TW400233B - Pharmaceutical compositions comprising IL-12 antagonists for treating autoimmune diseases - Google Patents

Description

A7 ____B7__ 五、發明說明（1 ) , 發明背醫 * 加瑪干擾素（I fn — r )和阿爾發腫瘤壞死因子（ TN F - α )已顯示與許多自體免疫病症的發展，復發和 /或惡化有關。舉例來說，IFN_r和TNF — α都與 多發性硬化〔Choflon 等人，E_ur. Cytokine Netw. 3(6)， 1 9 92, pp. 523-531 ; Steinman, Scientific American, September 1 9 9 3, pp. 107-114; Hofman 等人，J. . Exp.

Med. 170，1 98 9，ρρ· 6 0 7- 6 1 2 ; Panitch 等人 Neurology, 37，1 9 87，pp. 1 0 9 7- 1 1 0 2〕和第I型糖尿病（胰島素有關 的糖尿病，I D D Μ ) 〔 C a s t a n t 〇 等人，A η n u. R e v .

Immunol. 9. 1990. ρρ·647-6 7·9; Campbell 等人，J.

Clin. Invest. 87，1991，pp. 739-742〕之病程早有關聯 。當發現I NF — α:會助長風濕性動脈炎〔Feldmann等人 ，Progress in Growth Factor Research (生長因子發展 研究），4，1992, pp. 247-255〕的成長時，關節炎患者 已藉I F N - r之給藥而獲得改善〔Veys等人， Rheumatology (風濕病學），15(4). 1988. ρρ·570-574 〕。研究也早已顯示，含有該IFN— r的自體免疫症病 變會與全身性圓盤狀紅斑性狼瘡（SLE) 〔 Funauchi等 人’ Tohoku J. Exp_ Med.， 164，1991，ρρ·259-267; Bankhurst，J. Rheumatology (風濕病學），14(supp. 13 ).1 9 8 7. pp. 6 3 - 6 7〕〕，自體免疫甲狀腺炎〔Tang等人 ，Eur. J_ Immunol.(免疫學），23. 199 3. 257-278頁〕 ，及自體免疫炎性眼病（例如：葡萄膜視網膜炎）〔 氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線-_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _ B7 ___ 五、發明說明（2 ) .

Charteris等人，Immunol.(免疫學）75，1992，pp.463-467〕 有關 。自 體免疫 性肺炎 〔Deguchi 等人 ’ Clin. Exp. Immunol.(臨床實驗免疫學）’ 85.1991· pp. 3 92-3 95〕 和 Guillain-Barre氏徵候簇〔Baron等人 ’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90，1 9 9 3，pp.441 4-441 8〕的發展也繫 於T N F - α的活性。 間白素一 1 2 ( I L — 1 2)是一種雜雙體型的組織 介素，如同1 9 92年4月2日公開的PCT/US9 1 /0 6 3 3 2所說明，最初被視爲是從T細胞和天生殺手 細胞誘導I FN—r的一種因子。PCT/US9 1/ 06332認爲IL—12屬於天生殺手細胞刺激因子或 NKSF。1 99 1年6月26曰公開的 EP 4 3 3 82 7揭露I L— 1 2是一種胞毒性淋巴球 成熟因子（C LMF )。與已知的天生殺手細胞之胞毒性 活性活化劑IFN — rf!IL — 12 —樣，IL — 12也 會藉增加天生殺手細胞溶解標的細胞之能力在體外刺激天 生殺手細胞。I L— 1 2其它的體外活性已被證實的，包 括：誘導TNF — α ;當作輔刺激藥誘導T細胞芽胚增生 :抑制誘導Τ細胞增生的I L 一 2受體—r 5 —陽性細 胞；助長Thl T細胞由母細胞分化；增強Th l非T h 2增生；增強T細胞的細胞溶解活性；增強胞毒性淋巴 細胞生殖：增強天生殺手和其芽胚之細胞溶解活性；在體 內增強以I L - 1 2治療之病人其末梢血液單核細胞上的 天生殺手細胞活性；誘導天生殺手細胞上的吸附分子；誘 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I.--11111----nn·-----—訂· — — _ (請先閒讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 _____ B7___五、發明說明（3 ) , 導天生殺手芽胚增生素和顆粒酵素Bm核糖核酸；誘導天 生殺手細胞上的IL — 2受體次單位（P55. p 7 5 ) ;以I F N — r相關和不相關機制抑制免疫球蛋白E合成 ;於胎兒胸腺器官培養物上調節T細胞成長；以一群配體 協助促進骨髓巨核細胞和B細胞母細胞生長。該已知的 I L-1 2體內活性，包括；誘導I FN— r ;增強在脾 ，肝，肺和腹膜腔的天生殺手細胞；增強不同特異性的胞 毒性淋巴細胞生殖；誘導老鼠脾臟骨髓外造血作用；可逆 地抑制骨髓造血作用；可逆地誘導老鼠貧血，淋巴球減少 症和中性白血球減少症；抑制抗免疫球蛋白D誘導出之免 疫球蛋白E，免疫球蛋白G 1和I L _ 4的表現；增加以 嚼齒動物毒漿體原蟲模式處理的S C I D老鼠存活；治療 易感類老鼠的萊什曼病；減少囊球菌型生物負荷；抑制腫 瘤生長；並促進對腫瘤細胞免疫。敗血病性休克的 Shwarzman反應模式也貪^，在體內誘導Ϊ L : 1 2。 雖然I L — 1 2能在體內誘導I FN — r和TNF — α的產生，尙未證實與會影響體內I L- 1 2對自體免疫 症的量之I FN— r和TNF — α的量有關。此外，尙未 檢查出I L— 1 2或內生性的I L— 1 2拮抗劑（例如抗 -I L — 1 2抗體）對自體免疫症的給藥.效果與I F Ν-r和TNF — 0：的誘導有關。 發明之摘要說明 本發明提供處理（治療，改善，延緩或預防開始，預 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） -6 - A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 五、發明說明（4 ) > 防復發或再發）自體免疫病症或疾病的方法。於較佳體系 中，藉由增加一種選自由I FN - r和TNF — α組成的 組織介素量以促進其病症。彼等病症無限制地包括該些選 自由多發性硬化，全身性圓盤狀紅斑性狼瘡，風濕性動脈 炎，自體免疫性肺炎，Guillain-Barre氏徵候簇，自體免 疫性甲狀腺炎，胰島素有關的糖尿病和自體免疫炎性眼病 組成的病症。如本文所述，根據本發明治療多發性硬化和 胰島素有關的糖尿病較佳。. 在某些體系中，本發明之該治療方法包括給予哺乳動 物類一種I L — 1 2拮抗劑有效治療量，以抗體或其它與 I L _ 1 2有免疫反應性之種類較佳。在某些較佳體系中 ，該IL一12拮抗劑是以大約0. 05至25毫克/公 斤的劑量給藥，以大約0. 2至2毫克/公斤較佳。該拮 抗劑也能與治療上可接受的載體共同給藥。 其它體系中，本發明之該治療方法包括給予哺乳動物 類一種I L 一 1 2有效治療量。在某些體系中，該I L_ 12可以以大約〇. 〇1至大約100微克/公斤的劑量 給藥，以大約0. 0 1至10 0微克/公斤較佳。該11^ -12也能與治療上可接受的載體共同給藥。 附圖之簡單說明 圖1代表有關在體外用PLP和rm I.L — 1 2刺激 淋巴結和脾臟細胞之實驗性過敏性腦脊髓炎（E A E )的 過繼轉移數據圖。脾臟細胞和淋巴結是採自以P L P免疫 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ®-ί· — 訂

• - ί I— I n v^i I n ! n 1 I i II ί n ..... I n » 1— n It fl In a—· an n n I 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公f ) -7 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（5 ) 1 〇天後的老鼠’材料和方法如敘述，在體外只用抗原（ 開放式標§己）或抗原和2 〇毫微克/毫升rm I L_ 1 2 (封閉式標記）刺激。用3 〇 x 1 〇6細胞轉移該疾病。 其結果以（a )淋巴結（η = 7)和（b )脾臟細胞（η ==5 )平均分數表示。該數據代表至少兩個個別實驗。見 實施例1。」

圖2代表有關在體外用PLP和IL—12刺激 LNC製造I FN — 9^[]TNF — α。將來自以PLP免 疫老鼠的LNC (2_ 5xl〇0 /毫升），用3〇x 106細胞細胞轉移前，只與PLP，PLP和rml L 一 12 (20 毫微克/毫升）或 plP，rmIL-12 和抗一 I FN—r (5微克/毫升）培養9 6小時。（a )用EL I SA測量共同培養之上清液中的I FN — r和 TNF — a。（b)被刺激的淋巴結細胞轉移後之平均疾 病分數。PLP和PL/P+IL - 12取n = 3 ;而 PLP + I L — 1 2 + 抗—I FN—7* 取 n = 4：。見實施 例1。 圖3描述有關在體內以經P L P刺激的L N C對該過 繼性轉移的EAE給與I L— 1 2的效果數據圖。在體外 與敘述於材料和方法的抗原培養，以P L P免疫老鼠的 LNC轉移給未免疫的老鼠。在細胞轉移後（實心圓）的 第〇 ’ 1 ’和2天給與rmIL — 12 (〇· 3微克/老 鼠）並觀察老鼠的疾病徵狀。控制老鼠接受等量食鹽水（ 空心圓）。（a)轉移3〇xl〇eLNC細胞（n = 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4规格（210 X 297公釐） ----------------»—-------訂---------線 1#------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 8 A7 ____B7__ 五、發明說明（6 ) , )後的平均臨床分數。（b)轉移1〇xl〇6LNC細 胞（n = 4)後的平均臨床分數。圖3 a代表三個個別實 驗。見實施例1。 圖4描寫有關在體內以經P L P刺激的L N C對該過 繼性轉移的EAE給與抗一IL—12抗體的效果數據圖 。在體外與敘述於材料和方法的抗原培養，以P L P免疫 老鼠的L N C轉移3 Ο X 1 06細胞給未免疫的老鼠。在 細胞轉移（實心圓）日起由腹腔內注射給與抗一 1 L 一 1 2抗體（羊抗—與多株抗體’ 2 0 0微克/老鼠）。控 制老鼠接受等量羊的免疫球蛋白G (空心圓）。（a)從 第0至6天每隔一日給與αIL—12抗體後的平均臨床 分數（b)從第0至1 2天每隔一日給與α I L - 1 2抗 體後的平均臨床分數（η = 5 — 7)。見實施例1。 圖5描寫有關給與NOD老鼠IL一12的疾病影響 範圍數據圖。見實施例2。 一 * 發明之詳細說明 本發明提供治療自體免疫病症的方法。自體免疫病 症〃是指病患自己的免疫系統對其細胞或組織反應，導致 該些細胞或組織受傷。有一種特殊的自體免疫病症是^因 增加組織介素的量而促進該病症A 。當血清或組織內的該 組織介素量增加時，能導致或成爲該自體免.疫病症成長或 復發，或加速其開始的原因。增加I FN — 7*和/或 TN F - α的量而促進的自體免疫病症，無限制地包括： 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 零 訂---------線！ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -9 一 A7 B7 五、發明說明（7 ) 多發性硬化，全身性圓盤狀紅斑性狼瘡，風濕性動脈炎， 自體免疫性肺炎，Guillain-Barre氏徵候簇，自體免疫性 甲狀腺炎，胰島素有關的糖尿病和自體免疫炎性眼病。 "I L — 1 2拮抗劑〃包括：（1)會結合I L — 1 2或有關的生物活性碎片之種類（2)會干擾該I L-1 2對受體或其它結合蛋白質結合的種類。會無限制地結 合I L_1 2的拮抗劑，包括：抗體（單或多株）和有關 的碎片（包括F ab碎片），嵌合型抗體以及有關的碎片， 外源凝集素，I L- 1 2受體或有關的碎片，活性肽或有 關的碎片，以及設計成模擬該I L_ 1 2受體生物活性的 有機小分子。可無限制地干擾IL_12結合的拮抗劑， 包括：IL — 12經化學或基因改良的肽，IL — 12的 次單位和有關的碎片，、L - 1 2的同聚物次單位和有關 的碎片，以及設計成模擬該I L - 1 2生物活性的有機小 分子。干擾I L_1 2結合的拮抗劑，干擾其與可誘導 产、 I FN — r或TNF - α但不會誘導等量如上述可與受體 結合的I L_1 2之因子的受體較佳。 熟悉此技藝者早已知製造I L - 1 2拮抗劑的方法。 例如，單株I L_ 1 2抗體能根據已知方法，以生成製造 抗體的雜種瘤來製造（譬如，見Goding，1 9 8 3. Monoclonal antibodies (單株抗體）：principles and practice (原理與實行）。Academic Press. Inc.，New York; Yokoyama. 1992. Production of Monoclonal Antibodies' in current Protocols in Immunology.( 本紙張尺度適用+國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ο 訂---------線！ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 10 - A7 ____B7___ 五、發明說明（8 )

I 免疫學上製造單株抗體常用的記錄）Unit 2.5. Greene Publishing Assoc, and John Wiley & Sons)。多株抗 體血清和I L — 1 2抗體，根據已知方法，可用I L 一 1 2或有關碎片接種一種哺乳類動物來製_造。chizzonite 等人 ’J. Immunol. 148，1992，ρ·3117，敘述了 IL — 1 2受體的辨認與分離。根據已知方法，可利用分裂該相 關抗體並收集想要的碎片製造抗體碎片，受體或其它活性 肽。（譬如’見Goding，Supra; Andrew等人.1992. '

Fragmentation of Immunoglobulins'(免疫球蛋白的斷 裂作用）。Unit 2.8· Greene Publishing Assoc·· and John Wiley & Sons)。嵌合型抗體也可以根據已知方法 製造。 本發明之方法使用I L 一 1 2，也可用任何形式的 I L — 1 2，只要該I L_1 2的形式能治療彼需要治療 的自體免疫病症。例如，IL—12可以是一種40KD 次單位以雙硫鍵與一種3 5 KD次單位結合而組成的雜雙 體型之形式6當IL—12是一種雜雙體型時，該 4 0 KD次單位與人類I L — 1 2的4 0 KD次單位有本 質上的同質性，其說明於P CT/U S 9 1/0 6 3 3 2 ;而以雙硫鍵與一種3 5 KD次單位結合時，和人類I L —1 2的3 5 KD次單位有本質上的同質性，說明於該相 同PCT刊物中。"本質上的同質性"指當.維持一種哺乳 類受驗者治療需要治療之自體免疫病症的能力時，其胺基 酸量大於7 5%的同質性。本發明中可用的I L — 1 2另 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ®. ---訂----------線 1# 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 -11 - A7 ____ B7____ 五、發明說明（9 ) > 一種形式，是一種能在哺乳類受驗者上治療需要治療之自 體免疫病症的I L-1 2次單元。PCT/US 9 1/ 06332揭露該IL—12 40KD次單位與人類 I L - 1 2 40KD次單位有本質上的同質性；而該 I L - 1 2 35KD次單位和人類IL-12 3 5 K D次單位有本質上的同質性地揭露於該P C T刊物 中。根據本發明，維持I L — 1 2生物活性的該I L-1 2次單位碎片，對治療哺乳類受驗者之自體免疫病症也 有用。 關於本發明之用途，在一種適合變形的宿主細胞上， 經由對該單或雙股IL一12次單位編碼的DNA序列表 現而重組製造IL_12較佳。例如，利用已知方法，對 人類IL—12編碼的該DNA序列，說明於PCT/ US91/06332/可能與一種表現載體如pED( Kaufman等人，Nucleic Acids Res. 19，4484-449 0 ( 1 9 9 1 ))。有關在彼表現載體中，會完整轉譯的序列，例如C C A C C ( Kozak, M., Nucleic Acids Tes. 12,857-871 (1984)，利用已知方法可加到5 /端的起始密碼。含有該 I L — 1 2次單位的該表現載體然後可以轉形宿主細胞， 誘導及強化蛋白質表現至極至，以製造雜雙體型之人類 I L — 1 2。關於製造雜雙體型之I L— 1.2，其對彼 I L — 1 2次單元編碼的DNA序列可在相異的表現質體 上表示，或在填塞物內一種相同的表現實體上表示。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ----tr----------線丨----------------------- -12 - A7 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _ B7____ 五、發明說明（ίο ) ^ 當使用一種I L _ 1 2次單位或碎片實施本發明時， 也可利用已知方法重組製造。例如，對彼人類I L — 1 2 4 0 KD次單位編碼的該DNA序列，說明於p CT/ US9 I/O 6 3 3 2 ’可能與一種表現載體有關，轉形 進入宿主細胞’誘導及強化表現至極至，以製造該人類 IL—12 35KD次單位。同樣地，對彼人類IL一 1 2 3 5K.D次單位編碼的該DNA序列，說明於 P C T刊物中，可能與一種表現載體有關，轉形宿主細胞 ，而誘導及強化表現至極至，以製造該對應的蛋白質。當 然，將I L_ 1 2次單位編碼的DNA序列轉形，也可以 製造本發明使用的I L — 1 2次單位，如同對該I L — 1 2次單位的對偶質變種編碼的DN A序列。也可根據說 明於PCT刊物中的方法製造IL—12的化學或遺傳改 良型及其次單位。 ^ 可使用任何適合的赛現載體製造本發明所用的I L ~ 1 2。關於哺乳類表現方法，除了上述提及之該p E D載 體外，已知有表現載體，例如PEF—BOS ( Mizushima等人 ’ EMBO J.4, 645- 6 5 3 ( 1 98 5 ); and pMT2 乂 derived from pMT2-VWF)〔衍生自 PMT2—VWF 〕 ，A. T . C . C . #67122;見 PCT/US87 /00033)。已知適合使用於酵母菌，昆蟲，和細菌 細胞的表現載體。該些表現載體的結構和用.途在本技藝中 之水準相當高明。使用於本發明而且適合重組製造I L ~ 1 2的宿主細胞包括：例如：哺乳類細胞例如中國田鼠卵 纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ' ' -13 ~ --------------I ...-------訂---------線------ (請先閱讀背面之注音？事項再填窝本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __ ____B7__—— 五、發明說明（11 ) , 巢細胞（CHO) ’猴子COS細胞’老鼠3T3細胞’ 老鼠L細胞；骨髓瘤細胞像是N S 0 ( Gal f re and

Milstein, Methods in Enzymology (酵素學方法）7 3 ’3—46(1981)，小田鼠腎臟細胞’與其它相似 者。用已知方法，也可以用對該IL一12次單位編碼的 D N A序列誘導和放大蛋白質表現，與酵母菌，昆蟲’及 細菌細胞的轉形作用製造I L_1 2。 傳統純化技術能從培養介質或細胞萃取物中純化出重 組製造的I L 一 1 2。含有I L — 1 2的培養介質或細胞 萃取物可使用一種商用蛋白質濃縮濾器濃縮，，例如Am icon 或Millipore Pellicon超微過濾單位。該濃縮步驟後，彼 濃縮液可用於一種純化基質，像是一種凝膠過濾介質。可 選擇用一種陰離子交換樹脂，例如，一種帶有未定的乙基 二乙胺基團之基質或受質。該基質可以是丙烯醯胺，洋菜 糖，糊精，纖維素或一難常用於蛋白質純化作用的其它型 態。也可選擇用一種陽離子交換步驟。適用的陽離子交換 器包括：由丙基磺酸基或羧甲基組成的各種不能溶的基質 。來自培養物上清液之I L — 1 2純化作用，也可包括在 該些親和樹脂上置一或多管柱步驟，像外源凝集素_洋菜 糖’肝素—T 〇 y ο p e a r 1 或 C i b a c r 〇 m b 1 u e 3 G A S e p h a r 〇 s e ; 或藉由疏水交互作用層析後，使用樹脂像是苯乙醚，丁醚 ’或丙醚；或以免疫親和層析術。最後，一.或多個逆相高 成形液體色譜法（RP—HPLC)步驟，使用疏水的 RP — HP L C介質，例如，帶有未定的甲基或其它脂防 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I ^ n I i .Γ ^ · n I I— n I l J\ - tat an n· 1^1 n im i n n n· ^—B n n fen >ϋ ^^1 n f— n n ^1口 务^·· i 14 A7 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ____B7 __ 五、發明說明（l2 ) > 族基的矽膠’能用來進一步純化I L_ 1 2以利本發明方 法和組成份使用。該前述純化作用部份或全部的步驟，在 不同組合中，能用來提供一種本質上同質且分離的重組蛋 白質。使用於本發明中之i L- 1 2次單位或碎片的純化 作用’可能會與彼最理想的雜雙體型蛋白質純化記錄不同 〇 當以上述說明製造人類I L— 1 2時，其可以用以下 方法純化較佳。從彼有條件的介質中，以過濾作用移除該 製造I L - 1 2的細胞，而將彼有條件的介質裝填入Q-Sepharose FaseFlowTM( Pharmacia商品）或一種維持 1 0 - 3 0 m M Tris— HLC，PH7. 8-8. 3平衡的當量陰離子交換介質。然後，用該相同緩衝 液大面積地清洗該管柱，接著以3 0 — 4 5 mM組織胺酸 洗，PH5. 1 — 5. 8，再接著用其最初維持平衡的緩 衝液洗。以一種含有2jD — 50mM T r i s - H C L ，PH7. 8 — 8. 5 和 0. 15 至 0. 5M N a C 1 緩衝液的管柱溶析出該重組的人類I L - 1 2。將該溶析 物質裝填入 CM-Sepharose FaseFlowTM ( Pharmacia商.品） 或一種維持 20 — 5〇mM MES，PH5. 7 — 6. 4平衡的當量陽離子交換介質，用其相同緩衝液大面 積地沖洗。以一種含有2 0 — 4 OmM硫酸鈉， PH6. 8 — 7. 5 和 0. 2 — 0· 5M NaCl 的緩 衝液沖洗該管柱。利用AmiconTM S1Y30或使用於CM-Sepharose FaseFlowTM管柱，經過沖洗，並以該溶析緩衝 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-15 - A7 __B7_______ 五、發明說明（13 ) 液維持平衡的當量螺旋狀捲筒膜濃縮該溶析物質。將該物 質濃縮至大約該最終色層分析步驟管柱體積的5 %，使用 任何大小的S200 SephacrylTM( Pharmacia商品）或一種 任何大小的當量樹脂。以硫酸緩衝食鹽水，P Η 7 . 2 - 7，溶析和維持該任何大小的管柱平衡，並收集和過濾該 重組人類I L 一 1 2之尖峰供本發明方法使用。該些熟悉 蛋白質純化作用技藝者可使用另一種純化方法，以生成重 組製造的人類IL 一 12，供本發明方法使用。 I L - 1 2也可以從培養介質或天然製造該蛋白質的 細胞萃取物中純化出來並使用於本發明中。天然製造I L —1 2之實施例的純化作用圖說明於P CT/U S 9 1/ 06332 和 ΕΡ 433827 中》 含有一種I L — 1 2拮抗劑或I L— 1 2的治療組成 份可在實施本發明方法時使用，也可包括治療上可接受的 載體，稀釋劑，注入劑/鹽，緩衝液，穩定劑和/或此藝 中已知的其它物質。該名詞a治療上可接受的〃指一種不 干擾該活化成份的生物活性效果，並對給藥的宿主無害的 物質。該載體或其它物質的特徵依給藥途徑而定。 目前期待的各種治療組成份，應包含大約每毫升 0 . 1微克至1毫克的該IL— 12拮抗劑或IL — 12 〇 一些傳統方法可以完成給藥。腹膜內注.射是I L 一 1 2拮抗劑或I L 一 1 2較佳的給藥方法。也可使用靜脈 注射，皮膚內或皮下注射。注射I L— 1 2拮抗劑或I l 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-------------線丨#- 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印制衣 -16 - A7 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ___B7___ 五、發明說明（14) . 一 1 2，以非熱原’不經消化道而可接受的水溶液之形式 給藥較佳。本技藝中’製備彼不經消化道而可接受的蛋白 質溶液與酸鹼度，等張性，穩定性及其它性質有關。 I L 一 1 2拮抗劑或I L - 1 2的治療劑量依其情況 嚴重性，給藥途徑，該I L — 1 2拮抗劑與I L — 1 2的 反應性或該I L - 1 2的活性而定，最後由治療提供者決 定。實施本發明之該治療方法時，給與一種I L_i 2拮 抗劑或IL—12的治療有效量。該名詞”治療有效量" 指該方法的每一種活化成份，或足夠顯示對病患有利（例 如治療，改良，延緩或預防開始，預防復發或再發）之組 成物的總量。決定患病病人治療有效量常用的一種技術是 給與定期逐漸升高劑量的藥，直到該治療提供者發現對病 患有利爲止。當應用單一活化成份，單獨給藥，該名詞就 只指該成份。當應用一種化合成份時，不論是合併，連續 ’或同時給藥’該名詞g導致治療效果之該活性成份的化 合量。預期本發明中I L - 1 2拮抗劑的治療有效劑量是 在大約0. 05毫克/公斤至約25毫克/公斤的範圍內 。預期本發明中I L - 1 2的治療有效劑量是在大約 0 . 〇 〇 1毫克/公斤至約1 〇 〇 〇微克/公斤的範圍內 。給藥次數可改變，依各個病患及其自體免疫病症嚴重度 而定。 實施本發明時’該I L — 1 2拮抗劑或.1 L 一 1 2可 單獨給藥或與其它自體免疫情況治療法，例如類固醇的或 抗發炎治療法’及其它細胞介素共同給藥。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) n ^^1 In ^^1 ^^1 In I I n 1 n ^^1 ^^1 ^^1 n I n n n n n I ^^1 It n -17 - A7 ____ B7 五、發明說明（15 ) 本發明之該方法進一步敘述於以下實施例中，其欲示 例之本發明並不局限於此。 實施例1 實驗的過敏性腦脊髓膜炎（E A E )是T細胞媒介的 中樞神經系統（CNS)的自體免疫疾病。利用CNS髓 鞘質的抗原免疫老鼠的易感種株可誘導該疾病，或使用抗 原刺激C D 4+T細胞被動轉移該疾病至易感老鼠〔 P e 11; i n e 1 1 i，J . I m m u η ο 1. 1 2 7 , 1 9 8，p. 1 4 2 0〕。E A E 廣泛地被認爲是一種可接受的靈長類動物多發性硬化之動 物模式〔Alvord等人（eds·) 1984. Experimental allergic encephalomyelitis (實驗的過敏性腦脊髓膜炎 )—A useful model for multiple sclerosis (多發性 硬化的一種有用模式）Alan R· Liss，New York〕。I L -1 2拮抗劑對誘導從jp外以髓鞘質的蛋白脂類蛋白質之 合成性（P L P )再刺激免疫過的老鼠，其淋巴的過繼性 轉移後給與E A E的效果。 使L N C感應的P L P其過繼性轉移 從】3〇1^〇11實驗室購買母的3][1^/】老鼠（7 — 1 0週），每一籠放5隻，並餵食標準嚙齒動物飮食及任 意給水。以1 50微克含有殘餘物1 39—.1 5 1的老鼠 P L P性免疫老鼠腰窩兩部位》將P L P溶於2 0 0微升 含有2毫克/毫升結核分枝桿菌H37RA (Difco)的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 - - W --f、 n ^^1 fi ^^1 I - Hi ^^1 ^^1 n n f— 1 n n ϋ -"-& 么rtτ1ί A7 B7 五、發明說明（16 ) . 完全胡式（Freunds )佐助劑中給藥。於免疫日’以靜脈 內注射0 . 7 5 X 1 0 10百曰咳細菌（Bordatella pertussis)至老鼠體內（Massachusetts Public Health

Laboratories, Boston, ΜΑ)。免疫後 1 0 天’收集脾臟 與淋巴結（蟈，腋和肱），而且將該細胞懸染於含有1 0 %F B S (Hyclone) ，5 X 1 0-5Μ2 — 氫硫乙醇， 1 0 0微克/毫升鏈黴素和1 〇 〇 U/毫升青黴素的 RPMI -1 640中。將2微克/毫升PLP加入培養 物中。9 6小時後，收集該細胞，沖洗兩次，腹膜內注射 3 0 X 1 0 6細胞（LNC或脾臟）至未免疫的+S J L/ J老鼠。 疾病的臨床評估 觀察老鼠的ΕΑΕ徵狀’計分從0至3如下： 0 . 5 —遠側破尾 a 1 . 0 —完全的破 1. 5 —跛尾和後肢軟弱（步代不穩） 2. 0 —部份後肢痲痺 3 . 0 —完全的兩側後肢痲痺 細胞轉移前體外I2給藥 將重組的老鼠I L — 1 2 ( 2 0毫微克./毫升’ r m I L — 1 2 ’ Genetics Institute)和抗原，在細胞 轉移前加入該體外淋巴結或脾臟細胞培養物中。9 6小時 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -〆 訂----------線— In--- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -19 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7___五、發明說明（17 ) > 後，沖洗該細胞兩次，轉移3 Ο X 1 0 6細胞至未免疫的 S J L/J老鼠，以決定I L 一 1 2在疾病後續病程上的 效果。 在個別實驗中，LNC是只與抗原’抗原加I L—. 1 2 (2 0毫微克/毫升）或抗原加I L — 1 2加抗 I FN — 7 (來自Endogen的5微克/毫升）的一種中性 抗體培養。在培養期間之後，收集上清液（從3個燒杯匯 集）並用ELISA (購自Genezyme)測量I F N — r和 TNF — α。從每一群轉移3 0 X 1 06細胞至未免疫且 被觀察疾病徵狀的老鼠。 轉移PLP刺激的LNC後，體內給與IL—12和抗一 1 L 一 1 2抗體 在轉移3 0 X 1 06或1 0 X 1 06P L Ρ刺激的 LNC後，給與rmlj — 12 (〇. 3微克/老鼠， 2 0 0微升腹膜內注射）。在細胞轉移後第0，1和2天 給與I L 一 1 2。控制組老鼠只接受等量賦形藥。爲決定 是否I L 一 1 2介入PLP刺激LNC轉移後誘導該疾病 ，在細胞轉移後第6或1 2天老鼠以2 0 0微克羊抗鼠 I L_ 1 2的多株抗體（2 0 0微升腹膜內注射）治療並 觀察其疾病徵狀。控制組老鼠接受等量羊的I g G。觀察 該老鼠。 體外再刺激已接觸抗原P L P的τ細胞對r m I L — 1 2 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) σ: .. 線· 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公复） -20 - A7 B7 五、發明說明（18 ) 的效應 如方法所敘，用P L P免疫老鼠生成的L N C，於有 或無rml L - 1 2 (20毫微克/毫升）存在下，在體 外與抗原刺激9 6小時後，測試其轉移疾病給未免疫 S J L/J老鼠的能力。老鼠在體外接種只被PLP刺激 的LNC，於第6至第8天間發生疾病的臨床徵狀。所有 控制組的老鼠達到2或2以上的分數（7/7) ，7隻老 鼠中有4隻持續在第1至4天間發展爲完全的後肢痲痺^ (圖1 a )所有控制組老鼠在第1 9天前康復。對照組老 鼠接種與PLP和IL一12在體外培養的細胞，產生快 速開始而且嚴重的EAE。（圖la)。第6天以前，7 隻老鼠中有4隻達到2或2以上的臨床分數，而且所有的 老鼠在第8天以前繼續發展成完全的後肢痲痺。在該特別 的實驗中’ 7隻老鼠中有5隻無法從彼痲痺中復原。 測驗於有或無r L - 1 2 0毫微克/毫升）

存在下’在體外用抗原刺激來自P L P免疫老鼠的脾臟細 胞9 6小時’以決定彼等是否能轉移疾病給未免疫s J L /J老鼠。過繼性轉移30X1 06PLP刺激的脾臟細 胞後，該疾病嚴重性與由相同數目P L P刺激的L N C誘 導的相比較屬輕微的。5隻老鼠中只有2隻發展成完全後 .肢痲痺’而其剩餘的3隻老鼠只出現輕微疾病徵狀。（圖 lb)。與用LNC觀察的結果相似，在轉移惡化的後續 疾病之前加入rm I L — 1 2 (2 0毫微克/毫升）至體 外脾臟細胞的培養物內。（圖1B)。老鼠接種以PLP 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公复） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I ' ~-f、» a^i K f^i n n I I n n n n n n tn n t— .n n n I t 矣 ϋ·ι A7 B7 五、發明說明（19 ) 和rmIl—12刺激的脾臟細胞，在第6天前發展出臨 床疾病徵狀’而且在第12天前都演變成完全後肢痲痺。 該些老鼠其平均痲痺期間是5 4天（範圍2 — 8天）。 用P L P和I l — 1 2體外刺激後生成的細胞介素 爲決定在體外用抗原刺激期間IL-12對生成細胞 介素的效果’將來自接觸抗原p L P的老鼠之L N C，只 與PLP ’ PLP和I L — 12 (20毫微克/毫升）或 PLP ’ I L 一 1 2和一種中性抗一 I FN— r抗體一起 培養。在該體外培養後，以E L I SA測量上清液內的 I FN—r和TNF - α，並測試該細胞其轉移疾病至未 免疫老鼠的能力。在PLP與LNC的體外刺激期間，加 入Ϊ L-1 2會導致I FN — r增加1〇倍以上（控制組 5. 2毫微克/毫升，IL—12 64毫微克/毫升） ，而在該細胞上清液中剪TNF - α增加兩倍。（圖2 a )。LNC在與抗原和IL一12—起培養期間，將一種 中性抗體加入I F N _ r會完全阻斷I F N — r的偵測， 但對比控制組（1 0 0微微克/毫升控制組，1 8 0微微 克/毫升與α I FN — r抗體）高約兩倍的該上清液中其 TNF—α的增加無效。此外，在體外於抗IFN—r的 一種中性抗體存在下，以PLP和IL-12刺激該細胞 轉移，仍能以相同的動力學和持續期間，誘導只由P L P 和I L_1 2刺激該紐胞轉移後才可見的嚴重疾病（圖2 b ) ° 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 —______B7____ 五、發明說明（2〇 ) 疾病進行時體內給與IL-12的效果 轉移30xi PLP刺激LNC老鼠後，給與 r m I L - 1 2 ( 0 . 3微克/老鼠）或食鹽水3天，並 觀察其對疾病後續病程的效果。控制組中該疾病的開始和 進行與上述相似，在8 0%進行至完全兩側後肢痲痺之老 鼠L N C轉移後6 - 8天間有明顯臨床徵狀。控制組老鼠 最高發病記錄持續大約3天，爾後該老鼠自然復原。（圖 3a)。從該相同體外培養物轉移相同數目接觸抗原的 LNC後’給與rmiL—12(0. 3微克/老鼠）3 天’大大地改變了該疾病的病程。雖然在IL_12治療 老鼠（第5天）中該徵候開始時間稍早，但第8天之前所 有老鼠會出現完全後肢麻痺，並加速其後續進行至疾病之 最高峰。該痲痺期間也是明顯地長期持續到1 4天（範圍 1 1 - 1 4天）。放棄第些以rmlL-12治療發生長 期痲痺並持續至該控制組全部復原後的老鼠。 在個別實驗中，轉移次高數目的LNC ( 1 〇 X 10 6細胞）後，檢査體內給與rml L — 12對疾病嚴 重度的效果。接種較低數目L N C的控制組老鼠產生輕微 疾病（圖3b) ，4隻動物中有1隻進行至完全後肢痲痺 ，而其餘3隻只有極小疾病。相反地，轉移1 〇 X 1 〇6 LN C細胞後’以rm I L— 1 2體內治療的老鼠，所有 老鼠分數爲2分或2分以上，而且4隻老鼠中有3隻進行 至完全後肢痲痺之完全臨床徵候。轉移如5 X 1 0β般少 S氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） ' -23 - - 一 、1^· --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 ___B7__ 五、發明說明（2i ) > 的L N C細胞而且5隻老鼠中有3隻分數是1後，該 r m I L — 1 2的效果就很明顯了。在該細胞數目控制下 顯示無疾病徵狀（數據未顯示）。 在疾病病程中給與抗一 I L - 1 2抗體的效果 爲決定是否內生性I L - 1 2在疾病轉移上扮演一種 必需的角色，在轉移30X1 OePLP刺激的LNC細 胞後6或1 2天之間，每隔一天以2 0 0微克一種羊對鼠 I L - 1 2的多株抗體處理老鼠。控制組接種等量的羊 I gG。在以羊I gG治療的控制組，其臨床徵狀的開始 與未經治療接種P L P刺激的L N C之徵狀開始相同（6 -7天，圖4 a )。所有控制組老鼠發生分數2或2以上 之疾病徵狀（7 0%發生完全麻痺）。在轉移後的前6曰 給與該抗- I L - 1 2抗體真的減少該疾病之嚴重性；然 而，其臨床徵狀之開始藥緩了大約7天》以和控制組復原 相似的時間過程，彼等老鼠陸續繼續發生疾病’所有的老 鼠達到2或2以上的分數（8 0%發生完全痲痺）°尙未 決定是否該疾病轉移之延緩會忍受較長期給與抗一1L-12抗體。在過繼性轉移接觸抗原PLP的LNC後’我 們治療老鼠1 2天。在過繼性轉移接觸抗原P L P的 LNC後，以抗一I L — 1 2抗體隔日治療老鼠1 2曰。 其不只顯示更能忍受該疾病開始動力學之延緩，5隻老鼠 中只有2隻發生輕微疾病徵狀，也體驗了減少臨床疾病。 (圖 4 b )。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - ! 訂----------線— ----- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制^ A7 ___B7 ___ 五、發明說明（22) . 實施例 2_ 以 I L — 1 2 治療 NOD/L· t J 老鼠（jacks〇n Laboraotries)估計對與胰島素有關的糖尿病（ ID DM) 〔Kutani人，Adv. Immunol. 51， 1992， ρ· 2 85〕之一種可接受的動物模式其細胞介素的效果。 NOD母鼠會自然生成一種類似I DDM的疾病，在胰臟 中去除点細胞結構並在12-14週左右大小時會溢出葡 萄糖至尿中。在該發明者的動物設備中，NOD母鼠表現 大約8 8%疾病發生於3 0週大小前。 N〇D母鼠以兩種不同的記錄治療。治療A中，從9 週大小時開始連續兩週，每週3次腹膜內注射給與老鼠 10，1或0. 1 微克（0· 5，0. 05 或 0. 005 毫克/公斤）鼠IL-12(mIL— 12)。治療B中 ，從9週大小時開始，_星期1次腹膜內注射給與老鼠1 ’0. 1微克ml L — 12)，持績治療至25週大小止 〇 治療A中接種全部3種劑量的老鼠，用該1 0微克劑 量最有效，具有統計上意義之疾病發病率減少，（17% 疾病發病率）（見表1和圖5)。治療B中每週接種1微 克劑量的老鼠顯示疾病發病率減少最多（2 0%)，而用 接種0. 1微克劑量的老鼠無法顯示可以測到的疾病發病 率變化（80%)(見表1和圖6)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . ί線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 -25 - A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（23 ) - 表1 以1 L 1 — 1 _2 .脊里N 0 D老鼠之糖尿病發病率 IL-12 3X/week 2 weeks* IL-12 weekly! age unRx '繼1_麵議1 0 . l/xg i^g :議酵 8 0/10 0/10 9 0/10 0/10 10 0/10 0/6 1/5 0/11 0/10 0/10 11 0/20 1/6 2/5 2/11 0/10 0/10 12 1/25 1/6 2/10 .2/11 0/10 0/10 13 2/25 1/6 2/10 2/11 0/10 0/10 14 3/25 2/6 2/10 2/11 0/10 1/10 .15 4/25 1/6 2/10 3/11 0/10 1/10 16 5/25 1/6 2/10 3/11 0/10 4/10 17 6/25 1/6 3/10 3/11 0/10 4/10 18 6/25 1/6 3/10 4/11 0/10 7/10 19 9/25 1/6 3/10 ? 4/11 1/10 7/10 20 12/25 1/6 4/10 ' 5/11 1/10 7/10 21 12/25 1/6 4/10 5/11 ^ 1/10 7/10 22 14/25 1/6 . 5/10 5/11 1/10 7/10 23 15/25 1/6 . 5/10 5/11 1/10 7/10 24 16/25 1/6 •5/10 .5/11 1/10 ..7/10 25 18/25 1/6 :5/10 : 5/11 1/10 7/10 26 20/25 1/6 ;5/10 : 5/11 2/10 7/10 27 20/25 1/6 · .:5/10 5/11 2/10 7/10 28 21/25 1/6 .5/10 ' 5/11 .2/10 7/10 29 22/25 1/6 ' 5/10 5./11 2/10 7/10 30 22/25 1/6 5/.10 : .5/11 2/10 8/10 (請先閱讀背面之住意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -26 - A7 ____B7__ 五、發明說明（24) * 一治療開始於9 一 1 0週大小並持續2週 + —治療開始於9週大小並持續1 5週 明 說 部 全 要 需 如 料 資 考 參 件 文 利。 專料 有資 所考 之參 用爲 引文 處本 此入 併 (請先閲讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 訂---- 線！ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -27 -

Claims (1)

1. I 六、申請專利範圍 1. 一種治療哺乳動物自體免疫病症的藥學組成物， 該自體免疫病症係由增加I NF-r及/或Ί NF — α所 促進者，該藥學組成物包括治療有效劑量之I L - 1 2拮 抗劑。 2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該自體免 疫病症是選自由多發性硬化症，全身性圓盤狀紅斑性狼瘡 ’風濕性動脈炎，自體免疫性肺炎，Guillain-Barre氏徵 候簇，自體免疫性甲狀腺炎，胰島素有關的糖尿病和自體 免疫炎性眼病組成之類群。. 3 .如申請專利範圍第1項之組成物，其中該自體免 疫病症是多發性硬化症。 4. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該IL 一 12拮抗劑是與IL—12免疫反應的抗體或抗體片段。 5. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中該抗體或 抗體片段是以0. 05至約25毫克/公斤之劑量給藥° 6 .如申請專利範圍第4項之組成物，其中該抗體或 抗體片段與藥學上可接受的載劑共同給藥。 ------；-------Γ -------訂---------線-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 劑 抗 拮 該。 中藥 其給 , 量 物劑 成之 組斤 之公 項 \ 1 克 第毫 圍 5 範 2 利約 專至 請 5 申 ο 如 . ο 7 約 以 是 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -28 -