ES2317368T3 - Metodo para evaluar el efecto de un inhibidor de la angiogenesis a traves de la inhibicion de la expresion de la integrina. - Google Patents
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Abstract
Método para evaluar la influencia de un fármaco sobre la expresión de integrina, que comprende la etapa en la que se mide la cantidad de expresión de integrina en plaquetas recogidas de un paciente al cual se le administra el fármaco y la etapa en la que se determina la influencia del fármaco sobre la expresión de integrina en células que no son plaquetas sobre la base de la reducción de la cantidad de expresión medida, en el que la integrina es integrina alfa2, y las células son células de un tejido en el cual se puede producir angiogénesis o células tumorales, y en el que el fármaco es N-(3-ciano-4-metil-1H-indol-7-il)-3-cianobencenosulfonamida, o una sal farmacológicamente aceptable del mismo o un hidrato del mismo.
Description
Método para evaluar el efecto de un inhibidor de
la angiogénesis a través de la inhibición de la expresión de la
integrina.
La presente invención se refiere a un método
para evaluar el efecto de un fármaco que influye en la expresión de
integrinas, preferentemente un inhibidor de la angiogénesis.
El cáncer es una dolencia que presenta una
mortalidad elevada, y el objetivo de los tratamientos con agentes
anticancerosos reside en general en mejorar la QOL (calidad de vida)
del paciente y en prolongar el tiempo de supervivencia. No
obstante, resulta difícil determinar el efecto de prolongación de la
vida de un fármaco en un periodo de tiempo breve, y por lo tanto,
como marcadores indirectos que actúan como índices del efecto
terapéutico, se están usando la tasa de reducción del tumor y el
nivel de antígenos tumorales en sangre.
Además, como el uso del periodo de prolongación
de la vida para determinar el efecto del fármaco en estudios
clínicos de agentes anticancerosos requiere también un estudio de
larga duración, como marcador indirecto se ha usado la tasa de
reducción del tumor, la cual se puede evaluar en un periodo de
tiempo relativamente breve. No obstante, se ha señalado que es
posible que la tasa de reducción del tumor no actúe necesariamente
como índice de prolongación de la vida. Por consiguiente, además de
la tasa de reducción del tumor, se ha intentado usar como
marcadores indirectos el tiempo hasta la progresión, el periodo de
supervivencia libre de enfermedad, marcadores biológicos, etcétera.
No obstante, estos métodos no se han establecido todavía.
Se considera que si, como marcador indirecto se
puede utilizar un marcador biológico que indique un cambio inducido
por la administración de un fármaco y asociado íntimamente a la
prolongación del tiempo de supervivencia, en un estudio clínico se
puede determinar fácilmente un método de tratamiento adecuado, y el
marcador se puede usar como índice del efecto terapéutico del
fármaco durante el tratamiento.
Los siguientes marcadores se han dado a conocer
como indirectos.
El Panorex, el cual es un anticuerpo dirigido a
la glicoproteína EpCAM, se observó en primer lugar como marcador
tumoral de células cancerosas de colon y posteriormente se
identificó como molécula de adhesión. Se está revisando su
correlación con la tasa de supervivencia como marcador indirecto de
la eliminación de células de microcarcinoma que quedan en la médula
ósea (Stephan B et al., Clinical Cancer Research, 1999, 5,
3999-4004), y en paralelo se están efectuando
estudios clínicos de fase III a gran escala.
Los antígenos específicos prostáticos se han
usado como marcador indirecto en la terapia hormonal del cáncer
prostático para determinar las dosis óptimas (Denis L. Y Mahler C.
Urology, 1996, 47 (1ª Suppl.), 26-32).
En cuanto al uso de un marcador indirecto de un
inhibidor de la angiogénesis, en un estudio clínico de fase I del
BMS275291, que es un inhibidor de la metaloproteasa de matriz, se ha
examinado un método de uso de la angiogénesis en la cicatrización
de heridas después de que se haya realizado un agujero en la piel
como indicador. Además, con respecto a otro inhibidor de la
metaloproteasa de matriz, se ha dado a conocer un método de uso de
la actividad enzimática en un punto del tumor como marcador (Clin.
Cancer Res., 2000, 6(8), 3290-6).
Además, se espera que los inhibidores de la
angiogénesis actúen como agentes terapéuticos eficaces para
dolencias diferentes al cáncer, por ejemplo, arterioesclerosis,
retinopatía diabética, oclusión de venas retinianas, retinopatía
del prematuro, degeneración macular asociada a la edad, glaucoma
neovascular, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil,
psoriasis, angioma, angiofibroma y otras. Si se halla un marcador
indirecto de la angiogénesis, resultará posible determinar una
dosis adecuada de un fármaco, el efecto del fármaco y el periodo de
administración al usarlo como índice también en estas dolencias.
Las integrinas son moléculas de adhesión celular
que se expresan sobre una superficie celular y que están compuestas
por cadenas \alpha y cadenas \beta. Las integrinas están
involucradas en la adhesión entre proteínas de membranas de matriz
extracelular y células así como en la adhesión entre células. Cuando
una molécula de adhesión celular se une a una integrina, en la
célula comienzan a actuar sistemas de señalización. Como
consecuencia, se producen no solamente adhesión celular, sino
también extensión celular, crecimiento celular, apoptosis,
diferenciación, orientación del citoesqueleto, migración celular,
formación de tejidos, invasión cancerosa y metástasis,
cicatrización de heridas, coagulación sanguínea, etcétera.
De entre estas integrinas, se sabe que la
integrina \alpha2\beta1 actúa sobre el colágeno, la laminina y
otros, como moléculas de adhesión y que está implicada en la
formación tubular de células endoteliales vasculares durante la
angiogénesis (George E. et al., Exp. Cell. Res., 1996, 224,
39-51). Además, se ha dado a conocer también que
los anticuerpos dirigidos a la integrina \alpha1 y a la integrina
\alpha2 inhibían la angiogénesis inducida por VEGF in vivo
(Donald R.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1997, 94,
13612-13617).
La integrina \alphav\beta3 existe
específicamente en células endoteliales bajo angiogénesis, y se ha
dado a conocer que el anticuerpo neutralizante de la integrina
\alphav\beta3 (LM609) inhibía la angiogénesis inducida por el
factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF-2) en un
modelo de angiogénesis que utilizaba la membrana corioalantoidea de
un embrión de pollo (Brook, P.C. et al., Science, 1994, 264,
569-571). Además, se ha dado a conocer también que
la integrina \alphav\beta3 está implicada en la angiogénesis
inducida por el FGF-2 y el factor de necrosis
tumoral \alpha, y que la integrina \alphav\beta5 está
implicada en la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento transformador
\alpha (Friedlander, M et al., Science, 1995, 270,
1500-1502). El anticuerpo
anti-integrina \alphav\beta3 y el inhibidor de
la integrina \alphav\beta3 están actualmente bajo estudios
clínicos.
Uno de los objetivos de la presente invención es
proporcionar un marcador indirecto para un fármaco que influye en
la expresión de una integrina, preferentemente la integrina
\alpha2, e inhibe la angiogénesis.
Los inventores de la presente invención
observaron que, en unas condiciones tales en las que la expresión
de la integrina \alpha2 se reduce, la angiogénesis disminuye, y
por lo tanto el crecimiento de las células cancerosas se inhibe por
medio de un fármaco representado por un compuesto de la fórmula
general (II) (al que en lo sucesivo se hará referencia como
"Compuesto A"), el cual inhibe la angiogénesis a través de la
inhibición de la expresión de la integrina \alpha2, reduciéndose
también la expresión de la integrina \alpha2 en las superficies
de plaquetas de sangre periférica.
Observaron además que la cantidad de integrina
\alpha2 sobre las superficies de las plaquetas de la sangre
periférica resultaba útil como marcador indirecto de la inhibición
de la angiogénesis, y por lo tanto materializaron la presente
invención.
Es decir, la presente invención proporciona los
siguientes aspectos.
- 1.
- Método para evaluar la influencia de un fármaco sobre la expresión de integrina, el cual comprende la etapa en la que se mide la cantidad de expresión de integrina en las plaquetas recogidas de un paciente al cual se le administra el fármaco y la etapa en la que se determina la influencia del fármaco sobre la expresión de integrina en otras células que no sean las plaquetas sobre la base de la reducción de la cantidad de expresión medida, en el que la integrina es integrina \alpha2, y las células son células de un tejido en el cual se puede producir angiogénesis o células tumorales, y en el que el fármaco es N-(3-ciano-4-metil-1H-indol-7-il)-3-cianobencenosulfonamida, o una sal farmacológicamente aceptable del mismo o un hidrato del mismo.
- 2.
- Método según el punto 1, en el que la cantidad de expresión de integrina se mide a través de un método inmunoquímico.
- 3.
- Método según el punto 2, en el que el método inmunoquímico es un método de citometría de flujo.
- 4.
- Método según el punto 1, en el que la cantidad de expresión de integrina se mide midiendo una cantidad de codificación de ARNm para la integrina.
- 5.
- Método según el punto 4, en el que la cantidad de ARNm se mide mediante una PCR cuantitativa.
- 6.
- Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que las células que no son plaquetas son células de un tejido en el cual se puede producir angiogénesis, y la inhibición sobre la expresión de integrina se determina como una acción inhibitoria de la angiogénesis.
- 7.
- Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que las células que no son plaquetas son células tumorales, y la inhibición sobre la expresión de integrina se determina como una acción inhibitoria del crecimiento tumoral.
La Fig. 1 muestra el efecto del Compuesto A
sobre la expresión de la integrina \alpha2.
La Fig. 2 muestra la influencia del anticuerpo
anti-integrina \alpha2 sobre la formación de
tubos.
La Fig. 3 muestra la influencia del Compuesto A
sobre la formación de tubos.
La Fig. 4 muestra una acción inhibitoria del
Compuesto A sobre el aumento del volumen del tumor.
La Fig. 5 muestra la influencia del Compuesto A
sobre la expresión de la integrina \alpha2 en plaquetas.
El método de la presente invención es un método
para evaluar la influencia de un fármaco sobre la expresión de
integrina, el cual comprende la etapa en la que se mide la cantidad
de expresión de integrina en plaquetas de un paciente al cual se
administra el fármaco, y la etapa en la que se determina la
influencia del fármaco sobre la expresión de integrina en células
que no sean plaquetas sobre la base de la cantidad de expresión
medida.
La integrina es preferentemente integrina
\alpha2. La integrina \alpha2 es uno de los miembros de la
familia de moléculas de adhesión de las integrinas expresadas sobre
superficies celulares. La secuencia de la integrina humana
\alpha2 está registrada en el GenBank con el n.º de Acceso
NM_002203.
El Compuesto A antes mencionado reduce, en
particular, la expresión de integrina \alpha2, y presenta una
acción inhibitoria de la angiogénesis y una acción contra el
crecimiento tumoral. Por esta razón, el efecto de un fármaco
representado por el Compuesto A se puede determinar con una
sensibilidad mayor midiendo la cantidad de expresión de integrina
\alpha2 en plaquetas.
Las dosis y los métodos para administrar un
fármaco a un paciente no están limitados de forma específica, y se
pueden usar aquellos que resulten adecuados para la finalidad del
fármaco. El método de la presente invención se usa preferentemente
para evaluar la influencia de un fármaco administrado por
administración sistémica tal como administración oral.
Las células que no son plaquetas no están
limitadas de forma específica, pero son preferentemente células de
un tejido en el cual se puede producir angiogénesis. Por ejemplo, se
pueden mencionar las células endoteliales vasculares de un tejido
tumoral. Además, las mismas son preferentemente fibroblastos o
células tumorales, por ejemplo, células de melanoma, en las cuales
a través de la integrina \alpha2 se transmiten señales tales como
las correspondientes al crecimiento celular, apoptosis y
diferenciación. Además, como la expresión de la integrina \alpha2
se ha confirmado en monocitos, células B y células T, también se
pueden mencionar estas células. El método de la presente invención
resulta también útil para realizar estimaciones de funciones de
estas células.
El método para medir la cantidad de expresión de
integrina en plaquetas no está limitado de forma específica. La
cantidad de expresión de integrina se puede medir a través de un
método inmunoquímico u otro similar, o se puede medir una cantidad
de codificación de ARNm para la integrina.
Entre los ejemplos del método destinado a medir
la cantidad de expresión de integrina basado en un método
inmunoquímico se incluyen un método FACS. El método FACS es un
método de medición de la intensidad de fluorescencia o de un factor
similar de células con tinción inmunoquímica y con anticuerpos
marcados con fluorescencia mediante el uso de un separador celular
activado por fluorescencia.
Entre los ejemplos del método para medir la
cantidad de codificación de ARNm para la integrina se incluyen la
PCR cuantitativa.
De aquí en adelante se explicará detalladamente
una realización de la etapa de medición de la cantidad de expresión
en el siguiente orden 1. aislamiento de plaquetas, 2. cuantificación
de la cantidad de integrina sobre las superficies de las plaquetas
y 3. cuantificación de la cantidad de ARNm de integrina en las
plaquetas.
Las plaquetas se pueden aislar mediante técnicas
de centrifugación, filtración en gel, citometría de flujo y
otras.
1) Centrifugación: Se añade a la sangre un
volumen del 10% de disolución acuosa de citrato de sodio al 3,8% y
la mezcla se centrifuga a 100 x g a temperatura ambiente durante 10
minutos. La capa superior se usa como plasma rico en plaquetas y se
centrifuga a 1500 x g durante 10 minutos. A partir de los
precipitados se obtienen plaquetas.
2) Citometría de flujo: En un citómetro de flujo
se hizo fluir sangre diluida con PBS o una disolución similar y la
misma se expuso a un haz de láser o un haz similar. Las plaquetas se
pueden aislar con respecto a otras células sanguíneas basándose en
las intensidades de la luz de dispersión frontal y la luz de
dispersión lateral generadas en ese momento.
La cantidad de integrina sobre las superficies
de las plaquetas se puede cuantificar a través de un método
inmunoquímico, por ejemplo, tinción inmunohistológica, ELISA,
transferencia Western, citometría de flujo y otras similares. Por
ejemplo, en el ELISA, las plaquetas se unen a una fase sólida a
través de anticuerpos dirigidos a un antígeno de superficie de
plaquetas y por lo tanto inmovilizados en la fase sólida, y se
produce un lavado de las mismas. A continuación, con este conjunto
se hacen reaccionar anticuerpos anti-integrina
marcados, y la integrina sobre las superficies de las plaquetas se
puede cuantificar a partir de la cantidad de las marcas de unión.
En la transferencia Western, por ejemplo, las plaquetas aisladas se
solubilizan en un tampón que contiene SDS y a continuación se
someten a una SDS-PAGE y a una transferencia
Western. La integrina transferida sobre una membrana se puede
cuantificar usando anticuerpos anti-integrina
marcados. En este caso, si la cantidad de plaquetas se cuantifica
usando anticuerpos dirigidos a un antígeno de superficie de las
plaquetas al mismo tiempo, también se puede cuantificar la cantidad
de integrina por plaqueta.
En la citometría de flujo, por ejemplo, la
sangre total se diluye y se une con anticuerpos
anti-integrina marcados. Se puede aislar una
fracción de las plaquetas basándose en la luz de dispersión frontal
y la luz de dispersión lateral, y se puede cuantificar la cantidad
de integrina sobre las plaquetas midiendo la intensidad de la
fluorescencia sobre las mismas. La citometría de flujo se explicará
posteriormente de forma específica, aunque el alcance de la
presente invención no queda limitado por la explicación. Mediante el
uso de la citometría de flujo, se puede cuantificar la cantidad de
integrina usando sangre total sin aislar plaquetas.
4 \mul de sangre se diluyen con 396 \mul de
PBS que contenía una disolución acuosa de citrato de sodio 0,0038%.
Unos anticuerpos dirigidos a la integrina marcados con FITC,
preferentemente anticuerpos dirigidos a la integrina \alpha2, por
ejemplo, anticuerpos anti-CD49b de ratón marcados
con FITC (BD Pharmingen, Cat. N.º BD-558757) en el
caso de los ratones, o anticuerpos anti-CD49b humano
marcados con FITC (BD Pharmingen, Cat. N.º
BD-555498) en el caso de los humanos, se diluyen con
PBS que contenía BSA 0,1% hasta obtener una concentración adecuada.
A 90 \mul de la sangre diluida se le añaden 10 \mul de los
anticuerpos. La mezcla se deja reaccionar a temperatura ambiente
durante 60 minutos y se hace pasar a través de un filtro (FALCON,
Cat. N.º 2235). Al residuo se le añaden 900 \mul de PBS, y se
aísla una fracción de plaquetas basándose en las intensidades de la
luz de dispersión frontal y la luz de dispersión lateral medidas
mediante el uso de un citómetro de flujo (Becton Dickinson, FACS
Calibur). Se cuantifica la integrina, preferentemente la integrina
\alpha2, sobre las plaquetas midiendo la intensidad de
fluorescencia en las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN se puede extraer con el método del
tiocianato de guanidina, el método del fenol o métodos similares.
Las plaquetas aisladas se disuelven en 1 ml de ISOGEN y se dejan a
temperatura ambiente durante 5 minutos. A la mezcla se le añaden
0,2 ml de cloroformo, y la mezcla se agita y a continuación se deja
durante 2 minutos. La mezcla de la reacción se centrifuga a 4ºC
durante 15 minutos a 13000 rpm (MX-150, TOMY, Rotor
TMA-11), y el sobrenadante se transfiere a otro
tubo. Se añaden 0,5 ml de isopropanol y la mezcla se deja a
temperatura ambiente durante 5 minutos. La mezcla se centrifuga a
13000 rpm a 4ºC durante 10 minutos (MX-150, TOMY,
Rotor TMA-11), y el sobrenadante se descarta. A los
precipitados se les añade 1 ml de disolución de etanol acuosa al
70% y la mezcla se centrifuga a 15000 rpm a 4ºC durante 15 minutos
(MX-150, TOMY, Rotor TMA-11). El
sobrenadante se descarta, y los precipitados se disuelven en
H_{2}O libre de Rnasa.
El ARN se puede cuantificar mediante técnicas de
análisis de transferencia Northern, análisis de transferencia de
puntos, ensayo de protección contra la Rnasa, RT-PCR
comparativa, RT-PCR competitiva, PCR cuantitativa y
otras. Se prefiere la PCR cuantitativa. A continuación se explicará
la técnica de la PCR cuantitativa, aunque el ámbito de la presente
invención no queda limitado por dicha explicación. La PCR
cuantitativa se realiza de la forma siguiente usando una Sonda
TagMan y un Sistema de Detección de Secuencias ABI Prism 7700
(Perkin-Elmer Applied Biosystems).
La operación se realiza con dos etapas de
reacción de transcripción inversa y PCR. La reacción de
transcripción inversa de la primera etapa se lleva a cabo añadiendo
Dntp, un cebador oligo d(T)_{16}, un inhibidor de
la Rnasa y Transcriptasa Inversa Multiescribe
(Perkin-Elmer Applied Biosystems) al ARN obtenido,
manteniendo la mezcla a 25ºC durante 10 minutos y a continuación
calentando la mezcla a 48ºC durante 30 minutos. La mezcla se
calienta a 95ºC durante 5 minutos para finalizar la reacción.
El ADNc obtenido se usa en la PCR de la segunda
etapa. La PCR se lleva a cabo, por ejemplo, en un sistema de
reacción que comprende 2,5 ng de ADNc, 1 x tampón de PCR TagMan, 3
Mm de MgCl_{2}, 200 Mm de cada uno de entre Datp, Dctp y Dgtp,
400 Mm de Dutp, 200 Nm de un par de cebadores, 0,01 U/\mul de la
UNG AmpErase, y
0,025 U/\mul de ADN Polimerasa ApliTaq Gold (Perkin-Elmer Applied Biosystems). En cuanto a las condiciones de reacción, las reacciones se realizan a 50ºC durante 2 minutos y 95ºC durante 10 minutos seguidas por un ciclo que consta de reacciones a 95ºC durante 20 segundos, a 55ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 30 segundos, lo cual se repite 40 veces. Los cebadores y la sonda se diseñan usando el Primer Expression (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Para la comparación de dos o más muestras, se usan valores cuantificados después de la corrección sobre la base del nivel de ARNm de un gen de mantenimiento, el cual presenta una variación reducida en la cantidad de transcripción en cada muestra, preferentemente el nivel de ARNm de la GAPDH.
0,025 U/\mul de ADN Polimerasa ApliTaq Gold (Perkin-Elmer Applied Biosystems). En cuanto a las condiciones de reacción, las reacciones se realizan a 50ºC durante 2 minutos y 95ºC durante 10 minutos seguidas por un ciclo que consta de reacciones a 95ºC durante 20 segundos, a 55ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 30 segundos, lo cual se repite 40 veces. Los cebadores y la sonda se diseñan usando el Primer Expression (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Para la comparación de dos o más muestras, se usan valores cuantificados después de la corrección sobre la base del nivel de ARNm de un gen de mantenimiento, el cual presenta una variación reducida en la cantidad de transcripción en cada muestra, preferentemente el nivel de ARNm de la GAPDH.
La influencia de un fármaco sobre la expresión
de integrina en células que no sean plaquetas se determina
basándose en la cantidad de expresión medida con la etapa de
medición de la cantidad de expresión tal como se ha descrito
anteriormente. Esta determinación se puede realizar basándose en la
correlación de la cantidad de expresión de integrina en plaquetas
con la cantidad de expresión de integrina en células que no sean
plaquetas. Es decir, si la cantidad de expresión en las plaquetas
disminuye, se puede determinar que el fármaco presenta una
influencia de disminución de la expresión de integrina en células
que no sean plaquetas. Por el contrario, cuando la cantidad de
expresión en las plaquetas aumenta, se puede determinar que el
fármaco presenta una influencia de aumento de la expresión de
integrina en células que no sean plaquetas.
El fármaco es
N-(3-ciano-4-metil-1H-indol-7-il)-3-cianobencenosulfonamida.
Este fármaco puede formar una sal con un ácido o
una base. La presente invención incluye también sales del fármaco.
Entre los ejemplos de la sal con un ácido se incluyen sales con
ácidos inorgánicos tales como hidrocloruros, hidrobromuros y
sulfatos y sales con ácidos orgánicos tales como ácido acético,
ácido láctico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico,
ácido cítrico, ácido benzoico, ácido metanosulfónico y ácido
p-toluensulfónico, y entre los ejemplos de la sal
con una base se incluyen sales inorgánicas tales como sales de
sodio, sales de potasio y sales de calcio y sales con bases
orgánicas tales como trietilamina, arginina y lisina.
Los hidratos así como los isómeros ópticos de
estos compuestos, en el caso de que existan, están todos ellos
incluidos evidentemente en el alcance de los compuestos.
Los compuestos destinados a ser usados en la
presente invención se pueden producir a través de varios métodos.
Por ejemplo, algunos de los métodos se dan a conocer específicamente
en los documentos de publicación de patente japonesa (Kokai) n.º
7-165708 y 8-231505.
\vskip1.000000\baselineskip
Se explicará más específicamente la presente
invención haciendo referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplo de Referencia
1
A partir de cordón umbilical humano se aislaron
células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y las mismas
se cultivaron en un medio EGM (FCS 2%, libre de hidrocortisona,
Clonetics). Las células se subcultivaron en un matraz recubierto
con colágeno de tipo I (Sumilon), y se usaron del cuarto al sexto
subcultivos. El anticuerpo anti-integrina humana
\alpha2 (A2-IIE10) se adquirió en Upstate
Biotechnology Inc. El anticuerpo anti-CD31 humano
(JC/70ª) y un fragmento F(ab')_{2} marcado con FITC de
inmunoglobulina de conejo anti-ratón se adquirieron
en Dako.
Las células se inocularon en un matraz de 25
cm^{2} para el cultivo de las mismas y se cultivaron a 37ºC en un
incubador de CO_{2}. Después de 3 horas, el medio se sustituyó con
el mismo medio con el Compuesto A (5, 50, 500 ng/ml) y se cultivó
adicionalmente durante 48 horas. Las células se recogieron, y 2 x
10^{5} células se dejaron flotar en 100 \mul de PBS (BSA 0,1%,
NaN_{3} 0,05%). Se añadió 1 \mug del anticuerpo primario, y las
células se incubaron a 4ºC durante 30 minutos, se lavaron con PBS y
a continuación se incubaron con el anticuerpo secundario marcado
con FITC durante 30 minutos. Las células se lavaron con PBS y a
continuación se inmovilizaron con CellFix (Becton Dickinson). Se
midió el valor de fluorescencia de 2 x 10^{4} de cada muestra
usando un método FACS Calibur (Becton Dickinson). Se obtuvo la
cantidad de expresión de la molécula de la superficie celular
mediante la corrección del valor de fluorescencia de cada muestra
usando el valor de fluorescencia de la muestra de control, la cual
no contenía el anticuerpo primario (siguiente ecuación).
RMFI
(intensidad de fluorescencia media relativa) = MFI de la Muestra
(intensidad de fluorescencia media)/MFI de
Fondo
Tal como se muestra en la Fig. 1, el Compuesto A
(50, 500 ng/ml) redujo la cantidad de expresión de la integrina
\alpha2 en las HUVEC.
Ejemplo de Referencia
2
Se colocó gel de colágeno de tipo I en cada
pocillo de una placa de 24 pocillos y el mismo se dejó elificar, y
se inocularon, a una densidad de entre 1 y 1,2 x 10^{5} células
por pocillo, células HUVEC suspendidas en un medio sin suero (Medio
de Crecimiento Basal SFM-Endotelial Humano, GIBCO
BRL) que contenía 10 ng/ml de EGF (GIBCO BRL) y 20 ng/ml de Bfgf
(GIBCO BRL) o 20 ng/ml de VEGF (Wako Pure Chemical Industries). Las
células se cultivaron durante la noche a 37ºC, y se cubrieron con
gel de colágeno de tipo I para la gelificación. A continuación, se
añadió el medio sin suero antes mencionado (que contenía EGF y Bfgf
o VEGF) con un fármaco (anticuerpo anti-integrina
\alpha2 o Compuesto A) y las células se cultivaron adicionalmente
a 37ºC durante 4 días. Para estudiar la acción del anticuerpo
anti-integrina \alpha2, el experimento se efectuó
usando una placa de 96 pocillos.
Después del cultivo, las células se tiñeron con
MTT, y los tubos formados por las HUVEC se fotografiaron bajo un
microscopio. La fotografía se digitalizó mediante un escáner, y se
cuantificó la formación de tubos por HUVEC midiendo las longitudes
de los tubos mediante el uso de un software de análisis de imágenes,
Mac SCOPE 2.56 (MITANI).
Tal como se muestra en la Fig. 2, se descubrió
que el anticuerpo anti-integrina \alpha2 inhibía
la formación de tubos de HUVEC inducida por Bfgf, lo cual indicaba
que la integrina \alpha2 estaba implicada en la formación de
tubos inducida por Bfgf. Además, tal como se muestra en la Fig. 3,
el Compuesto A inhibía la formación de tubos de HUVEC inducida por
Bfgf o VEGF. Junto con los resultados del Ejemplo de Referencia 2,
se consideró que el Compuesto A inhibía la formación de tubos
inhibiendo la expresión de la integrina \alpha2.
Ejemplo
1
Se transplantaron al subcutis de un ratón (SLC
KSN, hembra, Lot. N.º 085605376) 100 \mul de suspensión de
KP-1 (cepa celular de cáncer pancreático humano) en
PBS (5 x 10^{7} células/ml). A partir de una semana después del
transplante, se le administró oralmente dos veces al día una
disolución acuosa de metilcelulosa 0,5% (vehículo) o 100 o 200
mg/kg del Compuesto A (suspensión en metilcelulosa 0,5%). El peso
corporal y el volumen del tumor se midieron diariamente. El ratón
se anestesió con éter dietílico, y se extrajo sangre del fondo
ocular usando un tubo capilar diariamente. Se diluyeron 4 \mul de
sangre con 396 \mul de PBS que contenía una disolución acuosa de
citrato de sodio 0,0038%. El anticuerpo anti-CD49b
de ratón marcado con FITC (Pharmingen, Cat. N.º 09794D, Lot. N.º
M006073) se diluyó 30 veces con PBS que contenía BSA 0,1%. A 90
\mul de la sangre diluida se le añadieron 10 \mul del
anticuerpo. La mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente
durante 60 minutos y se hizo pasar a través de un filtro (FALCON,
Cat. N.º 2235). Al residuo se le añadieron 900 \mul de PBS, y se
separó una fracción de plaquetas basándose en la luz de dispersión
frontal y la luz de dispersión lateral mediante el uso de un
citómetro de flujo (Becton Dickinson, FACS Calibur), y se midió la
intensidad de la fluorescencia en las plaquetas.
Tal como se muestra en la Fig. 4, el Compuesto A
inhibía el aumento del volumen tumoral KP-1 con unas
dosis de 100 mg/kg y 200 mg/kg. Junto con los resultados de los
Ejemplos de Referencia 1 y 2, se consideró que el Compuesto A
inhibía la formación de tubos inhibiendo la expresión de integrina
\alpha2 e inhibía la angiogénesis inducida por el tumor, dando
como resultado la inhibición del aumento del volumen tumoral.
Tal como se muestra en la Fig. 5, el Compuesto A
reducía la cantidad de expresión de integrina \alpha2 en las
plaquetas medidas al mismo tiempo. La reducción de la cantidad de
expresión de integrina \alpha2 en plaquetas se observó con dosis
de 100 mg/kg y 200 mg/kg, en las cuales se observó la inhibición del
aumento del volumen tumoral. De este modo, se demostró que la
cantidad de expresión de integrina \alpha2 en las plaquetas se
podía usar como marcador indirecto de la acción inhibitoria del
Compuesto A sobre el aumento del volumen tumoral.
Según la presente invención, resulta posible
monitorizar la eficacia de un fármaco, por ejemplo, un inhibidor de
la angiogénesis, el cual manifiesta su eficacia farmacológica
inhibiendo la expresión de integrina, mediante el uso de la
cantidad de expresión de integrina en las plaquetas como marcador
indirecto. Como las plaquetas se pueden extraer fácilmente en forma
de muestras, resulta posible realizar una monitorización eficaz.
Claims (7)
1. Método para evaluar la influencia de un
fármaco sobre la expresión de integrina, que comprende la etapa en
la que se mide la cantidad de expresión de integrina en plaquetas
recogidas de un paciente al cual se le administra el fármaco y la
etapa en la que se determina la influencia del fármaco sobre la
expresión de integrina en células que no son plaquetas sobre la
base de la reducción de la cantidad de expresión medida, en el que
la integrina es integrina \alpha2, y las células son células de un
tejido en el cual se puede producir angiogénesis o células
tumorales, y en el que el fármaco es
N-(3-ciano-4-metil-1H-indol-7-il)-3-cianobencenosulfonamida,
o una sal farmacológicamente aceptable del mismo o un hidrato del
mismo.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la cantidad de expresión de integrina se mide a través de un método
inmunoquímico.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
el método inmunoquímico es un método de citometría de flujo.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
la cantidad de expresión de integrina se mide midiendo una cantidad
de codificación de ARNm para la integrina.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
la cantidad de ARNm se mide mediante una PCR cuantitativa.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que las células que no son plaquetas
son células de un tejido en el cual se puede producir angiogénesis,
y la inhibición sobre la expresión de integrina se determina como
una acción inhibitoria de la angiogénesis.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que las células que no son plaquetas
son células tumorales, y la inhibición sobre la expresión de
integrina se determina como una acción inhibitoria del crecimiento
tumoral.
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