WO2006092515A1 - Souris transgeniques et leurs applications comme modele experimental - Google Patents

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WO2006092515A1
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iaβ
transgenic
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Yu-Chun Lone
Anthony Pajot
François Lemonnier
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Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
Institut Pasteur
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Definitions

  • the invention relates to the creation of novel class II HLA transgenic mice and their applications as an experimental animal model for studying the efficacy of vaccine candidates.
  • vaccine protection must jointly mobilize CD4 + T lymphocytes and CD8 + T lymphocytes specific for the virus, for a rapid elimination of the infected cells, as well as the B cells producing the neutralizing antiviral antibodies, to prevent re-infection with the same virus.
  • Virus-specific T cells recognize peptides derived from certain virus proteins, presented by HLA class I and class II molecules of infected cells.
  • HLA-DR ⁇ chain which is related to the mouse IE ⁇ b chain, or a couple of ⁇ and ⁇ chains of human origin.
  • mice Some of these mice allowed in vivo validation of CD4 epitopes of parasites.
  • mice have been of great interest for the comparative pre-clinical study of the efficacy of different vaccine candidates and for assessing the risks associated with an unwanted induction of autoimmune disease. They also make it possible to determine the best therapeutic strategy to adopt.
  • the object of the invention is therefore the use of expression vectors coding for functional complexes specifically recognized by anti-HLA-DP antibodies to create transgenic mice.
  • mice It is also intended to provide such mice and their use as an experimental model to study the immune responses induced after viral infection or by the compounds tested.
  • the invention thus relates to the use, for creating transgenic mice, of an expression vector construct coding for the functional HLA-DP ⁇ 103 ⁇ 401 complex, specifically recognized by anti-HLA-DP antibodies, characterized in that the construct comprises murine promoters of the IA ⁇ and IAa genes associating the cDNAs encoding DP ⁇ 103 and DP ⁇ 401.
  • the transgenic mice of the invention are characterized in that they are humanized mice individually expressing the transgene HLA-DP ⁇ 103 or HLA-DP ⁇ 401 or both transgenes simultaneously. It is aimed in particular at transgenic mice for HLA-DP ( ⁇ 103 ⁇ 401) and invalidated for H-2 class II (HLA-DP + / + IA ⁇ ° / °).
  • mice are advantageously obtained by microinjection into the oocytes of founder mice of the DNA fragments coding for said complex, obtained from plasmids containing them, crossing between them founder mice expressing individually the transgene HLA-DP ⁇ 103 or HLA-DP ⁇ 401, and crossing mice expressing both transgenes simultaneously with IA ⁇ ° mice.
  • mice for their high responsiveness to epitopes are also transgenic for HCD 4 and invalidated mCD 4. These are HLA-DP ( ⁇ l03 ⁇ 401) IA ⁇ ° mice. hCD 4 + / + mCD 4 ° / °.
  • HLA-DP ( ⁇ l03 ⁇ 401) IA ⁇ °. hCD 4 + / + mCD 4 ° / °
  • the transgenic mice of the invention HLA-DP + / + IA ⁇ ° / °
  • hCD 4 + + + mice mice and 4 ° / ° mCD mice.
  • HLA-DP ( ⁇ l03 ⁇ 401) IA ⁇ °. hCD 4 + / + mCD 4 ° / °.
  • mice of the invention represent novel experimental animal models of humanized mice to identify HLA epitopes -DP restricted, immunogenic in mice and humans.
  • the epitopes thus identified can then be used as subunits for the production of vaccines, in particular polyepitopic vaccines.
  • They can also be used to develop predictive tests of the state of protection of a subject vis-à-vis a given virus and / or monitor a viral infection.
  • the new experimental model of the invention also advantageously makes it possible to compare the effectiveness of the helper T response induced by different vaccine candidates or different immunization protocols. As such, they represent a model for assessing the risks of inducing autoimmune diseases.
  • the new experimental model of the invention can also be used to analyze the cellular cooperation between the CD4 T lymphocytes and the CD8 T lymphocytes in the mouse, following an immunization against a viral antigen, and to determine, if desired, the couples of HTL and CTL epitopes acting in synergy.
  • the invention also relates to isolated CD4 + lymphocytes after immunization of a transgenic mouse as defined above.
  • lymphocytes to establish specific cell lines and to create T-specific hybridomas by cell fusion, according to conventional techniques, these cell lines and hybridomas also being targeted by the invention as new products.
  • These cell lines are of great interest for the production of specific monitoring reagents, for example for calibrating or carrying out quality tests for HLA class II tetramers.
  • FIGS. 1 to 10 represent, respectively,
  • FIG. 1 the maps of 4 plasmid constructs used according to the invention;
  • Figure 2 the evaluation of the functionality of two vectors used according to the invention;
  • FIG. 3 the diagnostic PCR of HLA-DP transgenes;
  • Figure 4 flow cytometric analysis of the expression of HLA-DP molecules in transgenic mice of the invention;
  • Figure 5 the number of CD8 + and CD4 + splenic T cells;
  • FIG. 6 the repertoire diversity of the different TC4 Vb of CD4 + T cells in mice (HLA-DP + / IA ⁇ °) and C57BL6 mice,
  • FIG. 7 the specific proliferative response after immunization with KLH of transgenic mice of the invention;
  • FIG. 8 the specific proliferative response after immunization with a transgenic mouse HBs antigen of the invention;
  • FIG. 9 specific antibody responses after immunization with an antigen
  • HBs transgenic mouse of the invention and Figure 10, the histograms represent a comparative study between mice (HLA-DP ( ⁇ l03 ⁇ 401) IA ⁇ ° and HLA-DP ( ⁇ l03 ⁇ 401) IA ⁇ °. HCD 4 + / 4 + mCD 7 °.) Specific TCD4 proliferative response following immunization with given antigens.
  • the genetic background of the two mice corresponds to that of C57 / BL6 mice.
  • IA ⁇ b gene KPNI-XBA1 fragment of 9Kb, isolated from cosmid A ⁇ 19 and in a fully genomic configuration. The choice of the two restriction sites is based on Lahrammar mapping (JBC, 1985,260,14111-14119).
  • IA ⁇ b gene produced by subcloning a KpnI-SalI fragment obtained from cosmid LS8.1 (after shortening KpnI) of 6.8 Kb and ligated in 3 'to a fragment 250pb Sali-Notl, taken from pUT 626 and providing the polyadenylation site of SV 40.
  • Directed mutagenesis was carried out by the Kunkel method (PNAS USA, 1985 Jan; 82 (2): 488-92) in order to introduce the restriction sites necessary for cloning the DP ⁇ DP ⁇ cDNAs by respecting the different reading frames.
  • a single-stranded DNA template is generated by infecting bacteriophage KO.7 of LANs 032 bacteria (UTPase "unable to remove the U incorporated by mistake) previously transfected with vectors containing the target genes.
  • UTPase "unable to remove the U incorporated by mistake
  • a DNA polymerase synthesizes the mutated strand.
  • Transfection of XL1 supercompetent bacteria (UTPaSe + ) is then performed or the substituted (unmutated) U strand is degraded and the mutated strand conserved.
  • DP ⁇ 4011ong subcloning of the EcoRI fragment (signal sequences and ⁇ l ⁇ 2 domains and human sequence) PCR2 Topo into a plasmid pBlueScript / KS 'containing the HindIII-XbaI fragment (3 kb) of IA ⁇ BspDl + b + Sail.
  • the BspDl-XbaI fragment obtained from this construct was inserted into pBlueScript / KS "b IA ⁇ open BspDl -.
  • the XbaI end portion IA ⁇ b has been reconstituted and complete DP ⁇ 401 is inserted.
  • DP ⁇ l031ong subcloning the BspD1-SalI fragment (signal sequence and sequences of ⁇ 1 and ⁇ 2 human domains) from pcR Topo 2, in pBlueScript / KS "
  • the DP ⁇ l OSlong form was introduced into a vector containing a Neomycin cassette to give the final construct pIADP ⁇ long (8Kb) ( Figure 1). These different constructs were then cloned into XL1 supercompetent bacteria and sour bacteria (made competent) and verified by sequencing by the Sanger technique.
  • pSRDP ⁇ long 7.9kb: subcloning of SacI-EcoRV fragment of DP ⁇ long - Topo pcR2 in NT Open Hygrod Smal (blunt) - Sacl.
  • pSRDP ⁇ 1g 7.7kb: subcloning of SacI-EcoRV (blunt) fragment of DP ⁇ long corrected c .8-15 pcR2 Topo in NT Open Neod SacI-EcoRV.
  • HeLa cells human cervical cells
  • L Kuhn mouse fibroblasts C3H H-2 k
  • P815 mouse mastocytoma from DBA / 2 H-mice
  • 2 d were maintained in complete RPMI 1640 medium: FCS 10%, Penicillin-Streptomycin (200 IU / ml), Sodium-pyruvate (ImM) and L-Glutamine (2mM).
  • Exponentially growing growth cells were cotransfected by the +/- CIITA (transcriptional regulatory factor of MHC II genes); 24h after transfection they were selected with G418 (1 mg / ml) and 24 hours later with Hygromycin B (400 ⁇ g / ml).
  • the clones obtained were tested in direct immunofluorescence and in flow cytometry (FACScan, Becton Dickinson). Briefly, 500,000 cells are incubated for 40 minutes with a murine antibody recognizing HLA-DP (B721), IA d (MKD6) or HLA-A3 (GAPA 3) in PBS 1% BSA 2mM EDTA, then, after washing, incubated 40 minutes with a second goat anti-mouse antibody coupled to FITC, in 1% BSA 2mM BSBA EDTA, and washed in PBS 2mM BSA EDTA.
  • a murine antibody recognizing HLA-DP B721
  • IA d MKD6
  • GAPA3 HLA-A3
  • the genomic DNA is prepared from transfectants or from mouse tails according to the following method: Proteinase K treatment, Incubation 16h at 56 ° C, treatment with saturated NaCl, precipitation of DNA with isopropanol-2, 70% ethanol washings and recovery of the DNA pellet in 150 ⁇ l of TrislOmM EDTAImM. PH7.5.DNAs extracted from the DP transfectants were digested with BamHI for diagnosis by Southern analysis of DP ⁇ long and EcoRI for the diagnosis of DP ⁇ long, then after gel electrophoresis 0.6% agarose, transferred to a membrane of nitrocellulose and hybrids with their corresponding probe.
  • the DPa probe corresponds to the entire DP ⁇ 103 cDNA, the DP ⁇ probe is the DP ⁇ 401 cDNA. These probes were radiolabeled with dCTP32 according to the manufacturer's guidelines (Megaprime DNA labeling system Amersham Pharmacia).
  • the expression of the ⁇ 401 and DP ⁇ 103 DP transgenes was detected by PcR using primers specific for the DP sequences.
  • PcR was performed in tubes containing mouse genomic DNA (300 ng for DP ⁇ 401 and DP ⁇ 103, PcR Buffer, 15 ⁇ M of each primer, 12 ⁇ M of each dNTP and 1.25 ⁇ of Taq Polymerase (GibcoBRL) with a concentration of final MgC12 2.6 mM for DP ⁇ 401 and 4 mM for DP ⁇ l03.
  • Un 1 denaturing cycle is performed at 94 ° C T followed by 30 cycles consisting of 30 "denaturation at 94 ° C, 30" hybridization at 55 ° C and 30 "extension at 72 ° C, and a final extension cycle for 4 'to 72 ° vs.
  • the sense primer is 5 '(SEQ ID NO: 5) ggATTggAAAgAggCTC 3' and the antisense primer is 5 '(SEQ ID NO: 6) gCACtgCCCgCTTCTCC 3'.
  • the sense primer is 5 '(SEQ ID NO: 7) TAATACAAAgTCTgCAgCTggC 3' and the antisense primer (SEQ ID NO: 8) is 5 'AgCAATgTTAgCCAgCC 3'
  • pSRDP ⁇ long SR / DP ⁇ 103 / NcSV40 promoter
  • pSRDP ⁇ long SR / DP ⁇ 401 / NcSV40 promoter
  • Plasmids are fully sequenced and verified.
  • DP ⁇ DPa gene transfection has been associated with that of a plasmid encoding the human CIITA transcriptional regulatory factor which determines the activation of the HLA genes of class II ( ⁇ and ⁇ ) of the HLA-DP, -DQ, -DR series and also activates the expression of the gene encoding the invariant chain.
  • the MKD6 (anti-IAd) and GAPA3 (anti-HLA-A3) antibodies of the same immunoglobulin isotype as the B721 antibody were used as controls.
  • the functionalities of the vectors pSRDP ⁇ long and pSRDP ⁇ long were evaluated by co-transfection of human L Kuhn cells and HeLa cells. Those of the vectors pIADP ⁇ long and pIADP ⁇ long were evaluated by co-transfection in addition to the plasmid pCIITA and human CIITA (human CHTA transcriptional regulatory factor) of P815 cells.
  • FIG. 2A corresponds to P815 non-transfected HLA-DP transfectants, co-transfected with Dp ⁇ long / Dp ⁇ long / CIITA or by CIITA, incubated with monoclonal antibody B721 (anti-HLA-DP). , MKD6 (anti-IA) or GAP A3 (anti-HLA-A3), then with a goat anti-mouse IgG-FITC. The cells are analyzed by flow cytometry.
  • Figure 2B corresponds to L-Kuhn-DP and HeIa-DP transfectants.
  • the DP ⁇ long, DP ⁇ long constructs were microinjected individually into fertilized eggs of C57BL / 6 X DB A2 mice.
  • mice DP ⁇ 103 or HLA-DP ⁇ 401 were crossed with each other.
  • the mice expressing both the HLA-DP ⁇ 103 and HLA-DP ⁇ 401 transgenes simultaneously were then crossed with C57BL / 6IA ⁇ ° mice to obtain HLA-DP ⁇ 103 ⁇ 401 + IA ⁇ ° mice.
  • the expression of different transgenes or the absence of expression of the IA ⁇ gene are analyzed by PCR and for some, in addition, by Southern blotting.
  • IAa promoter (sense primer) (SEQ ID NO: 9) 5 'TAA TAC AAA TCG TgC AgC Tgg C 3'
  • DPa For DPa, a characteristic fragment of the transgene of about 445 bp is thus amplified.
  • the negative controls B6 and DBA / 2 show no amplification.
  • IA ⁇ promoter (sense primer) (SEQ ID NO : 11) 5 'ggA TTg gAA AgA ggC TC 3'
  • HLA-DP + / IA ⁇ transgenic mice The level of cell surface expression of HLA-DP transgenic complexes in HLA-DP + / IA ⁇ transgenic mice was measured by flow cytometry. The results are given in Figure 4. The number of peripheral CD4 + T lymphocytes and CD8 + cells were measured in the mice (HLA-DP + / Iab °). Figure 5 illustrates the results obtained.
  • mice The splenocytes of C57BL / 6 mice (B6 in Figure 5A), HLA-DP / H-2 class II-KO (DPCHKO in Figure 5B) and H-2 class I / class II-KO (CI CHKO in the figure 5C) were stained with PE-labeled CT-CD4 monoclonal antibodies (mouse anti-CD4 antibody, ordinate) and labeled with FITC 53-6.7.
  • preS2-S HBs (preS2-S) of the hepatitis B virus as a study model to simultaneously analyze the cellular and humoral anti-HBs response between mice (HLA-DP + / IA ⁇ ° / °).
  • preS2-S HBs protein
  • HBs Celis DP HLA-DP restricted epitopes derived from HBs protein
  • the HBs Celis DP T epitope (FLLRILTIP) restricted to HLA-DP is described in E. Celis and RW Karr, J. Virol. 1989, Feb; 63 (2): 747-52.
  • the simultaneous presence of a strong specific proliferative cell response (proliferative index> 3) for the HBs-Celis DP T epitope (see FIG. 8) and the presence of anti-HBs and anti-pre-S2 antibodies (see FIG. 9) have been documented in 3/4 mice (HLA-DP + / IA ⁇ ° / °) immunized against HBs. No immunized I ⁇ ° (0/4) mice with the plasmid pCMV-S2S gave a specific cellular response for the HBs T epitope, or any anti-preS2 or anti-HBs antibody response.
  • mice HLA-DP + / IA ⁇ ° / ° represent a new experimental animal model of optimized humanized mice for the identification of HLA-DP restricted epitopes present in the various antigens.
  • HLA-DP transgenic mice ( ⁇ l 03 ⁇ 40n IA ⁇ ° / ° hCD 4 + / + mCD 4 ° / °
  • HLA-DP4 transgenic H-2 class II KO mice HLA-DP ( ⁇ 103 ⁇ 401) IA ⁇ ° / °) and with HLA-DP4 CD4 human CII KO (HLA-H4) mice are described below.
  • DP ( ⁇ l03 ⁇ 401) IA ⁇ ° / ° hCD4 + / + mCD4 ° / °) on the study of proliferative responses TCD4 after immunization with
  • FIGS. 1 OA HLA-DP4 transgenic H-2 class II KO mice
  • HLA-DP HLA-DP ( ⁇ 103 ⁇ 401) IA ⁇ ° / °
  • 1OB mouse HLA-DP4 human CD4 CII KO
  • HLA-DP ⁇ 1O3 ⁇ 401 IA ⁇ ° / ° hCD4 + / + mCD 4 ° / °

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'une construction de vecteur d'expression, codant pour le complexe HLA-DPal03ß401 fonctionnel reconnu spécifiquement par des anticorps anti-HLA-DP, pour créer des souris transgéniques. Application des souris transgéniques obtenues, notamment, pour l'étude pré-clinique comparative de l'efficacité de candidats vaccins, pour évaluer les risques liés à une induction non désirée de maladie auto-immune et pour déterminer une stratégie thérapeutique.

Description

"Souris transgéniques et leurs applications comme modèle expérimental"
L'invention se rapporte à la création de nouvelles souris transgéniques HLA de classe II et à leurs applications comme modèle expérimental animal pour l'étude de l'efficacité de candidats vaccins.
A l'heure actuelle, il existe un besoin urgent en vaccins efficaces contre les infections par des virus responsables de graves pathologies, comme, par exemple, VIH, VHC5CMV, HSV.
Pour qu'un vaccin exerce un effet protecteur chez la majorité des sujets vaccinés, la protection vaccinale doit mobiliser conjointement les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8+ spécifiques du virus, pour un rapide élimination des cellules infectées, ainsi que les lymphocytes B producteurs des anticorps antivirus neutralisants, pour empêcher la ré-infection par le même virus.
L'ensemble de ces effets assure une bonne efficacité de protection globale et de mémoire.
Les lymphocytes T spécifiques du virus reconnaissent les peptides dérivés de certaines protéines du virus, présentés par les molécules HLA de classe I et de classe II des cellules infectées.
Si de nombreux peptides présentés par les molécules HLA de classe I ont été identifiés, en revanche, ceux présentés par les molécules HLA de classe II sont relativement inconnus. L'identification de ces peptides est cependant déterminante pour la réalisation d'un vaccin efficace.
L'étude de ces réponses régulatrices à partir de matériel humain est difficile en raison du polymorphisme des molécules HLA de classe II et de l'expression de nombreuses molécules HLA de classe II chez un même individu.
Des souris transgéniques HLA de classe II sont actuellement disponibles. Ces souris expriment soit une chaîne HLA-DRα isolée qui s'apparie à la chaîne IEβb de souris, soit un couple de chaînes α et β d'origine humaine.
Hagihara et al ont ainsi réalisé des souris transgéniques pour HLA- DPβ401α01 sauvage dans le cadre d'études de xénoréactions. Toutefois, les réactions observées sont apparues très faibles. En fait, aucune étude détaillée n'a été fournie sur la fonctionnalité du transgène et son implication dans l'éducation aboutissant à une capacité de réponse immunitaire normale chez ces souris, ce qui suggère fortement que ces souris ne sont pas fonctionnelles. Plus récemment, des souris HLA de classe II transgéniques H-2 de classe II
KO par inactivation dans l'haplotype H-2b de la chaîne IAβ ont été créées pour l'étude de maladies auto-immunes (voir Taneja et David, 2000, Arthritis Res., 2, 205-
7). Certaines de ces souris ont permis la validation in vivo d'épitopes CD4 de parasites.
Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont amené à développer un nouveau modèle expérimental animal de souris humanisées transgéniques pour HLA- DP et invalidées pour les gènes H-2 classe II, en utilisant un allèle particulier représenté à raison d'environ 50% dans la population caucasienne, ce qui permet de rechercher un vaccin avec un meilleur recouvrement de la population par rapport aux modèles disponibles à ce jour.
Ces souris se sont avérées de grand intérêt pour l'étude pré-clinique comparative de l'efficacité de différents candidats vaccins et pour évaluer les risques liés à une induction non désirée de maladie auto-immune. Elles permettent également de déterminer la meilleure stratégie thérapeutique à adopter.
L'invention a donc pour but l'utilisation de vecteurs d'expression codant pour des complexes fonctionnels reconnus spécifiquement par des anticorps anti- HLA-DP pour créer des souris transgéniques.
Elle a également pour but de fournir de telles souris et leur utilisation comme modèle expérimental pour étudier les réponses immunitaires induites après infection virale ou par les composés testés.
L'invention vise ainsi l'utilisation, pour créer des souris transgéniques, d'une construction de vecteur d'expression codant pour le complexe HLA-DPαl03β401 fonctionnel, reconnu spécifiquement par des anticorps anti-HLA-DP, caractérisée en ce que la construction comprend des promoteurs murins des gènes IAβ et IAa associant les ADNc codant pour DPαl03 et DPβ401.
Les souris transgéniques de l'invention sont caractérisées en ce qu'il s'agit de souris humanisées exprimant individuellement le transgène HLA-DPαl03 ou HLA-DPβ 401 ou simultanément les 2 transgènes. Elle vise en particulier des souris transgéniques pour HLA-DP(αl03β401) et invalidées pour H-2 classe II (HLA-DP+/+IAβ °/°).
Ces souris sont avantageusement obtenues par micro-injection dans les oocytes de souris fondatrices des fragments d'ADN codant pour ledit complexe, obtenus à partir de plasmides les renfermant, croisement entre elles des souris fondatrices exprimant individuellement le transgène HLA-DPαlO3 ou HLA-DPβ 401, et croisement des souris exprimant simultanément les deux transgènes avec des souris IAβ°.
Des souris particulièrement préférées pour leur capacité de réponse élevée à des épitopes sont en outre transgéniques pour hCD4 et invalidées pour mCD4. Il s'agit de souris HLA-DP(αl03β401)IAβ°. hCD4 +/+ mCD4 °/°.
Pour créer des souris souris HLA-DP(αl03β401)IAβ°. hCD4 +/+ mCD4 °/°, les souris transgéniques de l'invention (HLA-DP+/+IAβ °/°) sont croisées successivement avec des souris hCD4 + + et des souris mCD4 °/°. Pour obtenir une nouvelle souris répondant au phenotypes HLA-DP(αl03β401)IAβ°. hCD4 +/+ mCD4 °/°. Les souris de l'invention ( HLA-DP(αl03β401)IAβ° et HLA-DP(αl03β401)IAβ°. hCD4 +/+ mCD4 °/°) représentent de nouveaux modèles expérimentaux animaux de souris humanisées pour identifier des épitopes HLA-DP restreint, immunogéniques chez la souris et chez l'homme.
Les épitopes ainsi identifiés sont alors utilisables comme sous-unités pour l'élaboration de vaccins, en particulier de vaccins polyépitopiques.
Ils permettent également l'élaboration de nouveaux réactifs utilisables pour effectuer un suivi de la réponse immunitaire spécifique post-infection ou post-vaccination (par exemple les tétramères peptide/HLA classe II).
Ils sont également utilisables pour développer des tests prédictifs de l'état de protection d'un sujet vis-à-vis d'un virus donné et/ou effectuer un suivi d'une infection virale.
Le nouveau modèle expérimental de l'invention, permet également, de manière avantageuse, de comparer l'efficacité de la réponse T auxiliaire induite par différents candidats vaccins ou différents protocoles d'immunisation. Ils représentent à ce titre un modèle d'évaluation des risques d'inductions de maladies auto-immunes. Le nouveau modèle expérimental de l'invention peut être également mis à profit pour analyser la coopération cellulaire entre les lymphocytes T CD4 et les lymphocytes T CD8 dans la souris, suite à une immunisation contre un antigène viral, et déterminer, si souhaité, les couples d'épitopes HTL et CTL agissant en synergie.
L'invention vise également les lymphocytes CD4+ isolés après immunisation d'une souris transgénique telle que définie ci-dessus.
Elle porte en outre sur l'utilisation de ces lymphocytes pour établir des lignées cellulaires spécifiques et pour créer des hybridomes T-spécifiques par fusion cellulaire, selon les techniques classiques, ces lignées cellulaires et ces hybridomes étant également visés par l'invention en tant que produits nouveaux. Ces lignées cellulaires présentent un grand intérêt pour la production des réactifs de suivi spécifiques, par exemple pour le calibrage ou la réalisation de tests de qualité des tétramères HLA classe IL
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 10, qui représentent, respectivement,
- la figure 1, les cartes de 4 constructions plasmidiques utilisées selon l'invention ; la figure 2, l'évaluation de la fonctionnalité de deux vecteurs utilisés selon l'invention ; - la figure 3, la PCR diagnostique de transgènes HLA-DP ; la figure 4, l'analyse de cytométrie de flux de l'expression de molécules de HLA-DP chez des souris transgéniques de l'invention ; la figure 5, le nombre de cellules T spléniques CD8+ et CD4+ ; la figure 6, la diversité de répertoire des différents Vb des TCR des lymphocytes TCD4+ chez les souris (HLA-DP+/IAβ°) et des souris C57BL6, la figure 7 , la réponse proliférative spécifique après immunisation par KLH de souris transgéniques de l'invention ; la figure 8, la réponse proliférative spécifique après immunisation par un antigène HBs de souris transgéniques de l'invention, - la figure 9, les réponses spécifiques en anticorps après immunisation par un antigène
HBs de souris transgéniques de l'invention, et la figure 10, les histogrammes représentent une étude comparative entre les souris (HLA-DP(αl03β401)IAβ° et HLA-DP(αl03β401)IAβ°. hCD4 +/+ mCD4 7°.) de la réponse proliférative TCD4 spécifique suite à une immunisation à l'aide d'antigènes donnés. Le fond génétique des deux souris correspond à celui de souris C57/BL6.
Matériels et Méthodes
1) gènes et ADNc de départ
Gène IAβ b : fragment KPNI-XBAl de 9Kb, isolé du cosmide Aβl9 et dans une configuration entièrement génomique .Le choix des deux sites de restriction est fondé sur la cartographie de Lahrammar (JBC,1985,260,14111-14119). Gène IAαb produit par sous clonage d'un fragment Kpnl-Sall tiré du cosmide LS8.1(après raccourcissement Kpnl) de 6,8 Kb et ligué en 3' à un fragment de 250pb Sali - Notl, tiré de pUT 626 et apportant le site de polyadénylation de SV 40.
Obtention de l'ADNc de DPβ401 et DPαlO3
L'ARN total a été isolé de cellules HOM-2 d'haplotype HLA homozygote(A3, Cl , B27, DRl, DQ5, DPβ0401, DPα0103 )qui sont des cellules transformées par le virus d'Epstein Barr et exprimant les molécules de CMH de classell. Sur ces ARNm, ont été effectuées des RT-PCR en utilisant comme amorces :
Pour DPβ401 amorce 5' (SEQ ID N°l) 5'CCT TTT ATC gAT CCA TgA Tgg TTC TgC Agg 3 ' avec introduction d'un site BspDl pour le sous clonage dans IAβb amorce 3 ' (SEQ ID N°2) 5' TTA AAA gTC gAC TTA CCT gTT TAT gCA gAT CCT C 3' avec introduction d'un site Sali pour le sous clonage dans IAβb.
Pour DPαlO3 amorce 5' (SEQ ID N°3) 5' CCT TTT ATC gAT CAA CAT gCg CCC TgA AgA C 3' avec introduction d'un site BspDl pour sous clonage dans IAαb. amorce 3' (SEQ ID N°4) 5' TTA AAA CTC gAg gTg TgA gCA CgT ACC gTT ggT ggC CTg AgT gTg 3'avec introduction d'un site Xhol pour sous-clonage dans IAαb.
Des formes longues DPαlong et DPβlong ont été réalisées (totalité des ADN complémentaires de DPa et de DPβ) et ont été introduites dans des vecteurs pcR Topo 2 (Invitrogen) puis clonées dans des bactéries RZ1032.
2) Modification par mutagénèse dirigée des gènes IAαb et IAβb
Les mutagénèses dirigées ont été réalisées par la méthode de Kunkel (P.N.A.S. USA, 1985 Jan ; 82(2) : 488-92) afin d'introduire les sites de restriction nécessaires au clonage des ADNc DPa DPβ en respectant les différents cadres de lecture. En bref, une matrice d'ADN simple brin est générée en infectant par un bactériophage KO.7 des bactéries RZl 032 (UTPase", incapables d'enlever les U incorporés par erreur ) préalablement transfectées avec des vecteurs contenant les gènes cibles. Sur cette matrice est hybride l'oligonucléotide de mutagénèse que l'on a phosphorylé. Une ADN polymérase synthétise le brin muté. On réalise ensuite la transfection de bactéries supercompétentes XLl(UTPaSe+) ou le brin U substitué (non muté) est dégradé et le brin muté conservé.
Formes longues
DPβ4011ong : sous-clonage du fragment EcoRl (Séquence signal et séquences des domaines βl et β2 humain ) de pcR2 Topo dans un plasmide pBlueScript/KS " contenant le fragment HindIII-Xbal(3kb) de IAβb BspDl+ SaIl+.
Le fragment BspDl-Xbal obtenu à partir de cette construction a été inséré dans pBlueScript/KS" IAβb ouvert BspDl - Xbal . La partie terminale de IAβb a ainsi été reconstituée et DPβ401 complet est inséré.
DPαl031ong : sous-clonage du fragment BspDl-Sall (Séquence signal et séquences des domaines αl et α2 humain) de pcR Topo 2, dans pBlueScript/ KS"
IAa b ouvert BspDl- Sali . La forme DPβ4011ong a ensuite été introduite dans un vecteur comportant une cassette Hygromycine pour donner la construction finale pIADPβlong (8,5Kb).
(Figure 1).
La forme DPαl OSlong a été introduite dans un vecteur contenant une cassette Néomycine pour donner la construction finale pIADPαlong (8Kb) (Figure 1). Ces différentes constructions ont ensuite été clonées dans les bactéries supercompétentes XLl et les bactéries sure (rendues compétentes ), puis vérifiées par séquençage par la technique de Sanger.
Introduction devant les constructions DPβα longues d'un promoteur fort de Sarcome de Rous pSRDPαlong (7,9kb): sous-clonage du fragment SacI-EcoRV de DPαlong - pcR2 Topo dans NT Hygrod ouvert Smal(blunt)- Sacl. pSRDPβlg (7,7kb) : sous-clonage du fragment SacI-EcoRV(blunt) de DPβlong corrigé c .8-15 pcR2 Topo dans NT Néod ouvert SacI-EcoRV.
3) Cellules et transfectants.
Des cellules HeLa (cellules humaines de col utérin), L Kuhn (fibroblastes de souris C3H H-2k) et P815 (mastocytome de souris provenant de souris DBA/2 H- 2d) ont été maintenues en milieu RPMI 1640 complet : FCS 10%, Pénicilline- Streptomycine (200UI/ml), Sodium-pyruvate (ImM) et L glutamine (2mM). Des cellules en phase exponentielle de croissance ont été cotransfectées par les formes longes +/- CIITA (facteur de régulation transcriptionnelle des gènes de CMH II) ; 24h après la transfection elles ont été sélectionnées avec du G418( lmg /ml) puis 24h plus tard avec de l'Hygromycine B (400μg/ml).
Les clones obtenus ont été testés en immunofluorescence directe et en cytométrie de flux (FACScan, Becton Dickinson). En bref, 500 000 cellules sont incubées 40 minutes avec un anticorps murin reconnaissant HLA-DP (B721), IAd (MKD6) ou HLA -A3 (GAPA 3) en PBS 1% BSA 2mM EDTA, puis, après lavage, incubées 40 minutes avec un second anticorps de chèvre anti-souris couplé au FITC, en PBS 1% BSA 2mM EDTA, et lavées en PBS BSA 2mM EDTA.
4) Extraction d'ADN génomique, Analyse de Southern Blot et PCR diagnostiques des transgènes.
L'ADN génomique est préparé à partir de transfectants ou à partir de queues de souris selon la méthode suivante : traitement à la protéinase K, Incubation 16h à 56°C, traitement au NaCl saturé, précipitation de l'ADN à Pisopropanol-2, lavages à l'éthanol 70% et reprise du culot d'ADN dans 150 μl de TrislOmM EDTAImM. PH7,5.Des ADN extraits des transfectants DP ont été digérés par BamHI pour le diagnostic par analyse de Southern de DPαlong et par EcoRl pour le diagnostic de DPβlong, puis après électrophorèse en gel 0,6% d'agarose, transférés sur une membrane de nitrocellulose et hybrides avec leur sonde correspondante. La sonde DPa correspond à la totalité de l'ADNc de DPαlO3, la sonde DPβ est l'ADNc de DPβ401. Ces sondes ont été radiomarquées au dCTP32 selon les directives du fabriquant (Megaprime DNA labelling system Amersham Pharmacia).
L'expression des transgènes DP β401 et DPαl03 a été détectée par PcR en utilisant des amorces spécifiques des séquences DP. La PcR a été réalisée dans des tubes contenant de l'ADN génomique de souris (300 ng pour DPβ401 et DPαl03, PcR Buffer, 15pM de chaque amorce, 12pM de chaque dNTP et 1,25 U de Taq Polymérase (GibcoBRL) avec une concentration finale de MgC12 de 2,6 mM pour DPβ401 et de 4,ImM pour DPαl03.Un 1er cycle de dénaturation est réalisé T à 94°C suivi de 30 cycles consistant en 30" de dénaturation à 94°C, 30" d'hybridation à 550C et 30" d'extension à 72°C, et d'un cycle final d'extension pendant 4' à 72°C.
Pour DPβ401 l'amorce sens est 5' (SEQ ID N°5) ggATTggAAAgAggCTC 3' et l'amorce antisens est 5' (SEQ ID N°6) gCACtgCCCgCTTCTCC 3'. Pour DPαl03 l'amorce sens est 5' (SEQ ID N°7) TAATACAAAgTCTgCAgCTggC 3' et l'amorce antisens (SEQ ID N°8) est 5' AgCAATgTTAgCCAgCC 3'
Construction de vecteurs d'expression codant le transgène HLA-DPαlO3 ou HLA-DP B401 Les cartes des 4 plasmides pIADPαlong, pIADPβlong, pSRDPαlong et pSRDPβlong sont rapportées sur les figures IA à ID, respectivement.
- pIADPαlong : promoteur IAα/DPαl03/NcIAα
- pIADPβlong : promoteur IAβ/DPβ401/NcIAβ
- pSRDPαlong : promoteur SR/DPαl03/NcSV40 - pSRDPβlong : promoteur SR/DPβ401/NcSV40
Les plasmides sont entièrement séquences et vérifiés.
Fonctionnalité des constructions
Elle a été évaluée par transfection de fibroblastes murins (L Kuhn, H- 2k) et de mastocytomes de souris (P815, H-2d). Ces deux types cellulaires n'expriment pas naturellement de molécules d'histocompatibilité de classe IL La transfection des gènes DPβ DPa a été associée à celle d'un plasmide codant pour le facteur de régulation transcriptionnel CIITA humain qui détermine l'activation des gènes HLA de classe II (α et β) des séries HLA- DP, -DQ, -DR et active également l'expression du gène codant pour la chaîne invariante. Les anticorps MKD6 (anti- IAd) et GAPA3 (anti-HLA-A3) de même isotype immunoglobulinémique que l'anticorps B721, ont été utilisés comme contrôles. L'expression de surface des constructions DPαβ sauvages a de nouveau pu être documentée à la surface de transfectants L (non réactifs avec l'anti-IAd MKD6) et de transfectants P815. Dans ce dernier cas, une forte réactivité a été observée avec l'anticorps MKD6 pas avec GAP A3, traduisant l'activation transcriptionnelle des gènes IAd suite à la transfection du gène CIITA.
Les fonctionnalités des vecteurs pSRDPαlong et pSRDPβlong ont été évaluées par co-transfection de cellules humaines L Kuhn et de cellules HeLa. Celles des vecteurs pIADPαlong et pIADPβlong ont été évaluées par co-transfection en plus du plasmide pCIITA et CIITA humain (facteur de régulation transcriptionnel CHTA humain) de cellules P815.
Les résultats obtenus sont illustrés sur la figure 2 .La figure 2A correspond aux transfectants HLA-DP non transfectés P815, co-transfectés par Dpαlong/Dpβlong/CIITA ou par CIITA, incubés avec l'anticorps monoclonal B721 (anti- HLA-DP), MKD6 (anti-IA) ou GAP A3 (anti-HLA-A3), puis avec une IgG-FITC de chèvre anti-souris. Les cellules sont analysées par cytométrie de flux. La figure 2B correspond aux transfectants L-Kuhn-DP et HeIa-DP.
Ces évaluations ont permis de vérifier que ces constructions sont fonctionnelles et codent le complexe HLA-DPαl03β401 fonctionnel, reconnu spécifiquement par des anticorps spécifiques anti-HLA-DP.
Création de souris transgéniques et PCR diagnostiques des transgènes
Deux approches de transgénèse ont été réalisées : une série de transgénèses simples a été réalisée à l'hôpital Paul Brousse :
Les constructions DPαlong, DPβlong ont été microinjectées individuellement dans des œufs fertilisés de souris C57BL/6 X DB A2
- une série de transgénèses doubles a été réalisée à l'hôpital Cochin par microinjection des constructions DPαlong / DPβlong dans des oeufs fertilisés de souris C57BL/6 X DBA2.
Afin, de détecter les souris fondatrices simples ou double transgéniques, un test de PCR diagnostique a été mis au point et réalisé sur ADN extrait de queues de souris. La Figure 3a montre le résultat obtenu et la détection des transgènes
DPαlong. Une bande de 445 pb caractéristique de ce transgène apparaît avec les ADN des souris transgéniques pour DPαlong. Cette bande est naturellement absente avec les ADN des souris témoins DBA2 et B6. La Figure 3 b illustre la détection des transgènes DPβlong. La bande de 815 pb obtenue est spécifique de ces transgènes.
11 souris DP transgéniques ont été obtenues :
5 souris DP α long 3 souris DP β long
Des souris fondatrices exprimant individuellement le transgène HLA-
DPαlO3 ou HLA-DP β401 ont été croisées entre elles. Les souris exprimant simultanément les deux transgènes HLA-DPαlO3 et HLA-DPβ401 ont ensuite été croisées avec des souris C57BL/6IAβ° pour obtenir des souris HLA- DPαl03β401+IAβ°.
L'expression de différents transgènes ou l'absence d'expression du gène IAβ sont analysées par PCR et pour certaines, en plus, par Southern blot.
Protocole de la PCR diagnostique des transgènes : - HLA-DPαlO3
Produits : TAQ DNA polymérase (Invitrogen) MgClII 5OmM (Invitrogen) PcR Buffer lOX (Invitrogen) H2O stérile dNTP 4mM pour chaque
Amorce : promoteur IAa (amorce sens) (SEQ ID N°9) 5' TAA TAC AAA gTC TgC AgC Tgg C 3'
DP2 α antisens (SEQ ID N0IO) 5' AgC AAT gTT AgC CAg CC 3'
(MgClII) final = 4,1 mM Tm 55°C
Pour DPa, on amplifie ainsi un fragment caractéristique du transgène d'environ 445 pb. Les témoins négatifs B6 et DBA/2 ne présentent aucune amplification.
Cycles PCR 94°C 7 minutes
(94°C 30 sec, 55°C 30 sec, 720C 30 sec) X 40 cycles 720C 4 minutes
4 ° C - HLA-DPβ401 transgène diagnostique PCR
Produits : TAQ DNA polymérase (Invitrogen) MgClII 5OmM (Invitrogen) PcR Buffer 1OX (Invitrogen) H2O stérile dNTP 4mM pour chaque
Amorce : promoteur IAβ (amorce sens) (SEQ ID N011) 5' ggA TTg gAA AgA ggC TC 3'
DPβ antisens (SEQ ID N012) 5' gCA CTg CCC gCT TCT CC 3'
(MgClII) final = 2,6 mM
Tm 550C
Pour DPβ on amplifie ainsi un fragment caractéristique du transgène d'environ 815 pb. Les témoins négatifs B 6 et DBA/2 ne présentent aucune amplification.
Cycles PCR 940C 7 minutes
(940C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 30 sec) X 40 cycles 720C 4 minutes
4 0 C
Phénotypages des souris HLA-DPαl03β401+/IAβ°.
Le niveau d'expression à la surface cellulaire des complexes transgéniques HLA-DP chez les souris transgéniques HLA-DP+/IAβ° a été mesuré par cytométrie de flux. Les résultats sont donnés sur la figure 4. Le nombre de lymphocytes T CD4+ périphériques et de cellules CD8+ ont été mesurés chez les souris (HLA-DP+/Iab°). La figure 5 illustre les résultats obtenus.
Les splénocytes de souris C57BL/6 (B6 dans la figure 5A), HLA-DP/H-2 classe II-KO (DPCHKO dans la figure 5B) et H-2 classe I/classe II-KO (CI CHKO dans la figure 5C) ont été colorés avec des anticorps monoclonaux CT-CD4 marqués avec PE (anticorps anti-CD4 de souris, en ordonnées) et marqué par FITC 53-6,7
(anticorps anti-CD8, en abcisse). Les valeurs numériques indiquées correspondent aux cellules T CD4+ (figure 5 A, partie supérieure gauche) ou aux cellules T CD 8+ (figure 5C,partie inférieure gauche) dans les splénocytes totaux.
En utilisant la technologie de PImmunoscope, on a montré que la diversité du répertoire des différents Vb des TCR des lymphocytes T CD4+ est comparable entre les souris (HLA-DP+/IAβ+) et les souris C57BL6 (voir figure 6).
Etude fonctionnelle
En utilisant l'antigène KLH (T dépendant), on a montré chez 6/6 souris (HLA-DP+/IAβ°/°) qu'elles étaient capables d'une réponse proliférative à cet antigène alors qu'aucune réponse n'a été observée chez 6/6 souris (IAβ°/°).Les résultats obtenus sont illustrés par les figures 7A et 7B. D'autres expérimentations ont consisté à utiliser l'antigène d'enveloppe
HBs (préS2-S) du virus de l'hépatite B comme modèle d'étude pour analyser simultanément la réponse cellulaire et humorale anti-HBs entre les souris (HLA- DP+/IAβ°/°). Suite à une immunisation génétique par l'injection du plasmide pCMV- HBs codant la protéine HBs (préS2-S). Les tests suivants ont été utilisés :
- test ELISA pour suivre la réponse humorale spécifique anti-HBs (anticorps anti-préS2 et anti-S) ; test de prolifération cellulaire spécifique pour suivre la réponse cellulaire auxiliaire spécifique des épitopes HLA-DP restreints dérivés de la protéine HBs (HBs Celis DP) .
L'épitope T HBs Celis DP (FLLRILTIP) restreint à HLA-DP est décrit dans E. Celis et RW Karr, J.Virol. 1989, Feb ; 63(2) : 747-52. La présence simultanément d'une réponse cellulaire proliférative spécifique forte (index prolifératif >3) pour l'épitope T HBs Celis DP ( voir figure 8) et la présence d'anticorps anti-HBs et anti-pré-S2 (voir figure 9) ont été documentés chez 3 / 4 souris (HLA-DP+/IAβ°/°) immunisées contre HBs. Aucune souris Iαβ° immunisées (0/4) avec le plasmide pCMV-S2S ne donne de réponse cellulaire spécifique pour l'épitope T HBs, ni de réponse anticorps anti- préS2 ou anti-HBs.
Ces résultats montrent que les souris (HLA-DP+/IAβ°/°) représentent un nouveau modèle expérimental animal de souris humanisées optimal pour l'identification des épitopes HLA-DP restreints présents dans les antigènes divers.
Souris transgéniques HLA-DP(αl 03β40n IAβ°/° hCD4 +/+ mCD4 °/°
On rapporte ci-après les résultats d'expériences réalisées avec des souris HLA-DP4 transgéniques H-2 classe II KO (HLA-DP(αl03β401) IAβ°/°) et avec des souris HLA-DP4 CD4 humain CII KO (HLA-DP(αl03β401) IAβ°/° hCD4+/+ mCD4 °/°) portant sur l'étude des réponses prolifératives TCD4 après immunisation avec
• le peptide HLA-DP4 (Celis)
Réponses prolifératives T CD4 de souris HLA-DP transgéniques immunisées avec Ii-DP (Celis) au peptide HLA-DP4 ( Celis)
' Souris H LA-DP4 transgéniques Souris HLA-DP4CD4 humain
H-2 classe II KO CU KO
2.4 3,7
1.5 1.4 2,1 2,3
2.1 2,8 1.5 3
2.2 2,8
2.3 2,5 2,3
On observe 3% de lymphocytes TCD4 achez les souris HLA-DP4 transgéniques H-2 classe II KO versus 0,8% chez les souris H-2 classe II
KO, et de 12% de lymphocytes TCD4 chez les souris HLA-DP4 CD4 humain transgéniques CD4 murin KO CII KO. Les réponses prolifératives TCD4 au KLH de souris HLA-DP4 transgéniques sont illustrées par les histogrammes des figures 1 OA (souris HLA-DP4 transgéniques H-2 classe II KO) (HLA-DP(αl03β401) IAβ°/°) et 1OB (souris HLA-DP4 CD4 humain CII KO) (HLA-DP(αl03β401) IAβ°/° hCD4+/+ mCD4 °/°).

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation, pour créer des souris transgéniques, d'une construction de vecteur d'expression codant pour le complexe HLA-DPαl03β401 fonctionnel, reconnu spécifiquement par des anticorps anti-HLA-DP, caractérisée en ce que la construction comprend des promoteurs murins des gènes IAβ et IAa associant les ADNc codant pour DPαl O3 et DPβ401.
2. Souris transgéniques telles qu'obtenues selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'il s'agit de souris humanisées exprimant individuellement le transgène HLA-DPαl O3 ou HLA-DPβ 401 ou simultanément les 2 transgènes.
3. Souris selon la revendication 2, transgéniques pour HLA-DP (αl 03β401) et invalidées pour H-2 classe II (HLA-DP+/+IAβ °/°).
4. Souris selon la revendication 3, transgéniques pour HLA-DP (αl03β401) h CD4 +/+ et invalidées pour H-2 classe II IAβ °/°m CD4 °/° .
5. Utilisation des souris selon la revendication 3 ou 4, pour l'étude préclinique comparative de l'efficacité de candidats vaccins.
6. Utilisation des souris selon la revendication 3 ou 4, pour évaluer les risques liés à une induction non désirée de maladie auto-immune.
7. Utilisation des souris selon la revendication 3 ou 4, pour déterminer une stratégie thérapeutique.
8. Utilisation des souris selon la revendication 3 ou 4, pour identifier de nouveaux épitopes permettant l'élaboration de réactifs pour un suivi de la réponse immunitaire spécifique post-infection ou post-vaccination.
9. Lymphocytes CD4+ isolés à partir de souris selon la revendication 3 ou 4, après leur immunisation.
10. Utilisation des lymphocytes CD4+ selon la revendication 8, pour établir des lignées cellulaires spécifiques.
11. Utilisation des lymphocytes CD4+ selon la revendication 8, pour créer des hybridomes T spécifiques par fusion cellulaire.
12. Les lignées cellulaires établies selon la revendication 9.
13. Les hybridomes obtenus selon la revendication 10.
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