ 발현 벡터를 생성하기 위해, IFNτ 코딩 서열(예를 들어, 서열 번호 1)을 발현 벡터, 예를 들어, 세균성 발현 벡터에 정위시키고, 표준 방법에 따라 발현시킨다. 적합한 벡터의 예로는 람다 gt11(Promega, Madison WI); pGEX(Smith, et al., 1975); pGEMEX(Promega); 및 pBS(Stratagene, La Jolla CA) 벡터가 포함된다. T7 RNA 폴리머라제 프로모터 또는 tac 프로모터와 같은 적합한 프로모터를 함유하는 기타 세균성 발현 벡터가 또한 사용될 수 있다. OvIFNτ 합성 폴리누클레오티드를 개질된 pIN III omp-A 발현 벡터 내로 클로닝하는 것은 재료 및 방법 부분에 기재된다.

본원에 기재된 실험을 위해, 서열 번호 1에 있는 OvIFNτ 코딩 서열을, 메탄올-조절된 알코올 옥시다아제(AOX) 프로모터와 Pho1 시그날 서열을 함유하는 효모 세포 형질전환용으로 적합한 벡터 내로 클로닝시켰다. 상기 벡터를 사용하여 피치아 파스토리스(P. pastoris) 숙주 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단백질을 발현시켰다[참조예: Invitrogen, San Diego, CA].

본 발명의 방법을 사용하여 IFNτ을 발현시키는 데 적합한 기타 효모 벡터에는 2 미크론의 플라스미드 벡터(Ludwig, et al., 1993), 효모 삽입성 플라스미드(YIps; 예를 들어, Shaw, 1988), YEP 벡터(Shen, et al., 1986), 효모 동원체 플라스미드(YCps; 예를 들어, Ernst, 1986) 및 발현을 조절할 수 있는 기타 벡터(Hitzeman, et al., 1988; Rutter, et al., 1988; Oeda, et al., 1988)가 포함된다. 바람직하게는 상기 벡터는 MFα1 프로모터(Ernst, 1986; Bayne, et al., 1988), GADPH 프로모터(글리세르알데히드-3-포스페이트-디히드로게나제; Wu, et al., 1991) 또는 갈락토스-유도성 GAL10 프로모터(Ludwig, et al., 1993; Feher, et al., 1989; Shen, et al., 1986)와 같은 효과적인 효모 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 효모 형질전환 숙주는 대표적으로 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)이지만, 상기 언급된 바와 같이, 형질전환에 적합한 기타 효모도 사용될 수 있다(예를 들어,Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris등).

또한, IFNτ 폴리펩티드를 코드화하는 DNA는 적합한 숙주 시스템에서 폴리펩티드를 발현시키는 상용으로 입수할 수 있는 다수의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 시스템에는 상기 기재된 세균 및 효모 발현 시스템 뿐만 아니라 하기의 시스템이 포함된다: 바쿨로바이러스 발현(Reilly, et al., 1992; Beames, et al., 1991; Clontech, Palo Alto, CA); 식물 세포 발현, 형질전환된 식물 발현(예를 들어, Gelvin and Schilperoot), 및 포유동물 세포내에서의 발현(Clontech, Palo Alto Ca; Gibco-BRL, Githersburg MD). 재조합 폴리펩티드는 융합 단백질 또는 천연 단백질로서 발현될 수 있다. 발현된 서열이 배지 내로 분비되는 것을 촉진시키는 리더 서열과 같은 다수의 특징이 발현 벡터 내로 공학처리될 수 있다. 재조합적으로 생성된 폴리펩티드는 전형적으로 용해된 세포 또는 배지로부터 단리될 수 있다. 정제는 염 분별, 이온 교환 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피를 포함하는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이 IFNτ 폴리펩티드를 기재로 하여 생성시킨 항체를 사용하여, 면역친화도 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

재조합 방법 이외에, IFNτ 단백질 또는 폴리펩티드는 적합한 항체를 사용하는 것과 같은 친화도에 기초한 방법에 의해 선택된 세포로부터 단리될 수 있다. 또한, IFNτ 펩티드는 당업자들에게 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수있다.

C.IFNτ의 무독성

제 1 형 IFN(IFNα 및 IFNβ) 뿐만 아니라 제 2형 IFN(IFNγ)은 상당한 세포독성을 나타낸다[참조예: Detre, 1974; Fent and Zbinden, 1987]. 이러한 IFN에 의해 발생된 해로운 독성 효과가 임상 실험 및 환자의 치료 동안에 관찰되었으며, 열, 오한과 혼수와 같은 인플루엔자-유사 증상, 심박 급속증, 메스꺼움, 체중 감소, 백혈구감소증 및 호중구감소증이 포함된다[참조예: Detre, 1974; Fent and Zbinden, 1987].

본 발명을 입증하기 위해 수행되며, 하기 실시예 1에서 상세히 기재된 실험에서, IFNτ은 상기 기재된 IFN 보다 상당히 낮은 세포독성을 갖는 것으로 나타났 다. 세포독성은 여러가지 IFN을 주사한 뉴질랜드 화이트 마우스(NZW)의 백혈구수(WBC), 림프구 % 및 전체 체중을 사용하여 생체내(실시예 1A)에서 평가하였다. 이 결과가 표 3에 기재되며, 표 2a에 요약되어 있다. IFNβ보다 높은 독성을 유도하는 것으로 공지된 10⁵U의 쥐과동물 인터페론-α(MuIFNα)를 주사한 지 12시간 후, 상기 마우스들은 백혈구수 감소, 림프구감소증 및 상당한 체중 감소를 나타냈다. 그러나, OvIFNτ를 주사한 동물에서는 이러한 독성과 관련된 결과가 전혀 나타나지 않았다. 독성 연구에 사용된 OvIFNτ의 농도는 EAE를 예방하는 데에 효과적인 것으로 밝혀진 농도와 동일한 농도였다(하기 실시예 2에 자세히 기재됨).

또한, 세포 독성을 시험관내에서 평가하였다(실시예 1B). 200,000U/㎖와 같이 고농도의 IFNτ에 노출된 L929 세포의 생존력은 대조군 수준에 근접하였으나, IFNβ는 7,000U/㎖과 같이 저농도에서도 독성 효과를 나타내었다(도 1). 또한, IFNτ은 발암성 세포주의 패널에서 시험하는 경우에는 독성이 결여된 것으로 나타났지만, 세포 복제를 억제시켰다. 동물 모델과 조직 배양물에서 IFNβ 및 IFNα의 독성과 IFNτ의 독성을 비교한 상기 및 추가 연구 결과(Bazer and Johnson, 1991; Johnson, et al., 1994; Bazer, et al., 1989; and Soos and Johnson, 1995)가 하기 표 2a에 요약되어 있다.

[표 2a]

IFNα 및 β가 아닌 IFNτ의 무독성을 입증하는 파라미터

독성
시험관내(세포 생존률)	IFNτ	IFNα	IFNβ
마우스 L929(IFN 50,000-200,000 U/㎖)	-	+	+
소 MDBK(IFN 50,000 U/㎖)	-	+	ND
사람 WISH(IFN 50,000 U/㎖)	-	+	ND
사람 말초 림프구(IFN 50,000 U/㎖)		+	+
HIV 감염된 사람의 말초 림프구(IFN 50,000-500,000 U/㎖)	-	+	ND
생체내(NZW 마우스)	IFNτ	IFNα	IFNβ
백혈구수	-	+	+
림프구 감소	-	+	+
체중 측정	-	+	±
+ 및 - 표시는 다양한 제 1형 IFN의 치료에 의해유도된 독성 또는 독성 없음을 나타낸다.생체내 연구를 위해 105U가 주사당 투여되었으며,세포수 및 체중은 주사후 12 시간 또는 24시간 후에평가하였다.ND는 측정되지 않음을 나타낸다.

IFN의 존재하에 배양된 MDBK 세포는 IFNα의 존재(50,000U/㎖)하에서 배양되는 경우 생존률이 감소하였으나, IFNτ의 존재하에서 배양되는 경우 생존률이 감소하지 않았다[참조예: Pontzer et al., 1991]. 유사한 결과가 사람 WISH 세포주에서도 얻어졌다. IFNτ 및 다른 IFN에 의해 유도된 독성(또는 독성 없음)을 사람의 말초 단핵 세포(HPMC) 및 HIV-감염된 HPMC를 사용하여 비교하였다. IFNτ는 배양된 HPMC에 대해 독성 효과를 나타내지 않았으나, IFNα 및 IFNβ는 모두 50,000U/㎖에서 세포 생존률을 감소시켰다[참조예:Soos and Johnson, 1995]. 또한, HIV-1으로 감염된 사람 림프구 및 HIV로 감염된 고양이과의 림프구는 IFNτ의 존재하에서 생존률이 감소하지 않았다[참조예: Bazer, et al., 1989]. 이러한 결과는 무한증식 세포주를 이용한 관찰로부터 추측된 IFNτ의 무독성이 사람 말초 혈액에도 적용됨을 나타낸다. 이 결과가 표 2a가 요약되어 있으며, 이는 주사된 IFNτ가 시험관내에서 및 생체내에서 시험되는 경우, 주사된 IFNα, IFNβ 및 IFNγ와 비교하여 독성이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 나타남을 입증한다.

본 발명을 입증하기 위해 수행된 추가 실험에서, 경구 투여 및 주사 투여된 OvIFNτ의 독성과 경구 투여 및 주사 투여된 IFNα 및 IFNβ의 독성을 말초혈 림프구 기능 저하에 의해 측정하여 비교하였다. 혈액은 꼬리에서 취하였으며, 백혈구(WBC)수는 혈구계를 사용하여 측정하였다. 감별 백혈구수를 라이트-짐사-염색 혈액 도말(Wright-Giemsa-stained blood smears)상에서 수행하였다.

이 결과가 하기 표 2b, 2c 및 2d에 기재되어 있다. 상당한 수준의 독성이 IFNα 또는 β가 투여된 마우스에서 검출되었으나, 10⁵, 2 x 10⁵또는 5 x 10⁵U의OvIFNτ 또는 PBS만이 투여된 마우스에는 현저한 림프구 감소가 검출되지 않았다. 이러한 데이터는 경구 투여된 OvIFNτ(주사 투여된 OvIFNτ와 마찬가지로)가 기타 제 1형 IFN에 비해 현저하게 감소된 독성을 지닌다는 것을 제시한다.

표 2b-2d

경구 투여후 IFN τ, β 및 α의 독성 비교

[표 2b]

IFN(투여량)	세포수(x 10³)
	경구 투여전
	총 WBC	림프구
PBS	7.0 ± 1.4	6.1 ± 1.2
τ(105)	7.5 ± 0.7	6.4 ± 0.6
τ(2 x 105)	6.5 ± 0.7	5.3 ± 0.6
τ(5 x 105)	7.5 ± 0.7	6.5 ± 0.6
β(105)	7.0 ± 0.7	5.9 ± 1.2
β(2 x 105)	7.5 ± 2.1	6.5 ± 1.8
α(105)	7.5 ± 0.7	6.6 ± 0.6

[표 2c]

IFN(투여량)	세포수(x 10³)
	경구 투여 18시간 후
	총 WBC	림프구	림프구 강하율(%)
PBS	-	-	-
τ(105)	7.0 ± 1.4	6.0 ± 1.3	6.2
τ(2 x 105)	7.0 ± 2.8	5.9 ± 2.4	0
τ(5 x 105)	7.5 ± 2.1	6.3 ± 1.8	3.1
β(105)	6.5 ± 0.7	5.1 ± 0.6	13.6
β(2 x 105)	6.5 ± 0.7	4.1 ± 0.4*	37.0
α(105)	6.5 ± 2.1	4.7 ± 1.6	28.8
*p < 0.05

[표 2d]

IFN(투여량)	세포수(x 10³)
	경구 투여 24시간 후
	총 WBC	림프구	림프구 강하율(%)
PBS	7.5 ± 0.7	6.4 ± 0.6	0
τ(105)	8.0 ± 2.8	6.9 ± 2.4	0
τ(2 x 105)	7.0 ± 1.4	6.0 ± 1.1	0
τ(5 x 105)	8.0 ± 4.2	7.0 ± 3.6	0
β(105)	6.5 ± 3.5	5.1 ± 2.8	13.6
β(2 x 105)	6.5 ± 0.7	4.0 ± 0.4*	38.5
α(105)	7.0 ± 0	5.0 ± 0**	24.2
*p < 0.05**p < 0.03

IV.자가면역질환 치료제로서 IFNτ

본 발명의 조성물 및 방법은 치료적으로 사용되어, 면역계 기능의 활성 과다 또는 활성 저하를 특징으로 하는 다양한 면역계 관련 질환을 완화시킬 수 있다. 이러한 질환에는 과다알레르기발현증, 및 다발성 경화증, 제 1형(인슐린 의존성) 당뇨병, 홍반성 루푸스, 근위축성 측삭 경화증, 크론병, 류마티스 관절염, 구내염, 천식, 알레르기, 건선 등과 같은 자가면역질환이 포함된다.

A.다발성 경화증에 대한 동물 모델 EAE에 대한 IFNτ 치료

1.다발성 경화증에 대한 동물 모델 EAE의 발병을 억제시키는 OvIFNτ

자가면역질환 치료에서의 IFNτ의 효능은 사람의 다발성 경화증(MS)을 관찰하기 위해 널리 연구되고 있는 항원에 의해 유도된 자가면역 동물 모델로서, 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)를 앓고 있는 설치동물로 평가할 수 있다. EAE는 미엘린 염기성 단백질(MBP) 또는 뇌염유발 펩티드 단편으로 민감성 마우스, 래트 또는 기니피그 계통(strain)을 면역시키므로써 유도시킨 자가면역 탈수초성 질환이다. 동물 모델 계통에서의 유전적 감수성은 부분적으로는 뇌염유발 펩티드가 특정한 클래스 II 주요 조직적합성 복합체(MHC-II) 분자에 결합하는 능력에 근거한다[참조예: Fritz, et al., 1983; Wraith, et al., 1989]. 특히, H-2^u반수체를 갖는 마우스는 EAE에 걸리기 쉽다. 민감성 마우스 계통으로는 PL/J 마우스(Klein, et al., 1983), (PL/J x SJL)F₁마우스(Zamvil, et al., 1990; Wraith, et al.), B10.PL 마우스(Figuero, et al., 1982), NZW 마우스(Kotzin, et al., 1987), 및 (NZB x NZW)F1(Kotzin, et al.) 마우스가 포함된다.

γ-인터페론(IFNγ) 및 β-인터페론(IFNβ)는 다발성 경화증을 치료하는 데 효과적인 것으로 입증되었다[참조예: Johnson, et al., 1994; IFNβ Multiple Sclerosis Study Group, 1993). 사실상, IFNβ는 다발성 경화증의 치료제로서 FDA에서 공인되었다. β-IFN은 MS에 효과적이지만, 비교적 독성이 높으며, 결과적으로 바람직하지 않은 부작용이 많다. 그러나, 상기에 기술된 바와 같이, IFNτ는 다른 인터페론보다 독성이 상당히 낮으며, 이에 따라 바람직하지 않은 부작용이 거의 나타나지 않을 수 있다.

본 발명을 입증하기 위해 수행되며, 실시예 2에서 상세히 설명된 실험으로, IFN-τ의 EAE 유도 방지능에 대해 시험하였다. EAE는 뉴질랜드 화이트(NZW) 마우스를 소의 미엘린 염기성 단백질(bMBP)로 면역시켜 유도하였다. 상기 마우스를, MBP로 면역시킨 당일에 재조합 양의 IFN-τ(OvIFNτ) 또는 쥐과동물의IFN-β(MuIFN-β)를 1회 복강내 주사하거나, MBP로 면역시키기 48시간 전, 당일 및 48시간 후에 상기 인터페론을 3회 복강내 주사하였다.

이 실험의 결과가 표 4에 요약되어 있다. EAE의 평균 중증도에 대한 시간 경과가 도 2에 나타나 있다. 부호는 하기와 같다: △ - 대조군 동물;

- OvIFNτ 1회 투여; □ - OvIFNτ 3회 투여.

면역 당일에 주사된 모든 동물(허위 주사 및 IFN 주사)은 EAE가 발병되었지만, 중증도는 감소되었고, 발병 평균일은 대조군 동물(16.2 ± 0.8 일)에 비해 OvIFNτ로 처리된 동물(23.8 ± 0.5 일) 및 MuIFN-β로 처리된 동물(23.5 ± 0.6일)에서는 지연되었다.

3회 투여 프로토콜을 사용하여 얻어진 결과가 보다 바람직하다. 9마리의 대조군 동물중 7마리가 면역후, 평균 15.2 일째에 EAE에 걸렸다. 대조적으로, OvIFNτ로 처리된 9 마리의 동물은 모두 상기 질병에 걸리지 않았으며, MuIFN-β로 처리된 9 마리 동물중 한 마리가 EAE에 걸렸다(면역후 22일째).

상기 데이터는 IFNτ가 EAE의 예방에 대한 효과적인 면역 치료제이며, 자가면역질환의 상기 모델에서 MuIFN-β 만큼 효과적인 치료제임을 입증한다. IFNβ에 비해 IFNτ의 독성이 보다 낮다는 것을 고려하면, 상기 데이터는 자가면역질환(예를 들어, 다발성 경화증)이 있는 개체를 IFNτ로 치료하는 것이 바람직하며, IFNβ로 치료하는 것보다 효과적임을 나타내고 있다.

2.T-세포 증식을 억제시키는 OvIFNτ.

MBP로 자극된 MBP-면역된 NZW 마우스로부터의 비장 세포의 증식에 대한 IFNτ의 효과를 시험관내에서 평가하였다. 이 결과가 도 3에 나타나 있다. MBP에 반응하여 일어난 증식은 격렬하였고, 용량 의존 방식으로 IFNτ에 의해 감소될 수 있었으며, 이는 IFNτ가 자가 항원인 MBP에 대해 특이적인 T 세포에 대해 증식 억제 활성이 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 상기 T-세포의 억제가 자가면역 반응의 중증도를 감소시키는 것으로 예상되기 때문에, IFNτ가 MBP-유도된 EAE의 증상을 억제하거나 제거한다는 관찰과 일치한다.

3.EAE의 초항원 재활성화를 억제시키는 OvIFNτ

MS의 증상은 흔히 재발-완화 방식으로 발생하는 것으로 관찰될 수 있다. 이러한 형태의 MS는 MS의 임상적 증상 후에 완화 기간을 나타내는 것으로 이루어진다. 어떻게 재발되고 악화되었는지와 자가면역질환 재활성화의 원인이 무엇인가가 주로 고찰되어 왔다. 자가면역질환을 악화시키는 데 환경적 영향이 기여하거나 원인이 될 수 있는 것으로 제안되었다. 이러한 영향은 잠재적으로 감염원 뿐만 아니라 면역자극 활성을 갖는 인자에 노출되는 것을 포함한다. 우리의 환경에서 어디에나 있는 단백질중 한 부류가 미생물 초항원이다.

미생물 초항원은 여러 세균, 바이러스, 및 매우 강력한 면역자극 활성을 갖는 미코플라즈마와 같은 기타 생물체에 의해 생성된 독소이다[참조예: Langford, et al., 1978; Carlsson and Sjorgren, 1985; and Johnson and Magazine, 1988]. 상기 초항원은 식중독 및 독성 쇼크 증후군을 포함하는 많은 질병의 원인이 된다[참조예: Bergdoll, et al., 1981]. 초항원에 의한 이러한 강력한 면역자극은 초항원이 주요 조직적합성 복합체 클래스 II 분자에 결합한 후, 2성분의 복합체로서 β-사슬 가변 영역(Vβ)-특이적 방식으로 T 세포 수용체에 결합하는 능력에 근거한다[참조예: Johnson, et al., 1991; Janeway, et al., 1989; White, et al., 1989; Carlsson, et al., 1988; and Fleischer and Schrezenmeier, 1988]. 이러한 결합은 T 세포 레퍼토리의 20%가 증식되도록 T 세포를 활성화시킨다[참조예: Johnson, et al., 1991].

초항원으로 유도된 T 세포 증식은 인터류킨(interleukin) 2(IL2), IFNγ, 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα)를 포함하는 다량의 시토킨 생성을 수반한다. 초항원 자극에 의해 유도된 시토킨중 IFNτ 및 TNFα은 자가면역 발병의 매개체로서 관련되어 있다. IFNγ는 임상 실험에서 MS 악화의 원인이 되는 것으로 나타났다[참조예: Panitch, et al., 1987a; Panitch, et al., 1987b]. TNFα의 생성은 EAE를 입양 전이시키는 데 사용되는 특정 T 세포주의 뇌염 유발에 필요할뿐만 아니라(Powell, et al., 1990) 미엘린이 시험관내에서 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 치사시키도록 하는데(Selmaj and Raine, 1988) 필요한 것으로 밝혀졌다.

본 발명을 입증하기 위한 실험에서 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 장독소 B(SEB)-유도된 시토킨 생성이 또한 IFNτ에 의해 변경되었다. MBP-면역된 마우스로부터의 비장 세포를 IFNτ의 존재 또는 부재하에 시험관내에서 SEB로 자극하고, 상청액을 TNFα 및 IFNγ 생성에 대해 조사하였다. IFNτ을 SEB로 자극된 배양물에 첨가한 경우 TNFα 및 IFNγ의 생성이 상당히 감소되었다. 상기의 관점에서,이러한 결과는 IFNτ가 EAE의 중증도를 감소시킬 수 있다는 것과 일치하며, IFNτ가 MS의 악화를 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

EAE의 임상적 재발로서 입증된 악화는 먼저 미생물 초항원의 투여에 의해 입증되었다. PL/J 계통에서, EAE의 급성 에피소드가 일반적으로 고멸되고, 임상적 재발이 발생하지 않는 것으로 나타났다[참조예: Fritz, et al., 1983]. MBP로 면역시켜 유도된 EAE의 모든 임상적 징후가 소멸된 후, 스타필로코쿠스 아우레우스(aureus) 장독소(SE) 초항원, SEB 또는 스타필로코쿠스 장독소 A(SEA)를 투여하는 것이 질병 재활성화의 원인이 되는 것으로 나타났다[참조예: Schiffenbauer, et al., 1993]. SEB 다수회 주사에 의해 EAE가 재활성화되고 소멸될 수 있었던 4개월 기간 동안 질병 악화의 다수의 에피소드가 나타났다[참조예: Schiffenbauer, et al., 1993]. SEB에 의한 EAE의 재활성화는 NZW를 포함하는 기타 민감성 계통에서도 발생하는 것으로 밝혀졌다. 또한, SEB는 MBP의 아세틸화된 아미노 말단 펩티드가 면역원으로서 사용되는 경우 질병을 재활성화시킬 수 있다 (Brocke, et al., 1993).

EAE의 재활성화 이외에, SEB는 또한 MBP로 면역시키기 전에 투여되는 경우, EAE를 예방할 수 있다[참조예: Soos, et al., 1993; 및 Kalman, et al., 1993]. EAE의 최초 유도의 원인이 되는 Vβ8⁺T 세포 서브셋(subset)의 아네르기 및/또는 삭제(deletion)가 이러한 보호에 대한 메카니즘인 것으로 보인다. 그러나, Vβ 특이적 T 세포 집단의 표적화는 EAE의 발병으로부터 완벽하게 보호하지는 않는다.SEB 전처리에 의해 EAE의 발병으로부터 보호된 마우스가 SEA(SEB와는 상이한 Vβ T 세포 특이성을 갖는다)에 노출되는 경우, EAE의 유도가 일어나지 않는다. 이러한 SEA로 유도된 EAE는 심각한 마비증상 및 임상적 증상의 가속된 발병을 특징으로 한다. 따라서, 미생물 초항원의 효과는 EAE와 같은 자가면역질환 모델을 매우 복잡하게 하는 데, 이러한 복잡성은 MS에서 관찰된 병인의 복잡성과 유사하다.

초항원에 의해 유도된 EAE의 악화에 대한 OvIFNτ 치료 효과를 실시예 4에서 NZW 마우스로 평가하였다. 이 연구는 또한 PL/J 마우스에서 수행되었다. 10⁵U로 3회(SEB 주사 48 시간 전에, SEB 주사 당일 및 SEB 주사 48 시간 후) 투여되는 경우, OvIFNτ 치료는 초항원에 의한 EAE 재활성화를 차단하였다. 대조적으로, 치료되지 않은 대조군은 종래 연구에 일치하여 EAE의 초항원 재활성화를 나타내었다[참조예: Schiffenbauer, et al., 1993].

OvIFNτ이 EAE의 초항원 유도된 악화를 차단할 수 있다는 사실은 IFNβ1b로 치료받고 있는 MS 환자에게서 질병 악화의 감소에 대한 추론일 수 있다. OvIFNτ가 EAE의 발생 및 초항원 재활성화를 예방할 수 있다는 상기 연구에 대한 요약이 표 5에 기재되어 있다. 이 결과는 IFNτ이 또한 MS와 같은 자가면역질환의 경과에 대한 환경 요인의 효과를 조절할 수 있음을 입증한다.

본 발명을 입증하기 위해 수행된 추가 실험에서, MBP의 제 2 면역화가 EAE를 재활성화시킬 수 없으며, 초항원의 주입이, MPB로 면역시켰으나 EAE에 걸리지 않은 PL/J 마우스에 임상 질환의 최초 에피소드를 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 상기 실험은 추가로 이러한 유도는 IFNτ 치료에 의해 차단될 수 있으며, IFNτ가 IFNβ1b 치료된 MS 환자에서 관찰된 질병 악화 감소와 유사하게 초항원으로 유도된 EAE 악화를 차단할 수 있음을 입증하였다.

4.Vβ-특이적 T-세포 활성화를 억제시키는 IFNτ

SEB로 유도된 Vβ 특이적 T 세포 증식(expansion)에 대한 시험관내 IFNτ 치료 효과가 실시예 5에 기술된 바와 같이 평가되었다. Vβ 특이적 T-세포 FACS 분석은 미처리(naive), SEB 주사, 또는 IFNτ 및 SEB 주사된 NZW 마우스에 대하여 수행되었다. 주사후 72시간 후 분석하였다.

예시적 실험 결과가 도 5에 기재되어 있다. 빈 막대는 미처리 동물이고, 쌍점 막대는 SEB를 주사한 동물을 나타내고, 점선 막대는 IFNτ 및 SEB를 주사한 동물을 나타낸다. 미처리 NZW 마우스는 5.1 ± 0.1%의 Vβ8⁺CD4⁺T 세포를 나타냈으며, 이는 SEB의 주사후에 10.2 ± 0.2% 로 증식되었다. IFNτ 주사가 SEB 주사에 선행하는 경우, Vβ8⁺CD4⁺T-서브셋의 증식은 7.6 ± 0.2%로 제한되었다. Vβ7⁺및 Vβ11⁺T 세포(이에 대해 SEB는 또한 특이적이다)의 부분적 억제가 또한 관찰되었다.

이러한 데이터는 IFNτ 치료가 생체내 SEB-유도된 Vβ T 세포 확장을 부분적으로 억제할 수 있음을 나타내며, 또한 IFNτ이 MBP-유도된 EAE의 중증도를 감소시킨다는 결과를 뒷받침한다.

B.기타 자가면역질환 모델

EAE 이외에, 자가면역질환이 있는 기타 동물 모델을, IFNτ의 치료 효과를 평가하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스의 특정 계통은 사람의 전신 홍반성 루푸스와 유사한 질병인 쥐과동물 전신 홍반성 루프스에 특히 걸리기 쉽다. 특히, MRL-lpr/lpr루푸스 마우스(Singer, et al., 1986)는 사람 전신 홍반성 루푸스와 동일한 많은 면역학적 특징을 나타낸다. 상기 동물은 림프양 기관 확대부 및 증가된 T-세포 증식을 지니며, V_β유전자 발현은 V_β8.2/8.3유전자를 위해 상당히 왜곡되어 있다[참조예: Singer, et al.].

MRL-lpr/lpr마우스는 잭슨 레보러토리(Jackson Laboratory)(Bar Harbor, ME)로부터 구할 수 있다. MRL-lpr/lpr마우스의 발병은 자발적이기 때문에(약 3개월령), EAE의 경우에서와 같이 상기 질병을 유도할 필요가 없다. 상기 병의 진행에 대한 IFNτ의 효과를 평가하기 위해, 상기 동물을 소정의 나이(예를 들어, 6주령)에서 시작하여 소정의 기간(예를 들어, 6개월령이 될 때까지) 동안 소정의 간격(예를 들어, 2주마다 1회)으로 IFNτ(예를 들어, 상기 기재된 바와 같은)를 주사하여 치료한다.

치료 효과는 여러 방법으로 평가될 수 있으며, 예를 들어, 치료된 군 및 치료되지 않은 군의 동물의 비장 및 림프절에서 Vβ8⁺T 세포의 상대적 개수를 상기 기술된 FACS 분석법을 사용하여 측정할 수 있다. IFNτ의 효과적인 투여량은 Vβ8⁺T 세포의 수를 상당히 감소시킨다. 또한, 상기 질병의 신체적 증상(림프양 증식증, 귀의 괴사, 탈모)은 정량화될 수 있으며(Kim, et al., 1991), 치료된 군과 치료되지 않은 군을 비교할 수 있다. 상기 동물은 또한 IFNτ으로 치료한 후에 김(Kim)등의 문헌에 기재된 바와 같이 단백뇨가 있는 신장염의 감소 및/또는 ds-DNA -특이적 항체의 감소에 대해 평가될 수 있다.

IFNτ의 치료적 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있는 자가면역질환의 기타 동물 모델은 개에서 애쥬번트로 유도된 관절염이다[참조예: Kaplan, et al., 1993].

V.경구적으로 투여된 IFNτ의 효능

본 발명을 입증하기 위해 수행된 실험에서, 경구적으로 투여된 IFNτ 폴리펩티드 조성물은 자가면역질환(예를 들어, 다발성 경화증)과 같은 IFNτ에 의한 치료로 이롭게 되는 질환 또는 질환 상태의 치료와 관련하여 주사된 IFNτ 조성물과 효능에 있어서 필적할 만한 것으로 입증되었다.

하기에 논의되는 바와 같이, IFNτ 치료로 이롭게 되는 질병(EAE)을 치료하는 데 경구적으로 투여된 IFNτ은 효과적일 뿐만 아니라, 경구 투여 경로는 주사된 IFNτ 조성물로 치료하는 것에 비해 예상치 못했던 이점을 갖게 한다. 예를 들어, 경구적으로 투여된 IFNτ는 치료된 개체의 혈청에서 항-IFNτ 항체 농도를 상당히 낮아지도록 한다(실시예 12 참조). 이것은 경구적으로 투여된 IFNτ가 숙주 면역 반응에 의해 비효과적이 되는 것이 덜해지며(즉, 치료 및 용량 수준에 대한 탈감작이 상당히 감소한다), 치료를 받는 개체가 이러한 면역 반응의 결과로서 해로운 부작용을 덜 앓게 될 것이기 때문에 유리하다.

상기 사실 및 관련된 결과를 증명하는 실험 결과가 하기에 기재된다.

A.EAE 발병을 억제시키는 경구적으로 투여되는 IFNτ

실시예 6에서 설명되는 실험에서, 경구적으로 투여된 IFN-τ 및 주사된 IFN-τ의 EAE 유도 예방능에 대해 시험하였다. EAE는 소의 미엘린 염기성 단백질(bMBP)로 면역된 뉴질랜드 화이트(NZW) 마우스에서 유도되었다. 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)를 유도하기 위해 소의 미엘린 염기성 단백질(bMBP)로 면역시키기 48 시간 전, 면역 당일 및 면역 48시간 후에, 복강내 주사 또는 경구 투여에 의해 OvIFNτ을 수용자 NZW 마우스에 투여하였다.

OvIFNτ의 경구 투여 및 복강내 주사는 모두 EAE를 방어하였다(실시예 6, 표 6). IFNτ가 복강내 주사로 투여된 모든 동물 및 IFNτ이 경구적으로 투여된 9마리의 동물중 7마리는 EAE 증상으로부터 보호되었다. 또한, 항-OvIFNτ 모노클로날 항체 HL 127은 EAE를 차단하는 OvIFNτ의 능력을 부분적으로 중화시키는 데에 효과적이었다. 이러한 실험은 경구적으로 투여된 IFNτ가 다발성 경화증이 있는 동물 모델인 EAE의 증상을 치료하는 데 효과적임을 입증한다.

B.경구 투여후 혈청에 존재하는 OvIFNτ

경구적으로 투여된 IFNτ가 순환계로 들어가는 것을 확인하기 위해, IFNτ가 복강내 주사 또는 경구 투여된 마우스의 혈청을 실시예 7에 기재된 세포병변효과(항바이러스성) 분석법(Familetti, et al., 1981)을 사용하여 IFNτ의 존재에 대해 시험하였다.

이 결과가 도 6에 나타나 있다. 특이적 활성은 MDBK 세포를 사용하는 항바이러스 분석으로부터 수득된 항바이러스 단위/㎎ 단백질로 표시되어 있다. OvIFNτ는 200 U/㎖의 양으로 경구 투여(쌍점 막대)한 후 2시간까지 검출되었다. 이 데이터는 경구적으로 투여된 IFNτ가 순환계로 들어가며, 투여된 후 약 2시간 동안 혈청에 잔류함을 나타낸다.

C.EAE의 만성 재발을 예방하는 OvIFNτ

EAE와 관련된 증상의 발병을 예방하는 것 이외에, 경구적으로 투여된 OvIFNτ은 실시예 8에 상세히 설명되는 바와 같이, EAE의 만성 재발 모델에서의 마비를 예방한다. OvIFNτ 처리되지 않은, MBP로 면역시킨(EAE를 유도하기 위해) 5마리의 마우스 전부가 만성 재발 마비를 일으켰으나, OvIIFNτ로 처리된(48시간 마다 복강내 주사되거나 경구 투여됨) 동물 5마리 중 4마리가 상기 질병으로부터 완전히 보호되었다(도 7B 및 7C). 이러한 데이터는 상기 기재된 결과를 뒷받침하며, IFNτ의 경구 투여가 만성 재발 EAE의 발병을 차단할 수 있음을 나타낸다. 또한, 상기 실험은 장기간에 걸쳐 매 48 시간에 1회로 드물게 IFNτ를 경구적으로 투여하는 것이 인터페론-τ에 의한 치료에 반응하는 질병 상태를 치료하는 데에 있어서 복강내 주사만큼 효과적임을 나타낸다.

D.IFNτ의 경구 투여후 EAE 마우스의 척수에 대한 조직학적 분석

또한, 척수 백질내 림프구 손상으로서 중추 신경계(CNS)에서 분명히 나타나는 질병의 세포 결과에 대한 OvIFNτ의 치료 효과를 분석하므로써 OvIFNτ의 EAE 예방능을 평가하였다. 상기 손상은 소정의 림프구가 CNS 내로 침윤되었음을 나타낸다. MBP-면역된 마우스를 처리하지 않거나(대조군), 경구 또는 복강내 경로에 의해 OvIFNτ로 처리하고, 척수 요부의 절편을 염색하고 실시예 9에 기재된 바와같이 림프구에 대해 평가하였다. 림프구 손상은 대조 동물의 척수 백질에 존재하였으나(도 8A), OvIFNτ가 복강내 주사(도 8B) 또는 경구 투여(도 8C)에 의해 치료된 마우스에서는 나타나지 않았다. 이러한 데이터는 IFNτ의 보호 효과가 CNS의 림프구 침윤을 억제시키는 것과 관련되어 있음을 나타낸다. 또한, 상기 데이터는 IFNτ 치료가 단순히 증상을 은폐시키기 보다는 자가면역질환의 세포 징후를 억제함을 입증한다.

E.OvIFNτ 치료 중단 결과로 인한 마비 재발

실시예 11에서 설명되는 실험은 MBP가 주입된 마우스의 EAE를 예방하는데 효과적인 치료 형태 및 치료 기간을 측정하기 위해 수행되었다. 치료가 지속되는 한(실시예 11에서 58일)은, 복강내 주사 또는 경구 투여(매 48시간)에 의한 OvIFNτ 치료에 의해 EAE로부터 마우스가 보호되었으나, OvIFNτ 치료를 중단한 후 상기 질병의 증상이 발병하였다(도 10). 이러한 결과는 IFNτ가 EAE(예를 들어, MS)와 같은 자가면역질환을 치료하지 않을 수도 있지만, 치료가 지속되는 한 상기 질환의 병리학적 징후를 억제하는 효과적인 치료제임을 나타낸다.

F.항-OvIFNτ 항체 반응을 감소시키는 OvIFNτ의 경구 투여

실시예 12에 상세히 설명한 바와 같이, 경구적으로 투여되는(주사에 대립되는 것으로서) IFNτ 치료의 한 가지 이점은 경구적으로 치료받은 개체에게서 항-IFNτ 항체 역가를 감소시킨다는 것이다. OvIFNτ 치료를 중단한 후, 각각의 치료군으로부터의 마우스의 혈액을 취하고, 혈청을 ELISA에 의해 항-OvIFNτ 항체의 존재에 대해 조사하였다. IFNτ가 복강내 주사에 의해 투여된 마우스는 증가된 항-IFNτ 항체 농도를 나타내었지만, IFNτ가 경구 투여된 마우스는 훨씬 낮은 항-IFNτ 항체 역가(일반적으로 3 내지 5배 낮음)를 나타내었다. 예상된 바와 같이, OvIFNτ 처리되지 않은 마우스는 항-OvIFNτ 항체를 전혀 나타내지 않았다.

또한, 상기 혈청을 MDBK 세포주에 대한 OvIFNτ 항바이러스 활성을 중화시킬 수 있는 능력에 대해 조사하였다. 복강내 주사 또는 경구적으로 투여된 마우스로부터의 혈청은 중화 활성을 전혀 가지고 있지 않다(표 7). 이러한 결과는 OvIFNτ의 경구적 투여가 OvIFNτ 단백질에 대해 유도된 항체 반응을 거의 피한다는 것을 나타낸다. 경구적으로 치료된 대상에서의 이와 같은 감소된 항체 반응은 IFNτ 치료의 바람직하지 않은 면역계 관련 부작용의 발생 가능성을 감소시킨다.

VI.응용

A.면역계 질환 치료제로서의 IFNτ

본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 질병에는 자가면역, 염증성, 증식성 및 과다증식성 질환과 면역학적으로 매개된 질병의 피부 손상 징후가 포함된다. 특히, 본 발명의 방법은 면역계 과민증과 관련된 질환을 치료하는 데 유리하다. 면역계 과민증에는 4개의 유형이 있다(Clayman). 제 1형인 즉시성/아나필락시성 과민증은 알레르겐(예를 들어, 꽃가루)에 반응하는 비만세포의 탈과립에 의한 것이며, 천식, 알레르기성 비염(건초열), 두드러기(발진), 아나필락시성 쇼크, 및 기타 알레르기 특성의 질병을 포함한다. 제 2형인 자가면역 과민증은 신체 고유의 세포상에서 감지된 "항원"에 대해 유도된 항체에 기인한 것이다. 제 3형 과민증은 여러 조직내에 머물고, 추가 면역 반응을 활성화시키는 항원/항체 면역 복합체의형성에 의한 것이며, 혈청병, 알레르기성 폐포염, 및 부우스터(booster) 예방접종후 때때로 형성되는 대형 종창과 같은 질환의 원인이 된다. 제 4형 과민증은 염증 반응을 초래하는 감작 T-세포로부터의 림포킨의 방출에 기인한다. 이의 예로는 접촉피부염, 홍역발진, 및 특정 약제에 대한 "알레르기" 반응이 포함된다.

특정 질환이 일부 개체에서 과민증을 일으킬 수 있는 메카니즘은 일반적으로 잘 이해되어 있지 않지만, 유전적 요인 및 외인성 요인 둘 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세균, 바이러스 또는 약제는 자가면역질환에 대해 이미 유전적 소인을 갖는 개체에게서 자가면역 반응을 일으키는 역할을 할 수 있다. 몇몇 유형의 과민증의 발생은 다른 유형과 상호관련될 수 있는 것으로 제안되었다. 예를 들어, 특정한 일반적인 알레르기가 있는 개체가 자가면역질환에 더 걸리기 쉽다는 것이 제안되었다.

자가면역질환은 주로 특정 기관 또는 조직으로 제한되는 것과 전신에 영향을 미치는 것으로 분류될 수 있다. 기관 특이적 질환(병에 걸린 기관)은 다발성 경화증(신경 돌기상의 미엘린 피복), 제 1형 당뇨병(췌장), 하시모토 갑상선염(갑상선), 악성빈혈(위), 애디슨병(부신), 중증근무력증(신경근 접합부에 있는 아세틸콜린 수용체), 류마티스 관절염(관절 내층), 포도막염(눈), 건선(피부), 길랑-바레 증후근(신경 세포) 및 그레이브병(갑상선)이 포함된다. 전신 자가면역질병에는 전신 홍반성 루푸스 및 피부근염이 포함된다.

과민증 질환의 기타 예로는 천식, 습진, 아토피성 피부염, 접촉피부염, 기타 습진성 피부염, 지루피부염, 비염, 편평태선, 천포창, 수포성 유천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 맥관부종, 맥관염, 홍진, 피부 호산구증다증, 원형탈모증, 죽상경화증, 원발 담즙성 간경변증 및 신증후군이 포함된다. 관련된 질병은 체강병, 직장염, 호산구증다증, 위소장염, 비만세포증, 염증성 장병, 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 장염증과 음식물 관련 알레르기가 포함된다.

본 발명의 방법을 사용하여 특히 치료받을 수 있는 자가면역질병에는 다발성 경화증, 제 1형(인슐린 의존성) 당뇨병, 홍반성 루푸스, 근위축성 측삭 경화증, 크론병, 류마티스 관절염, 구내염, 천식, 포도막염, 알레르기 및 건선이 포함된다.

IFNτ를 함유하는 약제가 치료적으로 사용되어 상기 기술된 질환과 같은 자가면역질환의 증상을 완화시킬 수 있다. 이러한 약제로 치료하는 것이 본원에서는 다발성 경화증에 대한 동물 모델인, EAE 치료와 관련하여 예시되어 있다.

B.생식 질환 치료제로서 IFNτ

IFNτ가 구조 및 강력한 항바이러스 특성에 근거하여 IFNα 류와 어느정도 유사하다고 할지라도, IFNα는 IFNτ와 관련된 생식 특성을 갖고 있지 않다. 예를 들어, 재조합 사람 IFNα는 투여량을 2배로 하더라도 IFNτ과 비교하여 발정 간격에 영향을 끼치지 않는다[참조예: Davis, et al., 1992].

따라서, IFNτ는 다른 인터페론과 구조적으로 약간의 유사성을 가진다고 하더라도, 매우 구별되는 고유한 특성을 갖는다. 예를 들어, 발정 주기의 생화학적 이벤트에 상당한 영향을 끼치는 특성이 있다.

본 발명의 IFNτ 조성물은 일반적으로 참고 문헌(Hansen, et al. (1991))에 기재된 바와 같이 포유동물 암컷에서 수정능을 향상시키고, 황체 수명을 연장시키는 방법에 사용될 수 있다. 본원의 설명에 따라, 수정능을 향상시키는 방법은 치료적 또는 약제학적 유효량의 IFNτ을 함유하는 약제를 경구적으로 투여하는 것을 포함한다. 또한, 상기 조성물은 유사하게는 자궁 및 태아-태반 조직의 성장 및 발육을 조절하는데 사용될 수 있다. 사람 IFNτ을 함유하는 조성물은 사람을 치료하는데 특히 유용한 데, 이는 잠재적인 항원 반응이 동일종 단백질을 사용하는 경우 아마도 덜 일어나기 때문일 것이다.

C.항바이러스 치료제로서의 IFNτ

IFNτ의 항바이러스 활성은 일반적으로 IFNα와 관련된 독성 효과 없이 광범위한 치료에 적용된다. 상기 기술된 바와 같이, IFNτ는 세포에 대한 부작용 없이 치료 활성을 나타낸다. IFNτ의 세포독성이 비교적 없다는 것은 이것을 생체내 치료제로서 매우 가치 있게 만들며, IFNτ을 대부분의 공지된 기타 항바이러스제 및 공지된 기타 모든 인터페론과 구별되게 한다.

IFNτ를 함유하는 제형 또는 약제는 바이러스 복제를 억제하기 위해 경구적으로 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 태아와 모체 간의 면역 관계에 영향을 미치기 위한 방법, 예를 들어, 모체 바이러스(HIV)가 발육 중인 태아에 전달되는 것을 예방하는 방법에 사용될 수 있다. 사람 인터페론-τ를 함유하는 조성물은 사람을 치료하는 데 특히 효과적인데, 이는 동종 단백질을 사용하는 경우 잠재적인 항원 반응이 덜 일어날 것이기 때문이다.

경구적으로 투여되는 IFNτ에 의해 치료될 수 있는 특이적 바이러스성 질병의 예로는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 비-A, 비-B, 비-C형 간염, 엡스타인-바르 바이러스 감염, HIV 감염, 헤르페스바이러스(EB, CML, 단순포진), 유두종, 폭스바이러스, 피코르나바이러스, 아데노 바이러스, 리노 바이러스, HTLV I, HTLV II, 및 사람 로타바이러스가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

D.항증식 치료제로서의 IFNτ

IFNτ는 강력한 세포 증식 억제 활성을 나타낸다. 따라서, 경구 투여에 적합한 IFNτ를 함유하는 약제학적 조성물 또는 약제가 현재 공지되어 있는 다른 인터페론과 관련된 부작용 없이 세포 성장을 억제시키는 데에 사용될 수 있다. 이러한 조성물 또는 제형은 종양 성장을 억제하거나, 예방하거나, 지연시키는 데 사용될 수 있다.

경구적으로 투여되는 IFNτ에 의해 치료될 수 있는 특이적 세포 증식 질환의 예로는 모발상 세포 백혈병, 카포시 육종, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 표재성 방광암, 피부암(기저 세포 암종 및 악성 흑색종), 신세포암종, 난소암, 저급 림프구성 및 피부 T 세포 림프종, 및 교종이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 특정 종양의 발병은 에스트로겐에 의해 매개된다. 본 발명을 입증하기 위해 수행된 실험에서는 IFNτ가 에스트로겐 수용체 수를 억제시킬 수 있음을 나타내고 있다. 그러므로, IFNτ 함유 조성물은 에스트로겐 의존성 종양의 치료 또는 예방에 특히 유용할 수 있다.

E.수의학적 응용

상기 설명된 본 발명의 방법의 용도 이외에, 본 발명의 방법은 사육되는 동물 및 야생 동물이 걸리는 여러가지 자가면역질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를들어, 개의 갑상선 부전증은 일반적으로 갑상선의 점진적 파괴에 의한 것이며, 이는 림프구성 갑상선염과 관련될 수 있다[참조예: Kemppainen and Clark, 1994]. 사람의 하시모토 갑상선염과 유사한 림프구성 갑상선염은 자가면역질환으로 여겨진다. 본 원에 설명된 바에 따라, 개에서의 림프구성 갑상선염으로 인한 갑상선 부전증은 상기 기술된 바와 같이 IFNτ를 함유하는 약제로 치료될 수 있다.

IFNτ 치료로 완화될 수 있는 개의 또 다른 유형의 자가면역질환은 항핵항체(ANA) 양성(positivity), 발열 및 혈청반응음성 관절염을 특징으로 한다[참조예: Day, et al., 1985]. 면역-매개된 혈소판 감소증(ITP; Kristensen, et al., 1994; Werner, et al., 1985), 전신 홍반성 루푸스(Kristensen, et al., 1993), 및 백혈구 감소증 및 크움즈 양성 용혈성 빈혈증(Werner, et al., 1985)이 또한 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료받을 수 있다.

VII.IFNτ의 투여

A.약제학적 조성물

IFNτ 또는 관련된 폴리펩티드 또는 단백질을 함유하는 치료 제제 또는 약제가 약제학적으로 유용한 조성물(약제)를 제조하기 위해 공지된 방법에 따라 제형화되어 제조될 수 있다. 인터페론 또는 인터페론 유사 화합물을 함유하는 제형은 이미 공지되어 있다[참조예: Martin, 1976]. 일반적으로, IFNτ를 함유하는 약제는 유효량의 IFNτ가 적합한 담체 및/또는 부형제와 조합되어 조성물을 효과적으로 투여되도록 제형화될 것이다. IFNτ 또는 관련된 폴리펩티드는 정맥내, 근육내, 병소내 또는 피하 주사를 포함하는 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 특히, 기타 인터페론 화합물에 대해 사용된 조성물 및 방법이 이들 화합물을 전달하기 위해 사용될 수 있다.

경구 투여에 적합한 조성물의 경우, IFNτ를 함유하는 정제 및 캡슐은 IFNτ(예를 들어, 동결건조된 IFNτ 단백질), 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 락토오스, 옥수수 전분, 경질 규산 무수물, 미정질 셀룰로오스, 수크로오스), 결합제(예를 들어, 알파 형태 전분, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈), 붕해제(예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분, 저치환된 히드록시-프로필셀룰로오스), 계면활성제(예를 들어, Tween 80, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 산화방지제(예를 들어, L-시스테인, 아황산나트륨, 아스코르브산나트륨), 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석)등과 같은 첨가제로부터 제조될 수 있다.

또한, IFNτ 폴리펩티드는 또한 고형, 분말성, 또는 기타 담체, 예를 들어 락토오스, 사카로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 예를 들어, 감자 전분, 옥수수 전분, 밀로펙틴(millopectine), 셀룰로오스 유도체 또는 젤라틴과 혼합될 수 있으며, 또한, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 또는 압축된 폴리에틸렌 글리콜 왁스를 포함시켜 정제 형태로 압축시킬 수 있다. 다층의 담체 또는 희석제를 사용하여 서방형 정제를 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 제제는 일릭서, 시럽 또는 현탁액, 예를 들어, 약 0.1 내지 약 30중량%의 IFNτ, 당, 및 에탄올, 물, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜 및기타 가능한 통상적인 첨가제의 혼합물을 함유하는 용액의 형태로 제조될 수 있다.

B.투여량

경구적으로 활성인 IFNτ 약제학적 조성물을 치료가 필요한 개체에게 치료 유효량으로 투여한다. 투여량은 매우 다양할 수 있으며, 병의 심각성, 환자의 연령 및 체중과 같은 요인, 환자가 복용하는 있는 기타 약물등에 의존한다. 상기의 양 또는 투여량은 일반적으로 주치의에 의해 결정된다. 상기 투여량은 일반적으로 약 1 x 10⁵내지 약 1 x 10⁸단위/일, 바람직하게는 약 1 x 10⁶내지 약 1 x 10⁷단위/일이다. 독성이 낮기 때문에, IFNτ은 예를 들어, IFNβ보다 고용량으로 투여될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 비교하기 위해, 다발성 경화증(MS)이 있는 환자를 IFNβ 10⁶U 및 8 x 10⁶U로 치료하였다. 8 x 10⁶U을 투여받은 환자는 10⁶U을 투여받은 환자에 비해 질병의 재발 횟수가 더 적었다. 그러나, 고용량(8 x 10⁶U)의 IFNβ가 투여된 환자는 또한 IFNβ의 독성과 관련된 부작용이 더 많이 나타났다(IFNβ 다발성 경화증 연구 그룹). IFNτ의 낮은 독성면에서, 다량의 효과적인 투여량이 관련된 독성 부작용 없이 투여될 수 있다.

혈장내에서 IFNτ의 농도를 서서히 상승시키는 것을 필요로 하는 질병은 약 2시간 내지 4시간 마다 경구 투여하거나, 약 12 내지 24시간 마다의 주사에 의한 투여로 유리하지만, MS와 같은 기타 질병은 빈번하지 않은 간격으로, 예를 들어, 48시간 마다 1회로, 치료 유효량으로 투여하므로써 효과적으로 치료될 수 있다. 개체 투여량의 투여율은 일반적으로 주치의에 의해 조절되어 가장 낮은 총 투여량으로 투여되도록 하면서 치료하는 질병의 중증도를 완화시킬 수 있다.

환자의 상태가 개선되면, 필요에 따라 유지 투여량이 투여된다. 이후, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두는 증상의 작용에 따라 개선된 상태가 유지되는 정도로 감소될 수 있다.

건선과 같은 피부에 영향을 미치는 자가면역질환은 IFNτ을 사용하여 병소내 치료될 수 있으며, 여기서, 제형과 투여량은 투여방법 및 치료하려는 병소의 크기 및 중증도에 의존한다. 바람직한 방법은 피내 및 피하 주사를 포함한다. 큰 병소에 다수회 주사가 가능할 수 있으며, 한 환자 피부상의 여러 병소가 한번에 치료될 수 있다. 서방출을 위해 고안된 제형은 투여 빈도를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 IFNτ 폴리펩티드로 국부 치료하는 것은 특이적 기관의 자가면역 질병을 치료하는 데 유용하다. 치료는 동맥내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 달성될 수 있다. 카테테르는 외과적으로 또는 혈관조영적으로 이식되어 병에 걸린 기관의 치료를 유도할 수 있다. 카테테르에 연결된 피하 문맥이 만성 치료에 사용될 수 있으며, 이식가능하고, 재충전가능한 펌프가 또한 사용될 수 있다.

선택적으로, 상기 조성물은 병에 걸린 조직에 직접 주사하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 류마티스 관절염을 치료하기 위해, 조성물은 병에 걸린 관절에 직접 주사하여 투여될 수 있다. 환자는 24시간 이상의 반복 간격으로, 환자의 질병 증상 발병후 몇 주 동안 치료받을 수 있다.

전신 치료는 모든 응용에 대해 본질적으로 동등하다. 경구 투여를 이용하는 전신 치료는 상기에서 논의되었다. 다수회의 정맥내 또는 피하 투여가 가능하며,치료를 위한 이식 방법의 경우 지속적인 방출을 위해 고안된 제형이 특히 유용하다. 환자는 또한, 이식가능한 피하 문맥, 저장고 또는 펌프를 사용하여 치료받을 수 있다. 투여의 기타 방법으로는 좌약 및 질내 투여가 포함된다. 예를 들어, 전신 홍반성 루푸스(SLE) 또는 MS를 치료하기 위해서, 상기 조성물은 IV 투여와 같이 경구 또는 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다.

C.병용 요법

물론, 본 발명의 조성물 및 방법이 다른 치료와 조합하여 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 고용량에서도 IFNτ이 비교적 독성이 없다는 점에서, 저용량의 IFNβ1b로 호전되지 않거나 독성으로 인해 IFNβ1b가 허용될 수 없는 MS 환자는 고용량의 IFNτ 또는 이로부터 유도된 펩티드로 후속하여 또는 동시에 치료하므로써 이득을 얻을 수 있다. 이러한 관점에서, IFNβ1b는 "제 2의 치료제"로 간주될 수 있다. 또한, 중화 항체의 생성이 IFNβ1b로 치료된 환자에서 입증되었다[참조예: Weinstock-Guttman, et al., 1995]. 이러한 중화 항체가 IFNβ1b의 효능을 저해하는 것으로 나타나는 경우, 항체 교차-반응성이 발생하지 않을 것이며, IFNτ은 중화항체를 생성시키지 않을 것이기 때문에, IFNτ은 중요한 대안적인 치료제가 될 것이다(실시예 12 참조). 경구적으로 투여된 IFNτ는 주사된 IFNτ보다 항-IFNτ 항체 반응이 상당히 낮기 때문에 이러한 관점에서 특히 유리하다.

본 발명에 의해 가능한 또 다른 병용 요법의 형태는 자가면역반응이 유도되는 항원을 IFNτ와 조합하여 경구 투여하는 것이다. 이러한 항원의 경구 투여는자가면역질병의 중증도를 감소시키는 내성을 생기게 할 수 있다[참조예: Weiner, et al., 1994]. IFNτ가 항원에 의해 유도된 내성과 함께 상승 효과를 가지므로써, 자가면역질환의 중증도를 완화시키는 것으로 여겨진다. 예를 들어, MBP는 EAE를 억제시키는 것으로 나타났다[참조예: Lider, et al., 1989]. 본 발명의 방법에 따라, MBP가(" 제 2 치료제"로서) 다발성 경화증을 치료하기 위해 IFNτ과 조합하여 투여될 수 있다. 기타 실례로는 류마티스 관절염을 치료하기 위해 콜라겐과 함께, 그리고 중증근무력증을 치료하기 위해 아세틸콜린 수용체 폴리펩티드와 함께 IFNτ를 투여하는 것이 포함된다.

또한, IFNτ는 다발성 경화증과 같은 자가면역질환을 치료하기 위해, 공지된 면역억제제, 예를 들어 스테로이드와 함께 경구적으로 투여될 수 있다. 면역억제제("제 2의 치료제")는 IFNτ과 상승적으로 작용하여 IFNτ의 상응하는 투여량 또는 면역억제제 단독으로 얻어질 수 있는 것보다 효과적인 치료가 될 수 있도록 한다.

유사하게, 암 또는 바이러스 질환을 위한 치료에 있어서, IFNτ는 예를 들어, 부술판(busulfan), 5-플루오로-우라실(5--FU), 지도부딘(ziduvudine)(AZT), 류코보린(leucovorin), 멜팔란(melphalan), 프레드니손(prednisone), 시클로포스파미드, 다카르바진(dacarbazine), 시스플라틴(cisplatin) 및 디피리다몰(dipyridamole)과 같은 하나 이상의 치료 유효량의 화학치료제와 함께 투여될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 이에 제한되지는 않는다.

재료 및 방법

A.완충액

인산염-완충 염수(PBS)

10 x 원액, 1ℓ:

NaCl 80g

KCl 2g

Na₂HPO₄-7H₂O 11.5g

KH₂PO₄2g

실험 용액, pH 7.3

NaCl 137mM

KCl 2.7mM

Na₂HPO₄-7H₂O 4.3mM

KH₂PO₄1.4mM

B.항체를 검출하기 위한 일반적 ELISA 프로토콜

폴리스티렌 96 웰 플레이트 임물론(Immulon) II(PGC)를 pH가 9.5인 0.1M의 탄산염/중탄산염 완충액중의 항원 5㎍/㎖(각 웰당 100㎕)로 피복시켰다. 각 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 4℃에서 밤새 저장하였다.

인큐베이션 후, 플레이트를 흡인하고, 300㎕의 10% NGS로 블로킹시키고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 플레이트를 PBS 0.5% "TWEEN-20"으로 5회 세척하였다. 항혈청을 pH 7.2인 0.1M의 PBS로 희석하였다. 목적하는 항혈청 희석액(0.1㎖)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 각각의 플레이트를 PBS 0.5% "TWEEN-20"으로 5회 세척하였다.

양고추냉이 페록시다아제(HRP) 컨쥬게이트된 염소 항-사람 항혈청(Cappel, Durham, NC)을 PBS로 1/5,000로 희석시켰다. 상기 용액 0.1㎖를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, PBS로 5회 세척하였다.

시그마 ABTS(기질)를 플레이트에 첨가하기 직전에 제조하였다. 이 시제는 50㎖의 0.05M 시트르산(pH 4.2), 0.078㎖의 30% 과산화수소 용액 및 15㎎의 ABTS로 이루어진다. 0.1㎖의 상기 기질을 각각의 웰에 첨가한 후, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 상기 반응을, 0.050㎖의 5% SDS(w/v)를 첨가하여 중단시켰다. 상대 흡광도를 410㎚에서 측정하였다.

C.OvIFNτ의 생성

합성 OvIFNτ 유전자를 표준 분자 방법(Ausubel, et al., 1988)을 사용하여, OvIFNτ 아미노산 서열(Imakawa, et al., 1987)을 코드화하는 DNA 서열의 연속 부분을 함유하는 올리고누클레오티드를 연결하므로써 생성시켰다. 생성된 IFNτ 폴리누클레오티드 코딩 서열은 위치 16 에서 531에 이른다: 172개의 아미노산 코딩 서열.

온길이 합성 유전자StuI/SstI 단편(540bp)을 개질된 pIN III omp-A 발현 벡터로 클로닝시키고, 대장균의 컴피턴트(competent) SB221 균주로 형질전환시켰다. IFNτ 단백질을 발현시키기 위해, 발현 벡터를 함유하는 세포를 암피실린을 함유하는 L-브로쓰에서 0.1-1의 OD(550㎚)까지 성장시키고, 3 시간 동안 IPTG(이소프로필-1-티오-b-D-갈락토시드)로 유도하고, 원심분리하여 수집하였다. 가용성 재조합 IFNτ를 초음파 또는 삼투압 분별에 의해 세포로부터 유리시켰다.

효모내 발현을 위해, IFNτ 유전자를 각각 5' 및 3' 말단에StuI및SacI제한 부위를 함유하는 PCR 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR: Mullis, 1987; Mullis, et al., 1987)을 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 단편을StuI 및SacII로 분해하고, "pBLUESCRIPT +(KS)"의SacII 및SmaI 부위에 연결하여, pBSY-IFNτ를 생성시켰다. 플라스미드 pBSY-IFNτ를SacII 및EcoRV로 분해하고, 합성 IFNτ 유전자를 함유하는 단편을 단리시켰다. 효모 발현 벡터 pBS24Ub[참조예: Sabin, et al., 1989; Ecker, et al., 1989]를SalI로 분해하였다. T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활 말단을 생성시켰다. 벡터 DNA를 페놀로 추출하고, 에탄올로 침전시켰다[참조예: Sambrook, et al., 1989]. 회수된 플라스미드를SacII로 분해하고, 아가로우스 겔 전기영동으로 정제하고, pBSY-IFNτ으로부터 단리된SacII-EcoRV 단편에 연결하였다. 생성된 재조합 플라스미드를 pBS24Ub-IFNτ로 명명하였다.

재조합 플라스미드 pBS24Ub-IFNτ를 대장균 내로 형질전환시켰다. IFNτ 삽입물을 함유하는 재조합 클론을 단리시키고, 제한 효소 분석으로 확인하였다. IFNτ 코딩 서열을 pBS24Ub-IFNτ로부터 단리시키고, 알코올 옥시다아제(AOX1) 프로모터를 함유하는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 벡터 내로 클로닝시켰다[참조예: Invitrogen, San Diego, CA]. 이후 상기 벡터를 사용하여 피치아 파스토리스 GS115 His 숙주 세포를 형질전환시키고, 단백질을 제조자의 지시에 따라 발현시켰다. 단백질을 배지내로 분비시키고, 연속적인 DEAE-셀룰로오스 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 의해 SDS-PAGE 및 은 염색에 의해 측정하여 전기영동 균질성까지 정제한다. 정제된 단백질은 마딘-다비(Madin-Darby) 소 신장(MDBK) 세포상에서의 항바이러스 활성에 의해 측정할 때 약 0.29 내지 약 0.44 x 10⁸U/㎎의 특이적 활성을 갖는다.

실시예 1

IFNβ, IFNγ 및 IFNτ의 독성

A.생체내 독성-세포수 및 체중 변화

NZW 마우스의 총 백혈구(WBC)수, 총 림프구수 및 체중 측정치에 미치는 IFNτ, IFNβ 및 IFNα(10⁵U/주사)의 생체내 치료 효과를 하기와 같이 평가하였다. 인터페론(OvIFNτ, MuIFNβ 및 MuIFNα)을 PBS 중의 총 용적 0.2㎖중 10⁵U의 농도로 뉴질랜드 화이트(NZW) 마우스의 군에 복강내 주사하였다[참조예: Jackson Laboratories, Bar harbor, ME]. 3 내지 4마리의 동물을 각각의 군에 포함시켰다. 백혈구(WBC) 수를 혈구계 및 표준 방법을 사용하여 주사 전 및 소정의 시간 후(일반적으로 12 및 24시간)에 측정하였다. 감별 백혈구수는 라이트-짐사-염색 혈액도말상에서 수행하였다. 주사전, 동물의 체중은 20 내지 23g 이었다. 이 결과가 하기 표 3에 요약되어 있다.

[표 3]

백혈구 수 및 체중 변화율에 의해 측정된 인터페론의 생체내 독성

IFNτ-처리된 마우스와 처리되지 않은 마우스간의 혈구수, 림프구수 또는 체중 변화는 큰 차이가 없는 것으로 관찰되었다. 대조적으로, IFNβ-처리된 마우스는 주사후 12시간 후에 림프구수가 31.7% 감소하는 것으로 나타났으며, 이것은 이후 12시간 이상 동안 지속되었다. IFNα-처리된 마우스는 주사 12 시간 후, 림프구 감소가 55.8% 였고, 체중이 상당히 감소한 것으로 관찰되었다. 상기 데이터는 IFNβ 및 IFNα와는 달리, IFNτ는 말초혈 세포수 및 체중 측정으로 입증된 바와 같이 상기 농도에서 생체내 독성이 없음을 나타낸다.

B.시험관내 독성-L929 세포 검정

IFN 치료에 대한 독성을 마우스 L929 세포주를 사용하여 시험관내에서 측정하였다. L929 세포를 6000 U/㎖ 내지 200,000 U/㎖의 OvIFNτ 또는 MuIFNβ로 처리하였다. 인터페론이 첨가되는 시간을 0으로 하고, 상기 세포를 72 시간 동안 인큐베이션시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 살아있는 세포의 %를 405㎚에서 흡광도를 측정하므로써 측정하였다.

예시적 데이터가 도 1에 기재되어 있다. 값은 배지만으로 처리된 L929 세포의 생존률을 100%로 하여 생존률 ± 표준 오차로서 제시하였다. 6000 U/㎖에서, IFNβ-처리된 세포는 77.0% ± 0.6% 생존률을 나타냈다. L929 세포의 생존률은 IFNβ 농도의 증가에 따라 용량의존적 방식으로 감소하였다. 대조적으로, L929 세포는 시험된 어떠한 IFNτ 농도에서도 생존률이 전혀 감소하지 않았다. 이러한 데이터는 IFNτ는 IFNβ와는 달리 시험관내에서 고농도에서 독성이 없음을 나타낸다.

종합하면, 상기 요약된 결과는 IFNτ은 IFNβ가 시험관내 및 생체내에서 모두 독성을 유도하는 농도에서 실질적으로 무독성임을 입증하는 것이다.

실시예 2

EAE 발병을 억제하는 IFN-τ

IFNτ를 EAE 유도 예방능에 대해 시험하였다. 수용자 NZW 마우스에 EAE를 유도하기 위해 소 MBP(bMBP)로 면역시킨 당일에 재조합 양의 IFN-τ(OvIFNτ) 또는 쥐과동물의 IFN-β(MuIFN-β; Lee Biomolecular, San Diego, CA) 10⁵U/㎖를 1회 복강내 주사하거나, EAE를 유도하기 위해 MBP로 면역시키기 48시간 전, 당일 및 48시간 후에 상기 인터페론을 3회 복강내 주사하였다.

EAE를 유도하기 위해, 300㎍의 bMBP를 8㎎/㎖의 H37Ra를 함유하는 완전 프로인트 애쥬번트중에서 에멀젼화시키고, 꼬리끝의 양측면중 어느 한 면에 주사하였다. 면역 당일 및 48 시간 후에, 400ng의 백일해 독소(List Biologicals, Campbell, CA)를 또한 주사하였다. 마우스의 EAE 징후에 대해 매일 조사하였으며, 병의 중증도를 하기와 같이 등급화하였다: 1 : 꼬리 긴장 상실, 2: 뒷다리 약해짐, 3: 대부전마비, 4: 하지 마비, 5: 빈사/치사.

[표 4]

EAE의 발병에 대한 IFNτ의 효과

치료	IFN 투여 횟수	발병률	평균 발병일	평균 중증도
없음	0	5/5	16.2 ± 0.8	3.0 ± 1.0
oIFNτ	1	5/5	23.8 ± 0.5	2.0 ± 1.0
MuIFN-β	1	4/4	23.5 ± 0.6	2.1 ± 1.6
없음	0	7/9	15.3 ± 1.4	2.6 ± 0.8
oIFNτ	3	0/9	--	--
MuIFN-β	3	1/9	22	0.5

이 실험의 결과가 상기 표 4에 요약되어 있다. 상기 데이터는 두개의 세트로 나뉜다. 첫 번째 세트(처음 3개열)는 IFN을 면역 당일에 실험 동물에 주사한 실험에 상응한다. 이 세트에 있는 모든 동물은 EAE에 걸렸으나, 평균 발병일은 대조군 동물(16.2 ± 0.8일)에 비해 OvIFNτ(23.8 ± 0.5일) 및 MuIFN-β(23.5 ± 0.6일)로 치료된 동물 둘 모두에서 지연되었다. 또한, 상기 기재된 바와 같이 정량화된 상기 질병의 평균 중증도는 대조군에 비해 IFN 처리군 둘 모두에서 감소되었다. OvIFNτ과 유사하게 1회 10⁵U의 MuIFNβ 투여는 발병을 7일 지연시켰다.

이 결과는 IFN을 3회(면역 전 48시간, 면역 당일 및 면역 후 48시간) 실험 동물에 투여한 복수회 투여 프로토콜의 경우 더 현저하였다(표 1의 4-6열). 대조군 동물 9마리중 7마리가 면역후 평균 15.2일에 EAE에 걸렸으나, OvIFNτ로 처리된동물 9마리중 한 마리도 상기 질병에 걸리지 않았다. MuIFN-β로 처리된 동물 9마리중 한 마리만이 면역후 22일에 EAE로 사망하였다.

상기 기재된 실험에서 평균 중증도의 시간 경과가 도 2에 나타나 있다. 대조군 동물의 데이터는 (△)로, OvIFNτ가 1회 투여된 동물의 데이터는 (

)로, OvIFNτ가 3회 투여된 동물의 데이터는 (□)로 표시되어 있다.

상기 데이터는 IFNτ가 EAE의 예방에 효과적인 면역치료제이며, 자가면역질환에 대한 상기 모델에서 MuIFNβ 만큼 효과적인 치료제임을 입증한다. IFNτ은 IFNβ에 비해 독성이 낮다는 것을 함께 고려하면, 상기 데이터는 IFNτ로 자가면역질환(예를 들어, 다발성 경화증)을 앓고 있는 개체의 치료에 바람직할 수 있으며, IFNβ로 처리하는 것보다 효과적임을 나타낸다.

실시예 3

T-세포 증식에 대한 INFτ 억제

시험관내에서 MBP로 자극시킨 MBP 면역된 NZW 마우스로부터의 비장 세포의 증식에 대한 INFτ의 효과를 하기와 같이 측정하였다. bMBP로 면역시킨 NZW 마우스로부터의 비장 세포를 [³H]티미딘 및 0, 10, 100 또는 1000 U/㎖의 OvINFτ의 존재하에 300㎍/㎖의 bMBP 중에서 배양시켰다. 증식을 [³H]티미딘 혼입에 의해 측정하였다.

결과를 도 3에 나타내었다. 데이터를 삼중 샘플의 분당 평균 수(cpm)로서 제공하였다. 제공된 cpm 값으로부터 백그라운드 cpm을 공제하였다. MBP에 반응하는 증식은 활발하였고, 용량 의존적 방식으로 IFNτ에 의해 감소될 수 있었다. 1000 U/㎖의 IFNτ은 증식을 MBP 단독에 반응하여 관찰되는 값의 1/2 미만의 값으로 감소시켰다.

상기 결과는 IFNτ가 자가 항원인 MBP에 대해 특이적인 T 세포에 대해 증식 억제 활성을 갖고, IFNτ가 MBP 유도 EAE의 증상을 억제하거나 제거한다는 견해와 일치됨을 나타낸다.

실시예 4

초항원 재활성화를 억제시키는 IFNτ

IFNτ를 NZW 마우스[참조 : Jackson LaboratoryM Bar Harbor, ME]에서 EAE의 초항원 재활성화 억제능에 대해 시험하였다. 상기 실험에 따르는 프로토콜의 개략도를 도 4A, 4B, 4C, 4D, 4E 및 4F에 도시하였다. 이들 도면은 하기에 기술되는 프로토콜과 관련하여 언급된다.

EAE의 유도를 위해, 300㎍의 bMBP 및 400ng의 백일해 독소(List Biological Technologies, Campbell, CA)를 8㎎/㎖의 H37Re를 함유하는 완전 프로인트 애쥬번트중에 에멀션화시키고, 꼬리끝의 양측면 중 어느 하나에 주사하였다(도 4A). 400ng의 백일해 독소를 함유하는 또 다른 주사액을 48시간 후에 투여하였다. 주사액은 EAE를 유도하였고, EAE는 피크를 나타내고(도 4B) 점차적으로 약해져서, 결국은 EAE의 모든 증상이 소멸되었다(도 4C).

SEB를 질병이 소멸된 지 한달 후에 투여하였다(도 4D). 마우스에, 초항원 재활성화를 위해 40㎍의 SEB(Toxin technology, Sarasota, FL) 및 400ng의 백일해독소(List Biological Technologies, Campbell, CA)(0.2ml의 PBS중)를 주사하기 48시간 전, 주사시, 및 주사한 지 48시간 후에, 10⁵U의 IFNτ를 3회 복강내 주사하였다. 대조군 마우스에는 단지 SEB 및 백일해 독소만을 주사하였다. IFNτ 제조물은 실시예 2에 기술된 것과 동일하였다. 마우스를 EAE의 징후에 대해 매일 검사하고, 질병의 중증도를 실시예 2에 기술된 바와 같이 등급화하였다.

[표 5]

EAE의 초항원 재활성화를 억제시키는 IFNτ

처리	IFN 투여 횟수	발병율	평균 발병일	평균 중증도
실험 1비처리OvIFNτ	03	3/40/4	6.0±1.7--	1.6±0.5--
실험 2비처리OvIFNτ	03	3/50/5	10.0±2.5--	1.4±0.4--

데이터를 상기 표 5에 요약하였다. 총 9마리의 대조군 마우스(IFNτ를 주입하지 않음) 중에서, 6마리가 EAE의 재활성화를 나타내었다. 평균 발병일은 제 1 실험에서는 6±1.7일이고, 제 2 실험에서는 10±2.5일이었다. 질병의 평균 중증도는 제 1 실험에서는 1.6±0.5이었고, 제 2 실험에서는 1.4±0.4이었다. 그러나, IFNτ으로 처리한 9마리의 동물 중에서, 어느 것도 질병의 증상을 나타내지 않았다.

실시예 5

Vβ 특이적 T 세포 활성화를 억제시키는 IFNτ

생체내에서 SEB로 유도된 Vβ 특이적 T 세포 증식에 대한 IFNτ 처리의 효과를 하기와 같이 평가하였다. FACS 시약을 캘리포니아, 산 디에고에 소재하는 파아밍엔(Pharmingen)으로부터 입수하였다. Vβ 특이적 T 세포 FACS 분석을, 미처리, SEB(50㎍)을 주사하거나, IFNτ(10⁵U) 및 SEB(50㎍)을 주사한 NZW 마우스에 대하여 수행하였다. 모든 주사액을 복강내 주사하고, 실시예 3에 기술된 바와 같이 투여하였다. 분석을 주사 72시간 후에 수행하였다.

FACS 분석을 위해, 약 10⁶개의 T 세포를 동물로부터 단리시키고, 45분 동안 비오틴 표지된 항-Vβ 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 세척하고, 15분 동안 스트렙트아비딘-피코에리트린과 함께 인큐베이션시킨 후, 또 다시 세척하고, FITC 표지된 항-CD4 항체와 함께 45분간 인큐베이션시켰다. 세포를 다시 세척하고, 샘플 당 10,000회로 2벌로 FACSort(Becton-Dickinson, Mountain View, CA) 분석하였다.

대표적 실험의 결과를 도 5에 나타내었다. 빈 막대는 미처리 동물을 나타내고; 쌍점 막대는 SEB를 주입한 동물을 나타내며; 점선 막대는 IFNτ 및 SEB를 주사한 동물을 나타내는 것이다. 값을 포지티브 염색된 세포 ± 표준 오차의 퍼센트로서 제공하였다. SEB를 주사한 Vβ8⁺CD4⁺T 세포 서브셋 및 IFNτ과 SEB를 주사한 Vβ8⁺CD4⁺T 세포 서브셋에 대한 값은 스튜던트 t 시험(P < 0.02)에 의해 나타나는 바와 같이 유의차를 나타내었다. 미처리 NZW 마우스는 5.1±0.1% Vβ8⁺CD4⁺T 세포를 나타내었다. SEB 50㎍을 주입시킨 후 이러한 서브셋은 10.2±0.2%로 증식하였다. 10⁵U의 IFNτ가 SEB 주입 보다 선행되는 경우, Vβ8⁺CD4⁺T 세포 서브셋의 증식은 7.6±0.2%로 제한되었다. Vβ7⁺및 Vβ11⁺T 세포(이에 대해 SEB가 또한 특이적임)의 부분 억제가 또한 관찰되었다.

상기 데이터는 IFNτ에 의한 처리가 생체내에서 SEB로 유도된 Vβ T 세포 증식을 부분적으로 억제시킬 수 있음을 나타내고, IFNτ가 MBP로 유도된 EAE의 증상을 억제하거나 제거함을 추가로 지지한다.

실시예 6

실험적 알레르기성 뇌척수염의 발병을 차단하는 경구 투여된 OvIFNτ

경구 투여된 IFNτ와 주사된 IFNτ를 EAE 유도 억제능에 대해 시험하였다. 수용자 뉴질랜드 화이트(NZW) 마우스에, EAE의 유도를 위해 bMBP에 의해 면역시키기 48일 전, 면역시, 및 48일 후에 OvIFNτ(10⁵U/㎖)를 주사 및 경구 투여에 의해 투여하였다. 10⁵U의 IFNτ을 총부피가 100㎕가 될 때까지 PBS와 혼합시키고, 식도 아래에 위치한 섭취관을 사용하여 위 내로 투여하였다. PBS 중의 IFNτ의 희석을 투여 직전에 수행하였다.

NZW 마우스에서의 EAE의 유도를 위해, 300㎍의 소 미엘린 염기성 단백질(bMBP)을 8㎎/㎖의 H37Ra(Mycobacterium tuberculosis, Difco, Detroit, MI)를 함유하는 완전 프로인트 애쥬번트(CFA)중에 에멀션화시키고, 꼬리끝의 양측면 중 어느 하나에 주사하였다. 면역시에 그리고 48시간 후에, 400ng의 백일해독소(List Biological Technologies, Campbell, CA)를 또한 주사하였다. SJL/J 마우스에서 EAE를 유도하기 위해, 마우스를 최초 면역 7일 후에 다시 면역시킨 것을 제외하고는, 기술된 바와 동일한 프로토콜을 사용하였다. 마우스를 EAE의 징후에 대해 매일 검사하였고, 질병의 중증도를 실시예 2에 기술된 바와 같이 등급화하였다.

항-OvIFNτ 모노클로날 항체(mAB), 즉 HL127을 사용하여 EAE의 억제가 OvIFNτ처리에 대해 특이적인 지의 여부를 측정하였다 (서열번호 2의 aa 139-172에 대해 유도된 항체 HL127은 MDBK 세포주를 사용하는 항바이러스 검정에서 OvIFNτ의 항바이러스 활성을 중화시킨다). HL127의 1:10 희석물을 복강내 주사 또는 경구 섭취에 의한 투여 전에 OvIFNτ와 함께 2시간 동안 인큐베이션시켰다. IFNτ 항원에 대해 유도된 항체를, 본원의 정보와 항체 생성에 대한 공지된 기법(예: Harlow, et al., 1988)을 조합하여 사용하여 생성시킬 수 있다.

결과를 하기의 표 6에 나타내었다. OvIFNτ의 경구 섭취 및 복강내 주사 둘 모두는 EAE의 급성 유도를 방지하였다. 복강내 주사를 통해 IFNτ를 투여받은 동물 중 어느 것도 EAE의 증상을 나타내지 않은 반면, 경구적으로 IFNτ를 투여받은 동물 중에서는, 9마리 중 7마리(78%)가 보호되었다. 항체 HL127은 EAE를 막기 위한 OvIFNτ의 능력을 부분적으로 중화시키는 데에 효과적이었다. 이러한 데이터는 경구 투여된 IFNτ가 다발성 경화증의 동물 모델에서 치료제로서 효과적임을 나타내는 것이다.

[표 6]

급성 EAE를 차단하고, NZW 마우스에서 OvIFNτ 특이적 단클론성 항체에 의해 역전될 수 있는 OvIFNτ의 경구 투여

투여 경로	처리	발병률	평균 발병일	평균 중증도
i.p.(복강내)	PBS	4/4	24.8±2.1	2.5±0
i.p.	OvIFNτ	0/4	--	--
i.p.	OvIFNτ+HL127	3/4	20.7±1.2	2.3±0.6
경구	PBS	7/9	22.0±1.0	2.7±0.6
경구	OvIFNτ	2/9	19	3
경구	OvIFNτ+HL127	5/8	20.7±0.6	3±0

OvIFNτ(10⁵U)를 MBP 면역 48시간 전, 면역시 및 48시간 후에 복강내 주사 또는 경구 투여에 의해 투여하였다. HL127, 즉 OvIFNτ에 대해 특이적인 단클론성 항체를 투여 전 2시간 동안 OvIFNτ와 인큐베이션시켰다.

실시예 7

경구 투여 후 혈청에서의 OvIFNτ의 검출

마우스(상기와 같이 처리함)의 혈청 중에서 검출할 수 있는 OvIFNτ의 양을 OvIFNτ의 경구 투여(상기와 같음) 또는 복강내 주사 후에 시간 경과에 따라 비교하였다. 마우스에 3×10⁵U의 OvIFNτ를 투여하고, IFNτ 투여 후에 0.5, 2, 4, 6, 24 및 48시간 째에 채혈하였다. 혈청을 세포 변성 효과(바이러스 플라크) 검정(Familetti, et al., 1981)으로 시험하여 샘플 중의 IFNτ의 양을 측정하였다.

간략하게, IFNτ의 희석물을 평평한 바닥 96 웰 플레이트에서 컨플루언시( confluency)까지 성장시킨 MDBK 세포에 첨가하고, 37℃에서 18 내지 24시간 동안인큐베이션시켰다. 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 실온에서 45분 동안 플레이트에 첨가하였다. 바이러스를 제거시키고, 메틸 셀룰로오스를 첨가시키고, 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 메틸 셀룰로오스의 제거 후에, 플레이트를 플라크의 가시화를 위해 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. IFN 중화의 측정을 위해, 500 U/㎖의 농도의 OvIFNτ을 37℃에서 1시간 동안 혈청 또는 HL127과 인큐베이션시켰다. 하나의 항바이러스 단위는 VSV로 감염시킨 비처리 MDBK(대조 플레이트)에 비해 단층의 파괴를 50% 감소시켰다. 모든 샘플을 동시에 검정하여 검정간 가변성을 제거하였다.

도 6에 도시된 바와 같이, OvIFNτ는 경구 투여(쌍점 막대) 0.5시간 후 및 2시간 후에 200 U/㎖의 농도로 검출되었다. 비교에 의해, 약간 더 높은 수준의 OvIFNτ가 복강내 주사(빈 막대) 24시간 후에 검출되었다. 상기 데이터는 IFNτ의 상기 용량이 경구 투여후 약 2시간 동안 혈청에서 검출될 수 있음을 보여준다.

실시예 8

경구 투여된 OvIFNτ에 의한 실험적 알레르기성 뇌척수염의 만성 재발의 예방

OvIFNτ의 마비 예방능을 EAE의 만성 재발 모델을 사용하여 시험하였으며, 여기에서 MBP로 면역시킨 SJL 마우스는 재발-완화 방식으로 증상이 일어나는 만성 형태의 질병을 나타내었다 (Zamvil and Steinman, 1990).

EAE를 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 SJL 마우스에서 유도하였다. 마우스를 실험 기간 동안 면역시에(0일) 그리고 매 48시간 후에 복강내 주사 또는 경구투여에 의해 10⁵U의 OvIFNτ으로 처리하였다. 도 7A에 나타난 바와 같이, MBP로 면역시켰지만 OvIFNτ로 처리하지 않은 SJL 마우스는 5/5 발병률로 만성 재발성 마비를 나타내었으며, 실험의 개시 14일 후에 약 2.5의 피크 평균 중증도를 나타냈다. 대조적으로, 복강내 주사 또는 경구 투여(각각 도 7B 및 도 7C)에 의한 OvIFNτ처리는 EAE로부터의 보호를 유발시켰다. OvIFNτ 처리군 둘 모두에서의 발병률은 1/5 동물로 감소하였고, 평균 중증도는 약 1.0이었다. 상기 데이터는 IFNτ의 경구 투여가 만성 재발성 EAE의 발병을 막을 수 있다는 것을 나타내고, IFNτ가 장기간 동안 약 48시간 마다 투여되는 경우, 경구 투여된 IFNτ가 복강내 주사 만큼 효과적일 수 있음을 제시하는 것이다.

실시예 9

조직학적 분석

경구 및 복강내 경로에 의해 OvIFNτ로 처리한 MBP 면역 마우스의 CNS 내로의 림프구 침윤의 정도를 측정하기 위해 조직학적 분석을 수행하였다. 마우스에 4% 파라포름알데히드를 살포하고, 척주를 제거하고 이를 2 내지 3일 동안 포르말린으로 처리하였다. 척수를 절개하고, 4℃에서 밤새 0.5% 슈크로오스 중에 침지시켰다. 척수 박편을 포매시키고, 이 박편을 마이크로토옴(microtome)으로 절단시켰다. 박편을 4% 파라포름알데히드 중에서 슬라이드에 고정시키고, 염증 침윤의 가시화를 위해 크레실 바이올렛으로 염색하였다.

결과를 222×의 최종 배율로 도 8A, 8B 및 8C에 나타내었다. 림프구 병변이대조 척수 백질에 존재하였다 (도 8A). 대조적으로, 복강내 주사(도 8B) 및 경구 투여(도 8C)에 의해 OvIFNτ으로 처리한 마우스에서는 어떠한 림프구 침윤도 검출되지 않았다. 이들 데이터는 IFNτ의 보호 효과가 CNS의 림프구 침윤의 억제와 관련됨을 나타내는 것이다.

실시예 10

OvIFNτ처리에 의한 IL10의 유도

만성 재발성 EAE의 예방을 위해 SJL을 OvIFNτ로 처리하는 동안, 마우스로부터 채혈하고, 혈청을 인터류킨 10(IL10)의 존재에 대해 시험하였다. 1회 IFNτ(10⁵U) 처리(복강내 주사 또는 경구 투여에 의해), 장기간 IFNτ(10⁵U) 처리(20일이 넘는 기간 동안 복강내 주사 또는 경구 투여에 의해), 또는 처리하지 않은 마우스로부터의 혈청을 제조업자의 지시에 따라 IL10 ELISA 킷(Genzyme, Cambridge, MA)을 사용하여 효소면역측정법(ELISA)에 의해 IL10에 대해 시험하였다. 모든 혈청 샘플을 2벌로 시험하였다.

대조군 마우스, 또는 복강내 주사 또는 경구 투여에 의해 OvIFNτ로 1회 처리된 마우스에서는 IL10이 검출되지 않았다. 대조적으로, 20일이 넘는 기간 동안 매 48시간 마다 복강내 주사 또는 경구 투여에 의해 OvIFNτ를 주입한 SJL 마우스는 이들의 혈청에서 IL10의 검출가능한 수준을 나타내었다(도 9). 상기 데이터는 IFNτ로 인한 IL10 생성이 OvIFNτ가 EAE의 발병을 예방하는 기여 메카니즘일 수 있음을 제시하는 것이다.

실시예 11

OvIFNτ치료의 중단은 재발성 마비를 유발한다

복강내 주사 또는 경구 투여(매 48일 마다)를 통한 OvIFNτ 치료에 의해 EAE로부터 보호된 SJL 마우스를 58일간 추적조사하였으며, 그 동안 발병은 관찰되지 않았다. OvIFNτ에 의한 처리를 중단하고, 마우스를 질병의 증상에 대해 추가로 22일 동안 관찰하였다.

결과를 도 10에 나타내었다. IFNτ 처리는 +로 표시되어 있고, IFMτ 처리의 중단은 그래프 아래에 -로 표시되어 있다. 각각의 처리군에서의 발병률은 다음과 같다 : PBS 대조군 = 3/4(정사각형); 복강내 주사 = 3/3(삼각형) ; 경구 투여 = 3/4(원).

OvIFNτ 처리에 의해 EAE로부터 사전에 보호시킨 마우스의 두 그룹 모두는 OvIFNτ 처리를 중단한 지 6 내지 12일 후에 마비의 징후를 나타내었다. 상기 데이터는 복강내 주사 또는 경구 투여에 의한 IFNτ의 계속적 투여가 EAE의 만성 재발성 모델에서 EAE로부터의 지속적 보호를 위해 바람직함을 나타낸다.

실시예 12

항-OvIFNτ 항체 반응을 감소시키는 OvIFNτ의 경구 투여

상기 실시예 11에 기술된 실험에서 OvIFNτ 처리의 중단 후에, 각각의 처리군으로부터의 마우스에서 채혈하고, 혈청을 항-OvIFNτ 항체(Ab)의 존재에 대해 시험하였다. 항원, 즉 OvIFNτ을 600ng/웰의 농도로 밤새 플라스틱 조직 배양 웰의 평평한 바닥에 흡착시키고, 후속하여 증발 건조시켰다. 플레이트를 비특이적 결합을 막기 위해 2시간 동안 PBS 중의 5% 밀크(Carnation)로 처리한 후, 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 처리하지 않은 마우스, 복강내 주사에 의해 OvIFNτ로 처리한 마우스 및 경구 투여에 의해 OvIFNτ로 처리한 마우스로부터의 혈청의 여러 희석물을 첨가하고, 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 결합을 양고추냉이 퍼옥시다아제에 결합된 염소 항-마우스 면역글로불린으로 평가하였다. o-페닐렌디아민 및 H₂O₂를 첨가하고 반응을 2M H₂SO₄로 종결시킨 후에, 색의 전개를 ELISA 플레이트 리이더(Bio-Rad, Richmond, CA)로 492 nm에서 모니터링하였다.

대표적 결과를 도 11에 나타내었다. 비처리군, OvIFNτ 처리-복강내 주입군 및 OvIFNτ-경구 섭취군(2마우스/군)으로부터의 혈청을 1:30(개방 막대) 및 1:120(폐쇄 막대)를 포함하는 다수의 희석액을 사용하여 ELISA에 의해 시험하였다. 경구 섭취에 의해 OvIFNτ가 투여된 마우스는 최소 Ab 수준을 나타내는 반면, 복강내 주입에 의해 OvIFNτ가 투여된 마우스는 상승된 수준의 항-OvIFNτ Ab를 나타내었다. 예측되는 바와 같이, OvIFNτ로 처리되지 않은 마우스는 항-OvIFNτ Ab를 나타내지 않았다.

혈청을 또한 상기 기술된 바와 같이 MDBK 세포에 대한 OvIFNτ 항바이러스 활성을 중화시키기 위한 능력에 대해 시험하였다. 결과를 하기의 표 7에 나타내었다. 복강내 주사된 마우스 또는 경구 투여된 마우스 중 어느 것도 중화 활성을 갖지 않았다. 상기 데이터는 IFNτ에 의한 경구 처리가 복강내 주사 처리된 개체에서 관찰되는 OvIFNτ 단백질에 대해 유도된 Ab 반응을 피하며, 어떠한 처리도 전형적으로 중화 항체를 발생시키지 않음을 제시한다.

[표 7]

복강내 주사 또는 경구 투여에 의해 OvIFNτ로 처리된 마우스로부터의 혈청은 중화 활성을 갖지 않는다

하기와 같이 처리된 마우스로부터의 혈청과공동배양된 500 U/㎖의 OvIFNτ	OvIFNτ 역가(U/㎖)
처리되지 않음	500
복강내 주사	500
경구 투여	500
HL127	< 50

본 발명이 특정 방법 및 구체예를 참고로 하여 기재되었으나. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 변화가 이루어질 수 있는 것으로 인지되어야 한다.

서열목록

(1) 일반적 사항

(ⅰ) 출원인: 플로리다 오브 유니버시티

(ⅱ) 발명의 명칭 : 자가면역질병의 치료방법

(ⅲ) 서열의 수 : 6개

(ⅳ) 해당 주소:

(A)성명 : 데링거 & 어소시에이트

(B)스트리트 : 슈트 250 캠브리지 애브뉴 350

(C)도시명: 팔로 알토

(D)주: 캘리포니아

(E)국명: 미국

(F)우편번호: 94306

(ⅴ) 컴퓨터 판독형태

(A)매체 유형 : 플로피디스크

(B)컴퓨터 : IBM PC 호환기종

(C)작업 시스템 : PC-DOS / MS-DOS

(D)소프트웨어 : PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25

(ⅵ) 현재 출원상황 :

(A)출원번호:

(B)출원일: 1996년 3월 15일

(C)분류:

(ⅶ) 우선출원 상황 :

(A)출원번호: US 08/406,190

(B)출원일: 1995년 3월 16일

(ⅷ) 변리사/대리인 정보:

(A) 성명: 숄츠 챨스 케이.

(B) 등록번호: 38,615

(C) 참조번호: 5600-0002.41

(ⅸ) 통신처:

(A)전화: 415-324-0880

(H)텔렉펙스: 415-324-0960

(2) 서열 번호 1에 대한 사항 :

(ⅰ) 서열의 특성 :

(A)서열의 길이 : 516 염기쌍

(B)서열의 형 : 핵산

(C)쇄의 수 : 2 본쇄

(D)형태 : 환상

(ⅱ) 분자형 : DNA

(ⅲ) 추정 서열 : 아니오

(ⅳ) 앤티센스 : 아니오

(ⅵ) 기원:

(A) 생물체: 오비스 아리에스

(B) 주명: 도메스틱

(D) 분화의 정도: 포배(배반포)

(F) 조직의 종류: 트로펙토덤(trophectoderm)

(G) 세포의 종류: 단핵 트로펙토덤 세포

(ⅶ) 직접적인 기원 :

(B) 클론: oTP-1a

(ⅷ) 게놈내에서의 위치

(C) 단위 : bp

(ⅸ) 서열의 특징:

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치: 1..516

(ⅹ) 기타 정보:

(A) 저자 : 오트 트로이 엘

반 헤케 지노

존슨 하워드 엠

베이저 풀러 더블유

(B) 발명의 명칭: 제 1형 영양막 인터페론 소 영양막 단백질-1에 대 한 합성 유전자의 사카로마이세스 세레비시아에에서의 클로닝 및 발현: 정제 및 항바이러스 활성

(C) 저널 : J. Interferon Res.

(D) Vol. : 11

(F) 페이지 : 357-364

(G) 날짜 : 1991

(K) 서열 번호 1에서 관련된 잔기 : 1 내지 516

(xi) 서열 : 서열 번호: 1

[서열 1]

(2) 서열 번호 2에 대한 사항 :

(ⅰ) 서열의 특성 :

(A)서열의 길이 : 172 아미노산

(B)서열의 형 : 아미노산

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ) 분자형 : 단백질

(ⅳ) 기원:

(C) 개체 단리클론명: 성숙한 OvIFNτ 단백질의 아미노산 서열

(xi) 서열 : 서열 번호: 2

[서열 2]

(2) 서열 번호 3에 대한 사항 :

(ⅰ) 서열의 특성 :

(A)서열의 길이 : 516 염기쌍

(B)서열의 형 : 핵산

(C)쇄의 수 : 1 본쇄

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ) 분자형 : cDNA

(ⅳ) 기원:

(C) 개체 단리클론명: 성숙한 사람 인터페론-τ 단백질, 즉, HuIFNτ1을 코드화하는 합성 누클레오티드 서열

(xi) 서열 : 서열 번호: 3

[서열 3]

(2) 서열 번호 4에 대한 사항 :

(ⅰ) 서열의 특성 :

(A)서열의 길이 : 172 아미노산

(B)서열의 형 : 아미노산

(C)쇄의 수 : 1 본쇄

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ) 분자형 : 단백질

(ⅳ) 기원:

(C) 개체 단리클론명: 성숙한 HuIFNτ 단백질, 즉, HuIFNτ1에 대한 아미노산 서열

(xi) 서열 : 서열 번호: 4

[서열 4]

(2) 서열 번호 5에 대한 사항 :

(ⅰ) 서열의 특성 :

(A)서열의 길이 : 516 염기쌍

(B)서열의 형 : 핵산

(C)쇄의 수 : 2 본쇄

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)

(ⅲ) 추정 서열 : 아니오

(ⅳ) 앤티센스 : 아니오

(ⅵ) 기원:

(C) 개체 단리클론명: HuIFNτ3, mature no leader sequence

(ⅸ) 서열의 특징:

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치: 1..516

(xi) 서열 : 서열 번호: 5

[서열 5]

(2) 서열 번호 6에 대한 사항 :

(ⅰ) 서열의 특성 :

(A)서열의 길이 : 172 아미노산

(B)서열의 형 : 아미노산

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ) 분자형 : 단백질

(xi) 서열 : 서열 번호: 6

[서열 6]

Claims (13)

1. 인터페론-τ를 포함하는, 포유동물 환자의 자가면역질환을 치료하기 위한 경구 투여용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 인터페론-τ가 양 인터페론-τ 또는 소 인터페론-τ임을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 인터페론-τ가 서열 번호 2로 표시된 서열을 가짐을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 인터페론-τ가 재조합적으로 생성된 인터페론-τ임을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역질환이 제 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 홍반성 루푸스, 건선 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.
6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 환자가 사람 환자임을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.
7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 인터페론-τ가 1일당 IFNτ 약 1 x 10⁵단위 내지 약 1 x10⁸단위의 양으로 투여됨을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.
8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 자가면역질환 치료제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 제 2 치료제가 코르티코스테로이드 약물임을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.
10. 인터페론-τ를 포함하는, 바이러스성 질환 또는 세포 증식 질환을 치료하기 위한 경구 투여용 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 인터페론-τ가 양 인터페론-τ 또는 소 인터페론-τ임을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.
12. 제 10항에 있어서, 인터페론-τ가 재조합적으로 생성된 인터페론-τ임을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.
13. 제 11항에 있어서, 인터페론-τ가 서열 번호 2로 표시된 서열을 가짐을 특징으로 하는 경구 투여용 조성물.

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