CN109072219A - 肿瘤抗原肽 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供用于特异性检测肿瘤细胞的检测剂、被肿瘤细胞特异性地递呈的肿瘤抗原肽、含有该肿瘤抗原肽作为有效成分的可用于癌症的预防和/或治疗的医药组合物等。通过由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质的氨基酸序列中连续的8～14个氨基酸形成，具有HLA结合性的肿瘤抗原肽或其基序置换体，上述课题得到解决。

Description

肿瘤抗原肽
技术领域
本发明涉及利用肿瘤细胞中特异性表达的基因的用于检测肿瘤细胞的检测剂、可用作癌症的预防和/或治疗剂的来源于该基因的肿瘤抗原肽以及它们的应用。
背景技术
一直以来，外科疗法(手术)、放射线疗法和使用抗癌剂等的化学疗法被称为癌症的三大疗法。然而，这些治疗方法还有不少问题，例如根据病灶的位置和阶段可能难以完全除去病灶，或者存在很强的副作用。实际上，至今为止开发的抗癌剂中也有很多治疗效果不充分，或者伴有很强的副作用。
为了消除上述缺点，近年来有许多在异常细胞中针对特异性或过表达的特定靶点进行攻击的分子靶向治疗的研究。在此基础上，激活自身免疫系统来攻击肿瘤细胞的免疫疗法受到关注。然而，免疫疗法虽然因为激活自身的免疫而副作用少，但具有高治疗效果的疗法依然不多，还需要进一步的研究。
生物体对肿瘤细胞和病毒感染细胞等的排斥中，细胞免疫、特别是细胞毒性T细胞(CTL)起到重要的作用。例如肿瘤细胞排斥的情况下，CTL识别肿瘤细胞上的抗原肽(肿瘤抗原肽)与主要组织相容性复合物(MHC:Major Histocompatibility Complex)的复合物，对肿瘤细胞进行攻击和破坏。即，肿瘤抗原肽是通过肿瘤特有的蛋白质、即肿瘤抗原蛋白质在细胞内合成后由蛋白酶在细胞内分解而生成。另外，生成的肿瘤抗原肽在内质网内与MHCI类抗原(HLA I类抗原)结合而形成复合物，并被运送至细胞表面进行抗原递呈。肿瘤特异性CTL识别该涉及抗原递呈的复合物，通过细胞毒性作用和淋巴因子的产生而显示抗肿瘤效果。随着这一系列作用的揭示，不断地开发出通过将肿瘤抗原蛋白质或肿瘤抗原肽用作所谓的癌症免疫疗法制剂(癌症疫苗)来使癌症患者体内的癌症特异性CTL增强的治疗法。
肿瘤抗原肽是在肿瘤细胞中表达的蛋白质被片段化并递呈的肽。因此，癌症免疫疗法的开发中，重要的是寻找在肿瘤细胞中表达的蛋白质，特别是在正常细胞中未观察到表达而在肿瘤细胞中观察到表达的肿瘤抗原蛋白。
已知肿瘤细胞中表达数种正常组织中除睾丸以外未观察到表达的蛋白质，被称为“癌睾丸抗原(CT抗原)”。CT抗原主要只在睾丸表达，因此将其作为靶点的免疫疗法中正常细胞不会成为靶点，因此人们寻找着适合于癌症免疫疗法的靶点，目前为止SOX2、OR7C1、DNAJB8等蛋白质已作为癌睾丸抗原被报道。此外，提示癌睾丸抗原在被称为所谓的癌症干细胞/癌起始细胞(CSC/CIC)的具有高增殖能力的癌细胞有特别强的表达。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2010/050268号
专利文献2:国际公开第2012/164936号
发明的概要
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供用于特异性检测肿瘤细胞的检测剂、被肿瘤细胞特异性地递呈的肿瘤抗原肽、含有该肿瘤抗原肽作为有效成分的可用于癌症的预防和/或治疗的医药组合物等。
解决技术问题所采用的技术方案
在探索被肿瘤细胞特异性地抗原递呈的肽的过程中，即使肿瘤细胞特异性表达的蛋白质的序列中存在多个预测与HLA结合的表位区域，要鉴定该蛋白质的哪个部分可实际在体内与HLA结合而被抗原递呈至细胞表面并不容易。于是，本发明人为了解决所述课题，开发出直接鉴定实际被肿瘤细胞抗原递呈的肽(天然肽)的方法，鉴定了多种天然肽。并且，发现所述肽中的若干种是来源于在正常细胞中于睾丸以外的组织几乎无表达的蛋白质的肽，进一步继续认真研究，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下所示的发明。
[1]一种肿瘤抗原肽或其基序置换体，其中，该肽或其基序置换体由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质的氨基酸序列中连续的8～14个氨基酸形成，具有HLA结合性。
[2]如[1]的肿瘤抗原肽或其基序置换体，其中，HLA为HLA-A24。
[3]如[1]或[2]的肿瘤抗原肽，其中，该肽是自N末端起第2个氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽，或者该肽中自N末端起第2个氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽。
[4]如[1]～[3]的肿瘤抗原肽，其中，该肽以序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4或序列编号5表示。
[5]一种多条表位肽连结而成的多表位肽，其中，作为该表位肽，包含至少1条[1]～[4]的肿瘤抗原肽。
[6]一种多聚核苷酸，其中，该多聚核苷酸编码[1]～[4]的肿瘤抗原肽或[5]中记载的多表位肽中的至少1个。
[7]一种表达载体，其中，该表达载体包含[6]的多聚核苷酸。
[8]一种基因导入用组合物，其中，包含[7]的表达载体。
[9]一种抗原递呈细胞的制造方法，其中，包括使
(A)[1]～[4]的抗原肽或[5]的多表位肽、或者
(B)编码所述(A)的肽和/或多表位肽中的至少1个的多聚核苷酸
与具有抗原递呈能力的细胞在体外接触的工序。
[10]一种细胞毒性T细胞的诱导剂，其中，含有以下的(a)～(e)中的任一个作为有效成分：
(a)[1]～[4]的抗原肽或[5]的多表位肽；
(b)[1]的多聚核苷酸；
(c)[1]的表达载体；
(d)由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质、编码该蛋白质的多聚核苷酸或包含该多聚核苷酸的表达载体；
(e)将[1]～[4]的抗原肽作为抗原的抗原递呈细胞。
[11]一种细胞毒性T细胞的诱导方法，其中，包括使
(A)[1]～[4]的抗原肽或[5]的多表位肽、
(B)编码所述(A)的肽和/或多表位肽中的至少1个的多聚核苷酸、或者
(C)将[1]～[4]的抗原肽作为抗原的抗原递呈细胞
与外周血淋巴细胞在体外接触的工序。
[12]一种医药组合物，其中，包含以下的(a)～(e)中的任一个作为有效成分：
(a)[1]～[4]的抗原肽或[5]的多表位肽；
(b)[6]的多聚核苷酸；
(c)[7]的表达载体；
(d)选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的蛋白质、编码该蛋白质的多聚核苷酸或包含该多聚核苷酸的表达载体；
(e)特异性杀伤将[1]～[4]的抗原肽作为抗原的抗原递呈细胞的细胞毒性T细胞。
[13]如[12]的医药组合物，其中，包含[1]～[4]的抗原肽和/或[5]的多表位肽作为有效成分。
[14]如[12]或[13]的医药组合物，其中，还包含佐剂。
[15]如[12]～[14]的医药组合物，其中，该组合物是癌症的预防剂和/或治疗剂。
[16]如[12]～[15]的医药组合物，其中，该组合物是癌症的预防和/或治疗用疫苗。
[17]如[12]～[16]的医药组合物，其中，该组合物与免疫检查点抑制剂一起使用。
[18]一种HLA多聚体，其中，包含[1]～[4]的抗原肽和HLA。
[19]一种诊断药物，其中，包含[18]的HLA多聚体。
[20]一种T细胞受体样抗体，其中，该抗体识别[1]～[4]的抗原肽与HLA的复合物。
[38]一种肿瘤检测剂，其中，含有[20]的T细胞受体样抗体。
[22]一种嵌合抗原受体，其中，该受体识别[1]～[4]的抗原肽与HLA的复合物。
[23]一种人工CTL，其中，包含识别[1]～[4]的抗原肽与HLA的复合物的T细胞受体。
[24]一种双重特异性抗体，其中，该抗体特异性识别[1]～[4]的抗原肽与HLA的复合物以及淋巴细胞表面抗原。
[25]一种肿瘤细胞检测剂，其中，包含用于检测选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达产物的检测剂。
[26]如[25]的肿瘤细胞检测剂，其中，该检测剂用于在包含来源于选自肺、大肠、小肠、脑、心脏、胎盘、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、卵巢和血液的1种或2种以上的活体试样的细胞的细胞群中检测肿瘤细胞。
[27]如[25]或[26]的肿瘤细胞检测剂，其中，基因的表达产物为mRNA和/或内源性多肽。
[28]如[25]～[27]的肿瘤细胞检测剂，其中，基因的表达产物为mRNA，该检测剂包含具有与所述基因互补的碱基序列的探针和/或引物。
[29]如[25]～[28]的肿瘤细胞检测剂，其中，基因的表达产物为内源性多肽，该检测剂包含与该内源性多肽特异性反应的检测物质。
[30]如[29]的肿瘤细胞检测剂，其中，检测物质为抗体。
[31]一种用于筛选使用[12]～[17]的医药组合物的癌症处置方法有效的治疗对象患者的诊断药物，其中，包含[18]的HLA多聚体、[20]的T细胞受体样抗体和/或[25]～[30]的肿瘤细胞检测剂。
[32]针对选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的反义寡聚核苷酸。
[33]一种siRNA，其中，包含与选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因互补的反义区域以及与该反义区域至少部分互补的有义区域。
[34]一种医药组合物，其中，包含[32]的反义寡聚核苷酸和/或[33]的siRNA以及药学上可允许的载体。
[35]如[34]的医药组合物，其中，该组合物是癌症的预防剂和/或治疗剂。
发明的效果
通过本发明，能提供可用作对肿瘤细胞特异性攻击的CTL的诱导剂的肿瘤抗原肽、和含有该肿瘤抗原肽作为有效成分的可用于癌症的预防和/或治疗的医药组合物等。
附图的简单说明
图1表示癌细胞株SW480、HCT-116、HCT-15/β2m、Colo320、LHK2和Sq-1中的HLA-A24分子的局部分布。可知HCT-116以外的细胞株中，比对照多的HLA-A24分子存在于细胞表面。该结果提示这些细胞抗原递呈大量与HLA-A24分子复合物化的自然肽。
图2表示各细胞株中抗原递呈于细胞表面的自然肽的分布。图2-1表示大肠癌细胞株的情况，图2-2表示肺癌细胞株的情况，各图中A均表示自然肽所具有的各氨基酸数的存在比例，B均表示氨基酸数9和氨基酸数10的肽中各氨基酸位置上的氨基酸的存在比例。
图3为表示根据随机选择的26个自然肽的结合试验的结果调查的NetMHC评分与ΔMFI的相关关系的图表。纵轴表示ΔMFI，横轴表示NetMHC评分。NetMHC评分小于0.12的组除1组之外ΔMFI均小于10，NetMHC评分大于0.18的组除2组之外ΔMFI均为约40以上。由该结果推测，某肽的NetMHC评分大于0.15(ΔMFI大于17)的情况下，该肽为HLA-A24结合肽。
图4表示PVT1和来源于PVT1的自然肽(序列编号1)的评价结果。A表示自然肽的MS/MS的结果。B表示自然肽的结合试验的结果。C表示PVT1在各正常组织中的表达。D表示PVT1在各种癌细胞中的表达。
图5表示SUV39H2和来源于SUV39H2的自然肽(序列编号2)的评价结果。A表示自然肽的MS/MS的结果。B表示自然肽的结合试验的结果。C表示SUV39H2在各正常组织中的表达。D表示SUV39H2在各种癌细胞中的表达。
图6表示ZNF724P和来源于ZNF724P的自然肽(序列编号3)的评价结果。A表示自然肽的MS/MS的结果。B表示自然肽的结合试验的结果。C表示ZNF724P在各正常组织中的表达。D表示ZNF724P在各种癌细胞中的表达。
图7表示SNRNP40和来源于SNRNP40的自然肽(序列编号4)的评价结果。A表示自然肽的MS/MS的结果。B表示SNRNP40在各正常组织中的表达。C表示SNRNP40在各种癌细胞中的表达。
图8表示DYRK4和来源于DYRK4的自然肽(序列编号5)的评价结果。A表示自然肽的MS/MS的结果。B表示DYRK4在各正常组织中的表达。C表示DYRK4在各种癌细胞中的表达。
图9为表示对各CTL克隆的性质用HLA-A24四聚体试剂进行分析的结果的散点图。纵轴均为自然抗原肽/HLA-A24四聚体试剂的荧光强度，关于横轴，A和B的左图均表示CD8的荧光强度，B的右图表示HIV/HLA-A24四聚体试剂的荧光强度。A为作为自然抗原肽使用HF10的情况，B为作为自然抗原肽使用RF8的情况。通过本申请实施例的例5(1)中记载的方法，使用各自然抗原肽的情况均诱导出多个CTL克隆，A表示其中以HF10诱导的克隆A10、E10和H3的结果，B表示以RF8诱导的克隆11的结果。
图10为表示ELISPOT测试的结果的图。A表示作为自然抗原肽使用HF10的ELISPOT测试的结果，左侧6段表示使用克隆A10作为CTL的情况的结果，中央6段表示使用克隆E10作为CTL的情况的结果，右侧6段表示使用克隆H3作为CTL的情况的结果。B表示作为自然抗原肽使用RF8、作为CTL使用克隆11的ELISPOT测试的结果，图表中，纵轴表示平均1孔的检出IFN-γ的斑点数，横轴表示靶细胞。此外，图表下方的照片为表示通过针对各细胞的ELISPOT测试得到的实际的斑点的照片。
图11为表示使用克隆11的LDH致死测试的结果的图。A表示将以各肽进行了脉冲的T2-A24细胞用作靶细胞的情况的结果，B表示将各种癌细胞株用作靶细胞的情况的结果。
实施发明的方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明中，“表位肽”是指与MHC(人为HLA)结合而被抗原递呈至细胞表面，且具有抗原性(可被T细胞识别)的肽。表位肽中包括作为与MHC I类结合而抗原递呈并被CD8阳性T细胞识别的表位肽的CTL表位肽和作为与MHCII类结合而抗原递呈并被CD4阳性T细胞识别的表位肽的辅助表位肽。
表位肽中来源于肿瘤细胞中特异性或过度表达的蛋白质的肽特别成为肿瘤抗原肽。抗原递呈是指细胞内存在的肽与MHC结合，该MHC/抗原肽复合物集中分布于细胞表面的现象。如上所述，已知被递呈至细胞表面的抗原被T细胞等识别后，激活细胞免疫或体液免疫，被MHC I类递呈的抗原激活细胞免疫的同时，被初始T细胞的T细胞受体识别，将初始T细胞诱导为具有细胞毒性的CTL，因此作为用于免疫疗法的肿瘤抗原肽，较好是与MHC I类结合而抗原递呈的肽。
已知与MHC结合的肽大多具有一定的特征。本发明中，将该特征称为“结合基序”。怎样的MHC与具有怎样的结合基序的肽结合在该技术领域中已知。例如，作为人MHC的一种的HLA-A24的结合基序是自N末端起第2个氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸。
本说明书中，“基序置换体”是指具有某结合基序的肽中将该结合基序置换为其他结合基序的肽。本领域的一般技术人员应理解本发明中基序置换体也发挥与置换前的肽同等的效果。
本发明中，“肿瘤(tumor)”包括良性肿瘤和恶性肿瘤(癌，恶性新生物)。癌(cancer)包括造血器官的肿瘤、上皮性的恶性肿瘤(癌，carcinoma)和非上皮性的恶性肿瘤(肉瘤，sarcoma)。
本发明中，通过使用可分离/鉴定实际被抗原递呈至细胞表面的天然肽的下述实施例等中记载的方法，分离/鉴定本发明的天然肽。本发明中，“天然肽”是指实际被抗原递呈至细胞表面的肽。此外，“天然抗原肽”是指天然肽中确认具有抗原性的肽。通过从癌细胞分离该天然抗原肽并确定序列及其由来，可获得对使用CTL的癌症的靶向治疗有用的知识。
本发明中使用的天然肽的分离/鉴定方法中包括将递呈天然肽的癌症干细胞溶解并从该溶解物(裂解液)分离MHC与天然肽的复合物的工序、将分离的复合物分离为MHC分子和天然肽并分离天然肽的工序、对分离的天然肽进行鉴定的工序。
下述实施例中，MHC与天然肽的复合物的分离采用基于使用针对MHC的特异抗体的免疫沉淀法的肽/MHC复合物的提取法，但只要是可将裂解液同MHC与天然肽的复合物分离的方法即可，可使用任意的方法。
下述实施例中，作为适当的抗MHC抗体，使用抗HLA-A24抗体等针对HLAI类的抗体，但只要是可特异性识别MHC与天然肽的复合物分离的抗体即可，可使用任意的抗体。
下述实施例中，作为将复合物分离为MHC分子与天然肽的工序，进行使用弱酸的肽分离，但只要是可将MHC与天然肽的方法即可，可使用任意的方法。
另外，下述实施例中，使用组合液相色谱法和串联质谱法的肽序列分析法分析上述分离天然肽的序列，对实际被抗原递呈至细胞表面的天然肽进行鉴定，但只要是可鉴定肽的序列的方法即可，可使用任意的方法进行鉴定。
本发明人对在人癌细胞中被抗原递呈的天然抗原肽进行了分析。其结果是，作为在癌细胞中被抗原递呈的天然肽，鉴定得到383种肽。对于作为所述383种肽中发现HLA-A24结合性高的肽的来源的273种基因调查了正常组织中的表达，发现PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4这5种基因是在正常组织中仅于睾丸有表达的所谓的癌睾丸抗原。
PVT1(Plasmacytoma variant translocation 1，浆细胞瘤转化迁移基因1)被认为是存在于与作为原癌基因已知的MYC相同的染色体上的非编码RNA，起到MYC激活因子的作用。此外，观察到MYC的拷贝数增加的大量癌症中，同样报道了拷贝数增加，提示PVT1基因的转录量的增加参与细胞增殖和癌变。然而，如上所述PVT1被认为是非编码RNA，但令人意外的是，本发明人发现癌细胞中预测PVT1编码的蛋白质的部分肽被抗原递呈，这提示了至少癌细胞中PVT1作为蛋白质表达的可能性。
SUV39H2(Suppressor of variegation 3-9homolog 2(Drosophila)，花斑3-9抑制因子同源物1(果蝇))是编码特异性三甲基化组蛋白H3的Lys-9的转移酶、即组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶的基因。一般认为通过组蛋白H3的三甲基化，发生表观遗传性的转录抑制，特别是SUV39H2蛋白被报道在哺乳动物的细胞中参与端粒长度的表观遗传性抑制。此外，还报道了对于癌细胞，在肺癌、肝细胞癌、前列腺癌等中高表达。此外，还报道了在初期的未分化人胚胎干细胞中表达，表达随着分化的进行被逐渐抑制，然后又恢复至与未分化细胞同等的水平。另外，还报道了如果癌细胞中SUV39H2过表达，则癌细胞的集落形成能力提高，过表达SUV39H2的癌细胞中，如果敲除SUV39H2，则细胞增殖受到抑制(专利文献2)。
ZNF724P(zinc finger protein 724,pseudogene，锌指蛋白724假基因)被推测是编码一种锌指蛋白的基因，但没有对于ZNF724P蛋白的功能的报道。鉴于结构上的特征，由于是具有KRAB的C2H2型的典型的锌指蛋白，因此推测通过DNA相互作用而参与转录控制。此外，没有参与肿瘤形成和干细胞性的报道。
SNRNP40(U5 small nuclear ribonucleoprotein 40kDa protein，U5小核核糖核蛋白40kDa蛋白)是编码构成剪接体的核内小分子核糖核蛋白(snRNP)中构成U5 snRNP的蛋白质的基因。因此，推测SNRNP40蛋白参与mRNA的剪接。此外，没有参与肿瘤形成和干细胞性的报道。
DYRK4(Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 4，双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶4)是编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因。DYRK4所属的双特异性激酶家族被认为在细胞的分化和增殖的控制、存活以及发生中发挥作用。已知DYRK存在包括多种剪接变体在内的多种同源异构体。此外，没有参与肿瘤形成和干细胞性的报道。
＜1＞本发明的基因表达产物
本发明中，例如“PVT1”等简单地用基因名表示的情况下，只要没有另行记载，即指具有以该基因名表示的公知的核酸序列的基因，典型的情况下表示cDNA或mRNA序列，但只要本领域的一般技术人员可认作为该基因的序列，并不仅限于此，例如作为本发明中优选的基因及其核酸序列的例子，可例举以下述的序列表示的下述基因。
PVT1：GenBank登录号NR_003367
SUV39H2：GenBank登录号NM_001193424.1和NM_001193425
ZNF724P：GenBank登录号NR_045525.1
SNRNP40：GenBank登录号NR_004814.2
DYRK4：GenBank登录号NM_001282285.1、NM_001282286.1、NM_003845.2和NR_104115.1
因此，有时将作为本发明的基因表达产物的mRNA简单地用基因名的记载表示。
本发明中，“PVT1蛋白”等基因名加“蛋白”表示的情况下，是指由该基因编码的蛋白质、其同源异构体或其同源物。作为该同源异构体，可例举例如剪接变体、基于个体差异的SNP等的变体等。具体来说，可例举(1)由该基因编码的蛋白质中具有90％以上、较好是95％以上、更好是98％以上的同源性的氨基酸序列形成的蛋白质，(2)由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个、较好是1个～数个、更好是1～10个、1～5个、1～3个、1或2个氨基酸置换、缺失、添加或插入了的氨基酸序列形成的蛋白质。
作为本发明的基因表达产物优选的蛋白质可例举包含由上述的基因(核酸序列)编码的氨基酸序列的蛋白质，或者由所述蛋白质中1～3个、较好是1或2个氨基酸被置换了的氨基酸序列形成的蛋白质。可更优选例举由上述的基因(核酸序列)编码的氨基酸序列形成的蛋白质。
＜2＞本发明的肽
本发明的肽在一种形态中为由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质的部分肽，包括与MHC、特别是HLA结合的肽，较好是被MHC、特别是HLA抗原递呈的肽，更好是被MHC、特别是HLA抗原递呈的可诱导CTL的肽。HLA存在数种型，本发明的肽较好是可与HLAI类结合，更好是可与HLA-A24结合。本发明的肽可在与MHC结合之前经过加工(processing)等处理，这些结果后生成表位肽等肽也包括在本发明的肽内。因此，本发明的肽只要是包含表位肽的氨基酸序列的序列即可，氨基酸长度无特别限定。然而，较好是本发明的肽本身为表位肽，因此氨基酸长度较好是约8～14个氨基酸左右，更好是约8～11个氨基酸左右，特别好是约9～约11个氨基酸左右。
已知与作为人的MHC I类的HLA I类结合的表位肽的长度为约8～14个氨基酸，较好是约9～11个氨基酸，其序列中具有结合的HLA特有的结合模体。例如与HLA-A02结合的肽具有自N末端起第2个的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的结合模体，与HLA-A24结合的肽具有自N末端起第2个的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的结合模体。
因此，本发明的肽在一种优选形态中为由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质的部分肽，包括作为由该蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～14个氨基酸形成的自N末端起第2个氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽的表位肽，更好是该表位肽本身。其中，特别好是由以序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4或序列编号5中的任一个表示的氨基酸序列形成的表位肽。
此外，在另一种优选形态中，包括作为所述部分肽中自N末端起第2个氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽的表位肽，更好是该表位肽本身。其中，特别好是由以序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4或序列编号5中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽中自N末端起第2个氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的表位肽。
本发明的肽可以是其N末端和/或C末端被修饰的肽。作为该修饰，具体可例举N-烷酰基化(例如乙酰基化)、N-烷基化(例如甲基化)、C末端烷基酯(例如乙酯)和C末端酰胺(例如羧酰胺)等。
对于本发明的肽的合成，可按照通常的肽化学中所用的已知方法进行。作为所述已知的方法，可例举文献(Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；TheProteins，Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；肽合成，丸善株式会社，1975；肽合成的基础和实验，丸善株式会社，1985；医药品的开发续第14卷；肽合成，广川书店，1991；这些文献通过引用而构成本申请的一部分)等中所记载的方法。
本发明的肽可通过后述的CTL诱导方法或供于采用人模型动物的测试(国际公开第02/47474号公报、Int J.Cancer:100,565-570(2002))等来确认体内的活性。
本发明的肽中还包括将包含至少1条所述本发明的肽的多条表位肽连结而成的肽(多表位肽)。因此，具有CTL诱导活性的该多表位肽也可作为本发明的肽的具体例子示例。
本发明的多表位肽可定义为作为
(i)将本发明的肽(表位肽)和任意的除本发明的肽以外的1条或2条以上的CTL表位肽直接或适当介以间隔物连结而成的肽、
(ii)将本发明的肽和任意的1条或2条以上的辅助表位肽直接或适当介以间隔物连结而成的肽、或者
(iii)在上述(i)中记载的多表位肽上进一步直接或适当介以间隔物连结1条或2条以上的辅助表位肽而成的肽，
在抗原递呈细胞内接受加工，生成的表位肽被递呈至抗原递呈细胞，从而产生CTL诱导活性的肽。
在此，作为(i)中的除本发明的肽以外的CTL表位肽，无特别限定，具体可例举例如来源于人ASB4的表位肽、来源于人OR7C1、人DNAJB8的表位肽(例如，国际公开第2010/050190号中所记载的肽)、来源于人FAM83B的表位肽(国际申请第PCT/JP2014/076625号)等。
作为间隔物，只要是不对抗原递呈细胞内的加工产生不良影响即可，无特别限定，较好是与各表位肽通过肽键连结的连接物，可例举例如若干个氨基酸连结而成的肽连接序列或两端具有氨基和羧基的连接物等。具体来说，可例举甘氨酸连接物和PEG(聚乙二醇)连接物等，甘氨酸连接物可例举聚甘氨酸(例如由6个甘氨酸形成的肽；Cancer Sci,103卷,150-153页)，PEG连接物可例举来源于PEG的两端具有氨基和羧基的化合物的连接物(例如H2N-(CH2)2-(OCH2CH2)3-COOH；Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,7551-7556)。
本发明的多表位肽所包含的本发明的表位肽可选择1种或2种以上。即，可以是多条同样的表位肽连结而成，也可以是多条不同的表位肽连结而成。选择2种以上的表位肽的情况下，当然也可以是所选择的表位肽中的1种或2种以上多条连结。对于除本发明的肽以外的表位肽，同样也可以是多种和/或多条表位肽连结。本发明的多表位肽可以是2～12条表位肽连结而成，较好是2条、3条、4条、5条、6条、7条、8条、9条、10条、11条、12条表位肽连结而成，最好是2条表位肽连结而成。
在此，与本发明的肽连结的表位肽为辅助表位肽的情况下，作为所用的辅助表位肽，可例举例如来源于乙型肝炎病毒的HBVc128-140和来源于破伤风毒素的TT947-967等。此外，作为该辅助表位肽的长度，可例举13～30个氨基酸左右、较好是13～17个氨基酸左右。
这样的使多条表位肽连结而成的肽(多表位肽)也可如前所述通过通常的肽合成法制造。此外，还可基于编码这些使多条表位肽连结而成的多表位肽的多聚核苷酸的序列信息，用通常的DNA合成和基因工程的方法制造。
即，可通过将该多聚核苷酸插入周知的表达载体，培养用所得的重组表达载体转化宿主细胞而制成的转化体，从培养物中回收作为目标的使多个表位连结而成的多表位肽来制造。这些方法可如前所述按照文献(Molecular Cloning,T.Maniatis等,CSHLaboratory(1983)、DNA Cloning,DM.Glover,IRL PRESS(1985))中记载的方法等进行。
如上制成的时多条表位肽连结而成的多表位肽可通过供于所述的体外测试或者国际公开第02/47474号和Int J.Cancer:100,565-570(2002)(这些文献通过引用而构成本申请的一部分)中记述的采用人模型动物的体内测试等来确认CTL诱导活性。
如本说明书中所记载，本发明的肽(包括多表位肽)对癌症的预防和/或治疗有用，可作为医药组合物的有效成分。此外，本发明的肽可用于癌症的预防和/或治疗。另外，本发明还涉及用于癌症的预防和/或治疗的医药品的制造中的本发明的肽的用途。
＜3＞本发明的多聚核苷酸
本发明的多聚核苷酸包括编码所述本发明的肽中的至少1个的多聚核苷酸。本发明的多聚核苷酸可以是cDNA或mRNA、cRNA或者合成DNA中的任一种。此外，可以是单链和双链中的任一种形态。具体来说，可例举例如由编码作为由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质的部分肽，使用MHC与肽的结合预测程序，即BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)和IEDB(MHC-I processing predictions，MHC-I加工预测；http://www.iedb.org/)等预测具有结合性的氨基酸序列的核苷酸序列形成的多聚核苷酸等，但并不仅限于此。作为另一种具体形态，可例举由编码序列编号1～5中记载的氨基酸序列的核苷酸序列形成的多聚核苷酸以及由分别以可表达的方式编码选自序列编号1～5的任意2条以上的肽或使选自序列编号1～5的肽与辅助表位连结而成的多表位肽的核苷酸序列形成的多聚核苷酸等。
本发明的多聚核苷酸可呈单链和双链中的任一种形态。本发明的多聚核苷酸为双链的情况下，可通过将所述本发明的多聚核苷酸插入表达载体来制备用于表达本发明的肽的重组表达载体。即，本发明的多聚核苷酸的范畴也包括将本发明的双链型多聚核苷酸插入表达载体而制成的重组表达载体。
如本说明书中所记载，本发明的多聚核苷酸对癌症的预防和/或治疗有用，可作为医药组合物的有效成分。此外，本发明的多聚核苷酸可用于癌症的预防和/或治疗。另外，本发明还涉及用于癌症的预防和/或治疗的医药品的制造中的本发明的多聚核苷酸的用途。
本发明中使用的表达载体可根据使用的宿主和目的等采用各种表达载体，只要是本领域技术人员，就可适当选择。作为本发明中可使用的表达载体，可例举例如质粒、噬菌体载体、病毒载体等。例如，宿主为大肠杆菌的情况下，作为载体，可例举pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等质粒载体，λZAPII、λgt11等噬菌体载体。宿主为酵母的情况下，作为载体，可例举pYES2、pYEUra3等。宿主为昆虫细胞的情况下，可例举pAcSGHisNT-A等。宿主为动物细胞的情况下，可例举pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMW等质粒载体，或者反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等病毒载体。
所述载体可适当具有可诱导表达的启动子、编码信号序列的基因、筛选用标记物基因、终止子等元件。此外，可添加作为与硫氧还蛋白、His标签或GST(谷胱甘肽转硫酶)等的融合蛋白表达的序列，使得分离纯化变得容易。该情况下，可使用具有在宿主细胞内发挥功能的合适的启动子(lac、tac、trc、trp、CMV、SV40早期启动子等)的GST融合蛋白载体(pGEX4T等)或具有Myc、His等的标签序列的载体(pcDNA3.1/Myc-His等)、又或表达与硫氧还蛋白和His标签的融合蛋白的载体(pET32a)等。
通过用如上所述制成的表达载体转化宿主，可制成含有该表达载体的转化细胞。因此，本发明中包括包含所述表达载体的基因导入用组合物。
作为用于转化的宿主，只要不破坏本发明的多肽所具有的功能，可使用任意的细胞，可例举例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。作为大肠杆菌，可例举E.coli K-12品系的HB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株等。此外，作为酵母，可例举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。作为动物细胞，可例举L929细胞、BALB/c3T3细胞、C127细胞、CHO细胞、COS细胞、Vero细胞、HeLa细胞、293-EBNA细胞等。作为昆虫细胞，可例举sf9等。
作为向宿主细胞的表达载体的导入方法，使用适合于所述宿主细胞的通常的导入方法即可。具体来说，可例举磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、采用基因导入用脂质(Lipofectamine、Lipofectin；吉伯科BRL公司(Gibco-BRL社))的方法等。导入后，通过用含筛选标记物的通常的培养基进行培养，可筛选所述表达载体被导入宿主细胞中而得的转化细胞。
通过将如上所述得到的转化细胞在适当的条件下继续培养，可制造本发明的肽。所得的肽可通过通常的生物化学纯化手段进一步进行分离、纯化。在此，作为纯化手段，可例举盐析、离子交换色谱法、吸附色谱法、亲和色谱法、凝胶过滤色谱法等。此外，使本发明的肽作为所述的与硫氧还蛋白或His标签、GST等的融合蛋白表达的情况下，可通过利用这些融合蛋白或标签的性质的纯化方法进行分离、纯化。
编码本发明的肽的多聚核苷酸可以是DNA形态，也可以是RNA形态。这些本发明的多聚核苷酸可基于本发明的肽的氨基酸序列信息和由其编码的DNA的序列信息，使用该技术领域已知的常规方法容易地制造。具体来说，可通过通常的DNA合成或采用PCR的扩增等进行制造。
编码本发明的肽的多聚核苷酸包括编码所述表位肽的多聚核苷酸。
＜4＞以本发明的肽为有效成分的CTL诱导剂/医药组合物
本发明的肽具有CTL诱导活性，可作为肿瘤抗原肽制成CTL诱导剂。此外，如上所述，由本发明人首次发现由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质为肿瘤抗原，来源于该蛋白质的肽在肿瘤细胞表面与HLA I类抗原结合而形成复合物并被运送至细胞表面进行抗原递呈。因此，由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质本身也可成为CTL诱导剂。
即，通过从HLA-A24抗原呈阳性的人分离外周血淋巴细胞，在体外添加本发明的肽以及/或者由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质进行刺激，可诱导特异性识别用该肽进行了脉冲(pulse)的HLA-A24抗原阳性细胞的CTL(J.Immunol.,154,p2257,1995)。在此，是否诱导了CTL例如可通过用例如ELISA法等测定CTL对抗原肽递呈细胞作出反应而产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量来确认。此外，也可通过测定CTL对51Cr标记的抗原肽递呈细胞的毒性的方法(51Cr释放试验，Int.J.Cancer,58:p317,1994)来确认。
此外，还可通过Int.J.Cancer,39,390-396,1987、N.Eng.J.Med,333,1038-1044,1995等中记载的方法来构建CTL克隆。
通过本发明的肽以及/或者由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质诱导的CTL具有对将本发明的肽以及/或者其他来源于由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质的表位肽作为抗原递呈的细胞的毒性作用和淋巴因子的产生能力。如上所述，本发明的肽是肿瘤抗原肽，而由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质在细胞内被分解而生成肿瘤抗原肽，因此可通过这些机能发挥抗肿瘤作用、较好是抗癌作用。因此，本发明的肽以及/或者由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质、以及由其诱导的CTL可作为用于癌症的预防和/或治疗的医药品或医药组合物的有效成分。
如果将含有本发明的肽以及/或者由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质作为有效成分的CTL诱导剂给予癌症患者，则本发明的肽以及/或者来源于由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质的表位肽被递呈至抗原递呈细胞的HLA抗原、较好是HLA-A24抗原，特异性识别HLA抗原与递呈的肽的复合物的CTL增殖，可破坏癌细胞，因而能够预防和/或治疗癌症。因此，将本发明的肽以及/或者由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质作为有效成分的CTL诱导剂可优选对HLA-A24抗原阳性且罹患PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的对象使用。作为PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症，可例举例如大肠癌、肺癌、乳腺癌、骨髓瘤、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌等癌症(肿瘤)，本发明的CTL诱导剂可用于这些癌症的预防和/或治疗。
自此，癌症的“预防”不仅是预防患者罹患癌症，还包括防止通过手术切除的原发病灶的肿瘤的患者的复发，防止通过手术、放射疗法或药物疗法等癌症治疗无法完全除去的肿瘤的转移等。此外，癌症的“治疗”不仅是使癌缩小的癌症的治愈、症状改善，还包括抑制癌细胞的增殖、肿瘤的扩大或癌细胞自原发病灶的转移等癌症发展的防止等。
将本发明的肽以及/或者由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质作为有效成分的CTL诱导剂对罹患例如PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的癌症患者特别有效。具体来说，可用于例如大肠癌、肺癌、乳腺癌、骨髓瘤、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌等癌症(肿瘤)的预防和/或治疗。因此，含有本发明的肽以及/或者由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质作为有效成分的医药组合物也包含在本发明中。所述医药组合物较好是癌症的预防和/或治疗用的组合物，即癌症的预防和/或治疗剂。此外，本发明的医药组合物通过诱导对癌细胞具特异性的CTL，即激活癌细胞特异性的细胞免疫来进行预防和/或治疗，因此较好是癌症的预防和/或治疗用疫苗。
以本发明的肽为有效成分的医药组合物可将单一的CTL表位(本发明的肽)作为有效成分，也可将与其他肽(CTL表位或辅助表位)连结而成的多表位肽作为有效成分。近年来，已发现将多个CTL表位(抗原肽)连结而成的多表位肽在体内具有高效的CTL诱导活性。例如Journal of Immunology 1998,161:3186-3194(本文献通过引用而构成本申请的一部分)中记载了将来源于癌抗原蛋白PSA的HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11、HLA-B53限制性CTL表位(抗原肽)连结而成的多表位肽在体内诱导了对各CTL表位特异性的CTL。此外，也示出通过使CTL表位与辅助表位连结而成的多表位肽，可高效地诱导CTL。通过这样的多表位肽的形态给药的情况下，多表位肽被摄入抗原递呈细胞内后，经过细胞内分解而生成的各抗原肽与HLA抗原结合而形成复合物，该复合物被高密度地递呈至抗原递呈细胞表面，对该复合物特异性的CTL在体内高效地增殖，破坏癌细胞。癌症的治疗或预防由此得到促进。
将本发明的肽以及/或者由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质为有效成分的医药组合物可与作为医药品被允许的载体、例如适当的佐剂混合后给药或并用给药，从而有效地实现细胞免疫。
作为佐剂，可适用文献(例如Clin Infect Dis.:S266-70,2000)中记载的佐剂等该技术领域已知的佐剂，具体来说，例如作为凝胶类型，可例举氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙等；作为菌体类型，可例举CpG、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A，MPL)、霍乱毒素、大肠杆菌热敏感毒素、百日咳毒素和胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide，MDP)等；作为油乳浊液类型(乳液制剂)，可例举弗氏不完全佐剂、MF59和SAF等；作为高分子纳米粒子类型，可例举免疫刺激复合物(Immunostimulatory complex，ISCOMs)、脂质体、生物降解性微球体(Biodegradable microsphere)和来源于皂苷的QS-21等；作为合成类型，可例举非离子性嵌段共聚物、胞壁肽类似物(Muramyl peptide analogue)、聚磷腈和合成多聚核苷酸等；作为细胞因子类型，可例举IFN-γ、IL-2和IL-12等。
此外，作为将本发明的肽以及/或者由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质为有效成分的CTL诱导剂/医药组合物的剂型，无特别限定，可例举油乳浊液(乳液制剂)、高分子纳米粒子、脂质体制剂、与直径数微米的珠粒结合而得的粒子状制剂、与脂质结合而得的制剂、微球体制剂、微胶囊制剂等。
作为给药方法，可例举皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药等已知的任意的给药方法。制剂中的本发明的肽的给药量可根据要治疗的疾病、患者的年龄、体重等适当调整，通常为0.0001mg～1000mg，较好是0.001mg～1000mg，更好是0.1mg～10mg，较好是将其数日～数月1次给药。
作为使本发明的肽实际作为医药品作用的方法，除了将该肽直接导入体内的直接体内法之外，还有从人采集某种细胞在体外使本发明的肽对其进行作用并将该细胞植回体内的间接体内法(日经科学,1994年4月号,20-45页、月刊药事,36(1),23-48(1994)、实验医学增刊,12(15),(1994)及它们的引用文献等，这些文献通过引用而构成本申请的一部分)，只要是本领域的技术人员，可选择适合于所涉及方法的细胞、给药方法、给药形态和给药量。
＜5＞以本发明的多聚核苷酸为有效成分的CTL诱导剂/医药组合物
表达本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸的细胞成为可将本发明的肽以及/或者来源于由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质的其他表位肽作为抗原递呈的细胞，因此具有通过T细胞受体被T细胞识别的特征。因此，本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸也可成为CTL诱导剂。诱导得到的CTL与由本发明的肽以及/或者由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质诱导的CTL同样，可通过细胞毒性作用或淋巴因子的产生而发挥抗肿瘤作用、较好是抗癌作用。因此，本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸可作为用于癌症的治疗或预防的医药或医药组合物的有效成分。含有本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸作为有效成分的CTL诱导剂例如通过将本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸给予癌症患者并使其表达，从而可治疗和/或预防癌症。
例如将整合至表达载体的本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸通过以下的方法给予癌症患者后，肿瘤抗原肽在抗原递呈细胞内高度表达。然后，生成的肿瘤抗原肽与HLA-A24抗原等HLA抗原结合而形成复合物，该复合物被高密度地递呈至抗原递呈细胞表面，从而癌特异性的CTL在体内高效地增殖，破坏癌细胞。如上所述，实现癌症的治疗或预防。因此，包含本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸的医药组合物也包含在本发明中。所述医药组合物较好是癌症的预防和/或治疗用的组合物，即癌症的预防和/或治疗剂。此外，本发明的医药组合物通过诱导对癌细胞(较好是癌症干细胞)特异性的CTL，即激活癌细胞特异性的细胞免疫来进行预防和/或治疗，因此较好是癌症的预防和/或治疗用疫苗。
将本发明的多聚核苷酸为有效成分的CTL诱导剂/医药组合物较好是对HLA-A24抗原阳性且罹患PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的对象使用。作为PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症，可例举例如大肠癌、肺癌、乳腺癌、骨髓瘤、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌等癌症(肿瘤)，本发明的CTL诱导剂可用于这些癌症的预防或治疗。
作为给予本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸并导入细胞内的方法，可适用采用病毒载体的方法及其他的方法(日经科学,1994年4月号,20-45页、月刊药事,36(1),23-48(1994)、实验医学增刊,12(15),(1994)及它们的引用文献等，这些文献通过引用而构成本申请的一部分)中的任一种方法。因此，本发明的医药组合物的一种形态中，含有包含本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸的载体为有效成分。
作为采用病毒载体的方法，可例举在反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒等DNA病毒或RNA病毒中整合本发明的DNA并导入的方法。其中，特别好是采用反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒等的方法。
作为其他方法，可例举将表达质粒直接肌肉内给药的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、脂质转染法、显微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等，特别好是DNA疫苗法、脂质体法。
为了使本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸实际作为医药发挥作用，有将该多聚核苷酸直接导入体内的直接体内法以及从人采集某种细胞在体外将本发明的多聚核苷酸导入该细胞并将该细胞植回体内的间接体内法(日经科学,1994年4月号,20-45页、月刊药事,36(1),23-48(1994)、实验医学增刊,12(15),(1994)及它们的引用文献等，这些文献通过引用而构成本申请的一部分)。更好是直接体内法。
通过直接体内法给予本发明的多聚核苷酸以及/或者编码选自PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和DYRK4蛋白的蛋白质的多聚核苷酸的情况下，可适当选择与要治疗的疾病、症状等相适应的合适的给药路径和给药形态来给药。例如，可通过能够对静脉、动脉、皮下、皮内、肌肉内等进行注射的形态进行给药。通过直接体内法给药的情况下，例如可采用液剂等制剂形态，一般可制成含有作为有效成分的本发明的多聚核苷酸的注射剂等，根据需要加入医药上允许的载体。此外，对于含有本发明的多聚核苷酸的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)，可采用悬浮剂、冷冻剂、离心分离浓缩冷冻剂等脂质体制剂的形态。
制剂中的本发明的多聚核苷酸的含量可根据要治疗的疾病、患者的年龄、体重等适当调整，通常将以多聚核苷酸的含量计为0.0001mg～100mg、较好是0.001mg～10mg的本发明的多聚核苷酸数日～数月1次给药。
只要是本领域的技术人员，可适当选择合适的细胞、载体、给药方法、给药形态和给药量。
此外，近年来，已发现编码将多个CTL表位(肿瘤抗原肽)连结而成的多表位肽的多聚核苷酸或者编码将CTL表位与辅助表位连结而成的多表位肽的多聚核苷酸在体内具有高效的CTL诱导活性。例如Journal of Immunology 1999,162:3915-3925(本文献通过引用而构成本申请的一部分)中记载了编码将来源于HBV的6种HLA-A2限制性抗原肽、3种HLA-A11限制性抗原肽和辅助表位连结而成的表位肽的DNA(小基因)在体内有效地诱导了针对各表位的CTL。
因此，将通过使1种或2种以上编码本发明的肽的多聚核苷酸连结或者根据情况还连结编码其他肽的多聚核苷酸而制成的多聚核苷酸整合至合适的病毒载体，可作为CTL的诱导剂的有效成分。这样的CTL的诱导剂也可采用如前所述的给药方法和给药形态。
此外，近年来发现癌细胞通过逃避免疫细胞的攻击来回避免疫系统的清除，所述逃避利用原本为抑制对自身过度的免疫反应或对正常组织的伤害而具备的被称为“免疫检查点”的机理。因此，通过在癌细胞中抑制免疫检查点的机能，可使免疫细胞的攻击变得有效。本发明的医药组合物通过诱导肿瘤特异性的免疫细胞而发挥抗肿瘤效果，因此通过配合免疫检查点的机能进行抑制，可发挥更高的治疗效果。因此，一种优选形态中，本发明的医药组合物与免疫检查点抑制剂一起使用。
本发明中，将某剂A与其他剂B“一起使用”或“并用”的情况下，是指在剂A发挥效果期间剂B发挥效果的状态。因此，可在给予剂A的同时给予剂B，也可以在给予剂A后空开一定的间隔给予剂B。此外，剂A和剂B可采用同一给药方式，也可以是不同的给药方式。另外，只要剂A或剂B不丧失其效果，可将剂A与剂B混合而制成一个组合物。
作为本形态中的免疫检查点抑制剂，只要不抑制本发明的组合物的诱导CTL的能力，可使用作为免疫检查点抑制剂公知的任意药剂。作为免疫检查点抑制剂已知的药剂，可例举例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG-3抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗B7-H5抗体、抗TIGIT抗体等，但并不仅限于此。
＜6＞本发明的抗原递呈细胞
所述的本发明的肽和多聚核苷酸例如可如下在体外利用。即，通过使本发明的肽和多聚核苷酸中的任一种与具有抗原递呈能力的细胞在体外接触，可制备将本发明的抗原肽作为抗原递呈的抗原递呈细胞。因此，本发明的一种形态中，提供使HLA抗原、较好是HLA-A24抗原与本发明的肽的复合物递呈至细胞表面的抗原递呈细胞及其制造方法。如上所述，本发明的肽和多聚核苷酸可用于预防和/或治疗癌症。因此，本形态的抗原递呈细胞或其制造方法较好是利用来源于癌症患者的分离得到的细胞。具体来说，通过使从癌症患者分离的具有抗原递呈能力的细胞与本发明的肽或多聚核苷酸中的任一种在体外接触，制造使HLA抗原、较好是HLA-A24抗原与本发明的肽的复合物递呈至该细胞的细胞表面的抗原递呈细胞。
在此，“具有抗原递呈能力的细胞”只要是能够递呈本发明的肽的在细胞表面表达MHC、较好是HLA、更好是HLA-A24抗原的细胞即可，无特别限定，这些细胞中较好是专职性抗原递呈细胞，更好是被认为抗原递呈能力特别高的树突状细胞。
此外，作为为了由所述具有抗原递呈能力的细胞制备本发明的抗原递呈细胞而添加的物质，可以是本发明的肽或多聚核苷酸中的任一种。
本发明的抗原递呈细胞例如可通过从癌症患者分离具有抗原递呈能力的细胞，在体外用本发明的肽对该细胞进行脉冲，使HLA-A24抗原与本发明的肽的复合物递呈来获得(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、J.Immunol.,158,p1796,1997、Cancer Res.,59,p1184,1999)。使用树突状细胞的情况下，例如通过从癌症患者的外周血用Ficoll法分离细胞细胞，然后除去非附着细胞，将附着细胞在GM-CSF和IL-4的存在下培养而诱导树突状细胞，将该树突状细胞与本发明的肽一起培养进行脉冲等，从而可制备本发明的抗原递呈细胞。
此外，通过将本发明的多聚核苷酸导入所述具有抗原递呈能力的细胞来制备本发明的抗原递呈细胞的情况下，该多聚核苷酸可以是DNA的形态，也可以是RNA的形态。具体来说，DNA的情况下，可将Cancer Res.,56:p5672,1996或J.Immunol.,161:p5607,1998(这些文献通过引用而构成本发明的一部分)等作为参考进行，而RAN的情况下，可将J.Exp.Med.,184:p465,1996(这些文献通过引用而构成本发明的一部分)等作为参考进行。
所述抗原递呈细胞可作为CTL诱导剂和/或医药组合物的有效成分。由于可稳定地维持抗原递呈细胞，含有该抗原递呈细胞作为有效成分的CTL诱导剂和/或医药组合物较好是包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。作为给药方法，可例举静脉内给药、皮下给药、皮内给药等。通过将这样的含有抗原递呈细胞作为有效成分的CTL诱导剂和/或医药组合物送回至患者体内，在罹患PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的患者体内，对抗原递呈本发明的肽的癌细胞特异性的CTL被高效地诱导，从而可预防和/或治疗抗原递呈本发明的肽的PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症。
＜7＞本发明的细胞毒性T细胞(CTL)
本发明的肽和多聚核苷酸例如可如下在体外利用。即，通过使本发明的肽和多聚核苷酸中的任一种与外周血淋巴细胞在体外接触，可诱导CTL。因此，本发明的一种形态中，提供特异性地杀伤抗原递呈本发明的肽的细胞的CTL及其诱导方法。如上所述，本发明的肽和多聚核苷酸可用于预防和/或治疗癌症。因此，本形态的CTL及其诱导方法较好是利用来源于癌症患者的外周血淋巴细胞。具体来说，通过使来源于癌症患者的外周血淋巴细胞与本发明的肽或多聚核苷酸中的任一种在体外接触，从而诱导特异性地杀伤抗原递呈本发明的肽的细胞的CTL。
例如，对于恶性黑色素瘤，将患者本人的肿瘤内浸润T细胞在体外大量培养并将其植回患者的过继性免疫治疗确认具有治疗效果(J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994)。此外，对于小鼠的恶性黑色素瘤，通过在体外通过肿瘤抗原肽TRP-2刺激脾细胞，使肿瘤抗原肽特异性的CTL增殖，将该CTL给予恶性黑色素瘤移植小鼠，确认到转移抑制(J.Exp.Med.,185:453,1997)。这是基于在体外使特异性识别抗原递呈细胞的MHC与肿瘤抗原肽的复合物的CTL的结果。因此，可认为使用本发明的肽或多聚核苷酸在体外刺激患者外周血淋巴细胞而使肿瘤特异性CTL增殖后将该CTL植回患者的治疗方法是有用的。
该CTL可作为癌症的治疗剂或预防剂的有效成分。由于可稳定地维持抗原递呈细胞，该治疗剂或预防剂较好是包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。作为给药方法，可例举静脉内给药、皮下给药、皮内给药等。通过将这样的含有CTL作为有效成分的癌症的治疗或预防剂送回至患者体内，在罹患PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的患者体内，CTL产生的癌细胞的毒性作用得到促进，破坏癌细胞，从而可治疗癌症。
本发明的CTL能够以被肿瘤细胞抗原递呈的本发明的肽与HLA的复合物为靶发挥细胞毒性。即，本发明的CTL的T细胞受体(TCR)识别本发明的肽与HLA的复合物。近年来，设计出了克隆识别CTL中表达的特定的肽-HLA复合物的TCR基因，将该TCR基因导入从患者采集的CD8+T细胞而人工制作CTL，大量培养后，送回至患者体内的过继性免疫疗法(例如Ochi等,Blood.2011 Aug 11；118(6):1495-503等)。本发明中，提到“人工CTL”的情况下，是指如前所述将编码识别肽与HLA的复合物的TCR的基因导入T细胞而制成的CTL，该CTL也可与上述的天然CTL同样用于癌症的治疗。因此，所述人工CTL也包括在本发明的CTL内。所述形态中，人工CTL所基因导入的识别本发明的肽与HLA的复合物的TCR可为了提高对于该复合物的结合亲和性或细胞毒性而适当改造。因此，“人工CTL”中还包括将编码识别本发明的肽与HLA的复合物的TCR的基因适当进行基因改造后导入来源于患者的T细胞而制成的CTL。人工CTL的制作可使用该技术领域已知的方法。
＜8＞使用本发明的肽的肿瘤特异性CTL检测剂
本发明的肽能够被肿瘤特异性CTL识别，因此可用作肿瘤特异性CTL检测剂的成分。因此，本发明还涉及包含本发明的肽的肿瘤特异性CTL检测剂。一种形态中，本发明的肿瘤特异性CTL检测剂包括含有本发明的肽与HLA-A24的HLA多聚体(单体、二聚体、四聚体、五聚体和葡聚糖多聚体(Dextramer))。
例如，HLA四聚体是指将使HLA的α链和β2微球蛋白与肽(表位肽)组装而成的复合物(HLA单体)生物素化，使其与亲和素结合而四聚体化而成的多聚体(Science 279:2103-2106(1998)，Science 274:94-96(1996))。现在，市场上有各种含有抗原肽的HLA四聚体销售(例如自株式会社医学生物学研究所)，可容易地制备含有本发明的肽和HLA-A24的HLA四聚体。此外，HLA二聚体和HLA五聚体也基于同样的原理，对于这些多聚体，所述HLA单体分别二聚体化和五聚体化。因此，含有本发明的肽和HLA-A24的HLA多聚体也是本发明的一种形态。
具体来说，可例举例如含有由序列编号1～5中的任一个中记载的氨基酸序列形成的肽和HLA-A24的HLA四聚体。为了可通过流式细胞仪、荧光显微镜等已知的检测手段容易地筛选或检测结合的CTL，该HLA四聚体较好是经荧光标记。具体来说，可例举通过例如藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质(PerCP)等标记的HLA四聚体。
作为HLA四聚体的制法例子，可例举例如Science 279:2103-2106(1998)、Science274:94-96(1996)等文献中记载的方法，简单如下所述。
首先，向可表达蛋白质的大肠杆菌或哺乳动物细胞导入HLA-A24的α链表达载体和β2微球蛋白表达载体并使其表达。在此，较好是使用大肠杆菌(例如BL21)。将所得的单体HLA-A24与本发明的肽混合，形成可溶性的HLA-肽复合物。接着，将HLA-肽复合物中的HLA-A24的α链的C末端部位的序列通过BirA酶进行生物素化。将该经生物素化的HLA-肽复合物与经荧光标记的亲和素以4:1的摩尔比混合，从而可制备HLA四聚体。所述各步骤中，较好是进行采用凝胶过滤等的蛋白质纯化。
＜9＞肿瘤细胞检测剂
如上所述，本发明人发现选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因为在肿瘤细胞中特异性表达的癌睾丸抗原。即，由本发明人阐明选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因为在除睾丸之外的通常的体细胞中未见表达，但在肿瘤细胞中高表达的基因。根据所述认知，发现选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因可用作用于识别癌细胞、特别是癌症干细胞的标记物。因此，本发明在一方面涉及一种肿瘤细胞检测剂，其中，包含用于检测选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达产物的检测剂。
本发明中，单独提到PVT1等的情况下，只要没有另外的记载，均是指PVT1基因等。较好是人的基因，但也可以是其同源物。
本发明中，“基因的表达”是指以该基因的转录为起点的影响力的生物体反应，“表达产物”是指例如mRNA和内源性多肽等通过这一系列的生物体反应而生成的分子。作为基因的表达产物的内源性多肽较好是通过该基因的表达最终产生的蛋白质。
本发明中，“基因的表达产物的检测剂”是指用于定性和/或定量地检测选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达产物的检测剂。
本发明的肿瘤细胞检测剂包含用于检测选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达产物的检测剂。检测对象中检出选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达产物的情况下，可确认检测对象具有肿瘤细胞，即检出肿瘤细胞。本发明的肿瘤细胞检测剂在体内和体外均可使用，但较好是对于来源于从生物个体(检查对象)采集的活体试样的细胞群(检测对象)在体外使用。该情况下，在作为检测对象的来源于活体试样的细胞群中检测出肿瘤细胞意味着在作为检查对象的采集活体试样的生物个体中也检测出肿瘤细胞，即该生物个体具有肿瘤细胞。因此，如后所述，使用本发明的肿瘤细胞检测剂在检查对象中检测肿瘤细胞的方法、即对检查对象是否具有肿瘤进行检查的方法也包含在本发明中。
作为检查对象的生物个体只要是可能具有肿瘤的生物个体即可，可以是任意的生物个体，但较好是人和非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等啮齿类，黑猩猩等灵长类，牛、山羊、绵羊等偶蹄目，马等奇蹄目，兔子、狗、猫等)的个体，更好是人的个体。
关于检测对象的细胞群，可对来源于由上述检查对象得到的任意的活体试样的细胞群使用，但较好是来源于由人得到的活体试样的细胞群，更好是包含来源于确认在组织的细胞中选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因几乎无表达的选自除睾丸以外的组织，例如心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠和血液的1种或2种以上的活体试样的细胞的细胞群。
本发明的肿瘤细胞检测剂所含的选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达产物的检测剂可根据检测的表达产物而变化，本领域的一般技术人员均可适当选择最佳的检测剂。具体来说，例如表达产物为mRNA的情况下，可使用该技术领域中公知的任意的mRNA检测法，可例举例如RT-PCR法、原位杂交法、RNA印迹法、实时RT-PCR等，但并不仅限于此，其中，从检测灵敏度高、实验操作简便等角度来看，较好是RT-PCR法。例如表达产物为内源性多肽(较好是PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和/或DYRK4蛋白)的情况下，可例举例如蛋白质印迹法、免疫组织染色法等，但并不仅限于此。使用的选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达产物的检测剂可根据检测的表达产物和采用的检测法而变化，本领域的一般技术人员可适当选择最佳的检测剂。
具体来说，例如检测内源性多肽的情况下，可例举针对PVT1蛋白、SUV39H2蛋白、ZNF724P蛋白、SNRNP40蛋白和/或DYRK4蛋白的特异抗体(较好是单克隆抗体)等，检测mRNA的情况下，可例举具有与选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的碱基序列的一部分互补的碱基序列的探针和/或引物等，但并不仅限于此。此外，检测的表达产物可以是单一的表达产物，也可以将多种表达产物组合使用。
＜10＞识别本发明的肽的抗体
如上所述，本发明的肽被肿瘤细胞作为CTL表位肽抗原递呈。此时，与MHC形成复合物被递呈至细胞表面，因此通过使用识别本发明的肽或该肽与MHC的复合物的抗体，可将本发明的肽作为肿瘤标记物进行利用。作为这样的抗体，可例举例如特异性识别本发明的肽的抗体(较好是单克隆抗体)，识别本发明的肽与HLA的复合物、较好是与HLA-A24的复合物的TCR(T细胞抗原受体)样抗体等。因此，本发明还涉及识别本发明的肽或该肽与MHC的复合物的抗体、特别是单克隆抗体和T细胞抗原受体样抗体。
本发明中，“TCR样抗体”是对片段化的来源于抗体的肽与主要组织相容性抗原复合物(MHC)分子的复合物(pMHC)具有TCR样的结合能力(抗原识别能力)的分子。例如，如EurJ Immunol.2004；34:2919-29等中所报道，识别来源于肿瘤抗原的肽与MHC的复合物的TCR样抗体可识别CTL可作为靶的递呈肿瘤抗原肽的癌细胞、吞噬癌细胞而在MHC I类上递呈肿瘤抗原肽的树突状细胞等。
所述TCR样抗体可通过Eur J Immunol.2004；34:2919-29等中所记载的方法制备。例如，可通过用MHC和肽的复合物对小鼠等动物进行免疫而获得复合物特异性抗体。此外，还可用噬菌体展示法获得复合物特异性抗体。
如上所述，通过识别本发明的肽和/或递呈该肽的MHC复合物，可检测将包含本发明的肽的该MHC复合物提呈至细胞表面的肿瘤细胞。因此，本发明还涉及包含上述TCR样抗体的肿瘤检测剂。此外，除了肿瘤细胞之外，本发明的肽也同样被抗原递呈细胞、特别是树突状细胞等专职性抗原递呈细胞所递呈，因此上述TCR样抗体也可用于递呈本发明的肽的抗原递呈细胞等的检测。
本发明中，提到“抗体”的情况下，不仅是免疫球蛋白分子，还包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、dsFv、双价抗体(Diabody)和sc(Fc)2等抗体的功能性片段。此外，这些功能性片段的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、聚合物)也包括在本发明的抗体内。
此外，如上所述，本发明的肽被肿瘤细胞作为CTL表位肽递呈，因此识别本发明的肽和/或该肽与HLA的复合物、较好是与HLA-A24的复合物的TCR样抗体可与在对象中存在于细胞表面的所述复合物结合。TCR样抗体结合于肿瘤细胞表面后，巨噬细胞或NK细胞等效应细胞的Fc受体与该抗体的Fc部位结合，该效应细胞产生攻击肿瘤细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，从而可以处置肿瘤。因此，上述TCR样抗体还可用于癌症的预防和/或治疗。因此，本发明还涉及包含本发明的TCR样抗体的癌症的预防剂和/或治疗剂。
此外，近年来，开发出了以2个抗原结合部位分别与不同的抗原结合的方式进行了改造的双重特异性抗体。以一个抗原结合部位识别MHC-抗原肽复合物等癌细胞表面抗原并以另一个抗原结合部位识别CD3等淋巴细胞表面抗原的双重特异性抗体可将CTL和效应细胞等具有淋巴细胞表面抗原的细胞约束、聚集在癌细胞附近。被约束在癌细胞附近的淋巴细胞发挥不仅自身显示ADCC活性等抗肿瘤活性，而且通过细胞因子等的分泌将癌细胞周围的初始免疫细胞激活为抗肿瘤性的旁侧效应，从而可以对癌细胞进行攻击。
因此，本发明还包括特异性识别本发明的肽和/或该肽与HLA的复合物以及淋巴细胞表面抗原的双重特异性抗体。被特异性识别的淋巴细胞表面抗原只要是在淋巴细胞的表面特异性表达的抗原即可，无特别限定，可优选例举CD3、CD16、CD64等。特别是CD3为参与CTL的细胞毒性的诱导的细胞表面抗原，若抗体与CD3结合，不识别HLA-癌抗原复合物就可不受HLA约束地激活CTL，可期待发挥强力的细胞毒性，因此优选。
另外，近年来，设计出了将对肿瘤抗原特异性的单克隆抗体的一部分施加基因操作进行改造而得的嵌合抗原受体(CAR)基因导入来源于患者的T细胞，将该基因改造T细胞在体外扩增培养后输注给患者的新的免疫细胞治疗法(Nat Rev Immunol.2012；12:269-81)。具体来说，通过将从患者采集的外周血单核细胞在抗CD3抗体和IL-2等的存在下进行培养而激活T细胞后，使用逆转录病毒载体或慢病毒载体等转化用载体将编码CAR的基因导入T细胞，从而制作基因改造T细胞。
本发明中，“嵌合抗原受体”是按照在N末端侧具有识别存在于癌细胞的细胞表面的分子的抗体的抗体可变区的轻链与重链串联结合而得的单链抗体(scFv)且在C末端侧具有构成T细胞受体(TCR)/CD3复合物的分子中的CD3ζ链的方式设计的嵌合蛋白分子。该嵌合抗原受体识别在scFv区域识别特定的抗原后，介以CD3ζ链发生T细胞的激活。为了增强T细胞的激活，可在scFv与ζ链之间整合1个或2个以上的共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS等)。本发明中，作为scFv，可使用本形态的TCR样抗体(包括可由TCR样抗体设计的抗体分子或其片段)制作CAR。识别来源于肿瘤抗原的肽与MHC的复合物的CAR可识别CTL可作为靶的递呈肿瘤抗原肽的癌细胞、吞噬癌细胞而在MHC I类上递呈肿瘤抗原肽的树突状细胞等，因此导入所述CAR的基因改造T细胞与人工CTL同样可用作所述肿瘤抗原特异性的癌症的预防和/或治疗剂。因此，本发明还涉及包含导入识别本发明的来源于肿瘤抗原的肽与MHC的复合物的CAR的基因改造T细胞或者人工CTL的癌症的预防和/或治疗剂。
＜11＞肿瘤的检测方法(检查方法、诊断方法)
本发明提供利用所述的本发明的CTL检测剂或肿瘤细胞检测剂(肿瘤检测剂)的肿瘤的检测方法(检查方法、诊断方法)。
使用本发明的CTL检测剂的本发明的检测方法(诊断方法)典型的是采集受检者的血液，或者通过活检等采集被怀疑是肿瘤的受检组织的一部分，通过本发明的CTL检测剂检测、测定其中所含的识别来源于PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的CTL的量，从而检测、检查或诊断是否罹患大肠癌、肺癌、乳腺癌、骨髓瘤、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌等PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症(肿瘤)或者其程度。
使用本发明的肿瘤检测剂的本发明的检测方法(检查方法、诊断方法)典型的是采集受检者的血液，或者通过活检等采集被怀疑是肿瘤的受检组织的一部分，通过本发明的肿瘤检测剂检测、测定其中所含的识别来源于PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4的表达产物的量，从而检测、检查或诊断是否罹患大肠癌、肺癌、乳腺癌、骨髓瘤、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌等PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症(肿瘤)或者其程度。
使用本发明的肿瘤检测剂的本发明的检测方法(检查方法、诊断方法)典型的是采集受检者的血液，或者通过活检等采集被怀疑是肿瘤的受检组织的一部分，通过本发明的肿瘤检测剂检测、测定其中所含的递呈来源于PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的细胞的量，从而检测、检查或诊断是否罹患大肠癌、肺癌、乳腺癌、骨髓瘤、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌等PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症(肿瘤)或者其程度。
本发明的检测(检查、诊断)方法例如也可以对于患有肿瘤的患者检测(检查、诊断)为了改善该肿瘤而给予治疗药物的情况下的该肿瘤是否改善或其程度。另外，本发明的检测(检查、诊断)方法还可用于可有效地适用以本发明的肽或多聚核苷酸为有效成分的医药品的治疗对象患者的筛选和该医药品产生的治疗效果的预测或判定等。此外，使用本发明的肿瘤检测剂的形态中，能够检测通过给予以本发明的肽为有效成分的癌症疫苗而在患者体内诱导的CTL可实际作为靶的递呈肿瘤抗原肽的癌细胞。
使用本发明的CTL检测剂的本发明的检测(检查)方法的特定的形态包括以下的(a)和(b)以及任意采用的(c)的工序：
(a)使由受检者得到的活体试样与本发明的CTL检测剂接触的工序；
(b)以上述CTL检测剂结合的细胞的量为指标测定该活体试样中的识别来源于PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的CTL的量的工序；
(c)基于(b)的结果判断是否罹患癌症的工序。
使用本发明的CTL检测剂的本发明的诊断方法的特定的形态包括上述(a)、(b)和(c)的工序。
使用本发明的肿瘤细胞检测剂的本发明的检测(检查)方法的特定的形态包括以下的(d)和(e)以及任意采用的(f)的工序：
(d)使由受检者得到的活体试样与本发明的肿瘤细胞检测剂接触的工序；
(e)测定该活体试样中的PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4的表达产物的量的工序；
(f)基于(e)的结果判断是否罹患癌症的工序。
使用本发明的肿瘤细胞检测剂的本发明的诊断方法的特定的形态包括上述(d)、(e)和(f)的工序。
使用本发明的肿瘤细胞检测剂的检测肿瘤细胞的方法的形态包括上述(d)、(e)的工序且包括下述(f')的工序代替(f)：
(f')基于(e)的结果确定活体试样中是否存在肿瘤细胞的工序。
作为在此所用的活体试样，可例举由受检者的活体组织(被怀疑存在癌细胞的组织及其周边组织或者血液等)制备的试样。具体来说，可例举由该组织采集的含组织细胞的试样等。
使用本发明的肿瘤检测剂的本发明的检测(检查)方法的特定的形态包括以下的(g)和(h)以及任意采用的(i)的工序：
(g)使由受检者得到的活体试样与本发明的肿瘤检测剂接触的工序；
(h)以上述肿瘤检测剂结合的细胞的量为指标测定该活体试样中的递呈来源于PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的细胞的量的工序；
(i)基于(h)的结果判断是否罹患癌症的工序。
使用本发明的肿瘤检测剂的本发明的诊断方法的特定的形态包括上述(g)、(h)和(i)的工序。
作为在此所用的活体试样，可例举由受检者的活体组织(被怀疑存在癌细胞的组织及其周边组织或者血液等)制备的试样。具体来说，可例举由该组织采集的含组织细胞的试样等。
使用本发明的CTL检测剂的本发明的检测方法(检查方法、诊断方法)的一种形态通过检测活体试样中的本发明的肽特异性CTL并测定其量来实施。具体来说，可如下进行：按照文献(Science,274:p94,1996，本文献通过引用而构成本申请的一部分)中记载的方法制备荧光标记的HLA抗原与本发明的肽的复合物的四聚体(HLA四聚体)，使用该四聚体通过流式细胞仪对被怀疑的患者的外周血淋巴细胞中的抗原肽特异性CTL进行定量。
有无肿瘤的预测、判定、判断或诊断例如可通过测定受检者的血液或被怀疑是肿瘤的受检组织中的本发明的肽特异性CTL的量或者递呈本发明的肽的细胞的量来进行。这时，可根据情况将正常的对应组织中的PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4的基因表达水平、本发明的肽水平或CTL水平等作为基准值，将该基准值与由受检者得到的试样中的所述水平比较，判定两者的差异来进行。
在此，受检者的受检组织与正常的对应组织的所述水平的比较可通过平行地进行以受检者的活体试样和正常人的活体试样为对象的测定来实施。不平行进行的情况下，可将使用多份(至少2份，较好是3份以上，更好是5份以上)正常的组织以均一的测定条件测定的的本发明的肽特异性CTL的量或递呈本发明的肽的细胞的量的平均值或统计学中值作为正常人的值、即基准值，用于比较。
受检者是否罹患癌症的判断例如可将该受检者的组织中的本发明的肽特异性的CTL的量或者递呈本发明的肽的细胞与正常人的这些水平相比多例如多2倍以上、较好是3倍以上作为指标来进行。
此外，对于给予本发明的肽或多聚核苷酸的受检者，也可通过测定本发明的肽特异性的CTL的量来判定实际上是否诱导了CTL。例如，可将该受检者的组织中的本发明的肽特异性的CTL的量与正常人的这些水平相比多例如2倍以上、较好是3倍以上作为指标，判定采用本发明的肽或多聚核苷酸的治疗有效。
＜12＞癌症的预防和/或治疗方法
本发明还涉及预防和/或治疗对象的癌症的方法，该方法包括将有效量的选自本发明的肽、多聚核苷酸、CTL、抗原递呈细胞、TCR样抗体、人工CTL、基因改造T细胞的有效成分给予需要其的对象的工序。
本发明中的“对象”只要是可能罹患癌症的生物个体即可，可以是任意的生物个体，但较好是人和非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等啮齿类，黑猩猩等灵长类，牛、山羊、绵羊等偶蹄目，马等奇蹄目，兔子、狗、猫等)的个体，更好是人的个体。本发明中，对象可以是健康的，也可以罹患某种疾病，但想要进行癌症的预防和/或治疗的情况下，典型的是指罹患癌症或有罹患癌症的风险的对象。本发明的一种形态中，对象为HLA-A24阳性。本发明的一种形态中，对象罹患PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症，或者有罹患的风险。本发明的一种形态中，对象罹患HLA-A24阳性且PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症，或者有罹患的风险。
作为本发明的预防/治疗方法中使用的本发明的肽、多聚核苷酸、CTL、抗原递呈细胞、TCR样抗体、人工CTL以及基因改造T细胞，可例举本说明书中记载的任一种。本发明中的有效量例如为减轻癌症的症状或者延缓或停止其发展的量，较好是抑制或者治愈癌症的量。此外，较好是不产生超过给药产生的益处的不良影响的量。所述量可通过采用培养细胞等的体外试验或者小鼠、大鼠等模型动物的试验适当确定，这些试验的方法对本领域技术人员已知。有效成分的具体的使用量可考虑关于需要其的对象的各种条件，例如症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、给药的时期及频率、并用的医药品、对治疗的反应性、剂型及对治疗的顺应性等而确定。
作为具体的使用量，例如本发明的肽的情况下，通常为0.0001mg～1000mg，较好是0.001mg～1000mg，更好是0.1mg～10mg，较好是将其数日～数月1次给药。此外，本发明的多聚核苷酸的情况下，通常为0.0001mg～100mg，较好是0.001mg～10mg，较好是将其数日～数月1次给药。此外，本发明的TCR样抗体的情况下，通常为0.0001mg～2000mg，较好是0.001mg～2000mg，较好是将其1周～4周1次给药。本发明的基因改造T细胞或人工CTL的情况下，通常为1×104～1×108，较好是1×105～1×107，较好是将其1天～4周1次给药。此外，作为给药方法，可使用皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药等已知的任意的合适的给药方法。此外，除了将本发明的肽或核苷酸直接给药至体内的直接体内法之外，还可使用从人采集某种细胞在体外使用本发明的肽或多聚核苷酸诱导CTL或抗原递呈细胞后将这些细胞植回体内的间接体内法。
本发明的预防/治疗方法的一种形态在给药的工序之前还包括筛选HLA-A24阳性的对象作为预防/治疗的对象的工序。本发明的该形态在上述进行筛选的工序之前还包括确定对象的HLA型的工序。对象的HLA型的确定可通过已知的任意的方法进行。此外，本发明的预防/治疗方法的一种形态在给药的工序之前还包括筛选有PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的对象作为预防/治疗的对象的工序。本发明的该形态在上述进行筛选的工序之前还包括检测对象的PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的工序。对象的PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的检测可使用上述＜11＞中记载的肿瘤的检测方法。本发明的预防/治疗方法的一种形态在给药的工序之前还包括筛选有HLA-A24阳性且PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的对象作为预防/治疗的对象的工序。本发明的该形态在上述进行筛选的工序之前还包括确定对象的HLA型的工序以及检测对象的PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的工序。
＜13＞以癌细胞为靶的癌症治疗药的筛选方法
使用本发明的肿瘤细胞检测剂的形态中，检测对象中的PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4的表达产物的表达量被认为与检测对象中的肿瘤细胞的量正相关。因此，通过比较对于检测对象给予癌症治疗药的候选化合物前后的PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4的表达产物的表达量，可判定给予的候选药物是否可用作以肿瘤细胞为靶的癌症治疗药。
本发明的筛选方法包括以下的工序(I)、(II)和任意采用的(III)：
(I)在将癌症治疗药的候选化合物给予对象之前，测定该对象中的PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4基因的表达产物的检测量A的工序；
(II)在将所述候选化合物给予所述对象的细胞群之后，测定该对象中的所述基因的表达产物的检测量B的工序；以及
(III)比较所述检测量A与B，该检测量A显著大于B的情况下，将所述候选化合物判定为具有以癌症干细胞为靶的特征的候选癌症治疗药的工序。
本发明的筛选方法的特定的形态包括上述工序(I)～(III)。在此，工序(I)和(II)的测定检测量的工序分别包括上述检测(检查、诊断)方法中的工序(d)和(e)。
＜14＞用于抑制基因表达的多聚核苷酸
如上所述，初次发现选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因为在除睾丸以外的正常组织中无表达，但在肿瘤细胞中表达的癌睾丸抗原。这提示这些基因的表达参与细胞的癌变，因此认为可通过抑制这些基因的表达来处置癌症。
即，本发明在一种形态中，涉及抑制选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达的基因表达抑制剂。
在细胞中选择性抑制特定基因的表达的方法无特别限定，可例举例如反义RNA法、RNA干扰(RNAi)法、CRISPR-Cas法、ZFN法、TALEN法等。其中，从生物利用度和脱靶效应低等观点来看，较好是反义RNA法和RNAi法，更好是RNAi法。
因此，本发明的一种优选形态中，基因表达抑制剂是针对选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的反义寡聚核苷酸。本发明中，针对某基因的“反义寡聚核苷酸”是指可通过与作为该基因的表达产物的mRNA杂交而抑制该基因的表达的寡聚核苷酸，其可以是DNA或RNA等任意的核酸。作为所述寡聚核苷酸，典型的是具有与该基因的mRNA的序列的一部分互补的序列的寡聚核苷酸。在此，“互补”一词是指某核酸可与其他核酸序列形成氢键，与特定的“序列(的一部分)互补的序列”是指具有可与具有该序列的核苷酸在细胞内环境中杂交的程度的互补性的序列。因此，不需要序列全部互补(即完全互补)。
本发明的反义寡聚核苷酸典型的是具有约15～30个核苷酸的长度。此外，为了人体内的稳定性和表达抑制活性的提高、脱靶效应的下降等目的，可实施该技术领域中已知的修饰。
此外，本发明的一种优选形态中，基因表达抑制剂是针对选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的siRNA。本发明中，针对某基因的“siRNA”是指可抑制该基因的表达的双链结构RNA，该双链结构RNA具有有义区域和反义区域，反义区域与特定基因的mRNA的序列互补，有义区域与反义区域的序列互补。本发明的siRNA的各有义区域和反义区域具有约15～30个核苷酸左右的长度，较好是19～27个核苷酸左右的长度。此外，有义区域和反义区域可由分别为有义链和反义链的2条链形成双链结构。此外，有义区域和反义区域可连结而构成1个核苷酸链，该情况下单链的RNA折叠成发卡状，有义区域和反义区域形成双链结构。
该技术领域中，已知使siRNA的表达抑制效果提高、或使生物利用度提高、或使脱靶效应降低的方法。本发明的siRNA可适当适用用于使作为siRNA的机能提高的这些已知的修饰和改变。
上述多聚核苷酸可通过该技术领域中公知的方法、例如市售的DNA合成装置容易地合成。
本发明在另一方面提供包含上述反义寡聚核苷酸和/或上述siRNA的医药组合物。作为本形态的医药组合物所含的其他成分，可例举例如药学上可允许的载体、稀释剂、赋形剂等，特别好是包含药学上可允许的载体。作为药学上可允许的载体，可例举例如脂质体、亲水性聚合物等，但并不仅限于此。
如上所述，认为可通过抑制选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达来处置癌症。因此，本形态的包含多聚核苷酸的上述医药组合物可用作癌症的预防剂和/或治疗剂。
本发明在另一种形态中还涉及一种预防和/或处置癌症的方法，其中，包括抑制选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达的工序。本方法中，除所给予的有效成分为抑制选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达的基因表达抑制剂，较好是抑制选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达的反义寡聚核苷酸以外，可按照上述＜12＞中记载的方法实施。
即，上述方法可以认为是一种预防和/或处置癌症的方法，其中，包括向需要的对象给予有效量的选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达抑制剂的工序。对象可以是健康的，也可以罹患某种疾病，但想要进行癌症的预防和/或治疗的情况下，典型的是指罹患癌症或有罹患癌症的风险的对象。因此，对象罹患PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症，或者有罹患的风险。
此外，本发明的预防/治疗方法的一种形态可在给药的工序之前还包括筛选有PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的对象作为预防/治疗的对象的工序。选择对象时，可使用上述＜11＞的在对象中检测PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40或DYRK4阳性的癌症的方法。
本形态中的有效量例如为减轻癌症的症状或者延缓或停止其发展的量，较好是抑制或者治愈癌症的量。此外，较好是不产生超过给药产生的益处的不良影响的量。所述量可通过采用培养细胞等的体外试验或者小鼠、大鼠等模型动物的试验适当确定，这些试验的方法对本领域技术人员已知。有效成分的具体的使用量可考虑关于需要其的对象的各种条件，例如症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、给药的时期及频率、并用的医药品、对治疗的反应性、剂型及对治疗的顺应性等而确定。
本说明书中提及的全部的专利、申请及其他出版物通过参照将其整体引用至本说明书中。
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例
例1.递呈于HLA-A24的天然肽的鉴定
(1)细胞表面HLA-A24分子的确认
分别使用作为人大肠癌细胞株的SW480、HCT-116、HCT-15/β2m和Colo320、作为肺腺癌细胞株的LHK2和作为肺鳞状细胞癌Sq-1，对存在于细胞表面的HLA-A24分子的局部分布进行了调查。
将进行了培养的上述癌细胞用0.25％的胰蛋白酶-EDTA(Gibco)处理，用冰冷PBS清洗，按照约2×105个/孔分装至U型底96孔板(Corning)。将细胞用380g离心5分钟，与产生抗HLA-A24单克隆抗体的小鼠杂交瘤C7709A2(由P.G.Coulie博士(de Duve Institute,Brussel)提供)或产生抗泛HLA I类抗体的小鼠杂交瘤W6/32的培养上清一起在冰上孵育1小时。将细胞用冰冷PBS清洗后，与FITC偶联山羊抗小鼠IgG抗体一起在冰上孵育30分钟。再次将细胞用冰冷PBS清洗后，用含1％甲醛的PBS重悬细胞，用BD FACS Calibur系统(BDBiosciences,Mountain View,CA)进行分析，测量与HLA-A24分子的量成比例的荧光强度。
结果示于图1。使用的6种细胞株(SW480、HCT-116、HCT-15/β2m、Colo320、LHK2和Sq-1)中，基因上为HLA-A*2402的SW480、HCT-15/β2m、Colo320、LHK2和Sq-1这5种中，对于C7709A2抗体也观察到与W6/32抗体同等程度的荧光强度。这意味着通过C7709A2选择性检出细胞表面的HLA-A24与自然肽的复合物。
(2)肽的分离
局部发布于癌细胞表面的自然肽与HLA-A24的复合物的分离按照Purcell等,Methods Mol Biol.2004,251,291-306和Escobar等,J.Immunol,2008,181:4874-4882中记载的方法进行。简单来说，收集产生抗HLA-A24单克隆抗体的小鼠杂交瘤C7709A2(由P.G.Coulie博士(de Duve Institute,Brussel)提供)的培养上清，将通过对于PEG-20,000(WAKO chemicals)的反渗透浓缩至约1/40的体积的浓缩液约40ml(调至pH约7.2～7.4)添加至约3ml的经过清洗的蛋白质A-琼脂糖珠(GE Healthcare)，在4℃摇晃一晚进行孵育。
然后，将珠粒用0.1M的硼酸缓冲液(pH8.2)和0.2M的三乙醇胺(pH8.2)进行清洗。对于与蛋白质A结合的抗体，通过将珠粒重悬于0.2M的三乙醇胺(pH8.3)加入20体积的20mM庚二亚氨酸二甲酯(DMP)二盐酸盐(Sigma)而得的液体中，通过共价键连结。偶联反应在室温的Rotamix中进行1～1.5小时。通过将琼脂糖珠与10体积的20～50mM单乙醇胺溶液一起在室温下于Rotamix中孵育2小时，淬灭DMP中残留的游离亚胺酸基。然后，将珠粒用0.1M的硼酸缓冲液进行清洗，加入0.02％的叠氮化钠在4℃保存。
细胞分别使用上述(1)中使用的细胞株。将细胞在含有0.5％的Nonidet P-40、50mM的Tris盐酸、150mM的NaCl和蛋白酶抑制剂(Roche)的冰冷缓冲液中裂解。在4℃通过2000g-10分钟、38000g-30分钟、100000g-90分钟的一系列离心使细胞裂解液澄清。在最后的离心后，收集上清，使其通过Poly-Prep层析柱(Bio-Rad)中的0.5ml的蛋白质A-琼脂糖珠浆，除去与蛋白质A非特异性结合的所有分子。
将所得的纯化前的裂解液与共价结合1ml的上述中制成的抗HLA-A24单克隆抗体(C7709A2)的蛋白质A-琼脂糖珠混合，在4℃用Rotamix温和地处理一晚。将珠粒依次用4种冰冷缓冲液(缓冲液1:0.005％Nonidet P-40、50mM Tris盐酸、pH8.0、150mM NaCl、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)和蛋白酶抑制剂；缓冲液2:50mM Tris盐酸、pH8.0和150mM NaCl；缓冲液3:50mM Tris盐酸、pH8.0和450mM NaCl；缓冲液4:50mM Tris盐酸、pH8.0)清洗。最后，将HLA分子与肽的复合物用6ml的10％乙酸溶出。接着，将HLA分子与肽通过使用3kDa截止过滤器Amicon Ultra-15Centrifugal Filter Units(Millipore)的超滤分离。将所得的5.5ml为止的通过组分用SpeedVac浓缩至数毫升，将0.1％甲酸作为溶剂重新溶解，供于与MALDI点样器件连结的纳米流HLPC系统。
(2)肽的鉴定
将肽在与MALDI点样器件连结的DiNa系统(KYA Technologies)中的HiQsilC18W-3柱(100μm ID×100mm；KYA Technologies,东京,日本)上分离。溶出溶剂A采用0.1％三氟乙酸(TFA)，溶出溶剂B采用70％乙腈中的0.1％三氟乙酸。浓度梯度设为80分钟内溶剂B呈5％～50％，流速设为300nL/分钟。将分离的肽点样于DiNa MaP MALDI点样系统中的Opti-TOFTM384 Well Insert(123×81mm)不锈钢MALDI板(AB Sciex,Foster City,CA)。每隔30秒收集150nL的肽组分，用70％ACN/0.1％TFA中的4mg/ml的α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA；Sigma,东京,日本)700nL和80μg/ml的柠檬酸氢铵覆层。质谱分析通过4800Plus MALDI-TOF/TOF分析仪(AB Sciex)4000系列Explorer软件(版本3.5.3)(AB Sciex)实施。为了校正质量的准确性，使用胰蛋白酶处理BSA标准(KYA Technology)和6-肽混合物(AB Sciex)。
前体离子扫描在600～3500m/z的范围内实施，为了最终发生的分离而选择具有10以上的S/N阈值的100个为止的前体离子(TOP100algorithm)。MS/MS的获得将空气作为碰撞气体，碰撞能量设为1kV实施。根据获得数据的肽鉴定使用ProteinPilot 3.0software(ABSciex)所采用的Paragon search algorithm，对human International Protein Index(IPI)数据库(ipi.HUMAN.v3.71.fasta，包含86739种蛋白质序列；ipi.HUMAN.v3.87.fasta，包含91444种蛋白质序列)和human UniProt Knowledge Base(UniProtKB_HUMAN.fasta，截止2014年6月包含88993种蛋白质序列)进行。
为了调查，选择以下的设定：sample type-identification；Cys.alkylation-none；digestion-none；instrument-4800；species-Homo sapiens；ID Focus-no focus/focus on amino acid substitutions；search effort-thorough。肽鉴定的原始数据(ProteinPilot's.group files)转换为EXCEL文档格式(微软)，对鉴定各图谱的氨基酸序列与其MS/MS离子信号之间的对应关系手动进行调查后，将判定为假阳性的从列表中除去。
结果示于图2。从所得的复合物分离自然肽并测定其序列后，5种细胞株的情况下，氨基酸数9的自然肽均占大部分。此外，对各氨基酸位置的氨基酸残基的分布进行了调查，结果自N末端起第2个氨基酸为酪氨酸且/或C末端的氨基酸为苯丙氨酸的肽占大部分(图2)。这符合HLA-A24的结合基序。
然后，调查了作为通过MS/MS测序的384种自然肽的来源的亲本蛋白质，绝大部分(304种)是分别来源于各亲本蛋白质的唯一的肽。所鉴定的亲本蛋白质中，30种提供2种自然肽，5种蛋白质提供3种自然肽，1种蛋白质提供5种自然肽。
例2.对HLA-A24的结合试验
(1)肽的合成
通过合成制造上述1.中所鉴定的自然肽(PH Japan Co.Ltd.,广岛)。将纯度70％以上的肽用于结合试验。作为关于HLA-A24结合性的阴性对照，使用合成肽GK12(序列编号6)。
(2)结合试验
将表达HLA-A24的T2细胞、即T2-A24细胞于27℃在CO2培养箱内孵育一晚。将收集的细胞用Opti-MEM重悬，以每孔约1×105个细胞/200μL接种于U型96孔板(康宁公司制)。以0.33μM、1μM和10μM的浓度分别添加对象肽，在CO2培养箱内于27℃孵育3小时，再于37℃孵育2.5小时。然后，将细胞在加入板中的状态下离心(380g，5分钟)，用100μL产生C7709A2单克隆抗体的杂交瘤培养上清重悬，在冰上孵育45～60分钟。用冰冷PBS清洗后，将细胞与FITC偶联山羊抗小鼠IgG抗体(KPL,Gaithersburg,MD)一起在冰上孵育30分钟。在加入板中的状态下用冰冷PBS清洗后，用1％甲醛和PBS重悬，用FACScan(BD Biosciences,MountainView,CA)进行分析，测量稳定HLA-A24分子的量的增加产生的平均荧光强度(MFI)位移(通过结合肽而稳定，因而荧光增大)。用非结合肽GK12(0～10μM)处理的细胞的MFI一定，将其用作阴性对照。
对于上述例1中得到的自然肽中随机选择的26种肽，测量肽浓度1μM时的MFI位移(ΔMFI)。此外，对于这些肽，使用NetMHC3.4分别算出评分，对与ΔMFI的相关关系进行了探讨。结果示于图3。可知ΔMFI与NetMHC评分以决定系数R2＝0.6呈线性相关。另外，可知将NetMHC评分的阈值设为0.15(ΔMFI相当于17)，显示比其大的NetMHC评分的情况下，推测为结合肽。可知其结果是所鉴定的384种自然肽中，推测273种肽为结合肽(即NetMHC＞0.15)(未示出数据)。
例3.肿瘤特异性基因的鉴定
(1)亲本基因在正常组织中的表达的确认
为了确认各正常组织中的基因表达，使用通过管家基因标准化的人cDNA面板(Human MTC Panels I和II，Clontech公司制)。此外，各癌细胞株的总RNA使用RNeasy MiniKit(Qiagen公司制)制备，使用寡聚(dT)引物和SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)制备cDNA。
使用上述中制成的cDNA文库，通过PCR对编码作为例2中推测为结合肽的273种肽的来源的亲本蛋白质的基因(亲本基因)的表达进行了确认。引物组以包含编码上述自然肽的区域且PCR产物为约200～400碱基对的长度的方式设计。PCR通过包含DreamTaq DNA聚合酶、10×DreamTaq缓冲液(Thermo Scientific公司制)、2mM的dNTP混合物、0.25μM的正向引物和反向引物、以及对应的cDNA模板的20μL的体积进行。PCR循环按照以下的条件进行：
[表1]
初期变性：94℃-2分钟
最终延伸：72℃-2分钟
浸渍：4℃-不定
将所得的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭可视化，在UV光进行观察。
(2)癌睾丸抗原的鉴定
作为癌抗原已知的基因中，存在正常的组织细胞中几乎未见表达的基因。所述基因大多仅在睾丸发现表达，所以被称为“癌睾丸抗原”。根据上述(1)的结果，选择推测为癌睾丸抗原的基因。其结果是，推测PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40、DYRK4和TOPK/CT84这6种基因为癌睾丸抗原。其中，对于TOPK/CT84，已经报道了其为癌睾丸抗原，来源于该基因的肽在癌细胞中被抗原递呈(国际公开第2013/061594号)。
例4.自然抗原肽的评价
对于以例3中推测的癌睾丸抗原基因为亲本基因的以下的各自然肽，进行作为自然抗原肽的评价试验。
PVT1:HWNDTRPAHF(序列编号1)
SUV39H2:RYGNVSHF(序列编号2)
ZNF724P:KYVKDFHKF(序列编号3)
SNRNP40:IFQGNVHNF(序列编号4)
DYRK4:VYTYIQSRF(序列编号5)
上述各基因的表达分析中使用下表的引物组。
[表2]
(1)关于PVT1及来源于其的自然肽
关于PVT1及序列编号1的肽的试验结果示于图4。PVT1以前作为ncRNA已知，但根据本发明人的研究，提示了至少癌细胞中在蛋白质水平上表达的可能性。PVT1在除睾丸以外的正常组织细胞中未发现mRNA水平上的表达，来源于PVT1的序列编号1的肽显示与HLA-A24的高结合性，所以被认为可作为免疫治疗的靶点。此外，该基因在癌细胞中特异性表达，所以有可能与癌细胞化和癌细胞的生存性相关，因此作为基于表达抑制等的核酸治疗等的靶点也期待具有效果。
(2)关于SUV39H2及来源于其的自然肽
关于SUV39H2及序列编号2的肽的试验结果示于图5。SUV39H2在除睾丸以外的正常组织细胞中未发现mRNA水平上的表达，来源于SUV39H2的序列编号2的肽显示与HLA-A24的高结合性，所以被认为可作为免疫治疗的靶点。此外，该基因在癌细胞中特异性表达，所以有可能与癌细胞化和癌细胞的生存性相关，因此作为基于表达抑制等的核酸治疗等的靶点也期待具有效果。
(3)关于ZNF724P及来源于其的自然肽
关于ZNF724P及序列编号3的肽的试验结果示于图6。ZNF724P在除睾丸以外的正常组织细胞中未发现mRNA水平上的表达，来源于ZNF724P的序列编号3的肽显示与HLA-A24的高结合性，所以被认为可作为免疫治疗的靶点。此外，该基因在癌细胞中特异性表达，所以有可能与癌细胞化和癌细胞的生存性相关，因此作为基于表达抑制等的核酸治疗等的靶点也期待具有效果。
(4)关于SNRNP40及来源于其的自然肽
关于SNRNP40及序列编号4的肽的试验结果示于图7。SNRNP40在除睾丸以外的正常组织细胞中未发现mRNA水平上的表达，来源于SNRNP40的序列编号4的肽显示与HLA-A24的高结合性，所以被认为可作为免疫治疗的靶点。此外，该基因在癌细胞中特异性表达，所以有可能与癌细胞化和癌细胞的生存性相关，因此作为基于表达抑制等的核酸治疗等的靶点也期待具有效果。
(5)关于DYRK4及来源于其的自然肽
关于DYRK4及序列编号5的肽的试验结果示于图8。DYRK4在除睾丸以外的正常组织细胞中未发现mRNA水平上的表达，来源于DYRK4的序列编号5的肽显示与HLA-A24的高结合性，所以被认为可作为免疫治疗的靶点。此外，该基因在癌细胞中特异性表达，所以有可能与癌细胞化和癌细胞的生存性相关，因此作为基于表达抑制等的核酸治疗等的靶点也期待具有效果。
例5.CTL诱导及评价
(1)CTL的诱导
将获得知情同意的HLA-A24阳性健康人的外周血采集至添加肝素的50mL针筒。将全血在添加了13mL的Lymphoprep(Nycomed公司)的50mL管(FALCON公司)中叠层，2000rpm离心分离30分钟。通过移液管回收Lymphoprep层上沉淀的PBMc层，用PBS清洗3次，作为人PBMC。
向96孔U型细胞培养用微孔试验板(BECTON DIKINSON公司)的各孔中，Hepes改良RPMI1640培养基(Sigma公司)中加入2-巯基乙醇(最终浓度55μM)、L-谷氨酰胺(最终浓度2mM)、作为抗生素的链霉素(最终浓度100μg/mL)和青霉素G(最终浓度100U/mL)及5％的血清成分而得的培养基10mL以及约3×107个/板的上述中分离的人PBMC，使其悬浮进行培养。向其中以10μg/mL的浓度加入序列编号1的来源于PVT1的自然抗原肽(以下记作“HF10”)或序列编号2的来源于SUV39H2的自然抗原肽(以下记作“RF8”)。培养2天后，以50U/mL的最终浓度添加IL-2，再培养2周。
对于适量的上述培养细胞加入20μL的CD8-FITC抗体，对于HF10脉冲细胞加入10μL的PE标记HF10/HLA-A24四聚体试剂，对于RF8脉冲细胞加入PE标记RF8/HLA-A24四聚体试剂，温和地混合，在4℃静置30分钟。1.加入5mL的PBS搅拌后，以3000rpm离心分离5分钟，吸去上清后，将细胞重悬于400μL的PBS，在24小时以内通过流式细胞仪进行分析，筛选CD8(+)和HLA-A24四聚体(+)的细胞组分增殖，制备CD8+T细胞克隆，作为CTL。
图9表示对各CTL的性质用HLA-A24四聚体试剂进行分析的流式细胞分析(四聚体试验)的结果。所有株均显示CD8(+)和自然抗原肽/HLA-A24四聚体(+)。此外，提示RF8脉冲CTL对HIV/HLA-A24四聚体的结合性低，对RF8/HLA-A24四聚体具有高特异性。
(2)干扰素(IFN)γ ELISPOT测试
实验使用人IFNγ ELISPOT套装(碧迪公司)进行。将稀释200倍的抗IFNγ抗体于4℃在ELISPOT板上静置一晚进行涂敷。用10％FCS补充RPMI(Sigma-Aldrich公司)将板在室温下培养2小时，进行封闭，制成ELISPOT板。
以20μg/mL的浓度将各肽在室温下对作为向人淋巴样干细胞T2细胞导入HLA-A2402基因使其表达的细胞株的T2-A24细胞(由爱知县癌症中心葛岛医生提供)进行1小时的脉冲。肽脉冲组采用[1]无肽脉冲、[2]HIV肽脉冲、[3]HF10或RF8肽脉冲这3组。肽脉冲后添加PBS，以1500rpm离心分离5分钟。细胞团以5×105个/mL悬浮，在ELISPOT板上各孔分别接种5×104个。将上述中制备的CTL向各孔分别接种5×104个，在37℃培养一晚。
从培养一晚的ELISPOT板除去培养液和细胞后，用Milli Q水清洗2次，用清洗缓冲液清洗3次。向各孔添加稀释250倍的生物素化检测抗体，在室温下培养2小时。用清洗缓冲液清洗3次后，向各孔添加稀释100倍的HRP标记链霉亲和素，在室温下培养1小时。用清洗缓冲液清洗3次并用PBS清洗2次后，向各孔添加显色试剂，在室温下进行15～30分钟的显色反应。确认形成足够的可见斑点后，用Milli Q水清洗，结束反应。干燥硝基纤维素膜后，用KSELISPOT(ZEISS社公司)检测，摄影。
此外，作为靶细胞，除经肽脉冲的T2-A24细胞之外，还使用癌细胞同样进行ELISPOT测试。关于癌细胞，对CTL克隆A10、E10和H3使用大肠癌细胞SW480和colo320以及肺癌细胞Sq-1，对CTL克隆11使用大肠癌细胞SW480。
结果示于图10。A表示使用以HF10肽诱导的CTL克隆A10、E10和H3的测试的结果。所有克隆均对以HF10脉冲的T2-A24细胞显示特异性反应性。此外，使用癌细胞的测试中，对例4中检出PVT1的mRNA的SW480和colo320显示反应性，但对未检出PVT1的mRNA的Sq-1未见反应。这表示SW480和colo320表达PVT1蛋白质，将HF10抗原递呈至细胞表面。
B表示使用以RF8肽诱导的CTL克隆11的测试的结果。该结果与HF10同样，以RF8脉冲的T2-A24细胞显示特异性反应性。此外，除肽脉冲细胞之外，对于RF8被分离的细胞、即SW480细胞也显示特异性反应性。这表示SW480将RF8抗原递呈至细胞表面。
(3)LDH致死测试
通过LDH致死测试(TaKaRa Bio公司)对上述中制备的RF8肽特异性CTL实际上是否攻击表达SUV39H2的细胞进行了分析。首先，作为成为RF8肽特异性CTL的攻击对象的靶细胞(Target)，与上述(2)同样，制备肽脉冲T2-A24细胞。靶细胞以1×104个/孔接种至96孔V型板(康宁公司)。RF8肽特异性CTL(Effector)按照图11中记载的E/T比(即靶细胞的3倍、10倍和30倍)对各孔分别调整细胞数，与接种至96孔板的靶细胞混合。然后，将96孔板以1800rpm离心10分钟后，在37℃的CO2培养箱中静置4小时至12小时。将96孔板离心，使细胞沉淀后，将100μL上清移至平底96孔板。向各孔中加入100μL含黄递酶的反应液在室温下静置30分钟，然后测定490nm的吸光度。通过该操作，通常存在于细胞膜内的LDH在细胞受到伤害的情况下因细胞膜的损伤而被释放至细胞外，因此可通过以吸光度测定培养液中的LDH量来判定细胞毒性。使用该方法，探讨RF8肽特异性CTL是否识别递呈RF8肽的靶细胞进行攻击。
接着，作为靶细胞，使用各种癌细胞进行同样的试验。作为靶细胞，使用了作为RF8被分离的细胞株的大肠癌细胞株SW480，以及作为肺癌细胞株的LHK2和Sq-1。确认两细胞株均表达SUV39H2，还表达HLA-A24。此外，作为阴性对照，使用已知未表达HLA的慢性骨髓性白血病K562细胞株。
结果示于图11。A表示对肽脉冲T2-A24细胞的伤害活性试验的结果，对无肽脉冲和HIV肽脉冲T2-A24未显示细胞伤害活性，而对通过RF8肽脉冲的T2-A24显示强细胞伤害活性。此外，B表示对各种癌细胞株的伤害活性试验的结果，对SW480、LHK2和Sq-1的细胞株均显示强细胞伤害活性。另一方面，对于作为阴性对照的K562，未显示细胞伤害活性。该结果显示RF8肽被自然递呈至SUV39H2表达细胞的HLA-A24，同时显示诱导的CTL对癌细胞带来抗肿瘤效果。
工业上利用的可能性
本发明的肽均为肿瘤特异性抗原递呈的肽，显示作为分子靶向治疗、免疫疗法、核酸治疗等肿瘤特异性治疗的靶点非常有用。特别是这些肽被鉴定为实际作为与HLA-A24的复合物被抗原递呈至癌细胞表面的肽，因此在免疫疗法中可特别优选使用。

Claims (35)

1.一种肿瘤抗原肽或其基序置换体，其中，该肽或其基序置换体由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质的氨基酸序列中连续的8～14个氨基酸形成，具有HLA结合性。
2.如权利要求1所述的肿瘤抗原肽或其基序置换体，其中，HLA为HLA-A24。
3.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，该肽是自N末端起第2个氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽，或者该肽中自N末端起第2个氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽。
4.如权利要求1～3中的任一项所述的肿瘤抗原肽，其中，该肽以序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4或序列编号5表示。
5.一种多条表位肽连结而成的多表位肽，其中，作为该表位肽，包含至少1条权利要求1～4中的任一项所述的肿瘤抗原肽。
6.一种多聚核苷酸，其中，该多聚核苷酸编码权利要求1～4中的任一项所述的肿瘤抗原肽或权利要求5所述的多表位肽中的至少1个。
7.一种表达载体，其中，包含权利要求6所述的多聚核苷酸。
8.一种基因导入用组合物，其中，包含权利要求7所述的表达载体。
9.一种抗原递呈细胞的制造方法，其中，包括使
(A)权利要求1～4中的任一项所述的肿瘤抗原肽或权利要求5所述的多表位肽、或者
(B)编码所述(A)的肽和/或多表位肽中的至少1个的多聚核苷酸与具有抗原递呈能力的细胞在体外接触的工序。
10.一种细胞毒性T细胞的诱导剂，其中，含有以下的(a)～(e)中的任一个作为有效成分：
(a)权利要求1～4中的任一项所述的抗原肽或权利要求5所述的多表位肽；
(b)权利要求6所述的多聚核苷酸；
(c)权利要求7所述的表达载体；
(d)由选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因编码的蛋白质、编码该蛋白质的多聚核苷酸或包含该多聚核苷酸的表达载体；
(e)将权利要求1～4中的任一项所述的抗原肽作为抗原的抗原递呈细胞。
11.一种细胞毒性T淋巴细胞的诱导方法，其中，包括使
(A)权利要求1～4中的任一项所述的肿瘤抗原肽或权利要求5所述的多表位肽、
(B)编码所述(A)的肽和/或多表位肽中的至少1个的多聚核苷酸、或者
(C)将权利要求1～4中的任一项所述的抗原肽作为抗原的抗原递呈细胞与外周血淋巴细胞在体外接触的工序。
12.一种医药组合物，其中，包含以下的(a)～(e)中的任一个作为有效成分：
(a)权利要求1～4中的任一项所述的抗原肽或权利要求5所述的多表位肽；
(b)权利要求6所述的多聚核苷酸；
(c)权利要求7所述的表达载体；
(d)选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的蛋白质、编码该蛋白质的多聚核苷酸或包含该多聚核苷酸的表达载体；
(e)特异性杀伤将权利要求1～4中的任一项所述的抗原肽作为抗原的抗原递呈细胞的细胞毒性T细胞。
13.一种医药组合物，其中，包含权利要求1～4中的任一项所述的抗原肽和/或权利要求5所述的多表位肽作为有效成分。
14.如权利要求12或13所述的医药组合物，其中，还包含佐剂。
15.如权利要求12～14中的任一项所述的医药组合物，其中，所述组合物是癌症的预防和/或治疗剂。
16.如权利要求12～15中的任一项所述的医药组合物，其中，所述组合物是癌症的预防和/或治疗用疫苗。
17.如权利要求12～16中的任一项所述的医药组合物，其中，该组合物与免疫检查点抑制剂一起使用。
18.一种HLA多聚体，其中，该多聚体包含权利要求1～4中的任一项所述的抗原肽和HLA。
19.一种诊断药物，其中，包含权利要求18所述的HLA多聚体。
20.一种T细胞受体样抗体，其中，该抗体识别权利要求1～4所述的抗原肽与HLA的复合物。
21.一种肿瘤检测剂，其中，含有权利要求20所述的T细胞受体样抗体。
22.一种嵌合抗原受体，其中，该受体识别权利要求1～4所述的抗原肽与HLA的复合物。
23.一种人工CTL，其中，包含识别权利要求1～4所述的抗原肽与HLA的复合物的T细胞受体。
24.一种双重特异性抗体，其中，该抗体特异性识别权利要求1～4中的任一项所述的抗原肽与HLA的复合物以及淋巴细胞表面抗原。
25.一种肿瘤细胞检测剂，其中，包含用于检测选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的表达产物的检测剂。
26.如权利要求25所述的肿瘤细胞检测剂，其中，该检测剂用于在包含来源于选自肺、大肠、小肠、脑、心脏、胎盘、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、卵巢和血液的1种或2种以上的活体试样的细胞的细胞群中检测肿瘤细胞。
27.如权利要求25或26所述的肿瘤细胞检测剂，其中，基因的表达产物为mRNA和/或内源性多肽。
28.如权利要求25～27中的任一项所述的肿瘤细胞检测剂，其中，基因的表达产物为mRNA，该检测剂包含具有与所述基因互补的碱基序列的探针和/或引物。
29.如权利要求25～28中的任一项的肿瘤细胞检测剂，其中，基因的表达产物为内源性多肽，该检测剂包含与该内源性多肽特异性反应的检测物质。
30.如权利要求29所述的肿瘤细胞检测剂，其中，检测物质为抗体。
31.一种用于筛选使用权利要求12～17中的任一项所述的医药组合物的癌症处置方法有效的治疗对象患者的诊断药物，其中，包含权利要求18所述的HLA多聚体、权利要求20所述的T细胞受体样抗体和/或权利要求25～30中的任一项所述的肿瘤细胞检测剂。
32.针对选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因的反义寡聚核苷酸。
33.一种siRNA，其中，包含与选自PVT1、SUV39H2、ZNF724P、SNRNP40和DYRK4的基因互补的反义区域以及与该反义区域至少部分互补的有义区域。
34.一种医药组合物，其中，包含权利要求32所述的反义寡聚核苷酸和/或权利要求33所述的siRNA以及药学上可允许的载体。
35.如权利要求34所述的医药组合物，其中，所述组合物是癌症的预防剂和/或治疗剂。
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