JP2008531032A - トランスジェニックマウス及び実験モデルとしての、その使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】トランスジェニックマウスを作製するための、抗HLA−DP抗体によって特異的に認識される機能的なHLA−DPα103β401複合体をコードする発現ベクターコンストラクトの使用に関し、該コンストラクトは、DPα103及びDPβ401をコードするcDNAに関係するIAβ遺伝子及びIAα遺伝子のマウスプロモーターを含む。
【選択図】なし
Description
β401導入遺伝子を個別に発現するファウンダーマウス間の交配、又は、それら2つの導入遺伝子を同時に発現するファウンダーマウスとIAβ°マウスとを交配して作製することが好ましい。
1)開始遺伝子及びcDNA
IAβ b遺伝子:Aβ19コスミドから単離した、完全なゲノム立体配置にある9kb KPNI−XBAI断片。2つの制限部位の選択はLahrammarマッピングに基づく(JBC、1985、260、14111−14119)。
pUT626から採取した250bpのSalI−NotI断片が3’に結合した、6.8 kb のLS8.1コスミド(KpnI切り出し後)から採取したKpnI−SalI断片のサブクローニングによって作製。SV40ポリアデニル化部位を提供する。
ホモ接合体HLAハプロタイプ(A3、C1、B27、DR1、DQ5、DPβ0401、DPα0103)のHOM−2細胞から全RNAを単離した。該細胞は、Epstein Barrウイルスで形質転換された細胞であり、MHCクラスII分子を発現する。以下のプライマーを用いて、該RNAに対しRT−PCR法を行った。
DPβ401に対しては、IAβ bのサブクローニングのため、BspD1部位を導入する5’プライマー(SEQ ID No.1)5’CCT TTT ATC gAT CCA TgA Tgg TTC TgC Agg 3’;
IAβ bのサブクローニングのため、Sall部位を導入する3’プライマー(SEQ ID No.2)5’TTA AAA gTC gAC TTA CCT gTT TAT gCT gAT CCT C 3’
IAαb でのサブクローニングのため、Xho1部位を導入する3’プライマー(SEQ ID No.4)5’TTA AAA CTC gAg gTg TgA gCA CgT ACC gTT ggT ggC CTg AgT gTg 3’
DPα、DPβのcDNAのクローニングに必要な制限部位を導入するため、種々の読み枠を考慮しつつ、Kunkel法(P.N.A.S USA、1985 Jan;82(2):488-92)に基づいて、部位特異的変異導入法を行った。簡略に述べると、標的遺伝子を含むベクターを前もって導入したRZ1032菌(UTPase-、エラーにより組み込まれたUが除去不能)にKO.7バクテリオファージを感染させて一本鎖DNA鋳型を調製する。
ホスホリル化された変異原性オリゴヌクレオチドは、この鋳型上でハイブリダイゼーションする。DNAポリメラーゼは変異鎖を合成する。次いで、スーパーコンピテントXL1(UTPase+)細菌の形質移入を行い、その細菌内において、置換されたU鎖(変異なし)は分解され、該変異鎖は保存される。
長鎖DPβ401:pcR2 TopoのEcoR1断片(シグナル配列及びヒトβ1及びβ2ドメインの配列)を、IAβ b BspD1+Sal1+のHindIII−Xbal断片(3kb)を含むpBlueScript/KS-プラスミドでサブクローニングする。このコンストラクトから得られたBspD1−Xbal断片を、BspD1−XbalにオープンのpBlueScript/KS- IAβ bに挿入した。このようにして、IAβ bの末端部分は再構築され、完全なDPβ401が挿入される。
長鎖pSRDPα(7.9kb):長鎖DPα−pcR2 TopoのSacI−EcoRV断片の、SmaI(blunt)−SacIにオープンのNT Hygrodでのサブクローニング
長鎖pSRDPβ(7.7kb):長鎖DPβc.8−15 pcR2 TopoのSacI−EcoRV断片の、SacI−EcoRVにオープンのNT NeodでのSacI−EcoRV(blunt)のサブクローニング
HeLa細胞(ヒト子宮頸部細胞)、L Kuhn細胞(C3H H−2kマウス繊維芽細胞)及びP815細胞(DBA/2 H−2dマウス由来のマウス肥満細胞腫)を、10%のFCS、ペニシリン−ストレプトマイシン(200IU/ml)、ピルビン酸ナトリウム(1mM)及びL−グルタミン(2mM)を含むRPMI1640完全培地で培養した。指数関数的成長期にある細胞に長鎖型+/−CIITA(MHC II遺伝子の転写調節因子)を同時形質移入し、この形質移入24時間後、G418(1mg/ml)で選択し、24時間後にハイグロマイシンB(400μg/ml)で選択した。
以下の方法に従い、形質移入体又はマウスの尾からゲノムDNAを調製する。
すなわち、プロテイナーゼKによる処理、56℃で16時間のインキュベーション、飽和NaClによる処理、2−イソプロパノールによるDNAの沈降、70%エタノール及び150μlのpH7.5、10mM Tris 1mM EDTAのDNAペレットでの洗浄。DP形質移入体から抽出したDNAを、長鎖DPαのサザン解析のために、BamHIで消化し、長鎖DPβのサザン解析のため、EcoRIで消化した。その後、0.6%アガロースゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜にブロットし、相当するプローブとハイブリダイズさせる。DPαプローブは、完全なDPα103cDNAに相当し、DPβプローブは、DPβ401cDNAに相当する。これらのプローブには製造者のガイドラインに従って、dCTO32で放射性標識が取り込まれる(Megaprime DNA labeling system、Amersham Pharmacia)。
4種のプラスミド、長鎖pIADPα、長鎖pIADPβ、長鎖pSRDPα及び長鎖pSRDPβの地図を、それぞれ図1Aから1Dに示す。
長鎖pIADPα:プロモーター IAα/DPα103/Nc IAα
長鎖pIADPβ:プロモーター IAβ/DPβ401/Nc IAβ
長鎖pSRDPα:プロモーター SR/DPα103/NcSV40
長鎖pSRDPβ:プロモーター SR/DPβ401/NcSV40
上記プラスミドは完全に配列が決定、確認されている。
コンストラクトの機能性を、マウス繊維芽細胞(L Kuhn、H−2k)及びマウス肥満細胞腫(P815、H−2d)の形質移入によって評価した。これらの2種の細胞型は、自然にはクラスII組織適合性分子を発現しない。DPβ DPα遺伝子の形質移入は、ヒト転写調節因子CIITAをコードするプラスミドの形質移入と組み合わせた。該因子はHLA−DP、−DQ及び−DR系のHLAクラスII遺伝子(α及びβ)の活性化を決定し、また、不変鎖をコードする遺伝子を活性化する。B721抗体と同一の免疫グロブリンをもつMKD6(抗IAd)及びGAPA3(抗HLA−A3)抗体をコントロールとして使用した。野生型DPαβコンストラクトの表面発現は、L形質移入体(抗IAd MKD6と非反応)及びP815形質移入体の表面で再度記録できた。後者の場合、MKD6抗原で強い反応性が観察されたがGAPA3では観察されなかった。これはCIITA遺伝子の形質移入に続くIAd遺伝子の転写活性を反映している。
以下のように、2つの遺伝子導入アプローチを実施した。
Paul Brousse病院で一連のシングルの遺伝子導入を行った。すなわち、長鎖DPα及び長鎖DPβコンストラクトを、C57BL/6×DBA2マウスの受精卵にそれぞれマイクロインジェクションした。
Cochin病院で、一連のダブルの遺伝子導入を行った。すなわち、C57BL/6×DBA2マウスの受精卵に長鎖DPα/長鎖DPβコンストラクトをマイクロインジェクションした。
製品:TAQ DNAポリメラーゼ(Invitrogen)
50mM MgCl2 II(Invitrogen)
10×PCRバッファー(Invitrogen)
滅菌H2O
各dNTP 4mM
プライマー:
プロモーター IAα(センスプライマー)(SEQ ID No.9)
5’TAA TAC AAA gTC TgC AgC Tgg C 3’
DP2αアンチセンス(SEQ ID No.10)
5’AgC AAT gTT AgC CAg CC 3’
(MgCl2)最終濃度=4.1mM
Tm 55℃
PCRサイクル
94℃で7分間
(94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒)×40サイクル
72℃で4分間
4℃
製品:TAQ DNAポリメラーゼ(Invitrogen)
50mM MgCl2 (Invitrogen)
10×PCRバッファー(Invitrogen)
滅菌H2O
各dNTP 4mM
プライマー:
プロモーター IAβ(センスプライマー)(SEQ ID No.11)
5’ggA TTg gAA AgA ggC TC 3’
DPβアンチセンス(SEQ ID No.12)
5’gCA CTg CCC gCT TCT CC 3’
(MgCl2)最終濃度=2.6mM
Tm 55℃
PCRサイクル
94℃で7分間
(94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒)×40サイクル
72℃で4分間
4℃
HLA−DP+/αIAβ°トランスジェニックマウスのHLA−DPトランスジェニック複合体の細胞表面での発現のレベルは、フローサイトメトリーで測定した。結果を表4に示す。
KLH抗体(T依存性)を使用することにより、6/6(HLa−DP+/IAβ°/°)マウスにおいて、該マウスは、この抗原に対して増殖応答することができるが、6/6(IAβ°/°)マウスには応答が観察されないことが明らかになった。得られた結果を図7A及び7Bに示した。
特異的な抗HBs体液性応答(抗preS2抗体及び抗S抗体)をモニタリングするための ELISA法;
HBsタンパク質由来の HLA−DP拘束性エピトープ(HBs Celis DP)に特異的なヘルパー細胞応答をモニタリングするための特異的な細胞増殖法
HLA−DP4ペプチド(Celis)で免疫化後の増殖応答の研究に関して、H−2クラスII KOトランスジェニックHLA−DP4マウス(HLA−DP(α103β401)IAβ°/°)及びHLA−DP4ヒトCD4 CII KOマウス(HLA−DP(α103β401)IAβ°/°hCD4 +/+m CD4°/°)を用いて行った実験結果を次に示す。
Claims (13)
- トランスジェニックマウスを作製するための、抗HLA−DP抗体によって特異的に認識される機能的なHLA−DPα103β401複合体をコードする発現ベクターコンストラクトの使用に関し、該コンストラクトは、DPα103及びDPβ401をコードするcDNAに関係するIAβ遺伝子及びIAα遺伝子のマウスプロモーターを含むことを特徴とする該発現ベクターコンストラクトの使用。
- HLA−DPα103導入遺伝子又はHLA−DPβ401導入遺伝子を個別に発現するヒト化マウス、あるいは、それら2つの導入遺伝子を同時に発現するヒト化マウスであることを特徴とする請求項1によって作製されたトランスジェニックマウス。
- HLA−DP(α103β401)の遺伝子導入を行い、H−2クラスII(HLA−DP+/+IAβ°/°)に対してノックアウトした請求項2に記載のトランスジェニックマウス。
- HLA−DP(α103β401)hCD4 +/+の遺伝子導入を行い、H−2クラスII IAβ°/°mCD4°/°に対してノックアウトした、請求項3記載のトランスジェニックマウス。
- 種々のワクチン候補の有効性に関する比較前臨床研究のための、請求項3又は4記載のトランスジェニックマウスの使用。
- 望まない自己免疫疾患の誘発に関係した危険性の評価のための、請求項3又は4記載のトランスジェニックマウスの使用。
- 治療計画の決定するための、請求項3又は4記載のトランスジェニックマウスの使用。
- 感染症後又は免疫化後の特異的な免疫応答をモニタリングするために使用される新規な試薬の開発を可能にする新規なエピトープを同定するための、請求項3又は4記載のトランスジェニックマウスの使用。
- 請求項3又は4記載のトランスジェニックマウストランスジェニックマウスの免疫化後に、該マウスから単離したCD4+リンパ球。
- 特異的な細胞系を構築するための、請求項8記載のCD4+リンパ球の使用。
- 細胞融合によって、特異的なTハイブリドーマを作製するための、請求項8記載のCD4+リンパ球の使用。
- 請求項9により構築された細胞系。
- 請求項10により得られたハイブリドーマ。
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