JPH11503415A

JPH11503415A - インターフェロン−τを用いる自己免疫疾患の処置方法

Info

Publication number: JPH11503415A
Application number: JP8527814A
Authority: JP
Inventors: エム．スーズ，ジーネ; シュイフェンバウアー，ジョエル; マーセルスジョンソン，ホワード
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1995-03-16
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 1999-03-26
Anticipated expiration: 2016-03-15
Also published as: PT814831E; ATE219373T1; JP4121553B2; WO1996028183A1; DE69621918D1; DE69621918T2; EP0814831A1; KR19980702930A; DE69621918T4; DK0814831T3; CA2214490A1; AU688214B2; AU5422396A; US5906816A; EP0814831B1; KR100417485B1; US6060450A; ES2177780T3; JP2007314579A

Abstract

(57)【要約】多発性硬化症のような自己免疫障害の処置方法が開示される。この方法は、好ましくは経口摂取または注射により投与される、インターフェロンτ（IFNτ）の治療的有効用量での投与を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】インターフェロン-τを用いる自己免疫疾患の処置方法発明の分野本発明は、免疫系過敏症に関する症状の処置としてのIFNτの使用に関する。より詳細には、本発明は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、およびＩ型糖尿病を含む自己免疫疾患の処置に関する。参考文献発明の背景免疫系は、侵入生物体（例えば、細菌、ウイルス、または寄生虫）により引き起こされる疾患、および身体自体の組織の異常な増殖により引き起こされる疾患（例えば、ガン性腫瘍）に対する身体の一次的な防御である。免疫系は通常、正常な身体組織、すなわち自己を、外来組織またはガン性組織、すなわち非自己から区別し得る。特定の組織の自己としての認識の喪失、およびそれに続くその組織に対する免疫応答は、代表的には、しばしば重篤な臨床上の重要性を有する「自己免疫応答」をもたらす。このような自己免疫疾患の１つの特定の例は、中枢神経系（CNS）の進行性の疾患であり、脳および脊髄のミエリンのパッチ（神経繊維の保護的な被覆）が、身体自体の免疫系により破壊される多発性硬化症（MS）である。この破壊は、基礎をなす神経繊維に瘢痕および損傷を導き、そして冒される脳および脊髄の部分に依存して、種々の症状で現れ得る。脊髄損傷は、刺痛または麻痺、ならびに四肢における重度および／または軽度の感覚をもたらし得る。脳の損傷は、筋肉の虚弱、疲労、不安定な利得（unsteady gain）、麻痺、不明瞭言語、視覚障害、めまいなどをもたらし得る。多発性硬化症の現行の療法は、コルチコステロイド薬物（急性エピソードの症状を軽減する）および他の生体分子を含む。特に、β-インターフェロン（IFNβ ）が、MS療法として試験され、そして米国食品医薬品局(FDA)により承認された。不運なことに、現在使用される療法は、一連の問題を欠点として有する。薬物は、最大の治療効果のために必要とされる投与量においてしばしば有毒である。さらに、身体は薬物に対して感受性でなくなり得、それによりより多い（そして、さらに有毒な）投与量が最小の治療効果を維持するためにさえ必要とされる。本発明は、自己免疫疾患（例えば、MS）の処置方法を提供する。これは、現在用いられている療法に関連する有毒な副作用を有さない。発明の要旨１つの局面において、本発明は自己免疫疾患の処置を必要とする被験体における自己免疫疾患の処置方法を含む。１つの実施態様において、自己免疫疾患は多発性硬化症である。この方法は、被験体に薬学的有効量のτ-インターフェロンを投与する工程を包含する。τ-インターフェロンは、例えば、経口、あるいは静脈内注射または筋肉内注射を介して投与され得る。経口投与されるIFNτは、好ましくは被験体により摂取される。τ-インターフェロンは、τ-インターフェロンタンパク質（例えば、ヒツジ、ウシ（bovine）、ヤギ、ウシ（ox）、ラット、マウス、またはヒトτ-インターフェロン）を発現する任意の種に由来するτ- インターフェロンに由来し得る（これらのτ-インターフェロンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し得る）。 τ-インターフェロンは、適切な供給源から精製され得るか、組換えで産生され得るか（すなわち、組換えτ-インターフェロン）、または合成的に産生され得る。さらに、τ-インターフェロンポリペプチド（代表的には、約15〜172の間のアミノ酸を有する）が、本発明の方法において用いられ得る。本発明の方法はまた、τ-インターフェロンの投与前、投与と同時に、または投与後に、第二の自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）処置薬剤を投与する工程を包含し得る。例示的な第二の処置薬剤または薬物は、β-インターフェロンおよびコルチコステロイド薬物を包含する。さらなる実施態様において、本発明は、エリテマトーデスの処置を必要とする被験体におけるエリテマトーデスの処置方法を含む。この方法は、被験体に薬学的有効量のτ-インターフェロンを投与する工程を包含する。別の実施態様において、本発明は、Ｉ型糖尿病の処置を必要とする被験体におけるＩ型糖尿病の処置方法を含む。この方法は、被験体に薬学的有効量のτ-インターフェロンを投与する工程を包含する。さらなる実施態様において、本発明は、慢性関節リウマチの処置を必要とする被験体において慢性関節リウマチの処置方法を含む。この方法は、被験体に薬学的有効量のτ-インターフェロンを投与する工程を包含する。上記の方法はまた、経口投与または注射以外の経路（例えば、局所適用または動脈内注入）による投与を包含し得る。τ-インターフェロンが同種移植片または異種移植片のいずれかの移植拒絶の処置に有用であり得ることが、さらに意図される。別の局面において、本発明は、インターフェロン-τ（INFτ）による処置に応答する哺乳動物（例えば、イヌまたはヒト）における、疾患状態の処置方法の改善を包含する。この改善は、治療的または薬学的有効量のIFNτを経口的に投与する工程を包含する。経口投与されるIFNτは、好ましくは、哺乳動物により摂取される。一般的な実施態様において、IFNτは、一日当たり約1×10⁵〜約1×10⁸ 単位の間の投与量で、好ましくは一日当たり約1×10⁶〜約1×10⁷単位の間の投与量で経口投与される。IFNτは、例えば、ヒツジIFNτ(OvIFNτ)（例えば、配列番号２で示される配列を有するポリペプチド）またはヒトIFNτ(HuIFNτ)（例えば、配列番号４または配列番号６で示される配列を有するポリペプチド）であり得る。１つの実施態様において、疾患状態は、自己免疫障害（例えば、多発性硬化症 (MS)、Ｉ型(インスリン依存性)糖尿病、エリテマトーデス、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、慢性関節リウマチ、口内炎、喘息、アレルギー、または乾癬）のような免疫系の障害である。MSは、本発明の方法を用いた処置に特に感受性である。別の実施態様において、疾患状態は、ガン（例えば、ヘアリーセル白血病、カポージ肉腫、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、表在性膀胱ガン、皮膚ガン（基底細胞ガンおよび悪性黒色腫）、腎細胞ガン、卵巣ガン、低悪性度リンパ球性リンパ腫および皮膚性Ｔ細胞リンパ腫、ならびに神経膠種）のような細胞増殖障害である。なお別の実施態様において、疾患状態は、ウイルス性疾患（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎、エプスタイン−バーウイルス感染、HIV感染、ヘルペスウイルス（EB、CML、単純ヘルペス）、乳頭腫、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、HTLV I、HTLV I I、およびヒトロタウイルス）である。本発明はまた、治療的または薬学的有効量のインターフェロン-τ（IFNτ）をヒトに経口投与することにより、多発性硬化症（MS）を罹患したヒトにおけるMS の再発の重篤度または頻度を縮少する方法を包含する。IFNτの投与量および起源の例は上記に示す。別の局面において、本発明は、治療的または薬学的有効量のインターフェロン -τ（IFNτ）を被験体に経口投与することにより、被験体における細胞増殖障害を処置する方法を包含する。経口投与されるINFτは、好ましくは被験体により摂取される。IFNτの処置に感受性の細胞増殖障害の例、IFNτの投与量、および IFNτの起源は上記に示すとおりである。なおさらなる局面において、本発明は、治療的または薬学的有効量のインターフェロン-τ（IFNτ）を被験体に経口投与することにより、被験体におけるウイルス性疾患を処置する方法を包含する。経口投与されるINFτは、好ましくは被験体により摂取される。IFNτの処置に感受性のウイルス性疾患、IFNτの投与量、およびIFNτの起源は上記に示すとおりである。本発明の更なる局面は、治療的または薬学的有効量のインターフェロン-τ（I FNτ）を哺乳動物に経口投与することにより、雌性哺乳動物（例えば、イヌまたはヒト）の受胎能を増大する方法を包含する。IFNτの投与量および起源の例は上記に示すとおりである。本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明が添付の図面とともに読まれると、より完全に明らかになる。図面の簡単な説明図１は、IFNβおよびIFNτの毒性の比較を示す。図２は、IFNτの存在下または非存在下でMBPで免疫したNew Zealand White（N ZW）マウスにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）の平均重篤度を示す。図３は、MBP免疫したNZWマウスに由来する脾臓細胞の増殖に対するIFNτの効果を示す。図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ、および４Ｆは、IFNτの存在下または非存在下でのEAEのスーパー抗原再活性化の図解である。図５は、Vβ特異的Ｔ細胞活性化に対するIFNτの効果を示す。図６は、抗ウイルスアッセイを用いて測定したところの経口給餌（充填した棒）またはi.p.注射（白棒）のいずれかによる投与後のNZWマウス血清におけるOvI FNτの量を示す。図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、処置を受けていないマウス（図７Ａ）と比較してのIFNτを経口投与（図７Ｃ）およびi.p.注射（図７Ｂ）したIFNτによるSJL マウスにおける慢性再発性実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）の防止を示す。図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、IFNτ処置を受けていない（図８Ａ）か、i.p. 注射によるOvIFNτ処置（図８Ｂ）または経口給餌によるOvIFNτ処置（図８Ｃ）を受けたEAE誘導性動物由来の、リンパ球浸潤を検出するためにクレシルバイオレットで染色したマウスの脊髄の切片を示す。図９は、i.p.注射または経口給餌により投与される単回用量または延長された IFNτ処置のいずれかによるIL-10の誘導を示す。図10は、IFNτ処置の除去後の、SJLマウスにおけるEAEの再発を示す。図11は、OvIFNτのi.p.注射または経口給餌後の、OvIFNτ処置マウスの血清中の抗OvIFNτ抗体のELISA検出を示す。配列の簡単な説明配列番号１は、ヒツジインターフェロン-τ（OvIFNτ）をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。コードされるアミノ酸配列もまた示す。配列番号２は、成熟OvIFNτタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号３は、成熟ヒトインターフェロン-τ（HuIFNτ）タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。配列番号４は、成熟HuIFNτタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号５は、天然のHuIFNτ遺伝子であるゲノムDNAクローンHuIFNτ3の（リーダー配列を除く）ヌクレオチド配列である。配列番号６は、配列番号５として示す配列によりコードされる、HuIFNτ3によりコードされる成熟ヒトIFNτタンパク質の推定のアミノ酸配列である。発明の詳細な説明Ｉ．定義インターフェロン-τは、以下の２つの群の特性の各々から少なくとも１つの特性を有するインターフェロンタンパク質ファミリーの任意のものをいう：(i)( a)抗黄体融解性（anti-Iuteolytic）特性、(b)抗ウイルス特性、(c)抗細胞増殖特性；および(ii)α-インターフェロンとの約45から68％のアミノ酸相同性、および既知のIFNτ配列（例えば、Ottら、1991；Helmerら、1987；Imakawaら、198 9；Whaleyら、1994；Bazerら、1994）に対する70％より大きいアミノ酸相同性。アミノ酸相同性は、例えば、省略時パラメーター（default parameter）を用いるLALIGNプログラムを用いて決定され得る。このプログラムは、配列比較プログラムのFASTAバージョン1.7組（suite）において見出される（PearsonおよびLipm an、1988；Pearson、1990；プログラムはWilliam R．Pearson(Department of Bi ological Chemistry，Box 440，Jordan Hall，Charlottesville，VA)より入手可能）。IFNτは、乳牛（cow）、ヒツジ、ウシ（ox）、およびヒトを含む多くの供給源から単離され得る。インターフェロン-τポリペプチドは、インターフェロン-τアミノ酸コード配列に由来する約15と172との間のアミノ酸を有するポリペプチドである。ここで、上記の15〜172アミノ酸は、天然のインターフェロン-τに隣接している。このような15〜172アミノ酸の領域はまた、通常天然タンパク質においては不連続であるこのようなインターフェロン-τの領域の２つ以上が接続されているポリペプチドに組み立てられ得る。疾患の処置は、疾患の症状を緩和するおよび／または疾患の重篤度を軽減するために有効な治療的物質の投与をいう。 II．発明の概要本発明を支持するために行われた実験は、IFNτが、実験的アレルギー性脳髄膜炎（EAE；ZamvilおよびSteinman、1990）(これは、多発性硬化症（MS）を見抜くために幅広く研究されてきた抗原誘導性自己免疫の動物モデルである)の進行を妨げることにおいて有効であることを示す。IFNτは、これらの実験において少なくともIFNβと同様に有効であり、これは、MSの処置のためにFDAにより最近承認された。本実験はさらに、IFNτがIFNβよりも低い毒性を有すること、およびIFNτ処置したマウスが白血球減少症（これはIFNβ処置に伴う所望されない副作用である）を進行させないことを示す。さらに、本発明を支持するために行った実験は、経口投与されるIFNτが、EAE の処置において注入されるIFNτとほぼ同様に有効であるが、個体の処置においては、有意により低い抗IFNτ抗体力価をもたらすことを示す。この予期されなかった利点は、IFNτに対する宿主免疫応答による副作用の可能性の減少をもたらす。最近、スーパー抗原がEAEの再発を、MS患者において「自発的に」起こる再発と同様に含み得ることが示された。本発明を支持するために行ったさらなる実験は、IFNτがEAEのスーパー抗原の再活性化をブロックすること、ならびにEAEの誘導におけるIFNτの阻害効果およびスーパー抗原による再活性化が、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）の抑制、Ｔ細胞のスーパー抗原活性化、および例えば、腫瘍壊死因子のような破壊性サイトカインの抑制された誘導に関与することを示す。まとめると、これらの結果は、注入および経口投与されるIFNτの両方が、IFNβにともなわれるよりも毒性が低くかつ副作用が少なく、自己免疫疾患（例えば、MSのような）の処置に非常に有効であり得ることを示す。 III．インターフェロン-τ 同定された最初のIFNτはヒツジIFNτ（OvIFNτ）であった。18〜19kDaタンパク質のいくつかのイソ型が受胎産物（胚および周辺の膜）のホモジネート中で同定された（Martalら、1979）。続いて、受胎産物培養培地に放出される低分子量タンパク質が精製され、そして、熱不安定性およびプロテアーゼに対する感受性の両方であると示された（Godkinら、1982）。OvIFNτは、元来、ヒツジトロホブラストタンパク質-１（oTP-1）と呼ばれた。なぜなら、これは、ヒツジの母性認識の重要な時期の間にヒツジの受胎産物の栄養外胚葉により最初に生産される一次分泌タンパク質であったからである。続く実験は、OvIFNτが、反芻動物（例えば、ヒツジおよびウシ）において妊娠に対する生理的な応答を確立するために不可欠な妊娠認識ホルモンであることを決定した（BazerおよびJohnson、19 91）。類似の特性および活性を有するIFNτが、ウシおよびヤギを含む他の反芻動物種から単離された（Bartolら、1985；およびGnatekら、1989）。全てのIFNτに対する抗血清は交叉反応する。IFNτの種特異的形態が、同定された種由来のIFN sαに対してよりも互いにより密接に相同であることから、これは予想外ではなかった（Robertsら、1992）。ウシタンパク質（BoIFNτ；Helmerら、1987；Imakawaら、1989）は、妊娠の母性認識においてOvIFNτと類似の機能を有する。さらに、OvIFNτと高度のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列相同性を共有する。OvIFNτとBoIFNτとの間の核酸配列の相同性は5'非コード領域については76.3％であり、コード領域については89.7％であり、そして3'非コード領域については91.9％である。アミノ酸配列の相同性は80.4％である。 N末端アミノ酸配列を示す合成オリゴヌクレオチドを用いたヒツジ胚盤胞ライブラリーのプロービングにより得られたIFNτcDNA（Imakawaら、1987）は、ヒト、マウス、ラット、およびブタ由来のIFNsαと45〜55％の相同性を有し、そしてウシIFNａII（現在はIFNΩと呼ばれる）と70％の相同性を有する推定のアミノ酸配列を有する。異なるイソ型を示し得るいくつかのcDNA配列が報告された（Stew artら、1989；Klemannら、1990；およびCharlier，M.ら、1991）。全て、23アミノ酸のリーダー配列と172アミノ酸の成熟タンパク質とをコードする585塩基のオープンリーディングフレームを含む約１kbである。アミノ末端およびカルボキシル末端を有する並列する４つの螺旋型の束と推定されるIFNτの構造は、IFNτをＩ型IFNとして分類することをさらに支持する（Jarpeら、1994）。 IFNτは、Ｉ型IFNに分類的に関連する活性の多くを示す（表１、上記を参照のこと）が、IFNτと他のＩ型IFNとの間にはかなりの相違が存在する。最も顕著な相違は、上記に詳細に示したような妊娠におけるその役割である。ウイルス性誘導もまた異なる。IFNτを除く全てのＩ型IFNは、ウイルスおよびdsRNAにより容易に誘導される（Robertsら、1992）。誘導されるIFNαおよびIFNβの発現は、一次的であり、ほぼ数時間の間持続する。対照的に、IFNτ合成は、一旦誘導されると数日の期間を越えて維持される（Godkinら、1982）。１細胞当たりの基準において、他のＩ型IFNよりも300倍多くのIFNτが産生される（CrossおよびRobe rts、1991）。他の相違が、IFN遺伝子の調節領域に存在し得る。例えば、ウシIFNτ遺伝子を用いたヒトトロホブラスト細胞株JARのトランスフェクションは、抗ウイルス活性をもたらしたが、ウシIFNΩ遺伝子を用いたトランスフェクションはもたらさなかった。これは、独特のトランス活性化因子がIFNτ遺伝子発現に関与したことを示唆する。これは、IFNτの近位のプロモーター領域（126から転写開始部位まで）がIFNαおよびIFNβの近位のプロモーター領域と高く相同的であり；-126 から-450までの領域は相同的ではなく、IFNτの発現のみを促進する（CrossおよびRoberts、1991）という観察と一致する。従って、他のＩ型IFNと比較して、IF Nτの発現には異なる調節因子が関与しているようである。 IFNτの発現はまた、種間で異なり得る。例えば、IFNτの発現は反芻動物の受胎産物の発達の特定の段階（最初の13〜21日）に制限される（Godkinら、1982）が、予備的な実験は、ヒト型のIFNが妊娠期を通じて構成的に発現されることを示唆する（Whaleyら、1994）。Ａ．IFN τの単離 OvIFNτタンパク質を、妊娠中のヒツジから回収した受胎産物より単離し得、そして、Godkinら(1982)およびValletら(1987)に記載されるように改変最少必須培地（MEM）中でインビトロで培養する。IFNτを、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過により受胎産物の培養物から精製し得る。単離したIFNτの均一性をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE；Ma niatisら、1982；Ausubelら、1988）により評価し得、そして精製されたIFNτサンプル中のタンパク質濃度の決定をbiocinchoninic（BCA）アッセイ（Pierce Ch emical Co.、Rockford，IL；Smithら、1985）を用いて行い得る。Ｂ．IFN τの組換え産生組換えIFNτタンパタ質を、任意の選択されるIFNτポリヌクレオチドフラグメントから、適切な発現システム（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を用いて産生し得る。IFNτヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の単離は、Bazerら（ 1994）に記載される。例えば、Bazerらは、ヒトIFNτ遺伝子の同定および単離を記載する。成熟ヒトインターフェロン-τ（HuIFNτ）タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列を、本明細書中で配列番号３で示す。配列番号４は、成熟Hu IFNτ1タンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号５は、ゲノムDNAクローンHuIFNτ3（天然のHuIFNτ遺伝子）のリーダー配列を除くヌクレオチド配列であり、そして配列番号６は、配列番号５で示される配列によりコードされる成熟ヒトIFNτタンパク質の推定のアミノ酸配列である。 IFNτ発現ベクターを作製するために、IFNτコード配列（例えば、配列番号１）を発現ベクター（例えば、細菌の発現ベクター）中に配置し、そして標準的な方法に従って発現させる。適切なベクターの例としては、λgt11（Promega，Mad ison WI）；pGEX（Smithら、1985）；pGEMEX（Promega）；およびpBS（Stratage ne，La Jolla CA）ベクターが挙げられる。適切なプロモーター（例えば、T7 RNAポリメラーゼプロモーターまたはtacプロモーター）を有する他の細菌の発現ベクターもまた、使用され得る。OvIFNτ合成ポリヌクレオチドの改変pIN III o mp-A発現ベクターへのクローニングを材料および方法において記載する。本明細書中に記載される実験については、配列番号１で示されるOvIFNτコード配列を、酵母細胞の形質転換に適切な、メタノール調節アルコールオキシダーゼ（AOX）プロモーターおよびPho1シグナル配列を有するベクター中にクローン化した。このベクターを用いてP．pastoris宿主細胞を形質転換し、そして形質転換細胞を用いて、製造者の説明書（Invitrogen，San Diego，CA）に従ってタンパク質を発現させた。本発明の方法で使用するためのIFNτを発現させるために適切な他の酵母ベクターとしては、２μmプラスミドベクター（Ludwigら、1993）、酵母組み込みプラスミド（YIp；例えば、Shawら、1988）、YEPベクター（Shenら、1986）、酵母セントロメアプラスミド（YCp；例えば、Ernstら、1986）および調節可能発現を有する他のベクター（Hitzemanら、1988；Rutterら、1988；Oedaら、1988）が挙げられる。好ましくは、ベクターは、例えば、MFα1プロモーター（Ernst、1986 ；Bayneら、1988）、GADPHプロモーター（グリセルアルデヒド-3-リン酸-デヒドロゲナーゼ；Wuら、1991）、またはガラクトース誘導性GAL10プロモーター（Lud wigら、1993；Feherら、1989；Shenら、1986）などの有効な酵母プロモーターを含む発現カセットを含む。酵母の形質転換宿主は、代表的にはSaccharomyces ce revisiaeであるが、上記のように形質転換に適切な他の酵母（例えば、Schizosa ccharomyces pombe、Pichia pastorisなど）もまた同様に用いられ得る。さらに、IFNτポリペプチドをコードするDNAは、多くの市販のベクターにクローン化され得、適切な宿主システムにおいてポリペプチドの発現を生じ得る。これらの系としては、上記の細菌発現システムおよび酵母発現システム、ならびに以下が挙げられる：バキュロウイルス発現システム（Reillyら、1992；Beamesら、1991；Clonetech、Palo Alto CA）；植物細胞発現システム、トランスジェニック植物発現システム（例えば、GelvinおよびSchilperoot）、および哺乳動物細胞内での発現システム（Clontech、Palo Alto CA；Gibco-BRL、Gaithersburg MD）。組換えポリペプチドは、融合タンパク質としてまたは天然のタンパク質として発現され得る。多くの特性（例えば、培養培地中への発現される配列の分泌を促進するリーダー配列）を発現ベクター中に加工し得る。組換え生産されるポリペプチドは、代表的には溶解された細胞または培養培地から単離される。精製は、当該分野で公知の方法により行われ得る。この方法には、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。上記のように、IFNτポリペプチドに基づいて生成された抗体を用いて、イムノアフィニティークロマトグラフィーが用いられ得る。組換え方法に加えて、IFNτタンパク質またはポリペプチドが、親和性に基づく方法により（例えば、適切な抗体を使用することにより）選択された細胞から単離され得る。さらに、IFNτペプチドは、当業者に公知の方法を用いて化学的に合成され得る。Ｃ．IFN τは毒性を欠くＩ型IFN（IFNαおよびIFNβ）、ならびにII型（IFNγ）は、顕著な細胞傷害性を示す（Degre、1974；FentおよびZbinden、1987）。これらのIFNにより発揮される有害な毒性効果は、臨床試験および患者の処置の間に観察され、そしてインフルエンザ様の症状（例えば、熱、寒気および嗜眠、頻脈、吐気、体重の減少、白血球減少症、ならびに好中球減少症）を包含する（Degre、1974；FentおよびZ binden、1987）。本発明を支持するために行われ、そして下記の実施例１に詳細に記載される実験は、IFNτが上記に列挙したIFNよりも有意に低い細胞毒性を有することを示唆する。細胞傷害性を、種々のIFNを注射したNew zealand White（NZW）マウスの白血球数（WBC）、リンパ球パーセント、および全体重を用いてインビボで（実施例1A）評価した。結果を表３に示し、表2aに要約する。10⁵Uのマウスインターフェロン-α（MuIFNα）の注射の12時間後（IFNβよりも高度な毒性を誘導することが以前示された）マウスは、白血球数の減少、リンパ球減少症、および実質的な体重の減少を示した。これらの毒性関連効果は、OvIFNτ注入動物においては観察されなかった。毒性の実験に用いたOvIFNτの濃度は、EAEの阻害に有効であると示された濃度と同じであった（以下の実施例２に詳細に記載する）。細胞毒性をまた、インビトロでも評価した（実施例1B）。200,000U/ml程高い濃度のIFNτに曝したL929細胞の生存性は、コントロールレベルの近くのままであったが、IFNβは、7,000U/ml程低い濃度で毒性効果を示した（図１）。IFNτ はまた、腫瘍形成性細胞株のパネルで試験した場合、毒性を欠いたことが見出されたが、細胞複製は阻害しなかった。これらおよび更なる実験の結果を、動物モデルならびに組織培養におけるIFNτの毒性を、IFNβおよびIFNαの毒性と比較して（BazerおよびJohnson、1991；Johnsonら、1994；Bazerら、1989；ならびに SoosおよびJohnson、1995）、以下の表2aにまとめる。 IFNの存在下で培養したMDBK細胞は、IFNα（50,000U/ml）の存在下で培養した場合は生存性の減少を示したが、IFNτの存在下で培養した場合には生存性の減少を示さなかった（Pontzerら、1991）。同様の結果が、ヒトWISH細胞株を用いて得られた。IFNτおよび他のIFNにより誘導される毒性（またはその欠失）の比較を、ヒト末梢単核細胞（HPMC）およびHIV感染HPMCを用いて行った。IFNτは、培養HPMCにおいて毒性効果を示さなかったが、IFNαおよびIFNβの両方は、50,0 00U/mlで細胞の生存性を減少させた（SoosおよびJohnson、1995）。HIV-1で感染させたヒトリンパ球およびHIVで感染させたネコリンパ球もまた、IFNτの存在下で生存性の減少を示さなかった（Bazerら、1989）。これらの知見は、不死化した細胞株を用いた観察から推測されたIFNτの毒性の欠失が、ヒト末梢血にも適用されることを示す。表2aにまとめた結果は、注射したIFNα、IFNβ、およびIF Nγと比較して、インビトロおよびインビボの両方で試験した場合で、注射したI FNτがほとんど毒性を有さないかまたは全く毒性を有さないようであることを示す。本発明を支持するために行ったさらなる実験は、末梢血液中のリンパ球低下により測定して、経口投与したOvIFNτおよび注射したOvIFNτの毒性と、経口投与したおよび注射したIFNαおよびβの毒性とを比較した。血液を尾から得、そして白血球（WBC）数をヘマチトメーターを用いて数えた。WBC分画をWright-Giems a-染色血液スミアに対して行った。結果を、以下の表2b、2c、および2dに示す。有意なレベルの毒性がIFNαおよびβのいずれかを給餌されたマウスにおいて検出されたが、10⁵、2×10⁵、または5×10⁵UのOvIFNτ、またはPBSのみを給餌されたマウスにおいては、有意なリンパ球の低下は検出されなかった。これらのデータは、経口投与されたOvIFNτ （注射されたOvIFNτと同様）が、他のＩ型IFNと比較して、有意に減少された毒性を有することを示す。 IV．自己免疫疾患の処置としてのIFNτ 本発明の組成物および方法は、免疫系機能の過剰または低下により特徴づけられる種々の免疫系関連障害の、治療的処置およびそれによる緩和のために用いられ得る。このような障害は、過剰アレルゲン性および自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病、エリテマトーデス、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、慢性関節リウマチ、口内炎、喘息、アレルギー、乾癬など）を含む。Ａ．多発性硬化症の動物モデルであるEAEにおけるIFNτ処置１．OvIFN τは多発性硬化症の動物モデルであるEAEの発達を阻害する。自己免疫障害の処置におけるIFNτの有効性を、ヒト多発性硬化症（MS）を洞察するために広く研究されている抗原誘導性自己免疫の動物モデルである、実験的アレルギー性脳髄膜炎（EAE）を用いて齧歯類で評価し得る。EAEは、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）または脳炎誘発性ペプチドフラグメントで感受性のマウス、ラット、またはモルモット株を免疫することにより誘導される自己免疫脱髄性疾患である。モデル動物株の遺伝的感受性は、脳炎誘発性ペプチドが特定のクラス II主要組織適合性複合体（MHC-II）分子に結合する能力に部分的に基づく（Frit zら、1983；Wraithら、1989）。特に、H-2^uハプロタイプを有するマウスは、EAE に対して感受性である。感受性マウス株としては、PL/Jマウス（Kleinら、1983 ）、(PL/J×SJL)F₁マウス（Zamvilら、1990；Wraithら）、B10.PLマウス（Figue roら、1982）、NZWマウス（Kotzinら、1987）、および(NZB×NZW)F1（Kotzinら）マウスが挙げられる。 γ-インターフェロン（IFNγ）およびβ-インターフェロン（IFNβ）が多発性硬化症の処置に有効であることが示された（Johnsonら、1994；IFNβ多発性硬化症研究グループ、1993）。実際、IFNβは、多発性硬化症の治療としてFDAにより承認された。β-IFNはMSに対して有効であるが、比較的高い毒性を有し、そしてその結果、種々の所望されない副作用を有する。しかし上記のように、IFNτは他のインターフェロンよりも顕著に低い毒性を有し、したがってより少ない所望されない副作用を示す。本発明を支持するために行いそして実施例２に詳細に記載する実験において、 IFNτを、そのEAE誘導を阻止する能力について試験した。EAEを、New Zealand W hite(NZW)マウスにおいて、ウシミエリン塩基性タンパク質（bMBP）での免疫化により誘導した。マウスを、組換えヒツジIFN-τ（OvIFNτ）またはマウスIFN- β（MuIFN-β）の単回用量をMBPでの免疫化の当日に、あるいはOvIFN-τまたはM uIFN-βの３回用量をMBPでの免疫化の48時間前、当日、および48時間後のいずれかでi.p.注射した。この実験の結果を表４にまとめる。EAEの平均の重篤度の経時変化を図２に示量；□−OvIFNτの３回用量。免疫化した日に注射（疑似注射およびIFN注射の両方）した全ての動物はEAEを発達させたが、重篤度は減少し、そして平均の発症日は、コントロール動物（16 .2±0.8日）と比較して、OvIFNτ処置した動物（23.8±0.5日）およびMuIFN-β 処置した動物（23.5±0.6日）の両方で遅れた。３回用量プロトコルを用いて得られた結果はさらに顕著である。９匹のコントロール動物のうちの７匹は、免疫後平均15.2日でEAEを発達させた。対照的に、O v IFNτ処置した９匹の動物はいずれも疾患を発達させず、そしてMuIFN-β処置した９匹の動物のうちの１匹がEAEで死亡した（免疫化の22日後）。このデータは、IFNτがEAEの阻止に有効な免疫療法であり、そして自己免疫疾患のこのモデルにおいてMuIFNβと同様に有効な処置であることを示す。IFNτが IFNβよりも低い毒性を有することとまとめて、このデータは、IFNτを用いた自己免疫障害（例えば、多発性硬化症）を有する個体の処置が、IFNβを用いる処置よりも好ましく、かつより有効であり得ることを示唆する。２．OvIFN τはＴ細胞増殖を阻害する。 MBPでインビトロで刺激したMBP免疫NZWマウス由来の脾臓細胞の増殖に対するIFNτの効果を評価した。結果を図３に示す。MBPに応答しての増殖は活発であり、そして用量依存性の様式でIFNτにより減少され得た。これは、IFNτが自己抗原であるMBPに特異的なＴ細胞に対する抗増殖活性を有することを示す。これらの結果は、IFNτがMBP誘導EAEの症状を阻害または排除するという観察と一致する。なぜなら、このようなＴ細胞の阻害は自己免疫応答の重篤度を減少すると予想されたからである。３．OvIFN τはEAEのスーパー抗原再活性化を阻害する。 MSの症状は再発− 軽減様式で起こることが、しばしば観察され得る。このMSの形態は、軽減期間が後に続くMSの臨床的な症状の露呈からなる。再発および再燃がどのように起こるか、および何が自己免疫疾患の再活性化を引き起こすかは、多くの推測を有する論点であった。環境の影響が自己免疫疾患の再燃に対して貢献し得るかまたは原因となりさえし得ることが、示唆されてきた。このような影響は、感染性物質および免疫刺激活性を有する因子に曝すことを潜在的に包含する。我々の環境に遍在するタンパク質の１つのクラスは、微生物スーパー抗原である。微生物スーパー抗原は、種々の細菌、ウイルス、および他の生物（例えば、非常に強力な免疫刺激活性を有するマイコプラズマ）により産生される毒素である (Langfordら、1978；CarlssonおよびSjogren、1985；ならびにJohnsonおよびMag azine、1988)。これらは、食中毒および中毒性ショック症候群を含む多くの失病の原因である（Bergdollら、1981）。スーパー抗原によるこのような強力な免疫刺激は、主要組織適合性複合体クラスII分子に携わり（engage）、次いで二成分からなる複合体としてβ鎖可変領域（Vβ）特異的様式でＴ細胞レセプターに結合するこれらの能力に基づく(Johnsonら、1991；Janewayら、1989；Whiteら、19 89；Carlssonら、1988；ならびにFleischerおよびSchrezenmeier、1988)。この結合は、Ｔ細胞レパートリーの20％程度の増殖を導くＴ細胞活性化を誘発する（ Johnsonら、1991）。スーパー抗原誘導性Ｔ細胞増殖は、インターロイキン２（IL2）、IFNγ、および腫瘍壊死因子α（TNFα）を含むサイトカインの多量の産生により達成される。その産生がスーパー抗原刺激により誘導されるサイトカインの中で、IFNγおよびIFNαは、自己免疫病因のメディエーターとして関係づけられている。IFNγ は、臨床試験においてMSの再燃を引き起こすことが示された（Panitchら、1987a ；Panitchら、1987b）。TNFαの産生が、EAEを養子的に転移するために用いられる特定のＴ細胞株の脳炎誘発性（Powellら、1990）、およびインビトロでミエリン産生性稀突起膠細胞の死を引き起こすこと（SelmajおよびRaine、1988）のために必要であることが示された。本発明の支持のために行われた実験は、Staphylococcus Enterotoxin B(SEB) 誘導サイトカイン産生もまたIFNτにより変化されることを示す。MBP免疫化マウス由来の脾細胞を、インビトロでIFNτの存在下または非存在下でSEBを用いて刺激した。そして上清をTNFαおよびIFNγ産生について試験した。SEBを用いて刺激した培養物へのIFNτの添加は、TNFαおよびIFNγの両方の産生を有意に減少させた。上記の点から、これらの結果はEAEの重篤度を減少させるIFNτの能力と一致し、そしてIFNτがMSの再燃を減少し得ることを示唆する。 EAEの臨床的な再発として証明される再燃は、微生物スーパー抗原の投与により最初に明らかにされた。PL/J株において、EAEの急性エピソードは、通常、消散し、そして臨床的な再発は起こらないことが示された（Fritzら、1983）。MBP での免疫化により誘導されるEAEの全ての臨床的な徴候の消散の後の、Staphyloc occus aureusエンテロトキシン（SE）スーパー抗原、SEBまたはStaphylococcus Enterotoxin A（SEA）のいずれかの投与が、疾患の再活性化を引き起こすことが示された（Schiffenbauerら、1993）。４ヶ月間にわたる疾患の再燃の複数のエピソードはまた、EAEが再活性化され得、そしてSEBの複数回の注射に基づいて消散され得ることを示した（Schiffenbauerら、1993）。SEBによるEAEの再活性化が、NZWを含む他の感受性株においてもまた引き起こされることが示された。SEBはまた、MBP のアセチル化アミノ末端ペプチドが免疫原として用いられる場合、疾患を再活性化させ得る（Brockeら、1993）。 EAEの再活性化に加えて、SEBはまた、MBPでの免疫化の前に投与される場合、E AEを妨げ得る（Soosら、1993；およびKalmanら、1993）。EAEの最初の誘導の原因であるVβ8⁺Ｔ細胞サブセットのアネルギーおよび／または欠失は、この防御のための機構であるようである。しかし、Vβ特異的Ｔ細胞集団の標的化は、EAE の発達からの絶対的な防御を提供しない。SEB前処置によりEAEの発達から防御されたマウスをSEA（これは、SEBとは異なるVβ Ｔ細胞特異性を有する）に曝す場合、EAEの誘導は起こらない。このSEA誘導性EAEは、重篤な麻痺および臨床症状の発症の加速により特徴づけられる。従って、微生物スーパー抗原の効果は、MS において観察される病因の複雑さに類似して、例えばEAEのような、自己免疫疾患モデルに深遠な複雑さを誘導する。スーパー抗原により誘導されるEAEの再燃に対するOvIFNτ処置の効果を、実施例４でNZWマウスについて評価する。研究をまた、PL/Jマウスについても行った。10⁵Uを３回用量で投与した場合（SEB注射の48時間前、SEB注射の当日、および SEB注射の48時間後）、OvIFNτによる処置は、スーパー抗原によるEAE再活性化をブロックした。これと比較して、未処置のコントロール群は、以前の研究（Sc hiffenbauerら、1993）と一致して、EAEのスーパー抗原再活性化を示した。 OvIFNτがEAEのスーパー抗原誘導性再燃をブロックし得るという観察は、IFN β1bでの処置を経たMS患者において疾患の再燃の減少に対する結果であり得る。 OvIFNτがEAEの発達およびスーパー抗原再活性化を妨げ得ることを示す研究の要約を、表５に示す。この結果は、IFNτがまた、自己免疫疾患（例えば、MS）の過程における環境因子の効果を調節し得ることを示す。本発明を支持するために行ったさらなる実験は、MBPの第二の免疫化がEAEを再活性化し得ないこと、およびスーパー抗原の注射が、MBPで免疫化したがEAEを発達させなかったPL/Jマウスにおいて臨床的な疾患の最初のエピソードを誘導し得ることを、さらに示した。この実験はさらに、この誘導がIFNτを用いた処置によりブロックされ得ること、およびIFNτが、IFNβ1b処置したMS患者で観察された疾患の再燃の減少に類似して、EAEのスーパー抗原誘導性再燃をブロックし得ることを示す。４．IFN τはVβ特異的Ｔ細胞活性化を阻害する。インビトロにおけるSEB 誘導性Vβ特異的Ｔ細胞拡大のIFNτ処置の効果を、実施例５に記載のように評価した。Vβ特異的Ｔ細胞のFACS分析を、未処置のNZWマウス、SEB注射マウス、またはIFNτおよびSEB注射NZWマウスに対して行った。分析は、注射の72時間後に行った。代表的な実験の結果を図５に示す。白い棒は、未処置の動物を；充填した棒は、SEB注射した動物を示し、そして網掛けした棒は、IFNτおよびSEB注射動物を示す。未処置のNZWマウスは、5.1±0.1％のVβ8⁺CD4⁺ Ｔ細胞を示し、これはSEB 注射後に、10.2±0.2％に拡大された。SEB注射の前にIFNτ注射をした場合、Vβ 8⁺CD4⁺ Ｔサブセットの拡大は、7.6±0.2％に制限された。SEBがまた特異的である、Vβ7⁺およびVβ11⁺ Ｔ細胞の部分的な阻害もまた、観察された。これらのデータは、IFNτでの処置がインビボでSEB誘導性Vβ Ｔ細胞拡大を部分的に阻害し得ることを示し、そしてさらに、IFNτがMBP誘導性EAEの重篤度を減少するという観察を支持する。Ｂ．他の自己免疫疾患モデル EAEに加えて、自己免疫疾患の他の動物モデルが、IFNτの治療的効果を評価するために用いられ得る。例えば、マウスの特定の株は、ヒトの全身性エリテマトーデスに類似した疾患である、マウス全身性エリテマトーデスに対して特に感受性である。特に、MRL-lpr/lpr狼瘡マウス（Singerら、1986）は、ヒト全身性エリテマトーデスと同じ多くの免疫学的特徴を示す。この動物は、リンパ系器官拡大およびＴ細胞増殖の増大を有し、Ｖ_β8.2/8.3遺伝子を優先した顕著に片寄ったＶ_β遺伝子発現を有する（Singerら）。 MRL-lpr/lprマウスは、Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）より得られ得る。MRL-lpr/lprマウスにおける疾患の発症は自発的であり（約３ヶ月齢）、従って、疾患はEAEの場合にそうであるように誘導を必要としない。疾患の進行に対するI FNτの効果を評価するために、動物を、選択された期間（例えば、６ヶ月齢まで）の、選択された齢（例えば、６週齢）で開始する、選択された間隔（例えば、２週間に１回）でのIFNτの注射（例えば、上記のように）を用いて処置する。治療の効果は、いくつかの方法により評価され得る。例えば、処置および未処置の動物群の脾臓およびリンパ節におけるVβ8⁺細胞の相対数を、上記のようにF ACS分析を用いて決定し得る。IFNτの有効用量は、Vβ8⁺ Ｔ細胞数の有意な減少をもたらす。さらに、疾患の身体的な症状（リンパ系過形成、耳の壊死、脱毛）が定量され得（Kimら、1991）、そして処置群と未処置群との間で比較され得る。動物はまた、例えば、Kimらに記載されるように、IFNτを用いる処置の後に、 ds-DNA特異的抗体の減少、および／またはタンパク尿を伴う腎炎の減少についてアッセイされ得る。 IFNτの治療的効果を評価するために使用され得る自己免疫障害の別の動物モデルは、イヌにおけるアジュバント誘導性関節炎（Kaplanら、1993）である。Ｖ．経口投与されるIFNτの有効性本発明を支持するために行われた実験は、経口投与されるIFNτポリペプチド組成物が、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）のようなIFNτを用いた処置の恩恵を被る疾患または疾患の状態の処置に関して、注射されるIFNτ組成物と有効性において匹敵することを示す。以下に記載のように、経口投与されるIFNτがIFNτ処置の恩恵を被る疾患の処置に有効であったのみならず（EAE）、投与の経口経路は、注射されるIFNτ組成物を用いた処置と比較して予期されない利点をもたらした。例えば、経口投与されるIFNτは、処置された個体の血清中の顕著により低いレベルの抗IFNτ抗体をもたらした（実施例12を参照のこと）。経口投与されるIFNτが、それゆえ宿主の免疫応答により無効性をもたらしそうになく（すなわち、処置に対する脱感受性および／または用量レベルが顕著に減少する）、そして処置を受けた個体がこのような免疫応答の結果として有害な副作用を被りそうにないために、これは、有益である。これらの知見および関連する知見を示す実験の結果を、以下に示す。Ａ．経口投与されるIFNτはEAEの発達を阻害する実施例６に詳述される実験において、経口投与されるIFNτおよび注射されるI FNτを、これらがEAEの誘導を妨げる能力について試験した。EAEは、ウシミエリン塩基性タンパク質（bMBP）での免疫化により、New Zealand White（NZW）マウスにおいて誘導した。実験的アレルギー性脳髄膜炎（EAE）を誘導するための、ウシミエリン塩基性タンパク質（bMBP）での免疫化の48時間前、当日、および48 時間後に、レシピエントNZWマウスは、i.p.注射または経口給餌のいずれかによりOvIFNτを受けた。 OvIFNτの経口給餌およびi.p.注射の両方は、EAEに対して防御した（実施例６、表６）。i.p.注射によりIFNτを受容した全ての動物、およびIFNτを経口的に受容した９匹の動物のうちの７匹は、EAEの症状から防御された。さらに、抗OvI FNτモノクローナル抗体HL127は、EAEをブロックするOvIFNτの能力の部分的な中和に有効であった。これらの実験は、経口投与されるIFNτが、多発性硬化症の動物モデルであるEAEの症状の処置に有効であることを示す。Ｂ．OvIFN τは経口投与後、血清中に存在する経口投与されるIFNτが循環に入ることを確かめるために、i.p.注射または経口投与によりIFNτを受容したマウスの血清を、実施例７に記載のように、細胞変性効果（抗ウイルス）アッセイ（Familettiら、1981）を用いてIFNτの存在について試験した。結果を図６に示す。比活性を、MDBK細胞を用いた抗ウイルスアッセイから得られた抗ウイルス単位／mgタンパク質で表す。OvIFNτは、200U/mlのレベルで、経口給餌（充填した棒）後２時間まで検出された。これらのデータは、経口投与されるIFNτが循環に入り、そして投与後約２時間、血清中に残ることを示す。Ｃ．OvIFN τはEAEの慢性再発を妨げる EAEに関連する症状の発症の妨げに加えて、実施例８に詳述するように、経口投与されるOvIFNτはEAEの慢性−再発モデルにおいて麻痺を妨げる。OvIFNτ処置を受けなかったMBPで免疫化された（EAEを誘導するために）５匹のマウスのうち５匹が、麻痺の慢性再発を発達させたが、OvIFNτで処置した（48時間毎にi.p. 注射または経口給餌のいずれかで投与した）５匹の動物のうちの４匹は疾患から完全に防御された（図７Ｂおよび７Ｃ）。これらのデータは、上記の結果をさらに支持し、そしてIFNτの経口投与が、慢性再発性EAEの進行をブロックし得ることを示す。この実験はまた、延長された期間にわたってのIFNτの48時間に一度程度の稀な経口投与が、インターフェロン-τによる処置に応答性である疾患状態の処置において、i.p.注射と同程度に有効であることを示唆する。Ｄ．IFN τの経口投与後のEAEマウス由来の脊髄の組織学的分析 OvIFNτがEAEを妨げる能力をまた、脊髄白質中のリンパ球性損傷として中枢神経系（CNS）において発現される、疾患の細胞性の結果に対するOvIFNτ処置の効果を分析することにより、アッセイした。損傷は、CNSへのリンパ球の浸潤の程度の指標である。MBP免疫マウスは、処置されないか（コントロール）、あるいは経口またはi.p.経路によりOvIFNτで処置されるかのいずれかであり、そして脊髄の腰椎領域の切片を染色し、そして実施例９に記載のようにリンパ球について評価した。リンパ球性損傷はコントロール動物の脊髄白質中に存在した（図８Ａ）が、i.p.注射（図８Ｂ）または経口給餌（図８Ｃ）によりOvIFNτ処置したマウスには存在しなかった。これらのデータは、IFNτの防御効果がCNSのリンパ球浸潤の阻害に関連することを示す。さらに、このデータは、IFNτ処置が、単に症状をマスキングするのでなく、自己免疫疾患の細胞性発現を阻害することを示す。Ｅ．OvIFN τを用いた処置の中止は麻痺の再発をもたらす実施例11に詳述する実験は、MBPを注射したマウスにおけるEAEを妨げに有効な処置のタイプおよび継続時間を決定するために行った。マウスは、処置が継続している限り（実施例11においては58日）i.p.注射または経口給餌を介するOvIFN τ処置（48時間毎）によりEAEから防御されたが、OvIFNτ処置を停止した後に疾患の症状を発達させた（図10）。これらの結果は、IFNτは自己免疫症状様EAE（例えば、MS）を治療し得ないが、処置が継続する限り症状の病理学的な発現を阻害する有効な処置であることを示唆する。Ｆ．OvIFN τの経口投与は抗OvIFNτ抗体応答を減少させる。実施例12において詳述するように、経口投与されるIFNτ処置の（注射に対しての）１つの利点は、経口処置を受ける個体における抗IFNτ抗体力価の減少である。OvIFNτ処置の除去の後、各処置群由来のマウスを放血し、そして血清を抗OvIFNτ抗体の存在についてELISAにより検討した。i.p.注射によりIFNτを受けたマウスは上昇したレベルの抗IFNτ抗体を示したが、経口給餌によりIFNτを受けた動物はずっとより低い抗IFNτ抗体力価を示した（代表的には３〜５倍低い）。予想されたように、OvIFNτ処置を受けなかったマウスは抗OvIFNτ抗体を示さなかった。血清を、MDBK細胞株に対するOvIFNτの抗ウイルス活性を中和するそれらの能力についても検討した。i.p.注射したマウス由来の血清または経口給餌したマウス由来の血清のいずれもが、中和活性を有さなかった（表７）。これらの結果は、OvIFNτの経口給餌が、OvIFNτタンパク質に対する抗体応答を、大いに阻止することを示唆する。経口処置された被験体におけるこのような減少された抗体応答は、IFNτ処置の、所望されない免疫系関連副作用の機会を減少させる。 VI．適用 A．免疫系障害のための処置としてのIFNτ 本発明の方法を用いて処置され得る疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性および過剰増殖性疾患、ならびに免疫学的に媒介される疾患の皮膚発現を包含する。特に、本発明の方法は、免疫系過敏症に関連する症状を処置するために有利である。４つのタイプの免疫系過敏症が存在する（Clayman）。タイプＩ、または即時型／アナフィラキシー性過敏症は、アレルゲン（例えば、花粉）に応答する肥満細胞の脱顆粒に起因し、そしてぜん息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、じんま疹（urticaria）（じんま疹（hives））、アナフィラキシーショック、およびアレルギー性の他の病気を包含する。タイプII、または自己免疫過敏症は、身体自体の細胞上の認識された「抗原」に対する抗体に起因する。タイプIII過敏症は、抗原／抗体免疫複合体の形成に起因する。抗原／抗体免疫複合体は種々の組織中に存在し、さらなる免疫応答を活性化させ、そして血清病、アレルギー性肺胞炎、および時にブースターワクチン接種後に形成される大腫脹のような症状の原因となる。タイプIV過敏症は、感作されたＴ細胞からのリンホカインの放出に起因し、これは炎症性応答を生じる。例は、接触皮膚炎、麻疹の発疹、および特定の薬剤に対する「アレルギー性」反応を包含する。それによって特定の状態がある個体において過敏症を生じ得る機構は一般に十分には理解されていないが、遺伝的要因および外因性要因の両方が関与し得る。例えば、細菌、ウイルスまたは薬物が、自己免疫障害に対する遺伝的素因を既に有する個体における自己免疫応答を引き起こす役割を担い得る。あるタイプの過敏症の発生数が、他と相関され得ることが示唆されている。例えば、特定の一般的なアレルギーを有する個体は、より自己免疫障害になりやすいと提唱されている。自己免疫障害は、主に特定の器官または組織に限定される障害と、全身を冒す障害とにおおまかにグループ分けされ得る。器官特異的（冒された器官に）障害の例は、以下を包含する。多発性硬化症（神経突起上のミエリン被覆）、Ｉ型糖尿病（膵臓）、橋本甲状腺炎（甲状腺）、悪性貧血（胃）、アディソン病（副腎）、重症筋無力症（神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプター）、慢性関節リウマチ（関節内層）、ブドウ膜炎（眼）、乾癬（皮膚）、ギヤン−バレー症候群（神経細胞）およびグレーヴズ病（甲状腺）。全身性自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスおよび皮膚筋炎を包含する。過敏症障害の他の例は、以下を包含する。ぜん息、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、他の湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、鼻炎、扁平苔癬、天疱瘡（Pemp lugus）、水疱性類天疱瘡、表皮水疱症、じんま疹、血管性水腫、脈管炎（vascu litides）、紅班、皮膚性好酸球増加、円形脱毛症、アテローム性動脈硬化、原発性胆汁性肝硬変およびネフローゼ症候群。関連疾患は以下を包含する。小児脂肪便症、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、炎症性腸疾患、クローン病（Ch rohn's disease）、および潰瘍性大腸炎などの腸炎症、ならびに食物関連アレルギー。本発明の方法を用いる処置を特に受けやすい自己免疫疾患は、以下を包含する。多発性硬化症、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病、全身性エリテマトーデス、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、慢性関節リウマチ、口内炎、ぜん息、ブドウ膜炎、アレルギーおよび乾癬。 IFNτを含有する薬物を用いて、上で論じたような自己免疫疾患の症状を治療的に処置し、そしてそれにより軽減し得る。このような薬物を用いる処置は、本明細書中に、多発性硬化症の動物モデルであるEAEの処置に関して例示される。 B．生殖障害のための処置としてのIFNτ IFNτはIFNαファミリーに対して、構造およびその強力な抗ウイルス特性に基づいて、幾分かの類似性を有しているが、IFNαはIFNτに伴われる生殖特性を有さない。例えば、組換えヒトIFNαは、用量の２倍で投与された場合でさえ、IFN τに比較して、発情期間間隔に対して影響を有さなかった（Davisら、1992）。それゆえ、IFNτは他のインターフェロンに対して幾分かの構造類似性を有するが、IFNτは、それ自体の、例えば、発情期周期の生化学的事象に顕著に影響する能力の非常に独特の特性を有する。本発明のIFNτ組成物は、Hansenら（1991）において一般的に記載されるような、雌性哺乳動物において受胎能を増強し、そして黄体の寿命を延長させる方法において使用され得る。本明細書中の教示によれば、受胎能を増強するこのような方法は、IFNτを治療的または薬学的有効量で含有する薬物の経口投与を包含する。さらに、この組成物は、子宮および／または胎児胎盤組織の成長および発生を調節するために同様に用いられ得る。ヒトIFNτを含有する組成物は、ヒトの処置のために特に有用である。なぜなら、同一種のタンパク質を用いると、潜在的な抗原性応答が、より少なそうであるからである。 C．抗ウイルス処置としてのIFNτ IFNτの抗ウイルス活性は、IFNαに通常伴われる有毒な影響なしに、広範な治療適用を有する。上記のように、IFNτは、細胞に対する有害な影響なしに、その治療的活性を発揮する。IFNτの細胞傷害性の相対的欠如により、IFNτは、インビボ治療剤として非常に価値のあるものとなり、そして大部分の他の既知の抗ウイルス剤および全ての他の既知のインターフェロンから分離される。 IFNτを含有する処方物または薬物は、ウイルス複製を阻害するために経口投与され得る。さらに、この組成物は、胎児と母体との間の免疫関係に影響を及ぼすための方法において（例えば、母性ウイルス（例えば、HIV）の発生する胎児への伝播の防止において）用いられ得る。ヒトインターフェロン-τを含有する組成物は、ヒトの処置のために特に有用である。なぜなら、同一種のタンパク質を用いると、潜在的な抗原性応答が、より少なそうであるからである。経口投与されるIFNτにより処置され得る特定のウイルス性疾患の例は、以下を包含するが、それらに限定されない。Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎、エプスタイン−バーウイルス感染、HIV感染、ヘルペスウイルス（EB、CML、単純ヘルペス）、パピローマ、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、HTLV I、HTLV II、およびヒトロタウイルス。 D．抗増殖処置としてのIFNτ IFNτは、強力な抗細胞増殖活性を示す。従って、経口投与のために適切なIFN τ含有組成物または薬物は、現在知られている他のインターフェロンに伴われるネガティブな副作用なしに、細胞増殖を阻害するために使用され得る。このような組成物は、腫瘍成長を阻害するために、防止するために、または遅らせるために使用され得る。経口投与されるIFNτにより処置され得る特定の細胞増殖障害の例は、以下を包含するが、それらに限定されない。ヘアリーセル白血病、カポージ肉腫、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、表在性膀胱ガン、皮膚ガン（基底細胞ガンおよび悪性黒色腫）、腎細胞ガン、卵巣ガン、低悪性度のリンパ球性および皮膚性Ｔ細胞リンパ腫、および神経膠腫。さらに、特定の腫瘍の発達は、エストロゲンにより媒介される。本発明を支持するために実施された実験は、IFNτがエストロゲンレセプター数を抑制し得ることを示す。それゆえ、IFNτ含有組成物は、エストロゲン依存性腫瘍の処置または防止において特に有用であり得る。 E．獣医学的適用上で詳述した本発明の方法の使用に加えて、この方法が家畜動物および野生動物が患う種々の免疫系障害の処置に適用され得ることが理解される。例えば、イヌにおける甲状腺機能低下症は、代表的には、甲状腺の進行性破壊から生じ、これはリンパ球性甲状腺炎を伴い得る（KemppainenおよびClark、1994）。リンパ球性甲状腺炎（これはヒトにおける橋本甲状腺炎に類似する）は、自己免疫障害であると考えられている。本明細書に提示される指導に従って、イヌにおけるリンパ球性甲状腺炎に起因する甲状腺機能低下症を、上記のようなIFNτ含有薬物で処置し得る。 IFNτでの処置により軽減され得るイヌにおける別のタイプの自己免疫障害は、抗核抗体（ANA）陽性、発熱、およびセロネガティブ関節炎により特徴付けられる（Dayら、1985）。免疫媒介性血小板減少症（ITP; Kristensenら、1994; We rnerら、1985）、全身性エリテマトーデス（Kristensenら、1994）、ならびに白血球減少症およびクームズ陽性溶血性貧血（Wernerら、1985）もまた、本発明の方法および組成物を用いる処置を受けやすい。 VII．IFN τの投与 A．薬学的組成物 IFNτあるいは関連するポリペプチドまたはタンパク質を含有する治療的調製物または薬物は、薬学的に有用な組成物（薬物）を調製するための公知の方法に従って処方および製造され得る。インターフェロンまたはインターフェロン様化合物を含む処方物は、以前に記載されている（例えば、Martin、1976）。一般に、IFNτ含有薬物は、組成物の有効な投与を容易にするために、有効量のIFNτが適切なキャリアおよび／または賦形剤と組み合わされるように処方される。IFN τ、または関連するポリペプチドは、静脈内注射、筋肉内注射、病変内注射または皮下注射を包含する、任意の薬学的に受容可能な投与形態で、患者に投与され得る。詳細には、他のインターフェロン化合物のために使用される組成物および方法が、これらの化合物の送達のために使用され得る。経口投与のために適切な組成物の場合、IFNτを含有する錠剤およびカプセルが、IFNτ（例えば、凍結乾燥されたIFNτタンパク質）および任意に以下の添加物から製造され得る。薬学的に受容可能なキャリア（例えば、ラクトース、コーンスターチ、軽無水ケイ酸（light silicic anhydride）、微結晶性セルロース、スクロース）、結合剤（例えば、α型デンプン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン、低飽和ヒドロキシ-プロピルセルロース）界面活性剤（例えば、Tween 80、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマー）、抗酸化剤（例えば、Ｌ-システイン、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム）潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク）など。さらに、IFNτポリペプチドは、固体、粉状、またはその他のキャリア（例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン（例えば、ポテトスターチ、コーンスターチ）、ミリペクチン、セルロース誘導体、またはゼラチン）と混合され得、そして潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、あるいは錠剤の形態に圧縮されたポリエチレングリコールワックス）をまた含有し得る。いくつかのキャリアまたは希釈剤の層を用いることにより、徐放性を有して作用する錠剤が、調製され得る。経口投与のための液体調製物は、エリキシル剤、シロップ、または懸濁剤の形態で作製され得る。これは例えば、約0.1重量％〜約30重量％のIFNτ、糖、ならびにエタノール、水、グリセロール、プロピレン、グリコール、およびおそらく他の従来の性質の他の混合物を含有する溶液である。 B．投与量経口的に活性なIFNτの薬学的組成物は、治療的有効量で、処置を必要とする個体に投与される。用量はかなり変化し得、そして障害の重篤度、患者の年齢および体重、ならびに患者が摂取し得る他の薬物などの要因に依存する。この量または投与量は、代表的には主治医により決定される。投与量は代表的には、約１ ×10⁵単位／日と１×10⁸単位／日との間であり、好ましくは約１×10⁶単位／日と１×10⁷単位／日との間である。その低い毒性のために、IFNτは、例えばIFN βより高用量で投与され得ることが理解される。比較のために、多発性硬化症（ MS）の患者を、10⁶ Uおよび８×10⁶ UのIFNβで処置した。８×10⁶ Uを受けた患者は、10⁶ Uを受けた患者よりも少ない疾患の再発を被った。しかし、より高い用量のIFNβ（８×10⁶ U）を受けた患者はまた、IFNβの毒性に伴われる副作用をより多く示した（IFNβ多発性硬化症研究グループ）。IFNτのより低い毒性の点から、これらのより高い有効投与量が、伴われる有毒な副作用なしに投与され得る。定常的な上昇した血漿中IFNτレベルを必要とする障害は、約２〜４時間ごと程度の頻度の経口投与または約12〜24時間ごとの注射を介する投与から利益を得るが、他の障害（例えば、MS）は、より少ない頻度の間隔（例えば、48時間ごとに１回）で治療的有効用量を投与することにより、効果的に処置され得る。個々の用量の投与速度は、代表的には、主治医により、処置される疾患の重篤度を軽減しつつ最低の総投与量の投与を可能にするように調整される。一旦患者の症状の改善が生じれば、必要であれば維持用量が投与される。次に、投与量または投与の頻度、あるいは両方が、（症状の係数として）それで改善された症状が保持されるレベルまで減少され得る。皮膚に影響する自己免疫障害（例えば、乾癬）は、病変内で、IFNτを用いて処置され得る。ここで、処方および用量は、投与方法ならびに処置されるべき病変の大きさおよび重篤度に依存する。好ましい方法は、皮膚内注射および皮下注射を包含する。大きな病変への複数の注射が可能であり得、そして単一の患者の皮膚上のいくつかの病変が一度に処置され得る。投与スケジュールは、当業者により決定され得る。持続される放出のために設計される処方物は、投与の頻度を減少し得る。本発明のIFNτポリペプチドでの局所的処置は、特定の器官における自己免疫疾患の処置のために有用である。処置は、動脈内注入または静脈内注射により達成され得る。カテーテルを外科的にまたは血管造影的に移植して、処置を羅患した器官に処置を指向させ得る。カテーテルに連結された皮下門脈を、慢性処置のために使用し得、または移植可能な、再充填可能なポンプもまた用いられ得る。あるいは、組成物は、羅患した組織内への直接注射により投与され得る。慢性関節リウマチの処置のために、例えば、組成物は羅患した関節内への直接注射により投与され得る。患者は、少なくとも24時間での反復される間隔で、患者における疾患の症状の発症後数週間の期間にわたって処置され得る。全身的処置は、全ての適用について本質的に等価である。経口投与を用いる全身的処置を上で論じた。複数の静脈内または皮下用量も可能であり、そして処置のための移植可能な方法の場合、持続された放出のために設計された処方物が、特に有用である。患者はまた、移植可能な皮下門脈、レザバー、またはポンプを用いて処置され得る。他の投与方法は、坐剤および膣内を包含する。全身性エリテマトーデス（SLE）またはMSの処置のためには、例えば、組成物は、経口または非経口投与（例えば、IV投与）により投与され得る。 C．組合せ治療本発明の組成物および方法が、他の治療と組み合わせて使用され得ることが、もちろん理解される。例えば、高投与量でIFNτが相対的に毒性がないことの点で、IFNβ1bの低投与量で改善を示さない、または毒性のためにIFNβ1bを寛容し得ないMS患者は、より高い投与量のIFNτまたはそれに由来するペプチドでのその後のまたは同時の処置から利益を受け得る。この点で、IFNβ1bは、「第２の処置薬剤」と考えられ得る。さらに、中和抗体の発生が、IFNβ1b処置患者において実証された（Weinstock-Guttmanら、1995）。そのような中和抗体がIFNβ1b の有効性を妨げると判明する場合は、IFNτは重要な代替治療であり得る。なぜなら、抗体の交差反応が生じそうになく、そしてIFNτは中和抗体を生成しそうにないからである（実施例12を参照のこと）。経口投与されるIFNτは、この点で特に有利である。なぜなら、これは、注射されるIFNτより顕著に低い抗IFNτ 抗体応答を生じるからである。本発明により可能となる別のタイプの組合せ治療は、自己免疫応答がそれに対している抗原のIFNτとの組合せの経口投与である。このような抗原の経口投与は、寛容化を生じ得、自己免疫疾患の重篤度を軽減させ得る（総説については、 Weinerら、1994を参照のこと）。IFNτが抗原により誘導される寛容化と相乗効果を有し得、それにより自己免疫疾患の重篤度を軽減し得ることが意図される。例えば、MBPは、EAEを抑制すると示された（Liderら、1989）。本発明の方法によれば、多発性硬化症を処置するために、MBPはIFNτと組合わせて投与され得る（「第２の処置薬物」として）。他の例は、慢性関節リウマチを処置するためのコラーゲンとの、および重症筋無力症を処置するためのアセチルコリンレセプターポリペプチドとのIFNτの投与を包含する。さらに、IFNτは、多発性硬化症のような自己免疫疾患を処置するために、既知の免疫抑制剤（例えば、ステロイド）と共に経口投与され得る。免疫抑制剤（「第２の処置薬剤」と考えられる）はIFNτと共働的に作用し得、そして等価な用量のIFNτまたは免疫抑制剤単独で得られ得るよりも有効な処置を生じ得る。同様に、ガンまたはウイルス疾患のための処置において、IFNτは、例えば、治療有効量の１つ以上の化学療法剤（例えば、ブスルファン、5-フルオロ-ウラシル（5--FU）、ジドブジン（AZT）、ロイコボリン、メルファラン、プレドニゾン、シクロホスファミド、ダカルバジン、シスプラチン、およびジピリダモール）と共に投与され得る。以下の実施例は本発明を例示するが、いかにしても本発明を限定するように意図されない。材料および方法 A．緩衝液リン酸緩衝化生理食塩水（PBS） 10×ストック溶液、１リットル： 80 g NaCl ２ g KCl 11.5 g Na₂HPO₄-7H₂O ２ g KH₂PO₄ 作業溶液（pH 7.3）： 137 mM NaCl 2.7 mM KCl 4.3 mM Na₂HPO₄-7H₂O 1.4 mM KH₂PO₄ B．抗体の検出のための一般的なELISAプロトコルポリスチレンの96ウェルプレートであるImmulon II（PGC）を、0.1 Mカーボネート／バイカーボネート緩衝液（pH 9.5）中の５μg／mL（１ウェル当たり100μ L）の抗原でコートした。このプレートをパラフィルムで密封し、そして４℃で一晩保存した。インキュベーション後、このプレートを吸引し、300μLの10％NGSでブロックし、そして37℃で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを５回PBS 0.5％「TWEEN-20」で洗浄した。抗血清を0.1 M PBS（pH 7.2）中で希釈した。所望の希釈の抗血清（0.1 mL）を各ウェルに添加し、そしてプレートを１時間37℃ でインキュベートした。次いで、プレートを５回PBS 0.5％「TWEEN-20」で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗ヒト抗血清（Cappel，Durham ，NC）を、PBS中で１／5,000希釈した。0.1 mLのこの溶液を、各ウェルに添加した。プレートを30分間37℃でインキュベートし、次いで５回PBSで洗浄した。 Sigma ABTS（基質）をプレートへの添加の直前に調製した。この試薬は、50 m Lの0.05 Mクエン酸（pH 4.2）、0.078 mLの30％過酸化水素溶液、および15 mgの ABTSからなる。0.1 mLの基質を各ウェルに添加し、次いで30分間室温でインキュベートした。反応を0.050 mLの５％SDS（w/v）の添加で停止した。相対的吸光を 410 nmで測定する。 C．OvIFN- τの産生合成OvIFNτ遺伝子を、標準的な分子方法（Ausubelら、1988）を用いて、OvIF Nτアミノ酸配列をコードするDNA配列（Imakawaら、1987）の連続する部分を含むオリゴヌクレオチドを連結することにより生成した。生じたIFNτポリヌクレオチドコード配列は、172アミノ酸のコード配列である16位〜531位にわたる。全長合成遺伝子のStuI／SstIフラグメント（540 bp）を、改変したpIN III om p-A発現ベクター中にクローン化し、そしてコンピテントなE．coliのSB221株中に形質転換した。IFNτタンパク質の発現のために、発現ベクターを有する細胞を、アンピシリンを含有するL-ブロス中でOD（550 nm）0.1〜１まで増殖させ、I PTG（イソプロピル-1-チオ-b-D-ガラクトシド）で３時間誘導し、そして遠心分離により回収した。可溶性組換えIFNτを、超音波処理または浸透圧分画により、細胞から遊離させた。酵母における発現のために、IFNτ遺伝子を、それぞれ5'末端および3'末端にS tuIおよびSacI制限部位を含むPCRプライマーを用いるポリメラーセ連鎖反応（PC R; Mullis，1987; Mullisら、1987）を用いて増幅した。増幅されたフラグメントをStuIおよびSacIIで消化し、そして「pBLUESCRIPT+(KS)」のSacIIおよびSmaI 部位に連結して、pBSY-IFNτを生成した。プラスミドpBSY-IFNτをSacIIおよびE coRVで消化し、そして合成IFNτ遺伝子を含むフラグメントを単離した。酵母発現ベクターpBS24Ub（Sabinら、1989; Eckerら、1989）をSalIで消化した。平滑末端を、T4 DNAポリメラーゼを用いて生成した。ベクターDNAをフェノールで抽出し、そしてエタノール沈澱した（Sambrookら、1989）。回収したプラスミドを SacIIで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、そしてpBSY-IFNτから単離したSacII-EcoRVフラグメントに連結した。生じた組換えプラスミドをpBS24 Ub-IFNτと名付けた。組換えプラスミドpBS24Ub-IFNτを、E．coli中に形質転換した。IFNτインサートを含む組換えクローンを単離し、そして制限酵素解析により同定した。IFN τコード配列をpBS24Ub-IFNτから単離し、そしてアルコールオキシダーゼ（AOX 1）プロモーターを含むPichia pastorisベクター（Invitrogen，San Diego，CA ）中にクローン化した。次いで、このベクターを用いてPichia pastoris GS115H is^-宿主細胞を形質転換し、そしてタンパク質を製造者の説明書に従って発現させた。タンパク質を培地中に分泌させ、そして連続するDEAE-セルロースおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより、SDS-PAGEおよび銀染色により測定したところの電気泳動的な均質まで精製した。精製されたタンパク質は、Ma din-Darbyウシ腎臓（MDBK）細胞に対する抗ウイルス活性により測定したところ、約0.29〜約0.44×10⁸ U／mgの比活性を有していた。実施例１ IFN β、IFNγおよびIFNτの毒性 A．インビトロ毒性−細胞計数および体重変化 NZWマウスにおける総白血球（WBC）、総リンパ球計数および体重測定値に対する、IFNτ、IFNβ、およびIFNα（10⁵ U／注射）でのインビボ処置の影響を、以下のように評価した。インターフェロン（OvIFNτ、MuIFNβ、およびMuIFNα）を、10⁵ Uの濃度で、総容量0.2 mlで、数群のPBS中で、New Zealand White（NZW ）マウス（Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME）中に腹腔内（i.p.）注射した。３〜４匹の動物を各群に含んだ。白血球（WBC）計数を、注射前およびその後の選択された時点（代表的には、12および24時間）で、血球計算盤および標準的な技法を用いて測定した。分画WBC計数（differential WBC count）を、ライト−ギームザ染色した血液スミアに対して実施した。注射前に、動物の体重は20 〜23グラムの範囲であった。結果を以下の表３に要約する。 IFNτ処置マウスと未処置マウスとの間では、WBC計数においても、リンパ球計数においても、または体重変化においても、有意な差は観察されなかった。対照的に、IFNβ処置マウスは、リンパ球計数における31.7％の低下を、注射後12時間で示し、これは少なくとも次の12時間持続した。IFNα処置マウスは、55.8％のリンパ球低下および顕著な体重減少を、注射後12時間で示した。これらのデータは、IFNβおよびIFNαとは異なり、IFNτは、末梢血細胞計数および体重測定により証明されるように、上記の濃度においてインビボにおける毒性を有さないことを示す。 B．インビトロ毒性−L929細胞アッセイ IFN処理の毒性を、マウスL929細胞株を用いて、インビトロで測定した。L929 細胞を、6000 U／ml〜200,000 U／mlのOvIFNτまたはMuIFNβのいずれかで処理した。インターフェロンを０時点で添加し、そして細胞を72時間インキュベートし、そしてクリスタルバイオレットで染色した。生存細胞の割合を、405 nmにおける吸光度を測定することにより測定した。例示的なデータを図１に示す。値を％生存率±標準誤差として表し、ここで10 0％は、培地単独で処理したL929細胞の生存率に等しい。6000 U／mlで、IFNβ処理細胞は77.0±0.6％の生存率を示した。L929細胞の生存率は、IFNβの濃度が増加するにつれて、用量依存性の様式で低下した。対照的に、L929細胞は、試験したいずれのIFNτ濃度においても、生存率における低下を示さなかった。これらのデータは、IFNβとは異なり、IFNτは、高濃度におけるインビトロでの毒性を有さないことを示す。まとめると、上に要約する結果は、IFNβがインビトロおよびインビボの両方で毒性を誘導する濃度で、IFNτが本質的に無毒であることを実証する。実施例２ IFN τは実験的アレルギー性脳脊髄炎の発達を阻害する IFN-τを、EAEの誘導を防止するその能力について試験した。レシピエントNZW マウスを、単回用量の10⁵ U／mlの組換えヒツジIFN-τ（OvIFNτ）またはマウス IFN-β（MuIFN-β；Lee Biomolecular，San Diego，CA）のいずれかで、EAEの誘導のためのウシミエリン塩基性タンパク質（bMBP）での免疫の日に、または３用量の10⁵ U／mlのOvIFN-τまたはMuIFN-βで、EAEの誘導のためのMBPでの免疫の4 8時間前、当出および48時間後に、i.p.注射した。 EAEの誘導のために、300μgのbMBPを８mg／mlのH37Raを含有するフロイント完全アジュバント中で乳化し、そして尾の付け根の両側に注射した。免疫の日および48時間後に、400 ngの百日咳毒素（List Biologicals，Campbell，CA）もまた注射した。マウスを毎日EAEの徴候について検査し、そして疾患の重篤度を以下の尺度で等級付けした：１、尾緊張の喪失；２、後肢の脱力；３、不全対麻痺；４、対麻痺；５、瀕死／死亡。実験の結果を、上記表４に要約する。データを２つの組に分割する。第１の組（最初の３列）は、IFNを、実験動物に、免疫の日に注射した場合の実験に対応する。この組における全ての動物はEAEを発達させたが、発症の平均日は、OvIFN τ（23.8±0.5日）およびMuIFN-β（23.5±0.6日）処置動物の両方において、コントロール動物（16.2±0.8日）に比較して遅れた。さらに、疾患の平均重篤度（上記のように定量化した）は、両方のIFN処置群において、コントロールに比較して低下した。OvIFNτ同様、単回用量の10⁵ UのMuIFNβもまた、疾患の発達における７日の遅延を生じた。結果は、複数用量プロトコル（表１の４〜６列）についてより顕著である。ここで、３用量のIFN（免疫の48時間前、当日および48時間後）を実験動物に投与した。９匹中７匹のコントロール動物は、免疫後平均15.2日でEAEを発達させたが、９匹のOvIFNτで処置した動物は、全く疾患を発達させなかった。MuIFN-β で処置した９匹の動物の中で１匹が、免疫後22日にEAEに屈した。上記の実験からの平均重篤度の経時変化を図２に示す。コントロール動物からのデータを（△）により示し、単回用量のOvIFNτで処置した動物からのデータ（□）により示す。データは、IFNτが、EAEの防止のための有効な免疫療法であり、そして自己免疫疾患のこのモデルにおいてMuIFNβと同様に有効な処置であることを実証する。IFNτのIFNβに比較してより低い毒性とあわせると、このデータは、自己免疫障害（例えば、多発生硬化症）を有する個体のIFNτでの処置は、IFNβでの処置より好ましくあり得、そして有効であり得る。実施例３Ｔ細胞増殖のIFNτ阻害インビトロにおいてMBPで刺激したMBP-免疫NZWマウス由来の脾臓細胞の増殖に対するIFNτの影響を、以下のように測定した。bMBPで免疫したNZWマウス由来の脾臓細胞を、[³H]チミジンおよび０、10、100、または1000 U/mlのOvIFNτの存在下で、300μg/mlのbMBP中で培養した。増殖を、[³H]チミジン取り込みにより測定した。結果を図３に示す。データを、３連のサンプルの１分間あたりの計数（cpm）の平均として示す。バックグラウンドのcpmを示されたcpm値から差し引いた。MB Pに応答しての増殖は盛んであり、そして用量依存性の様式でIFNτにより減少され得た。1000 U/mlのIFNτが、増殖を、MBP単独に応答して観察される増殖の半分未満まで減少させた。これらの結果は、IFNτが、自己抗原であるMBPに特異的なＴ細胞に対して抗増殖活性を有することを実証し、そしてIFNτがMBP誘導性EAEの症状を阻害または除去するという観察と一致する。実施例４ IFN τはスーパー抗原再活性化を防止する IFNτを、NZWマウス（Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）におけるEAEのスーパー抗原再活性化を防止するその能力について検討した。これらの実験において従ったプロトコルの概略図を、図4A、4B、4C、4D、4E、および4Fに示す。これらの図は、下記のプロトコルの関係において言及される。 EAEの誘導のために、300μgのbMBPおよび400ngの百日咳毒素（List Biologica l Technologies，Campbell，CA）を、８mg/mlのH37Reを含有するフロイント完全アジュバント中で乳化し、そして尾の付け根の両側に注射した（図4A）。400ng の百日咳毒素を含有する別の注射を、48時間後に投与した。注射はEAEを誘導し、これはピークに達し（図4B）、そして次第に減少し、その結果ついに、すべてのEAEの臨床的症状は消散した（図4C）。 SEBを、疾患の消散の１ヶ月後に投与した（図4D）。マウスに、３用量の10⁵ U のIFNτを、スーパー抗原再活性化のための40μgのSEB（Toxin Technology，Sar asota，FL）および400ngの百日咳毒素（List Biological Technologies，Campbe ll，CA）（0.2 mlのPBS中）の注射の48時間前、当日、および48時間後に、i.p. 注射した。コントロールマウスは、SEBおよび百日咳毒素のみを受けた。IFNτ調製物は、実施例２において記載した調製物と同一であった。マウスを、EAEの徴候について毎日検査し、そして疾患の重篤度を実施例２に記載のように等級付けした。データを上の表５に要約する。総計９匹のコントロールマウス（IFNτを受けていない）中、６匹がEAEの再活性化を発達させた。発症の平均日は、第１の実験においては６±1.7であり、そして第２の実験において10±2.5であった。疾患の平均重篤度は、第１の実験においては1.6±0.5であり、そして第２の実験において1.4±0.4であった。しかし、IFNτで処置した９匹の動物中、１匹も疾患の症状を発達させなかった。実施例５ IFN τはVβ特異的Ｔ細胞活性化を阻害するインビトロにおけるSEB誘導性Vβ特異的Ｔ細胞拡大のIFNτ処置の影響を、以下のように評価した。FACS試薬をPharmingen，San Diego，CAから得た。Vβ特異的Ｔ細胞FACS分析を、未処置、SEB注射（50μg）、またはIFNτ（10⁵ U）および SEB（50μg）注射NZWマウスに対して実施した。全ての注射はi.p.であり、そして実施例３に記載のように投与した。分析を注射72時間後に実施した。 FACS分析のために、約10⁶個のＴ細胞を動物から単離し、そしてビオチン標識抗Vβ抗体と45分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンと15分間インキュベートし、その後別の洗浄およびFITC標識抗CD4抗体との45分間のインキュベーションを行った。細胞を再度洗浄し、そして２連で１サンプル当たり10,000事象（event）としてFACSort（Be cton-Dickinson，Mountain View，CA）で分析した。例示的な実験の結果を図５に示す。白棒は未処置動物を示し；充填した棒はSE B注射動物を示し；そして網掛けした棒はIFNτおよびSEB注射した動物を示す。値を、陽性に染色された細胞の百分率±標準誤差として示す。SEB注射ならびにI FNτおよびSEB注射のVβ8⁺CD4⁺Ｔ細胞サブセットについての値は、スチューデントｔ検定により示したところ有意に異なった（Ｐ＜0.02）。未処置のNZWマウスは、5.1±0.1％のVβ8⁺CD4⁺Ｔ細胞を示した。50μgのSEBでの注射の後、このサブセットは10.2±0.2％まで拡大された。10⁵ UのIFNτをSEB注射に先行させた場合、Vβ8⁺CD4⁺Ｔサブセットの拡大は、7.6±0.2％に制限された。SEBがそれに対しても特異的である、Vβ7⁺およびVβ11⁺Ｔ細胞の部分的阻害もまた観察された。これらのデータは、IFNτでの処置が、インビボにおいてSEB誘導性VβＴ細胞拡大を部分的に阻害し得ることを示し、そしてIFNτがMBP誘導性EAEの症状を阻害または除去するという観察をさらに支持する。実施例６経口投与されたOvIFNτは実験的アレルギー性脳脊髄炎の発達をブロックする経口投与されたIFNτおよび注射されたIFNτを、EAEの誘導を防止するその能力について試験した。レシピエントのNew Zealand White（NZW）マウスは、OvIF Nτ（10⁵ U/ml）を、i.p.注射または経口給餌のいずれかにより、EAEの誘導のためのbMBPでの免疫の48時間前、当日、および48時間後に受けた。10⁵ UのIFNτを、PBSと混合して総容量100μlとし、そして食道を下って胃の中へ入れた給餌管を用いて投与した。IFNτのPBS中での希釈を、投与の直前に行った。 NZWマウスにおけるEAEの誘導のために、300μgのウシミエリン塩基性タンパク質（bMBP）を、８mg/mlのH37Ra（Mycobacterium tuberculosis，Difco，Detroit ，MI）を含有するフロイント完全アジュバント（CFA）中で乳化し、そして尾の付け根の両側に注射した。免疫の当日および48時間後に、400ngの百日咳毒素（L ist Biologicals，Campbell，CA）も注射した。SJL/JマウスにおけるEAEの誘導のために、マウスを最初の免疫の７日後に再度免疫した以外は、記載したと同じプロトコルを使用した。マウスを毎日EAEの徴候について検査し、そして疾患の重篤度を実施例２に記載のように等級付けした。抗OvIFNτモノクローナル抗体（mAb）であるHL127を、EAEの防止がOvIFNτ処置に特異的であったかどうかを決定するために用いた（抗体HL127（配列番号２のaa 139〜172に対する）は、MDBK細胞株を用いる抗ウイルスアッセイにおいて、OvIFNτの抗ウイルス活性を中和する）。HL127の1:10希釈物を、i.p.注射または経口給餌のいずれかによる投与の前に、２時間OvIFNτとインキュベートした。IFNτ抗原に対する抗体は、本明細書に記載の情報を、公知の抗体産生のための技術（例えば、Harlowら、1988）と組み合わせて使用して、生成され得る。結果を以下の表６に示す。OvIFNτの経口給餌およびi.p.注射の両方が、EAEの急性誘導に対して防御した。IFNτをi.p.注射を介して受けた動物はいずれも、E AEの症状を発達させなかったが、IFNτを経口で受けた動物は、９匹中７匹（78 ％）が防御された。抗体HL127は、OvIFNτのEAEをブロックする能力を、部分的に中和することにおいて有効であった。これらのデータは、経口投与されるIFN τが、多発性硬化症の動物モデルにおける処置として有効であることを示す。 OvIFNτ（10⁵ U）を、MBP免疫の48時間前、MBP免疫の当日、およびMBP免疫の4 8 時間後に、i.p.注射または経口給餌のいずれかにより投与した。HL127（OvIFNτ に特異的なモノクローナル抗体）を、投与前に、OvIFNτと２時間インキュベートした。実施例７経口投与後の血清におけるOvIFNτの検出マウス（上記のように処置した）の血清において検出可能なOvIFNτの量を、O vIFNτの経口給餌（上記のように）またはi.p.注射の後、経時的に比較した。マウスに3×10⁵ UのOvIFNτを投与し、そしてIFNτ投与の0.5、２、４、６、24、および48時間後に放血した。血清を、細胞変性効果（ウイルスプラーク）アッセイ（Familettiら、1981）において試験して、サンプル中のIFNτの量を決定した。簡潔に記載すると、IFNτの希釈物を、平底96ウェルプレート中でコンフルエントになるまで増殖させたMDBK細胞に添加し、そして18〜24時間37℃でインキュベートした。水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatatosis virus）（VSV）を、プレートに45分間室温で添加した。ウイルスを除去し、メチルセルロースを添加し、そしてプレートを48時間37℃でインキュベートした。メチルセルロースの除去後、プレートをプラークの可視化のためにクリスタルバイオレットで染色した。IFN中和の測定のために、500 U/mlの濃度でのOvIFNτを、１時間37℃で、血清またはHL127のいずれかとインキュベートした。１抗ウイルス単位が、VSVで感染した未処理MDBK細胞（コントロールプレート）に比較して、単層の破壊における50％の減少を引き起こした。アッセイ間変動を除去するために、全てのサンプルを同時にアッセイした。図６に示すように、OvIFNτは、200 U/mlのレベルでの経口給餌（充填した棒）後0.5時間および２時間後に検出された。比較により、いくらかより高いレベルのOvIFNτが、i.p.注射（白棒）後24時間の期間にわたって検出された。これらのデータは、IFNτの上記の用量が、血清において経口投与後約２時間検出され得ることを示す。実施例８経口投与されるOvIFNτによる実験的アレルギー性脳脊髄炎の慢性再発の防止 OvIFNτの麻痺を防止する能力を、EAEの慢性再発モデルを用いて検討した。ここで、MBPで免疫したSJLマウスは、疾患の慢性型を発達させ、症状の出現は再発 −軽減様式（relapsing-remitting manner）で生じる（ZamvilおよびSteinman， 1990）。 EAEをSJLマウスにおいて、本質的に上記のように誘導した。マウスを10⁵ UのO vIFNτで、i.p.注射または経口給餌のいずれかにより、免疫の当日（０日目）およびその後、実験の間48時間毎に処置した。図7Aに示すように、MBPで免疫したが、OvIFNτ処置を受けなかったSJLマウスは、５／５の疾患の発生数で、実験の開始の14日後に生じた約2.5のピーク平均重篤度を有して、慢性再発性麻痺を発達させた。対照的に、i.p.注射または経口給餌のいずれかによるOvIFNτでの処置（それぞれ、図7Bおよび7C）は、EAEからの防御を生じた。両方のOvIFNτ処置群における疾患の発生数は、約1.0の平均重篤度を有して、１／５の動物に減少した。これらのデータは、IFNτの経口投与が、慢性再発性EAEの発達をブロックし得ることを示し、そして、IFNτが約48時間毎に延長された期間にわたって給餌される場合に、経口投与されるIFNτがi.p.注射と同様に有効であり得ることを示唆する。実施例９組織学的解析組織学的解析を、経口経路およびi.p.経路によりOvIFNτで処置したMBP免疫マウスのCNSへのリンパ球浸潤の程度を決定するために、実施した。マウスを４％パラホルムアルデヒドで灌流し、脊柱を取り出し、そしてホルマリンで２〜３日間処置した。脊髄を切除し、そして一晩４℃で0.5％スクロース中に浸した。脊髄切片を包埋し、そして切片をミクロトーム中で切断した。切片を４％パラホルムアルデヒド中でスライドに固定し、そして炎症性浸潤物の可視化のためにクレシルバイオレットで染色した。結果を図8A、8B、および8Cに、最終倍率222×で示す。リンパ球性病変がコントロール脊髄白質中に存在した（図8A）。対照的に、i.p.注射（図8B）または経口給餌（図8C）によりOvIFNτで処置したマウスにおいては、リンパ球性病変は検出されなかった。これらのデータは、IFNτの防御効果がCNSのリンパ球浸潤の阻害に関連することを示唆する。実施例10 OvIFN τでの処置によるIL10の誘導慢性再発性EAEの防止のためのSJLのOvIFNτ処置の過程の間に、マウスを放血し、そして血清をインターロイキン10（IL10）の存在について検討した。単回IF Nτ（10⁵ U）処置（i.p.注射または経口給餌による）、延長されたIFNτ（10⁵ U ）処置（20日より長いi.p.注射または経口給餌による）または無処置のいずれかを受けたマウス由来の血清を、IL10について、製造者の説明書に従いIL10 ELISA キット（Genzyme，Cambridge，MA）を用いて、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA ）により検討した。全ての血清サンプルを二連で試験した。コントロールマウスにおいても、i.p.注射または経口給餌のいずれかによりOv IFNτの単回処置を受けたマウスにおいても、IL10は検出されなかった。対照的に、20日より長く48時間毎に、i.p.注射または経口給餌のいずれかによりOvIFN τを受けたSJLマウスは、それらの血清中に検出可能なレベルのIL10を有した（図９）。これらのデータは、IFNτ誘導性のIL10の産生が、それによってOvIFNτ がEAEの発達を防止する寄与する機構であり得ることを示唆する。実施例11 OvIFN τでの処置の中止は再発性麻痺を生じる i.p.注射または経口給餌を介するOvIFNτ処置（48時間毎）によりEAEから防御されたSJLマウスを58日間追跡し、その間疾患の発達は観察されなかった。次いで、OvIFNτでの処置を除去し、そしてマウスを疾患の症状についてさらに22日間観察した。結果を図10に示す。グラフの下方に、IFNτ処置を＋の記号として表し、そしてIFNτ処置の除去を−の記号として表す。各処置群における疾患発生数は以下のとおりであった：PBSコントロール＝３／４（四角）；i.p.注射＝３／３（三角）；経口給餌＝３／４（丸）。以前にOvIFNτ処置によりEAEから防御された両方のマウスの群は、OvIFNτ処置の除去後６〜12日に、麻痺の徴候を発達させた。これらのデータは、継続中の IFNτの投与（i.p.注射または経口給餌のいずれかによる）が、EAEの慢性再発性モデルにおいて、EAEからの継続される防御のために望ましいことを示す。実施例12 OvIFN τの経口投与は抗OvIFNτ抗体応答を減少させる上記実施例11に記載の実験におけるOvIFNτ処置の除去後、各処置群由来のマウスを放血し、そして血清を抗OvIFNτ抗体（Ab）の存在について検討した。抗原であるOvIFNτを、プラスチック組織培養ウェルの平底に、一晩600ng/ウェルの濃度で吸着させ、そして次いで蒸発させて乾燥させた。プレートを、非特異的結合をブロックするために、２時間、PBS中の５％ミルク（Carnation）で処理し、次いで0.05％Tween 20を含有するPBSで３回洗浄した。未処置の、i.p.注射によりOvIFNτ処置した、および経口給餌によりOvIFNτ処置したマウス由来の血清の種々の希釈物を、添加し、そして３時間インキュベートした。結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウス免疫グロブリンを用いて評価した。発色を、o-フェニレンジアミンおよびH₂O₂を添加し、そして2M H₂SO₄で反応を停止した後に、492 nmで、ELISAプレートリーダー（Bio-Rad，Richmond，CA）を用いてモニターした。例示的な結果を図11に示す。未処置、OvIFNτ処置−i.p.注射、およびOvIFNτ 処置−経口給餌（２匹のマウス／群）由来の血清を、1:30（白棒）および1:120 （充填した棒）を含む複数の希釈物を用いて、ELISAにより検討した。OvIFNτを経口給餌により受けたマウスは、最小のAbレベルを示したが、OvIFNτをi.p.注射により受けたマウスは、上昇したレベルの抗OvIFNτ Abを示した。予想通り、 OvIFNτ処置を受けなかったマウスは、抗OvIFNτ Abを示さなかった。血清を、上記のようにMDBK細胞に対するOvIFNτの抗ウイルス活性を中和するその能力についても検討した。結果を以下の表７に示す。i.p.注射したマウス由来の血清も、経口給餌したマウス由来の血清も中和活性を有さなかった。これらのデータは、IFNτでの経口処置が、i.p.注射−処置個体において観察されるOvI FNτに対するAb応答を回避すること、およびいずれの処置もが代表的には中和抗体の生成を生じないことを示唆する。本発明を特定の方法および実施態様に関して記載したが、種々の改変および変更が本発明から逸脱することなくなされ得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジョンソン，ホワードマーセルスアメリカ合衆国フロリダ 32606，ガイネスビル，エヌ．ダブリュー．75ティーエイチストリート 4404

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物被験体における自己免疫疾患を処置するための薬物の製造のための τ-インターフェロン（IFNτ）の使用であって、該処置が薬学的有効量の該薬物を該被験体に経口投与することによる、使用。２．前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１に記載の使用。３．前記IFNτがヒツジIFNτおよびウシIFNτからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。４．前記IFNτがヒツジIFNτ（OvIFNτ）である、請求項３に記載の使用。５．前記OvIFNτが配列番号２として示される配列を有する、請求項４に記載の使用。６．前記IFNτが組換え生産されるIFNτである、請求項１に記載の使用。７．前記哺乳動物被験体がヒト被験体である、請求項１に記載の使用。８．前記薬学的有効量が１日当たり約１×10⁵単位のIFNτと約１×10⁸単位のIFN τとの間を含む、請求項１に記載の使用。９．前記薬学的有効量が１日当たり約１×10⁶単位のIFNτと約１×10⁷単位のIFN τとの間を含む、請求項８に記載の使用。１０．前記投与がさらに第２の自己免疫疾患処置薬剤の投与を包含する、請求項１に記載の使用。１１．前記第２の薬剤がコルチコステロイド薬物である、請求項１０に記載の使用。１２．IFNτによる処置に応答性の疾患を処置するための薬物の製造のためのτ- インターフェロン（IFNτ）の使用であって、該処置が該薬物を哺乳動物被験体に経口投与することによる、使用。１３．前記疾患が自己免疫疾患である、請求項１２に記載の使用。１４．前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１３に記載の使用。１５．前記IFNτがヒツジIFNτおよびウシIFNτからなる群から選択される、請求項１２に記載の使用。１６．前記IFNτが組換え生産されるIFNτである、請求項１２に記載の使用。１７．前記被験体がヒト被験体である、請求項１２に記載の使用。