JP2008528480A - 免疫調節用HIV−1gp41融合ペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、自己免疫疾患並びに他のT細胞媒介炎症性疾患及び病態を予防又は治療するための医薬組成物及び方法を提供し、この組成物は、HIV gp41融合ペプチド領域由来のペプチド又はそのフラグメント、類似体、相同体及び誘導体の有効量を活性成分として含む。本発明はさらに、T細胞媒介病態の治療に有用なHIV gp41融合ペプチド領域由来の新規のペプチドを提供する。
Description
本発明は、HIV gp41融合ペプチド又はそのフラグメント、相同体及び誘導体の有効量を対象に投与することを含む、自己免疫及び他のT細胞媒介病態を予防又は治療する方法における、HIV gp41融合ペプチド領域由来のペプチドの新規用途を提供する。したがって、本発明の方法において有用な、HIV gp41融合ペプチドの特定の新規なフラグメントを特許請求する。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染は、免疫応答を混乱させる。未治療のHIV感染は通常、全身的免疫抑制状態、後天性免疫不全症候群(AIDS)、及び他の場合には特に害はない日和見感染しやすい状態に導くことになる。しかし感染を達成し複製を確立するために、ウイルスは免疫による制御を回避する必要があり、HIVが多種多様な仕組みを用いて達成する作業が最近概説された(JohnsonとDesrosiers、2002)。HIVそれ自体に向けられたCD4+T細胞の活性阻害は、特に興味深く(Rosenbergら、1997;NorrisとRosenberg、2001)、抗HIV CD4+T細胞が、ウイルスの制御が可能なCD8+T細胞の応答を確立するために必要である(AltfeldとRosenberg、2000)。
標的細胞のHIV感染は、細胞膜とウイルス膜の融合を必要とし、この過程は、env遺伝子産物、エンベロープ糖タンパク質gp160により触媒される。成熟gp160は、2つの非共有結合したサブユニット、gp120及びgp41で構成される(WyattとSodroski、1998)。gpl20と標的細胞上の膜レセプターとの相互作用の後、gp41サブユニットは標的細胞へのウイルス侵入において重要な役割を果たす。いくつかの機能的領域が、gp41ですでに同定されている(図1)。N末端の疎水性融合領域である融合ペプチド(FP)が、膜融合において中心的な役割を果たすと考えられる(図1)。実際に1つのアミノ酸(aa)置換を伴うFP変異体であるV2Eは、野生型FPより低い融合性活性を示す(Kligerら、1997)。FPの最初の16個のaaを標的細胞膜に挿入し、C20領域をウイルス膜に挿入する(PeisajovichとShai、2003;Suarezら、2000)。N36及びC34ペプチドは、ウイルス膜と標的膜とを近接させる6−ヘリックスバンドルリンカー(six−helix bundle linker)(Chanら、1997)を形成する7残基反復を含む。C末端7残基反復に対応する1つのペプチドであるDP 178(HIV−1LAI gp41タンパク質のアミノ酸638〜673)により、融合は阻害でき、このペプチドはHIV感染の強力な阻害剤であり、ヒトに使用するために最近承認された(Lawlessら、1996)。ウイルス感染を阻害するのに有用なHIV gp41由来ペプチドが、たとえば米国特許第5,464,933号、同第6,133,418号、同第6,093,794号(HIVLAI gp41のアミノ酸558〜595に対応するペプチド及びその類似体であるDP178及びDP107に関する)、並びに第5,840,843号(アミノ酸残基600〜862、又はHIV−1IIIBのエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸残基637〜666に対応する配列を含むこれらの一部に相当するものに関する)に開示されている。
FPとT細胞膜との相互作用に関して、FPの16個のN末端aaをコードする合成ペプチドが、ジャーカットT細胞系の細胞膜上で不均一な分布を示すことをCladeraらは報告した(Claderaら、2001)。応答するT細胞の細胞膜領域中で顕著なものは、免疫シナプスである。免疫シナプスは、抗原特異的T細胞と抗原提示細胞間の特異的相互作用を達成する膜貫通分子のクラスターである。免疫シナプスは、TCR及びCD4分子並びにT細胞活性化に関与する他の主要な分子を含む(DavisとDustin、2004;Huppaら、2003)。完全なT細胞の活性化には、免疫シナプス機能が必要である(Huppaら、2003)。ただし、背景技術のいずれも、HIV−I gp41のFP領域が免疫シナプスに局在化し、T細胞の活性化を調節することを開示も示唆もしていない。
正常な免疫系は厳密に調節されるが、免疫応答の異常はまれでない。場合によっては免疫系が不適切に機能し、あたかも宿主の構成成分が実際に外来性であるかのようにその構成成分に反応する。このような応答は、宿主の免疫系が宿主自体の組織を攻撃する自己免疫性疾患を生じる。免疫系の主要な制御因子として、T細胞は直接的に又は間接的にこのような自己免疫病態に影響を及ぼす。
T細胞媒介炎症性疾患とは、不適切なT細胞応答が疾患の構成要素である全ての症状を指す。この疾患は、T細胞により直接的に媒介される疾患及び不適切なT細胞応答が異常な抗体産生の原因となる疾患の両方を含む。
多数の疾患が、自己免疫機序に起因していると考えられている。これらの中でも関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、I型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡が顕著である。世界中で何百万人もの人々が自己免疫疾患を患っており、実際の治療経費及び失われた生産性からみたこれらの疾患の経費は、毎年数十億ドルと評価されている。
さらにT細胞は、骨髄(造血幹細胞)移植による、臓器移植又は移植片対宿主疾患に対する拒絶反応において主要な役割を果たす。したがって、このような免疫応答の制御が、治療上望まれる。
また患者で免疫応答を制御する試みに用いられた従来の試薬と方法は望ましくない副作用を生じ、有効性が限られている。たとえば、自己免疫疾患を有する患者の治療に用いられる免疫抑制試薬(たとえば、シクロスポリンA、アザチオプリン及びプレドニゾン)は、患者の免疫応答全体も抑制して、それにより感染リスクを増加させ、非リンパ系組織に有毒な副作用を引き起こすことがある。免疫制御の医学的な重要性及び既存の免疫薬理学的な試薬の不完全性のため、免疫系の特異的な要素を制御する試薬と方法が、長年研究の対象であった。
いくつかの自己免疫性疾患では、関連する自己抗原が知られており、したがって特異的療法のために用いることができる。たとえば、特異的な自己抗原に免疫寛容及び/又は防御免疫を誘導する方法が、とりわけ、たとえばWO01/12222、WO97/02016及びWO01/30378により開示されている。
とりわけ、たとえばWO01/57056、米国特許第6,316,420号、WO04/002500及びWO00/63251により開示されているように、免疫応答の他の構成要素、たとえばサイトカイン及び接着分子も、免疫調節剤の開発の標的であった。
おそらく分子集合を妨げてTCR機能を乱すことに関する、TCR由来配列に基づくペプチドも開示されている(WO96/22306、WO97/47644)。しかし、これらのペプチドは、本発明のペプチドより約100倍高い濃度で有効であることが示され、したがって毒性と副作用のかなり高い可能性を有していた。
同種の非免疫血清と比べて、同種免疫−免疫原−吸収(AIA)血清と免疫反応性のより高い抗原の低免疫原性用量を投与することにより、自己免疫疾患の症状を治療又は抑制する方法が、米国特許第5,230,887号で開示された。MHCクラスII抗原との、その主張されている血清学的な交差反応性に基づく1つの推定上の抗原は、HIVの完全なgp41であることが示唆された。推定された交差反応性は、C末端のペプチドに存在する(Goldingら、1989)。
WO89/09785は、HIV誘導細胞融合又は細胞壊死性の融合細胞形成を阻害できるHIV−Iのgp41のアミノ末端及びHIV−2のgp40のアミノ末端に位置する疎水性領域に対応するペプチド配列に関する。本開示は、D−アミノ酸を含むいかなるペプチドの特定の実施形態も開示されないが、これらのペプチドは、ペプチドのアミノ末端及び/又はペプチドの最初の2つのアミノ酸の位置にL−異性体ではなくD−異性体を有し得ることを明記している。全てがBHlO株のgp41の少なくとも最初の3つのアミノ酸を含む関連ペプチド、すなわちアミノ酸残基1〜3に対応する特異的なペプチド、アミノ酸残基1〜6に対応するペプチド、及び変更された順序でアミノ酸残基1〜6を含むペプチドのファミリーを用いる、HIVに誘導された融合と融合細胞形成の阻害を‘785公開公報は開示している。
本発明の優先日以後に発表された、本発明の一部の発明者によるWO2005/060350は、膜貫通タンパク質のフラグメントに対応するアミノ酸配列を含む細胞膜結合ジアステレオ異性のペプチドであって、ジアステレオ異性のペプチドの少なくとも2つのアミノ酸残基が、特にウイルスの複製と伝染を含む融合膜タンパク質事象の阻害に有用な、D−異性体立体配置であるペプチドを開示する。とりわけ‘350公開公報は、膜融合過程を阻害するためのHIV−I LAV1 gp41のアミノ酸512〜544に対応するジアステレオ異性のペプチドの使用を開示している。
T細胞媒介炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療又は改善する、さらに有効な方法の必要性が長い間望まれている。したがって、最小限の副作用でTリンパ球の活性化を選択的に抑制できる、新たな免疫抑制因子の開発が望まれている。
本発明は、炎症性疾患、自己免疫及び移植片拒絶反応を含むがこれに限定されるものではないT細胞媒介病態の予防又は治療に有効な、HIVのgp41融合ペプチド領域(FP)由来のペプチド又はそのフラグメント、相同体及び誘導体の新規の用途を初めて開示する。したがって、これらの方法において特に有用なHIVのgp41融合ペプチド領域(FP)の特定の新規な活性フラグメントを特許請求する。
本発明は、HIV−I gp41分子の単離した融合ペプチド(FP)が、T細胞媒介炎症性自己免疫疾患に対して治療特性を有するという、一部には予想外の発見に基づいている。FPが他のgp41領域と共に作用してウイルス粒子の宿主細胞との融合を媒介することは当該技術分野では公知である。FPはT細胞膜中のTCR及びCD4分子と共存することが今初めて開示され、in vitro及びin vivoでT細胞活性化を阻害することが、今示される。意外にも、分裂促進的抗体などの非特異的な活性化因子によるT細胞活性化は影響を受けないが、FP(配列番号1)が、抗原特異的T細胞増殖及びサイトカイン分泌を特に阻害することが認められた。特に、in vivoのこれらの疾患の動物モデルで、FPは関節炎誘発性T細胞の活性化及びアジュバント関節炎を阻害した。さらに細胞−細胞融合を阻害するFPの能力と相関しない配列と構造に依存する様式で、FPはin vivoで非免疫原性であることが認められた。これらの予期しない発見は、T細胞媒介病態治療のための新規用途を有するgp41融合ペプチド領域の新規の機能を開示する。
意外にも、配列番号1のアミノ酸残基5〜13(配列番号407)に対応するFPフラグメントが、アミノ酸残基1〜8(配列番号406)に対応するFPフラグメントよりも、抗原特異的T細胞増殖をはるかに強く阻害するFPの能力を保持することが本明細書で認められた。本発明は、ペプチドの二次構造の破壊にもかかわらず、FPに対応するジアステレオ異性のペプチド又はこれらの部分的配列が炎症を阻害するというさらに予期しない発見に基づく。
したがって、本発明は、T細胞免疫の調節における、HIVのgp41由来の単離した融合ペプチド並びにそのフラグメント、類似体、突然変異体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩の新規の用途を提供する。したがって、本発明は、たとえば完全長FP(配列番号1)、そのジアステレオ異性誘導体IFFA(配列番号6)、及びFP変異体V2E(配列番号2)などの既知のペプチド、並びに当該技術分野で以前に述べられていないペプチドの両方の使用に関する。本発明は、以下に詳述するようなFPの新規なフラグメント、類似体及び変異体をさらに提供する。
一態様において、本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患及び移植片拒絶反応を含むがこれに限定されるものではないT細胞媒介病態の治療のための、HIV gp41融合ペプチド領域由来の単離したペプチド又はそのフラグメント、類似体、突然変異体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩の使用に関する。
ある特定の実施形態によれば、疾患はT細胞媒介自己免疫疾患、たとえば多発性硬化症、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、乾癬、I型糖尿病(IDDM)、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患(結腸クローン病及び潰瘍性大腸炎)、自己免疫性肝炎又は関節リウマチを含むがこれに限定されるものではない。
本発明は、アジュバント関節炎(AA)の動物病モデルである、関節リウマチの実験モデルとして用いられているT細胞媒介炎症性自己免疫疾患により、以下に特に例示される。このモデルは、本発明の原理の例示の目的に用いる非制限的な例として意図したものである。
別の特定の実施形態では、T細胞媒介病態は同種異系移植片拒絶反応及び対宿主性移植片病からなる群から選択される。
特定の実施形態によれば、ペプチドは、HIV−Iのgp41タンパク質の融合ペプチド領域由来のフラグメントである。好ましい一実施形態では、ペプチドは、配列番号1に示されたアミノ酸配列を有する(表1を参照)。代替実施形態によれば、ペプチドはV2E変異体である(配列番号2、表1を参照)。特定の好ましい実施形態によれば、ペプチドは、配列番号7〜198のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を有する、表2に記載のHIV−I gp41融合ペプチド変異体である。別の好ましい実施形態によれば、融合ペプチドは、配列番号199〜405のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を有する表2に記載のHIV−I gp41融合ペプチドフラグメントである。別の特定の実施形態では、本ペプチドは本明細書でFPi−8(配列番号406、表1を参照)と名付けた配列番号1のアミノ酸1〜8に対応するHIV−I gp41融合ペプチドフラグメントである。別の特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書でFP5−I3(配列番号407、表1を参照)と名付けた配列番号1のアミノ酸5〜13に対応するHIV−I gp41融合ペプチドフラグメントである。別の特定の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号409〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を有するFP5−I3の変異体である(表2を参照)。ペプチド由来の配列番号1、2、7〜407及び409〜414と表す短い活性フラグメントとこれらの配列を含む長いペプチドは両方とも、本発明の範囲内に入ることに留意されたい。
いくつかの実施形態では、ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。別の特定の実施形態では、ペプチドは配列番号6に示されたアミノ酸配列を有する、本明細書でIFFA(表1を参照)と名付けた完全長のFPに対応するジアステレオ異性のペプチドである。別の特定の実施形態では、ペプチドは配列番号408に示されたアミノ酸配列を有する本明細書でFPs−J3 A6(表1を参照)と名付けた、FP5−13に対応するジアステレオ異性のペプチドである。
ある実施形態では、ペプチドは、本明細書において式(I):
Xi−AArAA2−AA3−AA4−AA5−AA6−AA7−AA8−AA9−X2 (I)
に記載のT細胞活性化を阻害できるFP5−I3の類似体、変異体、誘導体及びコンジュゲートを含み、
式中、
X1は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるN末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
AA1、AA2、AA6及びAA9は、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
AA3は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
AA4、AA5、AA7及びAA8は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、AA4、AA5、AA7及びAA8の任意の3つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、AA4、AA5、AA7及びAAgのアミノ酸残基の2つ以下が同一であり、
X2は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるC末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、L型又はD型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが30アミノ酸残基以下である。
Xi−AArAA2−AA3−AA4−AA5−AA6−AA7−AA8−AA9−X2 (I)
に記載のT細胞活性化を阻害できるFP5−I3の類似体、変異体、誘導体及びコンジュゲートを含み、
式中、
X1は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるN末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
AA1、AA2、AA6及びAA9は、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
AA3は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
AA4、AA5、AA7及びAA8は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、AA4、AA5、AA7及びAA8の任意の3つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、AA4、AA5、AA7及びAAgのアミノ酸残基の2つ以下が同一であり、
X2は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるC末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、L型又はD型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが30アミノ酸残基以下である。
本発明の好ましい一実施形態では、ペプチドは1つを超えるセリン残基は含まない。
他の態様では、本発明は、不適切な又は有害なT細胞応答に関連する疾患又は障害の症状を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、HIV gp41融合ペプチド領域由来の単離したペプチド又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む。
一実施形態では、HIVはHIV−Iである。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態では、融合ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。
別の実施形態では、ペプチドは、上記に詳述したように、式(I)に記載のT細胞活性化を阻害できるペプチドである。
本発明の他の態様は、T細胞活性化を阻害する方法であり、この方法は、HIV gp41融合ペプチド領域由来の単離したペプチド又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む。
一実施形態では、HIVはHIV−Iである。別の実施形態では、ペプチドは配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はこれらのフラグメント、類似体、変異体、誘導体及び塩を有する。別の実施形態では、ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。
別の実施形態では、ペプチドは、上記に詳述したように、式(I)に記載のT細胞活性化を阻害できるペプチドである。
本発明の他の態様は、HIV gp41融合ペプチド領域由来の新規のペプチド及びこのペプチドを含む医薬組成物に関する。
したがって、他の態様では、式(I):
XI−AAI−AA2−AA3−AA4−AA5−AA6−AA7−AA8−AA9−X2 (1)
を有する、T細胞活性化を阻害できるペプチドが提供され、
式中、
X1は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるN末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
AAi、AA2、AA6及びAAgは、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
AA3は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
AA4、AA5、AA7及びAA8は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、AA4、AA5、AA7及びAA8の任意の3つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、AA4、AA5、AA7及びAA8のアミノ酸残基の2つ以下が同一であり、
X2は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるC末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸はL型又はD型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが30アミノ酸残基以下である。
XI−AAI−AA2−AA3−AA4−AA5−AA6−AA7−AA8−AA9−X2 (1)
を有する、T細胞活性化を阻害できるペプチドが提供され、
式中、
X1は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるN末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
AAi、AA2、AA6及びAAgは、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
AA3は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
AA4、AA5、AA7及びAA8は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、AA4、AA5、AA7及びAA8の任意の3つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、AA4、AA5、AA7及びAA8のアミノ酸残基の2つ以下が同一であり、
X2は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるC末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸はL型又はD型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが30アミノ酸残基以下である。
本発明の好ましい一実施形態では、ペプチドは1つを超えるセリン残基は含まない。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号407に示されたアミノ酸配列を有するFP5−I3である。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号409〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、ペプチドはL及びDアミノ酸の両方を含む。特定の一実施形態では、ペプチドは配列番号408に示されたアミノ酸配列を有するFP5−13A6である。
一態様によれば、本発明は式(I)のペプチド及びその塩並びに薬剤学的に許容し得る担体又は希釈剤を活性成分として含む医薬組成物を提供する。
本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の図、説明及び特許請求の範囲と共に明らかになるであろう。
本発明は、T細胞の活性を制御する新規な方法に関する。HIV gp41融合ペプチド(FP)を含む組成物は、T細胞媒介疾患の治療に有効な治療試薬であることが今初めて示される。
具体的には、本発明は、T細胞活性化を阻害するための、単離したヒトウイルスの融合ペプチドの使用に関する。ウイルスはヒト免疫不全ウイルスであるのが好ましい。ウイルスはHIV−Iであるのがより好ましい。自己免疫性疾患、炎症性疾患、移植片拒絶反応及びアレルギーなどのT細胞媒介病態を予防又は改善するために、単離した融合ペプチドを使用する。
本発明は本明細書でさらに詳細に記載されるように、HIV−I gp41融合ペプチド領域(FP)が、抗原特異的T細胞の活性化を抑制できるという、一部には予想外の発見に基づいている。
特定の作用機序に束縛されることを望むものではないが、本発明のペプチドは免疫シナプスに局在し、それによりT細胞活性化を阻害するという前提に立っている。
図7は、FPがHIV感染で2つの機能を果たす、FPの仮定した機能の概略図を示し、免疫療法のための新たな手段を提供する。HIV感染が、HIV感染症に及ぼすFPの2つの効果を図式的に示す。T細胞免疫シナプスへのFPの挿入は、融合及び感染を促進し、一方、挿入はHIVエピトープに対する特異的なT細胞免疫を下方制御する。T細胞媒介免疫応答、たとえば自己抗原に対する応答又は移植片拒絶反応が有害である状況下で、免疫療法はFPによる下方制御を、T細胞媒介免疫応答にまで拡大する。したがって、FPそれ自体又はその活性フラグメントを、新たな免疫療法薬剤として使用することができる。
(T細胞活性化)
Tリンパ球(T細胞)は、免疫応答に関与する多様な別個の細胞型の1つである。T細胞の活性は、主要組織適合複合体(MHC)分子に関連してT細胞に提示される抗原により制御される。次いでT細胞レセプター(TCR)は、MHC−抗原複合体と結合する。一旦、抗原がMHCと複合体を形成すると、MHC−抗原複合体はT細胞上の特異的TCRに結合し、それによりそのT細胞の活性を変更する。
Tリンパ球(T細胞)は、免疫応答に関与する多様な別個の細胞型の1つである。T細胞の活性は、主要組織適合複合体(MHC)分子に関連してT細胞に提示される抗原により制御される。次いでT細胞レセプター(TCR)は、MHC−抗原複合体と結合する。一旦、抗原がMHCと複合体を形成すると、MHC−抗原複合体はT細胞上の特異的TCRに結合し、それによりそのT細胞の活性を変更する。
抗原提示細胞によるTリンパ球の適切な活性化には、TCRだけでなく、そのコレセプターの組合せ、協調した関与の刺激を必要とする。大部分のTCRコレセプターは、細胞表面リガンドに結合し、細胞間接触の領域で濃縮され、免疫シナプスと呼ばれるものを形成する。シナプス形成は、抗原特異的T細胞増殖の誘導、サイトカイン産生及び溶解性顆粒放出を伴い、完全なT細胞活性化に必要なその機能が決定された(DavisとDustin、2004;Huppaら、2003)。
(T細胞媒介病態)
一態様において、本発明はT細胞媒介病態を治療するための方法を提供する。用語「T細胞媒介病態」とは、不適切又は有害なT細胞応答が、疾患又は障害の病因又は病態の構成要素である任意の症状を意味する。本用語は、T細胞により直接的に媒介される疾患、及びまた不適切又は有害なT細胞応答が、異常な抗体の産生並びに移植片拒絶反応の原因となる疾患の両方を含むものである。
一態様において、本発明はT細胞媒介病態を治療するための方法を提供する。用語「T細胞媒介病態」とは、不適切又は有害なT細胞応答が、疾患又は障害の病因又は病態の構成要素である任意の症状を意味する。本用語は、T細胞により直接的に媒介される疾患、及びまた不適切又は有害なT細胞応答が、異常な抗体の産生並びに移植片拒絶反応の原因となる疾患の両方を含むものである。
本発明の一実施形態において、組成物はT細胞媒介自己免疫性疾患、たとえば多発性硬化症、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、乾癬、I型糖尿病(IDDM)、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患(結腸クローン病及び潰瘍性大腸炎)又は自己免疫性肝炎、関節リウマチを含むがこれに限定されるものではない疾患を治療するのに有用である。
他の実施態様においては、組成物はT細胞媒介炎症性疾患、たとえば喘息、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、遅延型過敏症、間質性肺疾患(ILD)(たとえば、特発性肺線維症又は関節リウマチ、若しくは他の炎症性疾患に伴うILD)などの炎症性又はアレルギー性疾患;硬皮症;乾癬(T細胞媒介乾癬を含む);皮膚炎(アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む)、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、皮膚エリテマトーデス、硬皮症、腟炎、直腸炎、薬疹、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、グレーヴス眼症及び原発性胆汁性肝硬変を含むがこれに限定されるものではない疾患を治療するのに有用である。
他の実施形態においては、組成物は、同種移植片拒絶又は移植片対宿主病を含む移植片拒絶反応を治療するのに有用である。
(ペプチド及びペプチドに基づく医薬組成物)
本発明は、HIV融合ペプチド(FP)並びにそのフラグメント及び誘導体がT細胞活性化を阻害するという、一部には予想外の発見に基づいている。意外にも、FPのアミノ酸残基5〜13に対応する単離したFPフラグメント及びそのジアステレオ異性誘導体、並びにある程度ではあるが、FPのアミノ酸残基1〜8に対応する単離したフラグメントが、T細胞抗原依存性増殖を阻害するFPの能力を保持していることがさらに分かった。
本発明は、HIV融合ペプチド(FP)並びにそのフラグメント及び誘導体がT細胞活性化を阻害するという、一部には予想外の発見に基づいている。意外にも、FPのアミノ酸残基5〜13に対応する単離したFPフラグメント及びそのジアステレオ異性誘導体、並びにある程度ではあるが、FPのアミノ酸残基1〜8に対応する単離したフラグメントが、T細胞抗原依存性増殖を阻害するFPの能力を保持していることがさらに分かった。
したがって、本発明はその第1の態様において、式(I):
X,−AA,−AA2−AA3−AA4−AA5−AA6−AA7−AA8−AA9−X2
のT細胞活性化を阻害できるペプチドを提供し、
式中、
Xiは、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるN末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
AA1、AA2、AA6及びAApは、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
AA3は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
AA4、AA5、AA7及びAA8は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、AA4、AA5、AA7及びAA8の任意の3つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、AA4、AA5、AA7及びAA8のアミノ酸残基の2つ以下が同一であり、
X2は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるC末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、L型又はD型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが30アミノ酸残基以下である。
X,−AA,−AA2−AA3−AA4−AA5−AA6−AA7−AA8−AA9−X2
のT細胞活性化を阻害できるペプチドを提供し、
式中、
Xiは、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるN末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
AA1、AA2、AA6及びAApは、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
AA3は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
AA4、AA5、AA7及びAA8は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、AA4、AA5、AA7及びAA8の任意の3つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、AA4、AA5、AA7及びAA8のアミノ酸残基の2つ以下が同一であり、
X2は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるC末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、L型又はD型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが30アミノ酸残基以下である。
疎水性は、非極性溶媒と水の間でのアミノ酸の分配に関して一般に定義される。疎水性アミノ酸は、非極性溶媒に対する優先性を示すアミノ酸である。アミノ酸の相対的な疎水性は、グリシンが値0.5を有する疎水性スケールで表すことができる。このようなスケールで、水に対する優先性を有するアミノ酸は0.5より下の値を有し、非極性溶媒に対する優先性を有するアミノ酸は、0.5を上回る値を有する。本明細書で用いられる用語「疎水性アミノ酸」は、疎水性スケールで0.5より大きいか又は等しい値を有するアミノ酸を意味し、言い換えれば、少なくともグリシンの値に等しい非極性溶媒に分配される傾向を有するアミノ酸を意味する。天然の疎水性アミノ酸の例は、脂肪族アミノ酸アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン及びバリン、並びに芳香族アミノ酸トリプトファン、フェニルアラニン及びチロシンである。これらのアミノ酸は、タンパク質中の残基として見いだされる場合、脂肪族の長さと芳香族の側鎖のサイズの関数として疎水性を与える。
本発明の好ましい実施形態では、ペプチドは1つを超えるセリン残基は含まない。一実施形態で、ペプチドは、配列番号407(GALFLGFLG)に示されたアミノ酸配列を有するFP5−I3である。式(I)の一般的な構造の他の典型的な実施形態は、GAVFLGFLG(配列番号409)、GAMFLGFLG(配列番号410)、GAVLLGFLG(配列番号411)、GAFFLGFLG(配列番号412)、GAMIFGFLG(配列番号413)及びGALLFGFLG(配列番号414)からなる群から選択される単離したペプチドである。
別の実施形態では、ペプチドはジアステレオ異性ペプチド、すなわちL及びDアミノ酸の両方を含むペプチドである。ジアステレオ異性ペプチドの、より高い水溶性及びタンパク質分解に対するより低い感受性のため、ジアステレオ異性ペプチドは、同じアミノ酸配列を有する全てがL又は全てがDアミノ酸ペプチドに比べ有利でありうる。このような特性は、ジアステレオ異性ペプチドに、同じアミノ酸配列を含む全てがL又は全てがDアミノ酸ペプチドよりもさらに高い有効性とさらに高い生物学的利用能を与える。特定の一実施形態で、ペプチドは配列番号408(
、Dアミノ酸は太字で下線を施した)に示されたアミノ酸配列を有するFP5−I3 A6である。
、Dアミノ酸は太字で下線を施した)に示されたアミノ酸配列を有するFP5−I3 A6である。
式(I)のペプチドは、長さが30アミノ酸未満であることが好ましい。より長い、たとえば長さが50アミノ酸以下のペプチドも、本発明のT細胞媒介病態の治療のために用いることができることを理解すべきである。しかし一実施形態では、産生するのがより容易なために、より短いペプチドが好ましい。本発明の別の好ましい実施形態では、ペプチドは長さが20アミノ酸以下である。本発明の別の好ましい実施形態では、ペプチドは、長さが10アミノ酸以下である。したがって、ある実施形態では、任意のN及びC末端、すなわちXi及びX2は、長さが20アミノ酸以下の、好ましくは10アミノ酸以下の、より好ましくは5アミノ酸、又は他の実施形態では、3アミノ酸以下であるか、若しくは存在しなくてもよい。
ペプチドが、当該分野においてすでに記載されているペプチドでない限り、XiとX2のアミノ酸配列は、FPのフランキング領域に対応する配列を含むことができる。式(I)によって提供されるペプチドは、既知のペプチド、たとえば、完全長のFP(配列番号1)及びIFFA(配列番号6)などの完全長配列に対応するジアステレオ異性誘導体、並びにWO2005/060350で開示された完全長配列に対応する他のジアステレオ異性誘導体、Kligerら(1997)よりに開示された既知のV2E突然変異体(配列番号2)、Martinら(1992)により開示された配列番号225に示されたアミノ酸配列を有する配列番号1のアミノ酸1〜16に対応するペプチド、及びWO89/09785により開示された配列番号1のアミノ酸1〜3を含むペプチドを含まないことを意図していることに留意されたい。
代替実施形態では、配列が疎水性の要求されるレベルを保持する限り、X1及びX2は、FPに由来しない配列を含むことができる。
別の態様によれば、本発明は、HIVのgp41由来の単離した融合ペプチド並びにその類似体、突然変異体、変異体、コンジュゲート及び誘導体を含む組成物に関する。
特定の実施形態によれば、融合ペプチドはHIV−Iのgp41タンパク質に由来する。代替実施態様によれば、融合ペプチドはV2E変異体である。ある好ましい実施形態によれば、融合ペプチドは配列番号1に示されたアミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態では、融合ペプチドは配列番号2に示されたアミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態では、融合ペプチドは配列番号7〜198のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を有する、表2に記載のHIV−I gp41融合ペプチド変異体である。さまざまなHIV株と変異体のデータベースが、利用可能である(たとえば、http://www.hiv.lanl.gov/content/indexを参照)。他の好ましい実施形態によれば、融合ペプチドは、配列番号199〜405のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を有する、表2に記載のHIV−I gp41融合ペプチドフラグメントである。他の好ましい実施形態によれば、融合ペプチドは、配列番号406〜407及び409〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を有する、表2に記載のHIV−I gp41融合ペプチドフラグメントである。他の好ましい実施形態では、融合ペプチドは、L及びDアミノ酸残基の両方を含む。別の好ましい実施形態では、融合ペプチドは、配列番号6及び408のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を有する。
配列番号1、2及び6〜414として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメントとこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。本発明による融合ペプチドフラグメントは、長さが5〜50アミノ酸であるのが好ましく、長さが10〜36アミノ酸であるのがより好ましい。
他の好ましい実施形態では、上記に詳述したように、組成物は式(I)のペプチドを含む。
本発明のペプチドは、実施例で詳述する手順を用いて合成できる。しかし、固相(たとえばBoc又はf−Moc化学反応)並びに液相合成法を含むがこれに限定されるものではない、当技術分野で既知の他の方法を、本発明のペプチド合成に用いることができる。
本明細書に記載されているアミノ酸残基は、「L」異性体形態であるのが好ましい。しかし、ペプチドが望ましい機能的特性を保持する限り、「D」異性体形態の残基を任意のL−アミノ酸残基で置換できる。
融合ペプチドが必要とされる配列を含み、本明細書に記載されるような本発明のペプチドとして機能できる限り、融合ペプチドは本発明のペプチドのアミノ酸配列と同一である必要はないことを理解されたい。
本発明は、ペプチドがT細胞活性化を阻害できる限り、本発明のFPを含む任意の類似体、誘導体及びコンジュゲートを含む。したがって、本発明は非自然アミノ酸誘導体又は非タンパク質側鎖を含むペプチドを含む。
用語「類似体」は、1つ又は複数の残基が機能的に同等の残基で保存的に置換され、本明細書に記載されるような能力を示す、特にここに示された配列の1つに実質的に同一であるアミノ酸配列を有する任意のペプチドを含む。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニンなどの1つの非極性(疎水性の)残基の他の残基への置換、アルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間などの1つの極性(親水性の)残基の他の残基への置換、リジン、アルギニン若しくはヒスチジンなどの1つの塩基性残基の他の残基への置換、又はたとえばアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などの1つの酸性残基の他の残基への置換を含む。
「保存的置換」という語句は、このようなペプチドが、本明細書で特定されているT細胞に対して要求される阻害的機能を発揮するならば、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化した残基の使用も含む。
誘導体という用語は、側鎖又は官能基の反応により化学的に誘導体化した、1つ若しくは複数の残基を有する本発明のペプチドの任意の化学的誘導体を含む。このような誘導体化分子として、たとえば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、p−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成した分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、メチルエステル及びエチルエステル、又は他のタイプのエステル若しくはヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されてO−アシル誘導体又はO−アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、N−im−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。また化学的誘導体としては、20種類の標準的なアミノ酸残基の1つ若しくは複数の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドが含まれる。たとえば、4−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換してもよく、5−ヒドロキシリシンでリジンを置換してもよく、3−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換してもよく、ホモセリンでセリンを置換してもよく、オルニチンでリジンを置換してもよい。
さらに、末端−NH2アシル化、アセチル化又はチオグリコール酸アミド化を含むが、これに限定されるものではない化学的改変により、たとえばアンモニア、メチルアミンなどによる末端カルボキシルアミド化により、ペプチド誘導体は本発明のペプチドの天然配列と異なっていてもよい。ペプチドは直鎖状、環状又は分枝状その他であってもよく、当該技術分野で周知の方法を用いて配座を達成できる。
したがって、たとえば式(I)でX1及びX2により示される「保護基」は、エキソペプチダーゼによる消化に対して生化学的な安定性と耐性を与えるために、ペプチド化学の技術分野において通常用いられる化学基である。適当なN末端ブロック基には、たとえば、アセチルなどのCi−5アルカノイル基が含まれ、他の例示的な保護基としては、限定されないが、t−ブチルオキシカルボニル、メチル、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル(suberyl)、アジピルアゼライル(adipyl azelayl)、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアセライル(methoxyaselayl)、メトキシアジピル、メトキシスベリル(methoxysuberyl)、及び2,3−ジニトロフェニル基が挙げられる。またアミノ機能を欠くアミノ酸類似体も、N末端ブロック基として適している。適切なC末端ブロック基には、C末端カルボキシルの炭素原子においてケトン若しくはアミドを形成する基、又は該カルボキシルの酸素原子においてエステルを形成する基が含まれる。ケトン及びエステルを形成する基は、アルキル基、特に分枝状又は非分枝状のCi−5アルキル基、たとえばメチル、エチル及びプロピル基が含まれ、アミド形成基には、アミノ官能基、たとえば第一級アミン、又はアルキルアミノ官能基、たとえばモノCi−5アルキルアミノ及びジCi−5アルキルアミノ基、たとえばメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノなどが含まれる。他の例示的な保護基としては、限定されないが、C3−8シクロアルキル基、たとえばシクロペンチル、シクロヘキシル、C6〜I2アリール基、たとえばフェニル及びα−ナフチル、フェニル−Ci−2アルキル基、たとえばベンジル、フェネチル又はC7−i4アラルキル基、Ci−2アルキル基、たとえばαナフチルメチル基、並びにさらに経口用の生物利用可能なエステルとして一般に用いられるピバロイルオキシメチル基が挙げられる。また、たとえばアグマチンなどの脱カルボキシル化アミノ酸類似体も、本化合物のC末端を保護するのに適している。
本発明のペプチドは、要求される阻害活性が維持される限り、本発明の融合ペプチドの配列に比べて、残基の1つ若しくは複数の付加及び/又は欠失を有する任意のペプチドも含む。
本発明のペプチドが、担体に都合良く結合することができる「リンカー」を提供するために、アミノ酸残基の付加を本発明のペプチドのどちらの末端に実施してもよい。このようなリンカーは、通常は少なくとも1つのアミノ酸残基であり、40又はそれ以上の残基、より一般的には1〜10残基であってもよい。結合に用いる代表的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸等である。
本発明のペプチドを、別のタンパク質又はポリペプチドに結合させるか又はコンジュゲートさせてコンジュゲートを産生できる。このようなコンジュゲートは、単独で用いられたペプチドに比べ利点を有する。たとえば本発明のペプチドを、T細胞媒介病態に関与する抗原に結合できる。理論又は作用機序に束縛されることを望むものではないが、このようなコンジュゲートによるワクチン接種で、結合抗原に対するT細胞の活性化が低下することもあり、それにより前記疾患の標的抗原に対し免疫寛容を生じる免疫応答を誘導する。ペプチドは、二重リガンドペプチドとして合成されたアミド結合を介して直接的に結合することができるか、又は本発明が関係する本技術分野でよく知られているように、リンカー部分を用いて結合することができる。
別の実施形態では、本発明は、本発明の単離した融合ペプチドの治療有効量及び薬剤学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
本発明の実施において有用な医薬組成物は、典型的には薬剤学的に許容し得る中和した塩の形態で、医薬組成物に処方された本発明のペプチドを含んでいる。薬剤学的に許容し得る塩は、酸付加塩(ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される)を含み、たとえば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸で形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸などのような有機酸で形成される。
本発明のペプチドと塩を形成できる適切な塩基としては、無機塩基、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど、並びに有機塩基、たとえばモノ、ジ及びトリアルキル及びアリールアミン(たとえばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど)、並びに任意に置換されたエタノールアミン(たとえばエタノールアミン、ジエタノールアミンなど)を含むが、これに限定されるものではない。
活性成分としてペプチド又はポリペプチドを含む医薬組成物の調製は、当技術分野で周知である。典型的にはこのような組成物は、注射し得るように溶液又は懸濁液として調製されるが、注射前に懸濁又は可溶化できる固体形態としても調製できる。調製物はまた、乳化することができる。活性な治療的成分を、薬剤学的に許容し得る活性成分と適合性の無機及び/又は有機担体と混合する。担体は適切な粘稠性を与えるか又は組成物に形成するために、医薬組成物に添加される場合に、多少の不活性物質を含む薬剤学的に許容し得る賦形剤(ビヒクル)である。適切な担体としては、たとえば水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せである。さらに必要に応じて、組成物は少量の補助物質、たとえば活性成分の有効性を増強する湿潤剤又は乳化剤及びpH緩衝剤などを含むことができる。
(治療的な使用)
一態様において、本発明は、T細胞媒介病態の予防又は治療に有効な、gp41融合ペプチド領域(FP)を含む医薬組成物の使用を提供する。
一態様において、本発明は、T細胞媒介病態の予防又は治療に有効な、gp41融合ペプチド領域(FP)を含む医薬組成物の使用を提供する。
本発明の一態様は、自己免疫性疾患を治療する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチド又はその活性フラグメントを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、HIVはHIV−Iである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はそれらのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態では、融合ペプチドは、D及びLアミノ酸の両方を含む。配列番号1、2及び6〜414として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
本発明の他の態様は、自己免疫性疾患を治療する方法であり、この方法は、式(I)に記載の、T細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態では、ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。
本発明の他の態様では、自己免疫性疾患の症状を予防する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、HIVはHIV−Iである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態では、融合ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。配列番号1、2及び6〜414として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
本発明の他の態様は、自己免疫性疾患の症状を予防する方法であり、この方法は、式(I)に記載の、T細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態では、ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。
本発明の一態様は、T細胞媒介炎症性疾患を治療する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、HIVはHIV−Iである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態では、融合ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。配列番号1、2及び6〜414として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
本発明の他の態様は、T細胞媒介炎症性疾患を治療する方法であり、この方法は、式(I)に記載の、T細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態において、ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。
本発明の他の態様は、T細胞媒介炎症性疾患の症状を予防する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、HIVはHIV−1である。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態において、融合ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。配列番号1、2及び6〜414として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
本発明の他の態様は、T細胞媒介炎症性疾患の症状を予防する方法であり、この方法は、式(I)に記載の、T細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態において、ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。
本発明の一態様は、移植片拒絶反応又は移植片対宿主疾患の症状を治療又は予防する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、HIVはHIV−Iである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態において、融合ペプチドは、D及びLアミノ酸の両方を含む。配列番号1、2及び6〜414として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
本発明の他の態様は、移植片拒絶反応又は移植片対宿主疾患の症状を治療又は予防する方法であり、この方法は、式(I)に記載のT細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態において、ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。
本発明の一態様は、T細胞活性化を阻害する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、HIVはHIV−Iである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はそれらのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態において、融合ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。配列番号1、2及び6〜414として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
本発明の他の態様では、T細胞活性化を阻害する方法であり、この方法は、式(I)に記載の、T細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態において、ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。
他の態様では、本発明は、T細胞媒介病態の治療又は予防用の医薬組成物の調製のための本発明の融合ペプチドの使用に関する。一実施形態において、HIVはHIV−Iである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はそれらのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態において、融合ペプチドはD及びLアミノ酸の両方を含む。配列番号1、2及び6〜414として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
他の態様では、本発明は、T細胞媒介病態の治療又は予防用の医薬組成物の調製のための、式(I)に記載のT細胞活性化を阻害できるペプチドの使用に関する。
他の態様では、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、注入液、経口、鼻腔内、腹腔内、皮下、直腸、局所、又は滑液などの他部位を含む種々の方法により送達できる。しかし、経皮パッチを介する拡散によるような組成物の経皮的な送達も考慮される。経口摂取用に、当技術分野で知られているように、改善された経口生物学的利用能及び分解に対する増強した耐性を有するペプチド類似体又は特異的なペプチド製剤を調製することは可能である。
組成物は、投薬処方物に適合する様式で且つ治療有効量で投与される。投与する量は、治療する対象、活性成分を利用する対象の血液止血系の能力、及びT細胞活性化の阻害又は所望のT細胞媒介病態の程度に依存する。投与する必要のある活性成分の正確な量は、専門家の判断によって決まり、個体毎に特有である。
本発明のペプチドの治療有効量は、患者に投与されたとき、T細胞活性化を阻害できる量である。本発明のペプチドの活性を検出する分析法としては、T細胞抗原特異的な増殖阻害、IFN−γ及びIL−IOなどのサイトカインのT細胞抗原特異的分泌の阻害、並びに実施例で記載される限定はされないがアジュバント関節炎及びDTHを含むin vivoでの疾病モデルの阻害が挙げられる。しかし抗原特異的T細胞活性化の阻害を検出する他の方法は、当該分野で周知であり、本発明のペプチドの活性を評価するために用いることができる。好ましくは、本発明のペプチドの治療有効量は、in vitroの分析又はin vivoの分析で測定時にT細胞活性化を少なくとも10パーセント、より好ましくは少なくとも50パーセント、最も好ましくは少なくとも90パーセント減少させる(阻害する)量である。本明細書にさらに記載するように、医薬組成物は患者でT細胞媒介病態を阻害するのに有用であるのが好ましい。この実施形態で治療有効量とは、患者に投与したとき、T細胞媒介病態を阻害するのに十分な、好ましくは根絶するのに十分な量である。融合ペプチドの好ましい単回用量は、約5μg〜約50mg/kg(体重)であり、好ましくは約50μg〜約5mg/kg(体重)であり、より好ましくは約0.125mg〜約2mg/kg(体重)である。典型的には、医師が個々の患者に対して最も好適な実際の投与量を決定し、投与量は年齢、体重及び個々の患者の応答によって異なる。当然のことながら、個々の場合に、用量範囲が当然より高く又はより低くなるが、これらも本発明の範囲内である。本発明の融合ペプチドを、たとえば、上記のように1日又は1週の単回投与として投与することができる。
本発明による疾患の治療法は、単一の活性物質として又は治療の他の方法と組み合わせて本発明の医薬組成物の投与を含むことができる。本発明の治療法は、治療の他の方法に平行して、先行して又は続いてもよい。
本発明のいくつかの実施形態をより十分に例示するために、以下の実施例を示す。しかし、これらは発明の幅広い範囲を限定するものとして決して解釈すべきでない。
ペプチド合成。本研究で用いたペプチド(下記の表1に示す)は、前述したように、固相法を用いて合成した(Kligerら、1997、Merrifieldら、1982)。60分間、0.05%TFA中で、20〜60%アセトニトリルの直線勾配を用いてC4カラムの逆相HPLCで、合成ペプチドを精製した(>98%均質性)。ペプチドの組成を確かめるために、ペプチドをアミノ酸分析及び質量分析に供した。特に記載しない限り、濃縮したペプチドのストック溶液は、DMSO中に保持して使用前のペプチドの凝集を避けた。各試験でのDMSOの最終濃度(5%v/v)は、研究中のシステムに影響しなかった。
ペプチドの蛍光標識。樹脂に結合したペプチドを、4−クロロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾールフルオライド(NBD−F)又は5−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル(5−TAMRA)、SE(ローダミン−SE)でそれぞれ処理した。NBD−Fとローダミン−SE蛍光プローブは、Molecular Probesから購入した(City、State、Country)。すでに記載しているように、NBD−Fとの反応はDMF中で実施し、ローダミンとの反応は2%ジイソプロピルエチルアミンを含むDMF中で実施した(GerberとShai、2000)。蛍光プローブを、過剰の2つの当量中で用いて、樹脂に結合したN末端NBD又はローダミンペプチドの生成に導いた。1時間後、樹脂をDMFで十分に洗浄し、次いで塩化メチレンで十分に洗浄した。樹脂を窒素気流下で乾燥後、TFA 95%、H2O 2.5%及びトリエチルシラン 2.5%で3時間開裂した。蛍光標識ペプチドを、C4 Bio−Radセミプレパラティブカラム(250×10mm、孔部サイズ3OθA、粒径5μm)で、60分間、アセトニトリル/水(双方とも0.05%TFAを含む)の20%〜60%の勾配を用いて、RP−HPLC(逆相高性能液体クロマトグラフィー)により精製した。精製したペプチドは、分析用RP−HPLCにより、均質(>98%)であることが示された。
(細胞系、抗原及びアジュバント)。CD4+ T細胞クローンA2b 21は、M.チュバキュローシス(M.tuberculosis)(Mt)の65IcDa熱ショックタンパク質(HSP65)のエピトープ180〜188と反応し、このエピトープは本明細書で用いられるペプチドMtI 76〜90に含まれる(van Edenら、1988)。
Mt株H37Ra及び不完全フロイントアジュバント(IFA)は、Difcoから購入した(Detroit、MI、USA)。ツベルクリン精製タンパク誘導体(PPD)は、Statens血清研究所(Statens serum institute)(Copenhagen、Denmark)より提供された。精製した組換え型71kDa熱ショックタンパク質(HSP71)は、Ruurd van der Zee教授(感染症と免疫学研究所、獣医学部(Institute of InfectioUSDiseases and Immunology,Faculty of Veterinary Medicine)、Utrecht、The Netherlands)のご好意により提供された。PMA、イオノマイシン、オバルブミン(OVA)及びコンカナバリンA(Con A)は、Sigma(Rehovot、Israel)から購入した。
(細胞膜分子とペプチドの共存)。A2b細胞を4%パラホルムアルデヒドで、氷上で15分間固定し、PBSで洗浄した。次いで細胞を室温で、2%BSA(PBS中)で処理して非特異的な結合を阻止した。30分後に、細胞を50,000細胞/100μlを含むアリコートに分け、αTCR−FITCか又はαCD4−FITCを(1:100で)、2時間の間添加した。ローダミン標識FP又はV2Eペプチドを最終濃度0.5〜1μMで、インキュベーションの最後の5分間に添加した。次いで細胞をPBSで洗浄し、ガラススライド上に置いた。標識化した細胞試料を、蛍光共焦点顕微鏡下で観察した。FITC励起は、フルオロフォアの褪色を最小限に抑えるために、20%パワーのレーザー設定で、488nmに設定した。蛍光は505〜525nmから記録した。ローダミン励起は、5%パワーのレーザー設定で543nmに設定した。蛍光データは560nm及びこれ以上から収集した。
FITC(ドナー標識)とローダミン(アクセプター標識)間の蛍光エネルギー移動(FRET)は、ローダミンプローブが褪色した箇所でのFITC蛍光の増加により検出した。543nmで、6秒間、100%までのレーザー設定で、褪色はポイント励起によって達成した。FITC蛍光の増加が自己蛍光によるものではないことを確認するために、褪色は最初に488nmレーザーを用い、その後に543nmでのみ行った。505〜525nmか又は560nm以上では、シグナルは認められず、自己蛍光の可能性はなくなった。
(T細胞増殖)。T細胞増殖の分析は、MtI 76〜90ペプチドと反応するリンパ節細胞(LNC)か又はA2b T細胞系を用いて実施した。PPD及びMU76〜90に対する強いT細胞応答が検出可能である、不完全フロイントアジュバント(IFA)中でMtを注射後の26日目に、膝窩部及び鼠蹊部LNCを摘出した(Quintanaら、2002)。2×105細胞/ウェルの濃度でLNCを培養し、前述したように調製した照射した5×105胸腺抗原提示細胞(APC)/ウェルの存在下で、5×104 A2b T細胞を刺激した(van Edenら、1985)。抗原と共に、又は抗原なしで、さまざまな濃度の研究中のペプチドの存在下で、200μlの丸底マイクロタイタープレート(Costar Corp.、Cambridge、USA)に、細胞を4組反復して播種した。いくつかの実験のために、記述のように固定化した抗CD3抗体又はPMA/イオノマイシンで、細胞を活性化した(Wangら、2002)。培養を7.5%CO2の加湿雰囲気下、37℃で72時間インキュベートした。T細胞応答は、インキュベーションの最後の18時間に添加した[メチル−3H]−チミジン(Amersham、Buckinghamshire、UK;1μCi/ウェル)の取り込みにより検出した。T細胞増殖実験の結果は、HIV又は対照ペプチドの不在下で、抗原により誘発されるT細胞増殖阻害の%として示される。
(サイトカインの分析)。記述のように、刺激から72時間後、上清を採取し、ラットIL−10及びIFNγは、PharmingenOPTEIAキット(Pharmingen、San Diego、USA)を用いる酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により定量化した(Quintanaら、2002)。必要な場合、サイトカイン濃度は、ペプチドが存在しない場合のサイトカイン濃度に対するサイトカイン阻害の百分率として表す。その他の場合は、サイトカインはpg/mlで示す。本特許に記載した実験の検出の下限は、IL−10及びIFNγに関して15pg/mlであった。サイトカイン量は、標準物質として組換え型のサイトカインを用いて作成した検量線に基づいて算定した。
(動物)。ワイツマン科学研究所(Weizmann Institute of Science)の動物飼育センターで無菌状態下で飼育し維持した、生後3カ月の雌ルイスラットを我々の実験に用いた。実験は、動物の権利保護委員会(Animal Welfare Committee)の監督と指針に従って実施した。
(アジュバント関節炎(AA)の誘導及び評価)。in vivoでのT細胞活性化に及ぼすFPの効果を試験するために、AAをモデルシステムとして用いた。IFA中に懸濁したMt(0.5mg/ml)の50μlを、尾の付け根に注射してAAを誘導した。AA誘導時に、さらに各ラットに100μgのFP若しくは対照ペプチド、又は50μlのIFAに溶解し、AAを誘導するために用いたMt/IFAと混合したPBSを投与した。AA誘導日を0日として示した。重症度は、各動物で全4肢を直接観察して評価した。関節の炎症、赤み及び変形の程度に基づき、0と4の間の相対的なスコアを各肢に割り当て、したがって個々の動物に対する最大の可能なスコアは16であった(Quintanaら、2002)。平均AAスコア(±SEM)は、各実験群に対して示している。関節炎も、ノギスで後肢直径を測定して数量化した。測定は、AA誘導日及び26日後(AAのピーク時に)に行い、結果は各群の全ての動物の2つの値間の差の平均±SEMとして示す。疾患をスコアした人は、群の素性を知らされていなかった。
(遅延型過敏(DTH))。AA誘導後16日目に、20μlのPPD(PBS中、0.5mg/ml)を、右耳の耳介に皮内注射し、20μl滅菌PBSを対照として左耳に注射した。耳の厚さを、ノギスを用いて48時間後に測定し、右と左の耳間の差として示した。
(実施例1:FPはISに、CD4及びTCRと共存する)
活性化したT細胞膜上のFPの分布を、ローダミン(FP−Rho)と結合したFP又はNBD(FP−NBD)を用いて調べた。一様にT細胞膜を標識するのではなく、FP−Rho(図2A)及びFP−NBDの両方をそれ自体、特定の細胞膜領域に挿入した。濃縮された分布を、対照の細胞膜上で均一な分布を示す細胞膜活性な両親媒性ペプチド(AMP−Rho)と比較した(図2A)。
活性化したT細胞膜上のFPの分布を、ローダミン(FP−Rho)と結合したFP又はNBD(FP−NBD)を用いて調べた。一様にT細胞膜を標識するのではなく、FP−Rho(図2A)及びFP−NBDの両方をそれ自体、特定の細胞膜領域に挿入した。濃縮された分布を、対照の細胞膜上で均一な分布を示す細胞膜活性な両親媒性ペプチド(AMP−Rho)と比較した(図2A)。
CD4+ T細胞の細胞膜上で、IS領域は、種々の成分中、TCR、CD3及びCD4分子により標識される(HuppaとDavis、2003)。図2Bは、IS細胞膜領域でのCD4及びTCR分子の局在化を示す。FPコンジュゲートは、CD4及びTCR分子と共存したことに留意すべきである(図2B)。FP−Rho(図2B)及びFP−NBDは同じ共存を示し、したがってISに対する分布は、特定のフルオロフォアに限られていなかった。さらにローダミン標識したFP突然変異体のV2E(V2E−Rho)は、CD4及びTCRと同様な共存を示した(図2C)。
FP及びそのV2E突然変異体の共存が、蛍光エネルギー移動(FRET)により、TCR及びCD4レセプターを用いて確かめられた(図2D)。543nmレーザーを用いて、細胞膜の1箇所を褪色させ、それによりその特定の箇所でFP−Rho又はV2E−Rhoコンジュゲートの蛍光を減少させた。標識した褪色したFP(アクセプター)とTCR−特異的FITC−結合抗体(ドナー)との間のFRETに起因する、標識したTCRの蛍光の有意な増加が観察された。平均R0は、FITC/Rho対に対して50A未満であり(Heideckerら、1995)、したがってFRET(図2D)の検出は、細胞膜中でドナーとアクセプター分子の距離は50A未満であることを示唆する。FPは、T細胞膜に結合し、ISでCD4及びTCR分子と優先的に接近して共存することをこれらの結果は示唆する。
(実施例2:FPはin vitroでT細胞活性化を妨げる)
FPのISへの挿入がT細胞活性化を妨げるかどうか決定するために、Mt抗原PPD又はMtI 76〜90ペプチドに対する、Mtで免疫したラットLNCのT細胞応答を調べた。これらの抗原は、AAラットの排出LNCで強い増殖応答及びT細胞からのサイトカイン放出を誘導することが知られている(Quintanaら、2003;Quintanaら、2002)。
FPのISへの挿入がT細胞活性化を妨げるかどうか決定するために、Mt抗原PPD又はMtI 76〜90ペプチドに対する、Mtで免疫したラットLNCのT細胞応答を調べた。これらの抗原は、AAラットの排出LNCで強い増殖応答及びT細胞からのサイトカイン放出を誘導することが知られている(Quintanaら、2003;Quintanaら、2002)。
図3A及び3Bは、用量依存的な様式で、FP及びV2E突然変異体ペプチドが、PPD及びMtI 76〜90に対するT細胞増殖応答を阻害したことを示す。さらにV2Eの阻害効果は、FPの阻害効果より低く、阻害は配列特異的であり、重要な分子的相互作用がV2EでVからEへの置換により乱されたことを示唆している(表vを参照)。FPペプチド及びある程度ではあるがV2Eも、PPD又はMU76〜90ペプチドによる刺激により誘発されるIFNy及びIL−10の分泌を用量依存的な様式で阻害した(図3C〜F)。FP、V2E又は対照ペプチドp277と共に培養した細胞が、培養で同じ生存を示したので、抗原に誘発される増殖及びサイトカイン放出に及ぼすFP及びV2Eペプチドの阻害効果は、細胞死によるものではなかった。
(実施例3:FPは、APCでなくT細胞に作用する)
MtI 76〜90ペプチドによる刺激に応じて増殖して、IFNγを分泌するラットCD4+ T細胞クローン、A2bを用いて、T細胞活性化に及ぼすFPの阻害効果をさらに研究した(Quintanaら、2003;Quintanaら、2002)。FPの存在下でMtI 76〜90によるA2bの活性化は、細胞増殖の減少(図4)及びIFNγの放出減少を招いた。
MtI 76〜90ペプチドによる刺激に応じて増殖して、IFNγを分泌するラットCD4+ T細胞クローン、A2bを用いて、T細胞活性化に及ぼすFPの阻害効果をさらに研究した(Quintanaら、2003;Quintanaら、2002)。FPの存在下でMtI 76〜90によるA2bの活性化は、細胞増殖の減少(図4)及びIFNγの放出減少を招いた。
T細胞活性化の阻害で、FPの標的になる細胞を明確にするために、MtI 76〜90ペプチドと細胞を混合する前に、A2b T細胞又はAPCを、FPと共に別々に前培養した。APCの前培養は、A2b増殖には何の効果も示さなかった(図4)。しかし、対照ペプチドp277でなく、FPとのA2b T細胞の前培養は、T細胞増殖の有意な阻害を招いた(図4)。したがって、FPはAPCよりは、むしろ直接的にT細胞に作用することによりT細胞活性化を阻害する。
(実施例4:FPは、PMA/イオノマイシン又はCD3に対する抗体により誘導されるT細胞活性化を阻害しない)
特異的抗原のAPC提示により誘導されるT細胞活性化以外のT細胞活性化も、FPが阻害できるかどうかを知るために、PMA/イオノマイシンにより誘導されるT細胞活性化に及ぼすFPの効果(白い棒グラフは、0.5mg/mlのイオノマイシン投与を受けた細胞を示し、黒い棒グラフは、1mg/mlのイオノマイシン投与を受けた細胞を示す)又はCD3に対する分裂促進的モノクロナール抗体を試験した。PMA/イオノマイシン(図5A)によるか又は分裂促進的抗CD3(図5B)によるA2b T細胞の活性化を、FPは阻害しなかった。これらの知見は、APCで提示されたMHC−ペプチド複合体の認識により誘導されるT細胞活性化を、FPが特異的に阻害することを示す。
特異的抗原のAPC提示により誘導されるT細胞活性化以外のT細胞活性化も、FPが阻害できるかどうかを知るために、PMA/イオノマイシンにより誘導されるT細胞活性化に及ぼすFPの効果(白い棒グラフは、0.5mg/mlのイオノマイシン投与を受けた細胞を示し、黒い棒グラフは、1mg/mlのイオノマイシン投与を受けた細胞を示す)又はCD3に対する分裂促進的モノクロナール抗体を試験した。PMA/イオノマイシン(図5A)によるか又は分裂促進的抗CD3(図5B)によるA2b T細胞の活性化を、FPは阻害しなかった。これらの知見は、APCで提示されたMHC−ペプチド複合体の認識により誘導されるT細胞活性化を、FPが特異的に阻害することを示す。
(実施例5;FPは、in vivoでT細胞免疫を阻害する)
in vivoで特異的T細胞の活性化に及ぼすFPの阻害効果の試験として、AAに及ぼすFPの効果を調べた。自己抗原と交差反応性Mt−特異的T細胞によってもたらされる実験的自己免疫性疾患であるAAを、オイル中のMtによるルイスラットの免疫で誘発する(Holoshitzら、1984;Holoshitzら、1983)。MU76−90特異的T細胞は、AAの誘導に応じて検出可能であり(Andertonら、1994)、実際にA2b T細胞クローンは軟骨で交差反応してAAを媒介する(van Edenら、1985)。感作されたLNCのT細胞応答並びにin vitroでPPD及びMt176〜90に対するクローンA2bのT細胞応答を、FPが阻害したので(図3及び4)、in vivoでのAAを誘発するT細胞の活性化に及ぼすFPの効果を調べた。AA誘導の時点で抗原と共に投与したFPは、臨床スコア(図6A)及びくるぶし腫脹(図6B)の両方に関して、ごく軽度な関節炎を招いた。対照ペプチドp277又はV2Eは、AAを阻害しなかった。平均最大のスコアは、FP処理ラットの7.3±0.7に比べ、対照処理ラットで13.7±0.3であった(対照群と比較した両試験群に関し、p<0.05)。
in vivoで特異的T細胞の活性化に及ぼすFPの阻害効果の試験として、AAに及ぼすFPの効果を調べた。自己抗原と交差反応性Mt−特異的T細胞によってもたらされる実験的自己免疫性疾患であるAAを、オイル中のMtによるルイスラットの免疫で誘発する(Holoshitzら、1984;Holoshitzら、1983)。MU76−90特異的T細胞は、AAの誘導に応じて検出可能であり(Andertonら、1994)、実際にA2b T細胞クローンは軟骨で交差反応してAAを媒介する(van Edenら、1985)。感作されたLNCのT細胞応答並びにin vitroでPPD及びMt176〜90に対するクローンA2bのT細胞応答を、FPが阻害したので(図3及び4)、in vivoでのAAを誘発するT細胞の活性化に及ぼすFPの効果を調べた。AA誘導の時点で抗原と共に投与したFPは、臨床スコア(図6A)及びくるぶし腫脹(図6B)の両方に関して、ごく軽度な関節炎を招いた。対照ペプチドp277又はV2Eは、AAを阻害しなかった。平均最大のスコアは、FP処理ラットの7.3±0.7に比べ、対照処理ラットで13.7±0.3であった(対照群と比較した両試験群に関し、p<0.05)。
AAを媒介するT細胞の活性は、PPDに対する遅延型過敏(DTH)応答を調べることにより、in vivoでも検出できる(van Edenら、1985)。ペプチドFP、V2E又はp277で処理したラットで、AA誘導後16日目のPPDに対するDTH応答を調べた。図6Cは、FPの投与は、PPDに対するDTH応答の35%減少を招くが、V2E又はp277ペプチド処理により生じる阻害は、それぞれ25%及び10%であったことを示す。
AAを誘発するT細胞は、ThI表現型を表し、HSP71又はMtI 76〜90などのMt抗原による活性化に応じて比較的大量のIFNγを分泌する(Quintanaら、2003;Quintanaら、2002)。対照的に種々の処理によるAAの制御は、通常減少したThI応答を伴う(Quintanaら、2003;Quintanaら、2002、Tanakaら、1999)。FPで処理したラット由来のLNC(黒い棒グラフ)は、ミコバクテリア(Mycobacterial)抗原HSP71又はMtI 76−90(MtI 80とも呼ばれる)による刺激に応じてIFNγ分泌の減少を示したが、V2E(灰色の棒グラフ)又はp277(白い棒グラフ)による処理では、IFNγ分泌にわずかに影響を及ぼしただけであった(図6D)ことに留意すべきである。
総合すればこれらの結果は、FPはin vivoで特異的抗原により誘導されるT細胞活性化を阻害できることを示す。この干渉は、より軽度のAA(図6A及び6B)、減少したDTH反応性(図6C)及びMt抗原に応答するより減少したIFNγ分泌(図6D)に導いた。
(実施例6;FPは、in vivoでFPに対するT細胞性免疫を阻害する。)
ラットにMt及びIFAの存在下で、FP、対照ペプチド(V2E若しくはIFFA)又はPBSを注射した。26日後にLNCを採取し、FP、V2E、IFFA又はPBSのそれぞれとex vivoで培養し、LNCのIFN−γ分泌レベルを測定した。図8から理解できるように、LNCのIFN−γ分泌レベルが非活性化LNC(PBSと共に培養した)の分泌のレベルと適合したので、FPを注射したラット由来のLNCは、ex vivoでFPにより活性化することができなかった。これらの結果は、FPの低い免疫原性を示す。しかし、V2Eを注射したラット由来のLNCは、V2Eで中程度のex vivoでの活性化(FPの活性化より約5倍高い)を示し、4個のD−アミノ酸残基が取り込まれたFPのジアステレオ異性誘導体(配列番号6)であるIFFAペプチドを注射したラット由来のLNCは、ex vivoでIFFAに高い反応性(FPより約10倍)を有した。したがって、FPの免疫抑制効果は、配列及び構造に特異的である。FP、V2E及びIFFAの16個のN末端のアミノ酸に対応するペプチドを用いて実験を繰り返したとき、同様の結果が得られた(データは示さず)。
ラットにMt及びIFAの存在下で、FP、対照ペプチド(V2E若しくはIFFA)又はPBSを注射した。26日後にLNCを採取し、FP、V2E、IFFA又はPBSのそれぞれとex vivoで培養し、LNCのIFN−γ分泌レベルを測定した。図8から理解できるように、LNCのIFN−γ分泌レベルが非活性化LNC(PBSと共に培養した)の分泌のレベルと適合したので、FPを注射したラット由来のLNCは、ex vivoでFPにより活性化することができなかった。これらの結果は、FPの低い免疫原性を示す。しかし、V2Eを注射したラット由来のLNCは、V2Eで中程度のex vivoでの活性化(FPの活性化より約5倍高い)を示し、4個のD−アミノ酸残基が取り込まれたFPのジアステレオ異性誘導体(配列番号6)であるIFFAペプチドを注射したラット由来のLNCは、ex vivoでIFFAに高い反応性(FPより約10倍)を有した。したがって、FPの免疫抑制効果は、配列及び構造に特異的である。FP、V2E及びIFFAの16個のN末端のアミノ酸に対応するペプチドを用いて実験を繰り返したとき、同様の結果が得られた(データは示さず)。
本明細書でIFFAペプチドの免疫原性を実質的に増加させることが示されたIFFAペプチド中へのDアミノ酸の取り込みは、gp41媒介膜融合を阻害するIFFAペプチドの能力に影響を及ぼさない(Gerberら、2004)。したがって、初めて本明細書において開示されたFPの免疫抑制能力は、単なるFPの既知の融合性能力の反映ではなく、ペプチドに存在する新規に同定された機能である。
(実施例7:FP由来のフラグメント及びジアステレオ異性ペプチドは、in vitroでT細胞活性化を阻害する。)
抗原特異的T細胞増殖に及ぼす、FP由来のペプチドFP5−I3、FPi−8、FP5−i3A6及びIFFA(表1を参照)の効果を調べた。T細胞増殖分析は、上記のように不完全フロイントアジュバント(IFA)中でMtを注射後、26日目に摘出した膝窩部及び鼠蹊リンパ節細胞(LNC)を用いて実施した。いくつかの実験では、マウスLNCを、研究下の種々の濃度のペプチドの存在下で、MOG 35〜55ペプチド抗原と共に、又は無しで培養した(0.5μg/ml(図8A)、0.25μg/ml(図8B〜C))。他の実験では、研究下の種々の濃度のペプチドの存在下で、ラットLNCをPPD抗原と共に、又は無しで培養した(25μg/ml、図8D)。T細胞増殖実験の結果は、HIV又は対照ペプチドの不在下で抗原により誘発されたT細胞増殖阻害の%として示される。
抗原特異的T細胞増殖に及ぼす、FP由来のペプチドFP5−I3、FPi−8、FP5−i3A6及びIFFA(表1を参照)の効果を調べた。T細胞増殖分析は、上記のように不完全フロイントアジュバント(IFA)中でMtを注射後、26日目に摘出した膝窩部及び鼠蹊リンパ節細胞(LNC)を用いて実施した。いくつかの実験では、マウスLNCを、研究下の種々の濃度のペプチドの存在下で、MOG 35〜55ペプチド抗原と共に、又は無しで培養した(0.5μg/ml(図8A)、0.25μg/ml(図8B〜C))。他の実験では、研究下の種々の濃度のペプチドの存在下で、ラットLNCをPPD抗原と共に、又は無しで培養した(25μg/ml、図8D)。T細胞増殖実験の結果は、HIV又は対照ペプチドの不在下で抗原により誘発されたT細胞増殖阻害の%として示される。
図8から理解できるように、検討した全てのペプチドは、用量に依存する様式でT細胞増殖を阻害し、アミノ酸5〜13に対応するフラグメント及びそのジアステレオ異性ペプチドは、FPのアミノ酸1〜8に対応するフラグメントよりもはるかに強くT細胞増殖を阻害した。
(実施例8:FP由来のジアステレオ異性ペプチドは、in vivoでT細胞免疫を阻害する。)
ペプチド由来のジアステレオ異性FPがin vivoでT細胞活性化に及ぼす効果をさらに検討するために、AA及びDTHモデルを使用した。
ペプチド由来のジアステレオ異性FPがin vivoでT細胞活性化に及ぼす効果をさらに検討するために、AA及びDTHモデルを使用した。
上記のように、AAをラットで誘導した。すなわちAA誘導時に、各ラットに50μlのIFA中に溶解し、AAを誘導するために用いたMt/IFAと混合したIFFA 100μg又はPBSも投与した。重症度は上記のように評価した。
図10から理解できるように、IFFAの投与により、AA臨床スコアで決定される軽度の関節炎を生じた。
他の実験では、FP及びIFFAの存在下でオキサゾロンに対するDTH応答を測定した。雌Balb/cマウス(群当たり5匹)を、剃った腹部の皮膚に対して、アセトン/オリーブ油(4:1 容量/容量)に溶解した2%オキサゾロンの100マイクロリットルを局所的に塗布して感作し、5日後にアセトン/オリーブ油中の0.5%オキサゾロンの20マイクロリットルに曝露し、10マイクロリットルを耳の両側に投与した。刺激の1時間後、FP、IFFA(40μl DMSO中100μg)又はDMSOを耳の両側に投与した。耳の一定の領域を、曝露の直前及び曝露後24時間目に測定した。
図11から理解できるように、FP及びIFFAは両方とも、DTH反応を阻害した。
特定の実施形態の前述の説明は、全般的な本発明の特質を十分に明らかにするので、現在の知識を適用することにより、他のものは各種の応用のために、過度の実験を行わずに且つ一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態に関して容易に改変及び/又は適応することができる。したがって、そのような適応形態及び改変形態は、開示された実施形態と同等の意味及び範囲内に包括されると意図されるべきである。本発明をこれらの特定の実施形態と関連させて記載したが、多くの代替形態、改変形態及び変更形態は当業者に明らかであろうことは明白である。したがって、このような代替形態、改変形態及び変更形態は、全て本特許請求の範囲内に包含されるものと理解しなければならない。
Claims (36)
- 不適切又は有害なT細胞応答に関連する疾患又は障害の症状を治療又は予防する方法であって、HIV gp41融合ペプチド領域由来の単離したペプチド又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む方法。
- HIVがHIV−1である請求項1に記載の方法。
- 融合ペプチドが、配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する請求項1に記載の方法。
- 融合ペプチドが、アミノ酸配列AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL(配列番号1)を有する請求項1に記載の方法。
- 融合ペプチドが、アミノ酸配列AEGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL(配列番号2)を有する請求項1に記載の方法。
- 融合ペプチドが、アミノ酸配列AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLを有し、位置3、6、9及び11の下線を付したアミノ酸残基が「D」異性体立体配置(配列番号6)である請求項1に記載の方法。
- 融合ペプチドが、アミノ酸配列AVGIGALF(配列番号406)を有する請求項1に記載の方法。
- 融合ペプチドが、アミノ酸配列GALFLGFLG(配列番号407)を有する請求項1に記載の方法。
- 融合ペプチドが、アミノ酸配列GALFLGFLGを有し、位置2の下線を付したアミノ酸残基が、「D」異性体立体配置(配列番号408)である請求項1に記載の方法。
- 融合ペプチドが、GAVFLGFLG(配列番号409)、GAMFLGFLG(配列番号410)、GAVLLGFLG(配列番号411)、GAFFLGFLG(配列番号412)、GAMIFGFLG(配列番号413)及びGALLFGFLG(配列番号414)からなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 融合ペプチドが、D及びLアミノ酸の両方を含む請求項1に記載の方法。
- T細胞病態が、自己免疫性疾患である請求項1に記載の方法。
- 自己免疫性疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、I型糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患(結腸クローン病若しくは潰瘍性大腸炎)及び自己免疫性肝炎からなる群から選択される請求項12に記載の方法。
- T細胞病態が、炎症性疾患である請求項8に記載の方法。
- T細胞病態が、移植片拒絶反応及び移植片対宿主疾患から選択される請求項8に記載の方法。
- 不適切又は有害なT細胞応答に関連する疾患又は障害の症状を治療又は予防する方法であって、式(I):
X1−AA1−AA2−AA3−AA4−AA5−AA6−AA7−AA8−AA9−X2(I)
を有する、T細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む方法であって、
[式中、
X1は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるN末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
AA1、AA2、AA6及びAA9は、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
AA3は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
AA4、AA5、AA7及びAA8は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、AA4、AA5、AA7及びAA8の任意の3つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、AA4、AA5、AA7及びAA8のアミノ酸残基の2つ以下が同一であり、
X2は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるC末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が、配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、L型又はD型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが30アミノ酸残基以下である]。 - 融合ペプチドが、D及びLアミノ酸の両方を含む請求項16に記載の方法。
- 前記ペプチドが、1つを超えるセリン残基は含まない請求項16に記載の方法。
- T細胞病態が、自己免疫性疾患である請求項16に記載の方法。
- 自己免疫性疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、I型糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患(結腸クローン病若しくは潰瘍性大腸炎)及び自己免疫性肝炎からなる群から選択される請求項19に記載の方法。
- T細胞病態が、炎症性疾患である請求項16に記載の方法。
- T細胞病態が、移植片拒絶反応及び移植片対宿主疾患から選択される請求項16に記載の方法。
- T細胞活性化を阻害する方法であって、HIV gp41融合ペプチド領域由来の単離したペプチド又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む方法。
- HIVがHIV−1である請求項23に記載の方法。
- 融合ペプチドが、配列番号1、2及び6〜414のいずれか1つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する請求項23に記載の方法。
- 融合ペプチドが、D及びLアミノ酸の両方を含む請求項23に記載の方法。
- T細胞活性化を阻害する方法であって、式(I):
XI−AA1−AA2−AA3−AA4−AA5−AA6−AA7−AA8−AA9−X2(I)
を有する、T細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む方法
[式中、
Xiは、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるN末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
AAi、AA2、AA6及びAA9は、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
AA3は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
AA4、AAs、AA7及びAA8は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、AA4、AA5、AA7及びAA8の任意の3つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、AA4、AA5、AA7及びAA8のアミノ酸残基の2つ以下が同一であり、
X2は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるC末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、L型又はD型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが30アミノ酸残基以下である]。 - 融合ペプチドが、D及びLアミノ酸の両方を含む請求項27に記載の方法。
- 前記ペプチドが、1つを超えるセリン残基は含まない請求項27に記載の方法。
- 式(I):
Xi−AA,−AA2−AA3−AA4−AA5−AA6−AA7−AA8−AA9−X2(I)
を有する、T細胞活性化を阻害できるペプチド
[式中、
X1は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるN末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
AAi、AA2、AA6及びAA9は、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
AA3は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
AA4、AA5、AA7及びAA8は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、AA4、AA5、AA7及びAA8の任意の3つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、AA4、AA5、AA7及びAA8のアミノ酸残基の2つ以下が同一であり、
X2は、アミノ酸配列の長さが約20アミノ酸残基以下であるC末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも50%が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、L型又はD型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが30アミノ酸残基以下である]。 - 1つを超えるセリン残基は含まない請求項30のペプチド。
- アミノ酸配列GALFLGFLG(配列番号407)を有する請求項30のペプチド。
- GAVFLGFLG(配列番号409)、GAMFLGFLG(配列番号410)、GAVLLGFLG(配列番号411)、GAFFLGFLG(配列番号412)、GAMIFGFLG(配列番号413)及びGALLFGFLG(配列番号414)からなる群から選択される請求項30のペプチド。
- 「L」及び「D」アミノ酸の両方を含む請求項30のペプチド。
- 位置2の下線を付したアミノ酸残基が、「D」異性体立体配置(配列番号408)である、アミノ酸配列GALFLGFLGを有する請求項34のペプチド。
- 請求項30のペプチド及び薬剤学的に許容し得る担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
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