KR20030080013A

KR20030080013A - 인테그린 발현 억제를 통한 혈관 신생 억제제의 효과를검정하는 방법

Info

Publication number: KR20030080013A
Application number: KR10-2003-7010944A
Authority: KR
Inventors: 오노나오토; 센바타로; 하타나오코; 후나하시야스히로; 와카바야시도시아키
Original assignee: 에자이 가부시키가이샤
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2003-10-10
Also published as: DE60217300D1; EP1742052A1; US7122318B2; HK1059038A1; DE60229676D1; EP1362601A4; EP1362601B1; CA2438427A1; AU2002233677B2; JPWO2002066073A1; ATE412895T1; WO2002066073A1; HK1099363A1; CN100384482C; EP1362601B8; ATE350660T1; CN101025419A; CA2438427C; ES2317368T3; CN1620313A

Abstract

본 명세서에는 약제를 투여받은 환자의 혈소판에서 인테그린 발현량을 측정하는 공정 및 측정된 발현량에 근거하여 혈소판 이외의 세포에서 인테그린 발현에 대한 당해 약제의 영향을 판정하는 공정을 포함하여 이루어진, 당해 약제의 인테그린 발현에 대한 영향을 검정하는 방법이 기재되어 있다.

Description

인테그린 발현 억제를 통한 혈관 신생 억제제의 효과를 검정하는 방법{Method of examining effect of angiogenesis inhibitor mediated by the inhibition of integrin expression}

암은 사망률이 높은 질환이며 항암제에 의한 치료 목적은 일반적으로 환자 QOL의 향상 및 생존기간의 연장에 있다. 그러나, 약제에 의한 수명 연장 효과를 단기간에 판정하는 것은 곤란하며 종양 축소율이나 혈중 종양 항원량이 치료 효과의 지표로 되는 대리(surrogate) 마커로서 사용되고 있다.

또한, 항암제의 임상치료 효력에서도 수명 연장 기간을 약제의 효과 판정에 사용하는 경우에는 장기적인 시험이 필요해지므로 비교적 단기간에 평가할 수 있는 종양 축소율이 대리 마커로서 이용되고 있다. 그러나, 종양 축소율이 반드시 수명 연장의 지표는 아닌 것으로 지적되고 있다. 그래서, 종양 축소율에 추가하여 증악(增惡) 억제 기간(time to progression), 무병 기간(decease free survival),생물학적 마커 등을 대리 마커로서 사용하는 것이 시도되고 있지만, 이들 방법은 아직 확립되어 있지 않다.

약제 투여에 의해 야기되며, 또한 생존기간의 연장과 밀접하게 관련되는 변화를 나타내는 생물학적 마커를 대리 마커로서 이용할 수 있으면 임상시험에서 적정한 치료방법을 용이하게 결정할 수 있으며 치료시에는 약제의 치료효과의 지표로서 사용할 수 있게 된다고 생각된다.

대리 마커로서 다음이 보고되어 있다.

당 단백질 EpCAM에 대한 항체인 파노렉스(Panorex)는 최초에 대장암 세포의 종양 마커로서 발견되고 이후에 접착 분자로서 동정되어 있지만 골수 중에 잔존하는 미소 암세포 소실의 대리 마커로서 생존율과의 관계성이 검토되고 있으며[참조: Stephan B. et al., Clinical Cancer Research, 1999, 5, 3999-4004], 이와 병행하여 대규모적인 제3상(三相) 임상시험이 진행중이다.

전립선 특이항원(prostatic specific antigen)은 전립선암의 호르몬 요법의 대리 마커로서 최적 투여량의 결정에 사용된다[참조: Denis L. and Mahler C. Urology, 1996, 47(1A Suppl.), 26-32].

혈관 신생 억제제에 관한 대리 마커의 사용으로서는 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제 인자(matrix metalloproteinase inhibitor)인 BMS 275291의 제1상 임상시험에서 피부에 구멍을 낼 때에 창상 치유의 혈관 신생을 지표로 하는 방법이 검토되고 있으며, 또한 별도의 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제 인자로서 종양 부위에서 효소활성을 마커로 하는 방법이 보고되어 있다[참조: Clin. Cancer Res.,2000, 6(8), 3290-6)].

또한, 혈관 신생 억제제는 암 이외의 질환, 예를 들면, 동맥 경화증, 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색증, 미숙아 망막증, 연령에 따른 황반 변성, 혈관 신생 녹내장, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선, 혈관종, 혈관 선유종 등의 효과적인 치료약으로 되는 것이 기대된다. 이들 질환에서도 혈관 신생의 대리 마커가 발견되면 이것을 지표로 하여 약제의 적절한 투여량을 설정하며 약제의 효과나 사용기간을 판단할 수 있게 된다.

인테그린은 세포 표면에 발현되는 세포 접착분자이며 α쇄와 β쇄로 구성되어 있다. 인테그린은 세포외 매트릭스막 단백질과 세포와의 접착 또는 세포간 접착에 관여하고 있다. 세포 접착분자가 인테그린에 결합하면 세포내 시그널계가 작동하기 시작하며, 그 결과 세포 접착 뿐만 아니라 세포 진전, 세포 증식, 아포프토시스, 분화, 세포 골격 배향, 세포 이동, 조직 형성, 암의 침윤 및 전이, 창상 치유, 혈액 응고 등이 가동된다.

이들 인테그린 중에서 인테그린 α2β1은 콜라겐, 라미닌 등을 접착분자로 하고 있으며 혈관 신생시에 혈관 내피 세포의 튜브 형성에 관여하는 것으로 공지되어 있다[참조: George E. et al., Exp. Cell. Res. 1996, 224, 39-51]. 또한, 생체내에서 인테그린 α1과 인테그린 α2의 항체가 VEGF에 의한 혈관 신생을 억제한다고 보고되어 있다[참조: Donald R. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 13612-13617].

인테그린 αvβ3는 혈관 신생을 일으키는 내피 세포에 특이적으로 존재하며닭 배장뇨막(胚漿尿膜)을 사용하는 혈관 신생모델에서 인테그린 αvβ3 중화 항체(LM 609)가 섬유 아세포 증식인자(fibroblast growth factor)-2(FGF-2)에 의한 혈관 신생을 억제한다고 보고되어 있다[참조: Brook, P. C. et al., Science, 1994, 264, 569-571]. 또한, FGF-2와 종양 괴사인자(tumor necrosis factor)-α에 의한 혈관 신생에는 인테그린 αvβ3이 관여하며 혈관 내피 증식인자(vascular endothelial growth factor)(VEGF), 트랜스포밍 증식인자(transforming growth factor)-α에 의한 혈관 신생에는 인테그린 αvβ5가 관여한다고 보고되어 있다[참조: Friedlander, M. et al., Science, 1995, 270, 1500-1502]. 항 인테그린 αvβ3 항체 및 인테그린 αvβ3 억제제는 현재 임상시험 중이다.

발명의 개시

본 발명의 과제는 인테그린, 바람직하게는 인테그린 α2의 발현에 영향을 주며 혈관 신생을 억제하는 약제의 대리 마커를 밝혀내는 것이다.

본 발명자 등은 인테그린 α2의 발현 억제를 통해 혈관 신생을 억제하는 화학식 II의 화합물(이하, 화합물 A라고 칭한다)을 대표로 하는 약제에 의해 인테그린 α2의 발현이 저하되며 혈관 신생이 감소되어 암 세포의 증식이 억제되도록 하는 조건하에서는 말초혈의 혈소판 표면의 인테그린 α2의 발현도 감소함을 밝혀냈다.

또한, 말초혈 혈소판 표면의 인테그린 α2량이 혈관 신생 억제의 대리 마커로서 유용함을 밝혀내어 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 하기를 제공한다.

1. 약제를 투여받은 환자의 혈소판에서 인테그린 발현량을 측정하는 공정 및 측정된 발현량에 근거하여 혈소판 이외의 세포에서 인테그린 발현에 대한 당해 약제의 영향을 판정하는 공정을 포함하여 이루어진, 당해 약제의 인테그린 발현에 대한 영향을 검정하는 방법.

2. 항목 1에 있어서, 인테그린이 인테그린 α2인 방법.

3. 항목 1에 있어서, 인테그린 발현량을 면역화학적 방법으로 측정하는 방법.

4. 항목 3에 있어서, 면역화학적 방법이 FACS법인 방법.

5. 항목 3에 기재된 방법에 사용하기 위한, 인테그린 정량 시약.

6. 항목 1에 있어서, 인테그린 발현량을 인테그린 암호화 mRNA의 양을 측정함으로써 측정하는 방법.

7. 항목 6에 있어서, mRNA의 양을 정량적 PCR로 측정하는 방법.

8. 항목 6에 기재된 방법에 사용하기 위한, 인테그린 암호화 mRNA의 정량 시약.

9. 항목 2에 있어서, 약제가 화학식 I의 설폰아미드 화합물, 약리학적으로 허용되는 이의 염 또는 이들의 수화물인 방법.

상기식에서,

B는 치환기를 가질 수 있으며 환의 일부가 포화될 수 있는 C6-C10 아릴 환 또는 6 내지 10원 헤테로아릴 환이며,

K는 단일결합, -CH=CH- 또는 -(CR^4bR^5b)m^b-(여기서, R^4b및 R^5b는 동일하거나 상이하며, 수소원자 또는 C1-C4 알킬기이며, m^b는 1 또는 2의 정수이다)이며,

R¹은 수소원자 또는 C1-C6 알킬기이며,

Z는 단일결합 또는 -CO-NH-이며,

R은 치환기를 가질 수 있으며 환의 일부가 포화될 수 있는 C6-C10 아릴 환 또는 6 내지 10원 헤테로아릴 환이다.

10. 항목 9에 있이서, R이 인돌, 퀴놀린 또는 이소퀴놀린인 방법.

11. 항목 2에 있어서, 약제가 화학식 Ia의 설폰아미드 화합물, 약리학적으로 허용되는 이의 염 또는 이들의 수화물인 방법.

상기식에서,

A^a환은 치환기를 가질 수 있는 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 환이며,

B^a환은 치환기를 가질 수 있는 6원 불포화 탄화수소 환 또는 헤테로 원자로서 질소원자를 1개 함유하는 불포화 6원 헤테로사이클이며,

C^a환은 치환기를 가질 수 있는, 질소원자를 1 또는 2개 함유하는 5원 헤테로사이클이며,

R^1a는 수소원자 또는 C1-C6 알킬기이며,

W^a는 단일결합 또는 -CH=CH-이며,

Y^a는 탄소원자 또는 질소원자이며,

Z^a는 -N(R^2a)-(여기서, R^2a는 수소원자 또는 저급 알킬기이다) 또는 질소원자이다.

12. 항목 11에 있어서, W^a가 단일결합인 방법.

13. 항목 1에 있어서, W^a가 단일결합이고, Z^a가 -NH-이고, Y^a가 탄소원자인 방법.

14. 항목 11 내지 13 중의 어느 한 항목에 있어서, B^a환이 치환기를 가질 수 있는 벤젠 또는 피리딘인 방법.

15. 항목 11 내지 14 중의 어느 한 항목에 있어서, C^a환이 치환기를 가질 수 있는 피롤인 방법.

16. 항목 11에 있어서, A^a환이 치환기를 가질 수 있는 벤젠 또는 피리딘이며, B^a환이 치환기를 가질 수 있는 벤젠이며 C^a환이 치환기를 가질 수 있는 피롤이며 W^a가 단일결합이며, Z^a가 -NH-인 방법.

17. 항목 2에 있어서, 약제가 화학식 Ib의 설폰아미드 함유 헤테로사이클릭 화합물, 약리학적으로 허용되는 이의 염 또는 이들의 수화물인 방법.

상기식에서,

A^b는 수소원자; 할로겐 원자; 하이드록실기; 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기 또는 알콕시기; 시아노기; -(CO)_k ^bNR^2bR^3b(여기서, R^2b및 R^3b는 동일하거나 상이하며, 각각 수소원자이거나 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이며, k^b는 0 또는 1이다); 치환기를 가질 수 있는 C2-C4 알케닐기 또는 알키닐기; 또는 하기 그룹 A에서 선택된 치환기를 가질 수 있는 페닐기 또는 페녹시기이며,

B^b는 하기 그룹 A에서 선택된 치환기를 가질 수 있는 아릴기 또는 모노사이클릭 헤테로아릴기, 또는(여기서, 환 Q^b는 1 또는 2개의 질소원자를 가질 수 있는 방향족 환이며, 환 M^b는 환 Q^b와 이중결합을 공유하는 C5-C12 불포화 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 환이고, 당해 환은 질소원자, 산소원자 및 황원자로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로 원자를 가질 수 있으며, 환 Q^b및 환 M^b는 질소원자를 공유하는 경우가 있고, 환 Q^b및 환 M^b는 하기 그룹 A에서 선택된 치환기를 가질 수 있다)이며,

K^b는 단일결합 또는 -(CR^4bR^5b)_m ^b-(여기서, R^4b및 R^5b는 동일하거나 상이하며, 수소원자 또는 C1-C4 알킬기이며, m^b는 1 또는 2의 정수이다)이며,

T^b, W^b, X^b및 Y^b는 동일하거나 상이하며, =C(D^b)-[여기서, D^b는 수소원자, 할로겐 원자, 하이드록실기, 또는 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기 또는 알콕시기, 시아노기, -(CO)_n ^bNR^6bR^7b(여기서, R^6b및 R^7b는 동일하거나 상이하며, 수소원자이거나 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이며, n^b는 0 또는 1이다), 또는 치환기를 가질 수 있는 C2-C4 알케닐기 또는 알키닐기이다] 또는 질소원자이며,

U^b및 V^b는 동일하거나 상이하며, =C(D^b)-(여기서, D^b는 위에서 정의한 바와 동일하다), 질소원자, -CH₂-, 산소원자 또는 -CO-이며,

Z^b는 단일결합 또는 -CO-NH-이며,

R^1b는 수소원자 또는 C1-C4 알킬기이며,

은 단일결합 또는 이중결합이고,

그룹 A는 할로겐 원자; 하이드록실기; 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기 또는 알콕시기; 시아노기; -R^8bR^9bN(NH)_p ^b-(여기서, R^8b및 R^9b는 동일하거나 상이하며, 수소원자이거나 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이며, p^b는 0 또는 1이다. 또한, R^8b및 R^9b는 이들이 결합되어 있는 질소원자와 함께 5 또는 6원 환을 형성할 수 있으며, 당해 환은 추가로 질소원자, 산소원자 또는 황원자를 함유할 수 있으며, 치환기를 가질 수 있다); 모노 또는 디 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 아미노설포닐기; 치환기를 가질 수 있는 C1-C8 아실기; C1-C4 알킬-S(O)_s ^b-C1-C4 알킬렌기(여기서, s^b는 0, 1 또는 2의 정수이다); C1-C4 알킬 또는 치환기를 가질 수 있는 페닐설포닐아미노기; -(CO)_q ^bNR^10bR^11b(여기서, R^10b및 R^11b는 동일하거나 상이하며, 수소원자이거나 할로겐 원자 또는 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 아미노기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이며, q^b는 0 또는 1이다); 또는 치환기를 가질 수 있는 아릴기 또는 헤테로아릴기이다.

18. 항목 17에 있어서, U^b및 V^b가 =C(D^b)-(여기서, D^b는 위에서 정의한 바와 동일하다) 또는 질소원자인 방법.

19. 항목 17 또는 18에 있어서, Z^b가 단일결합인 방법.

20. 항목 17 내지 19 중의 어느 한 항목에 있어서, T^b, U^b, V^b, W^b, X^b및 Y^b중의 하나 이상이 질소원자인 방법.

21. 항목 17 내지 20 중의 어느 한 항목에 있어서, A^b가 할로겐 원자; 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기 또는 알콕시기; 시아노기; -(CO)_r ^bNR^12bR^13b(여기서, R^12b및 R^13b는 동일하거나 상이하며, 수소원자 또는 할로겐 원자로 치환될수 있는 C1-C4 알킬기이며, r^b는 0 또는 1이다); 또는 치환기를 가질 수 있는 C2-C4 알케닐기 또는 알키닐기인 방법.

22. 항목 17 내지 21 중의 어느 한 항목에 있어서, T^b, U^b, V^b, W^b, X^b및 Y^b중의 하나만이 질소원자인 방법.

23. 항목 17 내지 22 중의 어느 한 항목에 있어서, T^b, W^b및 Y^b중의 하나만이 질소원자인 방법.

본 발명은 인테그린 발현에 영향을 주는 약제, 바람직하게는 혈관 신생 억제제의 효과를 검정하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 화합물 A의 인테그린 α2 발현에 대한 효과를 도시한 것이다.

도 2는 항 인테그린 α2 항체의 관강(管腔) 형성에 대한 영향을 도시한 것이다.

도 3은 화합물 A의 관강 형성에 대한 영향을 도시한 것이다.

도 4는 화합물 A의 종양 체적 증가에 대한 억제작용을 도시한 것이다.

도 5는 화합물 A의 혈소판에서 인테그린 α2 발현에 미치는 영향을 도시한 것이다.

발명을 실시하기 위한 최상의 형태

본 발명의 방법은 당해 약제의 인테그린 발현에 대한 영향을 검정하는 방법이며 약제를 투여받은 환자의 혈소판에서 인테그린 발현량을 측정하는 공정 및 측정된 발현량에 근거하여 혈소판 이외의 세포에서 인테그린 발현에 대한 당해 약제의 영향을 판정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

인테그린은 인테그린 α2가 바람직하다. 인테그린 α2는 세포 표면에 발현되는 접착분자의 인테그린 부류의 하나이다. 인간 인테그린 α2의 서열은 젠뱅크(GenBank)에 승인 번호 제NM 002203호로 등록되어 있다.

상기한 화합물 A는 특히 인테그린 α2 발현을 저하시켜 혈관 신생 억제작용 및 항종양 증식작용을 나타낸다. 따라서 혈소판 위의 인테그린 α2 발현량을 측정함으로써 화합물 A에 의해 대표되는 약제의 효과를 한층 더 고감도로 판정할 수 있다.

환자에 대한 약제의 투여량이나 투여방법은 특별히 한정되지 않으며 당해 약제의 목적에 적합한 것일 수 있다. 본 발명의 방법은 경구 투여 등의 전신적 투여에 의한 약제의 영향을 검정하는 데 사용하는 것이 바람직하다.

혈소판 이외의 세포는 특별히 한정되지 않지만 혈관 신생이 일어날 수 있는 조직의 세포인 것이 바람직하며, 예를 들면, 종양 조직의 혈관 내피 세포를 들 수 있다. 또한, 인테그린 α2를 통해 세포 증식, 아포프토시스 및 분화라는 시그널이 전달되는 섬유 아세포, 종양세포, 예를 들면, 흑색종 세포인 것이 바람직하다. 또한, 인테그린 α2는 단구, B세포 및 T세포로 발현이 확인되므로 이들 세포도 들 수 있다. 본 발명의 방법은 이들 세포의 기능을 추정하는 데 유용하다.

혈소판에서의 인테그린 발현량의 측정방법은 특별히 한정되지 않으며 면역화학적 방법 등으로 측정할 수 있으며 인테그린 암호화 mRNA의 양을 측정할 수 있다.

인테그린 발현량의 면역화학적 방법에 따른 측정방법으로서는 FACS법을 들수 있다. FACS법은 형광활성화 세포 분류기를 사용하여 형광 표지 항체에 의해 면역화학적으로 염색한 세포의 형광강도 등을 측정하는 방법이다.

인테그린 암호화 mRNA 양의 측정방법으로서는 정량적 PCR을 들 수 있다.

하기에 발현량 측정공정의 한가지 양태에 관해서 1.혈소판의 분리, 2.혈소판 표면의 인테그린량의 정량, 3.혈소판 중의 인테그린 mRNA 양의 정량의 순으로 상세하게 설명한다.

1. 혈소판의 분리

혈소판은 원심, 겔 여과, 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 등의 기술로 분리할 수 있다.

1) 원심분리: 혈액에 10% 용적의 3.8% 나트륨 시트레이트 수용액을 가하고 100 x g으로 실온에서 10분 동안 원심분리한다. 상층을 혈소판 풍부 혈장으로서 사용하며 이를 1500 x g으로 10분 동안 원심분리함으로써 침사(沈査)로부터 혈소판을 수득한다.

2) 플로우 사이토메트리: PBS 등으로 희석한 혈액을 플로우 사이토미터로 유동시키고 레이저 광선 또는 유사한 광선을 비춘다. 이때에 발생하는 전방(前方) 산란광 및 측방 산란광의 강도를 기초로 하여 혈소판과 다른 혈구를 분리할 수 있다.

2. 혈소판 표면의 인테그린량의 정량

혈소판 표면의 인테그린량의 정량은 면역화학적 방법, 예를 들면, 면역조직염색, ELISA, 웨스턴 블로팅(western blotting), 플로우 사이토메트리 등의 기술로 측정할 수 있다. ELISA에서는, 예를 들면, 고상화한 혈소판의 표면 항원에 대한 항체로 혈소판을 고상으로 결합시키고, 세정 후 표지한 항 인테그린 항체를 반응시켜 결합한 표지의 양으로부터 혈소판 표면의 인테그린을 정량할 수 있다. 또한, 웨스턴 블로팅에서는, 예를 들면, 분리된 혈소판을 SDS를 함유하는 완충액에 가용화한 후, SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 수행하고, 멤브레인 위에 블로팅된 인테그린을 표지한 항 인테그린 항체로 정량할 수 있다. 이때에 동시에 혈소판 표면 항원에 대한 항체로 혈소판의 양을 정량하면 혈소판당 인테그린의 양을 정량할 수 있다.

플로우 사이토메트리에서는, 예를 들면, 전체 혈액을 희석하여 표지한 항 인테그린 항체를 결합시켜 전방 산란광 및 측방 산란광에 의해 혈소판 분획을 분리하고 혈소판 위의 형광강도를 측정함으로써 혈소판 위의 인테그린의 양을 정량할 수 있다. 하기에 플로우 사이토메트리에 관해서 구체적으로 설명하지만 본 발명은 이에 의해 한정되지 않는다. 플로우 사이토메트리를 사용하면 혈소판을 분리하지 않고 전체 혈액을 사용하여 인테그린량을 정량할 수 있다.

혈액 4㎕를 0.0038% 나트륨 시트레이트 수용액을 함유하는 PBS 396㎕로써 희석한다. FITC로 표지한 인테그린에 대한 항체, 바람직하게는 인테그린 α2에 대한 항체, 마우스이면, 예를 들면, 항 마우스 CD49b FITC 표지(BD Pharmingen, Cat. BD-558757), 인간이면 항 인간 CD49b FITC 표지(BD Pharmingen, Cat. BD-555498)를 0.1% BSA를 함유하는 PBS로써 적당한 농도로 희석한다. 이러한 항체 10㎕를 희석한 혈액 90㎕에 가한다. 실온에서 60분 동안 반응시키고 필터(FALCON, Cat. 2235)에 통과시킨다. PBS 900㎕를 가하고 플로우 사이토미터[벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson); FACS 캘리버(Calibur)]로써 전방 산란광 및 측방 산란광에 의해 혈소판 분획을 분리하며 혈소판 위의 형광강도를 측정함으로써 혈소판 위의 인테그린, 바람직하게는 인테그린 α2의 양을 정량한다.

3. 혈소판 중의 인테그린 mRNA 양의 정량

1) RNA의 추출

RNA는 구아니딘 티오시아네이트법, 페놀법 등으로 추출할 수 있다. 분리된 혈소판을 ISOGEN 1㎖로 용해시켜 실온에서 5분 동안 방치시킨다. 클로로포름 0.2㎖를 가하고, 교반하여 2분 동안 방치시킨다. 13000rpm, 4℃(MX-150, TOMY, Rotor TMA-11)에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 별도의 튜브로 옮긴다. 이소프로판올 0.5㎖를 가하여 실온에서 5분 동안 방치시킨다. 13000rpm, 4℃(MX-150, TOMY, Rotor TMA-11)에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 버린다. 70% 에탄올 수용액 1㎖를 가하여 15000rpm, 4℃(MX-150, TOMY, Rotor TMA-11)에서 15분 동안 원심분리한다. 상등액을 버리고, RNase 비함유 H₂O에 용해시킨다.

2) RNA의 정량

RNA는 노던 블로팅 분석법(Northern blotting analysis), 도트 블로팅 분석법(dot blotting analysis), RNase 보호 검정법, 비교 RT-PCR, 경쟁(competitive) RT-PCR, 정량적 PCR 등의 기술로 정량할 수 있다. 바람직하게는, 정량적 PCR이 바람직하다. 하기에 정량적 PCR의 기술에 관해서 설명하지만, 본 발명은 이에 의해 한정되지 않는다. 정량적 PCR은 타크만(TaqMan) 프로브와 ABI 프리즘(Prism) 7700 연속 검출 시스템(Sequence Detection System)[퍼킨-엘머 어플라이드 바이오시스템즈(Perkin-Elmer Applied Biosystems)]을 사용하여 다음과 같이 수행한다.

조작은 역전사 반응 및 PCR 반응의 2단계로 수행한다. 최초 단계인 역전사 반응은 수득된 RNA에 dNTP, 올리고 d(T)₁₆프라이머, Rnase 억제 인자, 멀티스크라이브 리버스 트랜스크립타제(Multiscribe Reverse Transcriptase)(퍼킨-엘머 어플라이드 바이오시스템즈)를 가하여 25℃에서 10분 동안 유지한 다음, 48℃에서 30분 동안 가열함으로써 수행한다. 반응을 95℃에서 5분 동안 가열함으로써 정지시킨다.

수득된 cDNA를 제2 단계의 PCR 반응에 제공한다. PCR 반응은, 예를 들면, cDNA 2.5ng, 1 × 타크만 PCR 완충액, 3mM MgCl, 각 200μM dATP, dCTP, dGTP, 400μM dUTP, 200nM 프라이머쌍, 0.01U/㎕ AmpErase UNG, 0.025U/㎕ 앰플리타크 골드 DNA 폴리머라제(AmpliTaq Gold DNA Polymerase)(퍼킨-엘머 어플라이드 바이오시스템즈) 반응계에서 수행한다. 반응 조건은 50℃에서 2분 동안, 95℃에서 10분 동안, 이어서 95℃에서 20초 동안-55℃에서 20초 동안-72℃에서 30초 동안을 40사이클로 수행한다. 프라이머와 프로브는 프라이머 익스프레션(Primer Expression)(퍼킨-엘머 어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 설계한다. 복수 검체(檢體)의 비교는 정량치를 각 검체의 전사량에 변동이 적은 하우스 키핑 유전자, 바람직하게는 GAPDH의 mRNA 레벨을 기초로 보정하여 수행한다.

상기와 같은 발현량의 측정공정으로 측정된 발현량에 근거하여 혈소판 이외의 세포에서 인테그린 발현에 대한 당해 약제의 영향이 판정된다. 이러한 판정은 혈소판에서 인테그린 발현량이 혈소판 이외의 세포에서의 인테그린 발현량에 관계하는 것에 근거하여 실시할 수 있다. 즉, 혈소판에서 발현량이 감소하면 약제는 혈소판 이외의 세포에서의 인테그린 발현을 감소시키는 영향이 있다고 판정할 수 있으며 반대로 혈소판에서 발현량이 증가하면 약제는 혈소판 이외의 세포에서의 인테그린 발현을 증가시키는 영향이 있다고 판정할 수 있다.

본 발명은, 또한 본 발명 방법에 사용하기 위한 정량 시약을 제공한다.

제1 양태의 정량 시약은, 또한 약제를 투여받은 환자의 혈소판에서 인테그린 발현량을 면역화학적 방법에 따라 측정하는 공정 및 측정된 발현량에 근거하여 혈소판 이외의 세포에서 인테그린 발현에 대한 당해 약제의 영향을 판정하는 공정을 포함하여 이루어진, 당해 약제의 인테그린 발현에 대한 영향을 검정하는 방법에 사용하는 인테그린 정량 시약이다.

이러한 양태의 정량 시약의 구성 성분은 인테그린을 면역화학적으로 정량하는 데 사용하는 시약과 동일할 수 있다. 이러한 양태의 정량 시약은 면역화학적 방법에 의한 측정방법에 따라 정량 시약의 제조에 통상적으로 사용되는 기술을 선택하여 사용함으로써 제조할 수 있다. 통상적으로는 항 인테그린 항체를 함유한다. 항 인테그린 항체는 형광물질에 의해 표지될 수 있다.

정량 시약이 복수의 구성 성분으로 구성되는 경우에는 키트로 될 수 있다. 또한, 정량 시약은 정량 시약에 사용되는 데 허용할 수 있는 담체를 추가로 함유하는 조성물로 할 수 있다. 예를 들면, 키트에는 형광 표지된 인테그린 α2에 대한 모노클로날 항체 또는 인테그린 α2에 대한 모노클로날 항체와 형광표지된 항 마우스 Ig 항체, 희석액 및 고정액이 함유될 수 있다.

제2 양태의 정량 시약은 약제를 투여받은 환자의 혈소판에서 인테그린 발현량을 인테그린 암호화 mRNA의 양을 측정함으로써 측정하는 공정 및 측정된 발현량에 기초하여 혈소판 이외의 세포에서의 인테그린 발현에 대한 당해 약제의 영향을 판정하는 공정을 포함하여 이루어진, 당해 약제의 인테그린 발현에 대한 영향을 검정하는 방법에 사용하기 위한, 인테그린 정량 시약이다.

이러한 양태의 정량 시약의 구성 성분은 인테그린 암호화 mRNA를 정량하는 데 사용하는 시약과 동일할 수 있다. 이러한 양태의 정량 시약은 mRNA의 정량방법에 따라서 정량 시약의 제조에 통상적으로 사용되는 기술을 선택하여 사용함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, PCR, 혼성 등에 근거하는 방법을 들 수 있다. 통상적으로는, 인테그린 암호화 mRNA에 상보적인 프라이머나 프로브로서 사용할 수 있는 핵산을 포함한다. 또한, 공지된 인테그린 암호화 염기 서열에 근거하여 프라이머나 프로브를 설계하는 것은 당업자이면 용이하다.

정량 시약이 복수의 구성 성분으로 구성되는 경우에는 키트로 할 수 있다. 또한, 정량 시약은 정량 시약에 사용되는 데 허용할 수 있는 담체를 추가로 함유하는 조성물로 할 수 있다. 예를 들면, 키트에는 PCR 프라이머, 바람직하게는 정량적 PCR을 위한 표지 프라이머, 컨트롤 프라이머 및 컨트롤 DNA가 함유될 수 있다.

약제는 바람직하게는 화학식 I, 화학식 Ia 또는 화학식 Ib의 설폰아미드 화합물, 약리학적으로 허용되는 이의 염 또는 이들의 수화물이다.

화학식 I의 B 및 R에서, 치환기를 가질 수 있으며 환의 일부가 포화될 수 있는 C6-C10 아릴 환 또는 6 내지 10원 헤테로아릴 환이란 탄소수 6 내지 10의 방향족 탄화수소기 또는 헤테로 원자로서 질소원자, 산소원자 및 황원자 중의 1개 이상을 함유하는 6 내지 10원의 방향족 헤테로사이클을 의미하며, 이의 환에 1개 이상의 치환기를 가질 수 있으며 환의 일부가 포화될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 벤젠, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 피리다진, 나프탈렌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 인돌, 이소인돌, 인돌리딘, 인다졸, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤즈옥사졸, 벤즈이미다졸, 벤조피라졸, 벤조티아졸, 4,5,6,7-테트라하이드로인돌, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린, 2,3-디하이드로벤조푸란, 인단, 테트랄론, 인돌린, 이소인돌린, 크로만, 테트랄린 등을 들 수 있다. 상기 방향족 환은 치환기 1 내지 3개를 가질 수 있으며 치환기가 복수개인 경우에는 동일하거나 상이할 수 있다. 치환기로서는, 예를 들면, 저급 알킬기 또는 저급 사이클로알킬기로 치환될 수 있는 아미노기, 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 하이드록실기, 니트로기, 머캅토기, 시아노기, 저급 알킬티오기, 할로겐기, 화학식 -a^a-b^a[여기서, a^a는 단일결합, -(CH₂)_k ^a-, -O-(CH₂)_k ^a-, -S-(CH₂)_k ^a- 또는 -N(R^3a)-(CH₂)_k ^a-(여기서, k^a는 1 내지 5의 정수이며, R^3a는 수소원자 또는 저급 알킬기이다)이며, b^a는 -CH₂-d^a(여기서, d^a는 저급 알킬기로 치환될 수 있는 아미노기, 할로겐기, 하이드록실기, 저급 알킬티오기, 시아노기 또는 저급 알콕시기이다)이다]의 기, 화학식 -a^a-e^a-f^a[여기서, a^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, e^a는 -S(O)- 또는 -S(O)₂-이며, f^a는 저급 알킬기 또는 저급 알콕시기로 치환될 수 있는 아미노기, 저급 알킬기, 트리플루오로메틸기, -(CH₂)_m ^a-b^a또는 -N(R^4a)-(CH₂)_m ^a-b^a(여기서, b^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, R^4a는 수소원자 또는 저급 알킬기이며, m^a는 1 내지 5의 정수이다)이다]의 기, 화학식 -a^a-g^a-h^a[여기서, a^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, g^a는 -C(O)- 또는 -C(S)-이며, h^a는 저급 알킬기로 치환될 수 있는 아미노기, 하이드록실기, 저급 알킬기, 저급 알콕시기, -(CH₂)_n ^a-b^a또는 -N(R^5a)-(CH₂)_n ^a-b^a(여기서, b^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, R^5a는 수소원자 또는 저급 알킬기이며, n^a는 1 내지 5의 정수이다)이다]의 기, 화학식 -a^a-N(R^6a)-g^a-i^a[여기서, a^a및 g^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, R^6a는 수소원자 또는 저급 알킬기이며, i^a는 수소원자, 저급 알콕시기 또는 f^a(f^a는 위에서 정의한 바와 동일하다)이다]의 기, 화학식-a^a-N(R^7a)-e^a-f^a(여기서, a^a, e^a및 f^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, R^7a는 수소원자 또는 저급 알킬기이다)의 기, 화학식 (CH₂)_p ^a-j^a-(CH₂)_q ^a-b^a(여기서, j^a는 산소원자 또는 황원자이며, b^a는 위에서 정의한 바와 동일하며 p^a및 q^a는 동일하거나 상이하며, 1 내지 5의 정수이다), 화학식 (CH₂)_u ^a-Ar^a(여기서, Ar^a는 저급 알킬기, 저급 알콕시기 또는 할로겐 원자로 치환될 수 있는 페닐기 또는 헤테로아릴기이며, u^a는 0 또는 1 내지 5의 정수이다), 화학식 -CONH-(CH₂)_u ^a-Ar^a(여기서, Ar^a및 u^a는 위에서 정의한 바와 동일하다) 또는 화학식 -SO₂-(CH₂)_u ^a-Ar^a(여기서, Ar^a및 u^a는 위에서 정의한 바와 동일하다)의 기 등을 들 수 있다.

화학식 I에서는 R이 인돌, 퀴놀린 또는 이소퀴놀린인 화합물이 바람직하다.

상기 화학식 Ia에서 A^a환이 의미하는 「치환기를 가질 수 있는 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 환」이란 방향족 탄화수소 또는 질소원자, 산소원자 및 황원자 중의 1개 이상을 함유하는 방향족 헤테로사이클을 의미하며, 당해 환에는 치환기가 1 내지 3개 있을 수 있다. A^a환에 포함되는 주된 방향족 환을 예시하면 피롤, 피라졸, 이미다졸, 티오펜, 푸란, 티아졸, 옥사졸, 벤젠, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 피리다진, 나프탈렌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 인돌, 이소인돌, 인돌리딘, 인다졸, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤즈옥사졸, 벤즈이미다졸, 벤조피라졸, 벤조티아졸 등이 있다. 상기 방향족 환은 치환기 1 내지 3개를 가질 수 있으며 치환기가 복수개인 경우에는 동일하거나 상이할 수 있다. 치환기로서는, 예를 들면, 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 하이드록실기, 니트로기, 머캅토기, 시아노기, 저급 알킬티오기, 할로겐기, 화학식 -a^a-b^a[여기서, a^a는 단일결합, -(CH₂)_k ^a-, -O-(CH₂)_k ^a-, -S-(CH₂)_k ^a- 또는 -N(R^3a)-(CH₂)_k ^a-(여기서, k^a는 1 내지 5의 정수이며, R^3a는 수소원자 또는 저급 알킬기이)이며, b^a는 -CH₂-d^a(여기서, d^a는 저급 알킬기로 치환될 수 있는 아미노기, 할로겐기, 하이드록실기, 저급 알킬티오기, 시아노기 또는 저급 알콕시기이다)이다]의 기, 화학식 -a^a-e^a-f^a[여기서, a^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, e^a는 -S(O)- 또는 -S(O)₂-이며, f^a는 저급 알킬기 또는 저급 알콕시기로 치환될 수 있는 아미노기, 저급 알킬기, 트리플루오로메틸기, -(CH₂)_m ^a-b^a또는 -N(R^4a)-(CH₂)_m ^a-b^a(여기서, b^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, R^4a는 수소원자 또는 저급 알킬기이며, m^a는 1 내지 5의 정수이다)이다]의 기, 화학식 -a^a-g^a-h^a[여기서, a^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, g^a는 -C(O)- 또는 -C(S)-이며, h^a는 저급 알킬기로 치환될 수 있는 아미노기, 하이드록실기, 저급 알킬기, 저급 알콕시기, -(CH₂)_n ^a-b^a또는 -N(R^5a)-(CH₂)_n ^a-b^a(여기서, b^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, R^5a는 수소원자 또는 저급 알킬기이며, n^a는 1 내지 5의 정수이다)이다]의 기, 화학식 -a^a-N(R^6a)-g^a-i^a[여기서, a^a및 g^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, R^6a는 수소원자 또는 저급 알킬기이며, i^a는 수소원자, 저급 알콕시기 또는 f^a(f^a는 위에서 정의한 바와 동일하다)이다]의 기, 화학식-a^a-N(R^7a)-e^a-f^a(여기서, a^a, e^a및 f^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, R^7a는 수소원자 또는 저급 알킬기이다)의 기, 화학식 -(CH₂)_p ^a-j^a-(CH₂)_q ^a-b^a(여기서, j^a는 산소원자 또는 황원자이며, b^a는 위에서 정의한 바와 동일하며, p^a및 q^a는 동일하거나 상이하며, 1 내지 5의 정수이다), 화학식 -(CH₂)_u ^a-Ar^a(여기서, Ar^a는 저급 알킬기, 저급 알콕시기 또는 할로겐 원자로 치환될 수 있는 페닐기 또는 헤테로아릴기이며, u^a는 0 또는 1 내지 5의 정수이다), 화학식 -CONH-(CH₂)_u ^a-Ar^a(여기서, Ar^a및 u^a는 위에서 정의한 바와 동일하다) 또는 화학식 -SO₂-(CH₂)_u ^a-Ar^a(여기서, Ar^a및 u^a는 위에서 정의한 바와 동일하다)의 기 등을 들 수 있다.

상기 치환기예에서 아미노기가 2개의 알킬기로 치환되어 있는 경우에는 이들알킬기가 결합되어 5 또는 6원환을 형성할 수 있다. 또한, A^a환이 하이드록실기 또는 머캅토기를 갖는 질소 함유 헤테로사이클인 경우에는 이들 기가 공명 구조를 취함으로써 옥소기 또는 티옥소기의 형으로 될 수 있다.

B^a환이 의미하는 「치환기를 가질 수 있는 6원 불포화 탄화수소 환 또는 헤테로 원자로서 질소원자를 1개 함유하는 불포화 6원 헤테로사이클」이란 일부가 수소화될 수 있는 벤젠 또는 피리딘이며, 당해 환에 치환기 1 또는 2개를 가질 수 있으며, 치환기가 2개인 경우에는 동일하거나 상이할 수 있다.

C^a환이 의미하는 「치환기를 가질 수 있는, 질소원자를 1 또는 2개 함유하는 5원 헤테로사이클」이란 일부가 수소화될 수 있는 피롤, 피라졸, 이미다졸이며, 당해 환에 치환기 1 또는 2개를 가질 수 있으며, 치환기가 2개 있는 경우에는 동일하거나 상이할 수 있다.

B^a환 및 C^a환이 가질 수 있는 치환기로서는, 예를 들면, 할로겐기, 시아노기, 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 하이드록실기, 옥소기, 화학식-C(O)-r^a(여기서, r^a는 수소원자, 저급 알킬기로 치환될 수 있는 아미노기, 저급 알킬기, 저급 알콕시기 또는 하이드록실기가다), 저급 알킬기로 치환될 수 있는 아미노기, 트리플루오로메틸기 등을 들 수 있다.

화학식 Ia에서 R^1a, R^2a및 A^a환, B^a환, C^a환이 가질 수 있는 치환기의 정의중의 저급 알킬기는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 측쇄상의 알킬기, 예를 들면, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기(아밀기), 이소펜틸기, 네오펜틸기, tert-펜틸기, 1-메틸부틸기, 2-메틸부틸기, 1,2-디메틸프로필기, n-헥실기, 이소헥실기, 1-메틸펜틸기, 2-메틸펜틸기, 3-메틸펜틸기, 1,1-디메틸부틸기, 1,2-디메틸부틸기, 2,2-디메틸부틸기, 1,3-디메틸부틸기, 2,3-디메틸부틸기, 3,3-디메틸부틸기, 1-에틸부틸기, 2-에틸부틸기, 1,1,2-트리메틸프로필기, 1,2,2-트리메틸프로필기, 1-에틸-1-메틸프로필기, 1-에틸-2-메틸프로필기 등이다. 이들 중에서 바람직한 기로서는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기 등을 들 수 있으며 이들 중에서 가장 바람직한 기로서는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기를 들 수 있다.

A^a환이 가질 수 있는 치환기의 정의 중의 저급 사이클로알킬기란 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬기이며, 이의 예로서는 사이클로프로필기, 사이클로펜틸기, 사이클로헥실기 등을 들 수 있다.

A^a환, B^a환 및 C^a환이 가질 수 있는 치환기의 정의 중의 저급 알콕시기란 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, 이소프로폭시기, 1-부톡시기, 이소부톡시기, tert-부톡시기 등 상기한 저급 알킬기로부터 유도되는 저급 알콕시기이지만 이들 중에서 가장 바람직한 기로서는 메톡시기 및 에톡시기를 들 수 있다. 저급 알킬티오기란 상기한 저급 알킬기로부터 유도되는 저급 알킬티오기이다. 할로겐 원자로서는 불소원자, 염소원자, 브롬 원자 등을 들 수 있다.

이들 중에서 특히 바람직한 화합물로서는,

1) N-(3-시아노-4-메틸-1H-인돌-7-일)-3-시아노벤젠설폰아미드

2) N-(3-시아노-4-메틸-1H-인돌-7-일)-6-클로로-3-피리딘설폰아미드

3) N-(3-브로모-5-메틸-1H-인돌-7-일)-4-설파모일벤젠설폰아미드

4) N-(5-브로모-3-클로로-1H-인돌-7-일)-6-아미노-3-피리딘설폰아미드

5) N-(3-브로모-5-메틸-1H-인돌-7-일)-3-시아노벤젠설폰아미드

6) N-(4-브로모-1H-인돌-7-일)-4-시아노벤젠설폰아미드

7) N-(4-클로로-1H-인돌-7-일)-6-아미노-3-피리딘설폰아미드

8) N-(3-브로모-4-클로로-1H-인돌-7-일)-6-아미노-3-피리딘설폰아미드

9) N-(3-브로모-5-메틸-1H-인돌-7-일)-5-시아노-2-티오펜설폰아미드

10) N-(4-브로모-3-클로로-1H-인돌-7-일)-2-아미노-5-피리미딘설폰아미드

11) N-(3-클로로-1H-인돌-7-일)-4-설파모일벤젠설폰아미드 등을 들 수 있다.

화학식 Ia의 설폰아미드 유도체는 산 또는 염기와 염을 형성하는 경우도 있다. 본 발명은 화합물 I^a의 염을 포함한다. 산과의 염으로서는, 예를 들면, 염산염, 브롬화수소산염, 황산염 등의 무기산염이나 아세트산, 락트산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 시트르산, 벤조산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산 등의 유기산과의 염을 들 수 있다. 또한, 염기와의 염으로서는 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등의 무기염, 트리에틸아민, 아르기닌, 라이신 등의 유기 염기와의 염을 들 수 있다.

본 발명에서 환 Q^b가 의미하는 「1 또는 2개의 질소원자를 가질 수 있는 방향족 환」이란 방향족 탄화수소 또는 1 또는 2개의 질소원자를 함유하는 6원 방향족 헤테로사이클이다. 환 Q^b에 포함되는 주된 방향족 환을 예시하면 벤젠, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 피리다진 등이 있다. 또한, 환 M이 의미하는 것은 「C5-C12 불포화 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 환이고, 당해 환은 질소원자, 산소원자 및 황원자로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로 원자를 가질 수 있다」란 환 Q^b와 이중결합을 공유하는 불포화 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 환이며 벤젠, 나프탈렌 등의 방향족 탄화수소, 사이클로펜텐, 사이클로헥센, 사이클로헵텐, 사이클로옥텐, 사이클로펜타디엔, 사이클로헵타디엔, 사이클로옥타디엔 등의 불포화 탄화수소, 테트라하이드로피리딘, 피롤, 푸란, 티오펜, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 피라졸, 이미다졸, 트리아졸, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 피리다진, 트리아진, 인돌, 이소인돌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 인다졸리딘, 나프티리딘, 벤조푸란, 벤조피란, 벤조티오펜, 벤즈이미다졸벤족사졸, 벤조티아졸, 피롤로피리딘, 피리도피리미딘, 이미다조피리딘 등의 불포화 헤테로사이클이다. 또한, 「환 Q^b와 환 M^b는 1개의 질소원자를 공유할 수 있다」란 양쪽 환의 축합 위치에 질소원자가 있는 경우를 말하며 이와 같이 형성되는 환으로서는 인다졸리딘, 이미다조[1,2-a]피리딘, 이미다조[1,5-a]피리딘, 피라졸로[1,5-a]피리미딘 등을 들 수 있다.

본 발명에서 R^1b, R^4b, R^5b에서의 C1-C4 알킬기 또는 A^b, D^b, R^1b, R^2b, R^3b, R^6b,R^7b, R^8b, R^9b, R^10b, R^11b, R^12b, R^13b, R^14b, R^15b, G^1b, G^2b및 그룹 A에서 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기에서 C1-C4 알킬기란 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄상의 알킬기, 예를 들면, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기이다. 할로겐 원자로 치환될 수 있다는 것은 이들 알킬기가 불소원자, 염소원자, 브롬 원자 및 요오드 원자로부터 선택되는 할로겐 원자로 치환될 수 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 모노플루오로메틸기, 모노클로로메틸기, 디플루오로메틸기, 트리플루오로메틸기, 1- 또는 2-모노플루오로에틸기, 1- 또는 2-모노클로로에틸기, 1- 또는 2-모노브로모에틸기, 1,2-디플루오로에틸기, 1,2-디클로로에틸기, 1,1,2,2,2-펜타플루오로에틸기, 3,3,3-트리플루오로프로필기 등을 들 수 있다. 이들 예의 바람직한 것으로서 모노플루오로메틸기, 디플루오로메틸기, 트리플루오로메틸기, 1- 또는 2-모노플루오로에틸기, 1,2-디플루오로에틸기, 1,1,2,2,2-펜타플루오로에틸기 등을 들 수 있다.

본 발명에서 A^b, D^b및 그룹 A에서 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알콕시기에서 C1-C4 알콕시기란 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄상의 알콕시기, 예를 들면, 메톡시기, 에톡시기, n-프로필옥시기, 이소프로필옥시기, n-부틸옥시기, 이소부틸옥시기, sec-부틸옥시기, tert-부틸옥시기이다. 할로겐 원자로 치환될 수 있다는 것은 이들 알콕시기가 불소원자, 염소원자, 브롬 원자 및 요오드 원자로부터 선택되는 할로겐 원자로 치환될 수 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 모노플루오로메톡시기, 디플루오로메톡시기, 트리플루오로메톡시기, 1- 또는 2-모노플루오로에톡시기, 1- 또는 2-모노클로로에톡시기, 1- 또는 2-모노브로모에톡시기, 1,2-디플루오에톡시기, 1,1,2,2,2-펜타플루오로에톡시기, 3,3,3-트리플루오로프로필옥시기 등을 들 수 있다. 이들 예의 바람직한 것으로서 모노플루오로메톡시기, 디플루오로메톡시기, 트리플루오로메톡시기, 1- 또는 2-모노플루오로에톡시기, 1,2-디플루오로에톡시기, 1,1,2,2,2-펜타플루오로에톡시기 등을 들 수 있다.

본 발명에서 A^b및 D^b의 C2-C4 알케닐기 또는 알키닐기란 탄소수 2 내지 4의 알케닐기 또는 알키닐기이며, 비닐기, 알릴기, 2- 또는 3-부테닐기, 1,3-부타디에닐기, 에티닐기, 2-프로피닐기, 2-메틸에티닐기, 2- 또는 3-부티닐기 등을 들 수 있다.

본 발명에서 B^b및 그룹 A의 아릴기란 방향족 탄화수소이며 페닐기, 나프틸기 등을 들 수 있다. 또한, 헤테로아릴기란 질소원자, 산소원자 및 황원자를 하나 이상 함유하는 모노사이클 또는 비사이클이며, 예를 들면, 피롤릴, 이미다졸릴기, 피라졸릴기, 트리아졸릴기, 푸릴기, 티에닐기, 옥사졸릴기, 이소옥사졸릴기, 티아졸릴기, 이소티아졸릴기, 티아디아졸릴기, 피리딜기, 피리미딜기, 피라질기, 인돌릴기, 인돌리디닐기, 벤조이미다졸릴기, 벤조티아졸릴기, 벤조옥사졸릴기, 퀴놀리닐기, 이소퀴놀리닐기, 퀴나졸리닐기, 프탈라지닐기 등을 들 수 있다.

본 발명에서 R^8b및 R^9b의 「R^8b및 R^9b는 이들이 결합되어 있는 질소원자와 함께 5 또는 6원 환을 형성할 수 있으며, 당해 환은 추가로 질소원자, 산소원자 또는황원자를 함유할 수 있다」란 R^8b및 R^9b가 이들이 결합되어 있는 질소원자와 함께 피롤리디닐기, 피페리디닐기, 모르폴리노기, 티오모르폴리노기, 피페라지닐기 등을 형성하는 것을 의미한다.

본 발명에서 그룹 A의 모노 또는 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 아미노설포닐기, C1-C4 알킬-S(O)_s ^b-C1-C4-알킬렌기, C1-C4 알킬기 또는 치환기를 가질 수 있는 페닐설포닐아미노기, C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기란 위에서 정의한 바와 동일한 알킬기이며, 알킬렌기란 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 부틸렌기, 메틸메틸렌기, 1- 또는 2-메틸에틸렌기, 1-, 2- 또는 3-메틸프로필렌기, 디메틸메틸렌기 등을 들 수 있다.

또한, C1-C8 알카노일기와 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 발레릴기, 벤조일기 등이다.

본 발명의 J^b의 「보호기를 가질 수 있는 아미노기」에서의 보호기란 통상적인 유기합성상 아미노기의 보호기로서 공지되어 있는 기이면 어떤 것도 양호하며 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 벤질옥시카보닐기, t-부톡시카보닐기, 포르밀기, 아세틸기, 클로로아세틸기, 2,2,2-트리클로로에틸기, 벤질리덴기, 벤즈하이드릴기, 트리틸기 등을 들 수 있다. 또한, 보호기를 가질 수 있는 카복시기에서의 보호기 및 R^16b에서의 카복시기의 보호기란 통상적인 유기합성상 카복시기의 보호기로서 공지되어 있는 기이면 어떠한 기라도 양호하며 특별히 한정되지 않지만, 예를들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, t-부틸기, 메톡시메틸기, 2,2,2-트리클로로에틸기, 피발로일옥시메틸기, 벤질기 등을 들 수 있다.

본 발명에서 「치환기를 가질 수 있다」에서의 치환기란 상기에 기재된 할로겐 원자; 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기 또는 알콕시기; 하이드록실기; 하이드록시 C1-C4 알킬기; 모노 또는 디 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 아미노기; C2-C4 알케닐기 또는 알키닐기; 시아노기; C1-C8 아실기; 모노 또는 디 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 아미노설포닐기; 카복시기; C1-C4 알콕시카보닐기; 모노 또는 디 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 카바모일기를 의미한다.

상기 화학식 Ib의 설폰아미드 함유 헤테로사이클릭 화합물은 산 또는 염기와 염을 형성하는 경우도 있다. 본 발명은 화합물 Ib의 염을 포함한다. 산과의 염으로서는, 예를 들면, 염산염, 브롬화수소산염, 황산염 등의 무기산염이나 아세트산, 락트산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 시트르산, 벤조산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산 등의 유기산과의 염을 들 수 있다. 또한, 염기와의 염으로서는 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등의 무기염, 트리에틸아민, 아르기닌, 라이신 등의 유기 염기와의 염을 들 수 있다.

또한, 이들 화합물의 수화물은 물론 광학이성체가 존재하는 경우에는 이들 모두가 포함되는 것은 말할 필요도 없다. 또한, 생체내에서 산화, 환원, 가수분해, 포합(抱合) 등의 대사를 받아 본 화합물로부터 생성되는 혈관 신생 억제작용을 나타내는 화합물도 포함한다. 또한, 본 발명은 생체내에서 산화, 환원, 가수분해 등의 대사를 받아 본 발명 화합물을 생성하는 화합물을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 화합물은 각종 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 일본 공개특허공보 제(평)7-165708호 및 제(평)8-231505호에 이의 몇 가지가 구체적으로 개시되어 있다.

하기에 구체적인 예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 이로써 한정되지는 않는다.

[참고예 1] 화합물 A의 인테그린 α2 발현에 대한 효과

인간 배꼽 정맥 내피세포(HUVEC)는 인간 제대(臍帶)에서 단리하며 EGM 배지(2% FCS, 하이드로코티손 비함유, Clonetics)에서 배양한다. I형 콜라겐 피복 플라스크(Smilon)로 계대 배양(subculture)하며 4 내지 6계대로 사용한다. 항 인간 인테그린 α2 항체(A2-IIE10)는 업스테이트 바이오테크놀러지 인코포레이티드(Upstate Biotechnology Inc.)로부터 구입하고, 항 인간 CD31 항체(JC/70A) 및 토끼 항 마우스 이뮤노글로불린의 FITC 표지된 F(ab')₂프래그먼트는 다코(Dako)로부터 구입한다.

25cm²세포 배양용 플라스크에 도입시키고, CO₂인큐베이터에서 37℃로 배양한 다음, 3시간 후에 화합물 A(5, 50, 500ng/㎖)를 함유하는 상기 배지와 교환하고, 다시 48시간 동안 배양한다. 세포를 회수하며 2×10⁵개의 세포를 100㎕의 PBS(0.1% BSA, 0.05% NaN₃)에 부유시키고, 1μg의 1차 항체를 가하여 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하여 PBS로 세정한 다음, FITC 표지된 2차 항체로 30분 동안 인큐베이팅한다. PBS로 세정한 다음, 셀픽스(CellFix; 벡톤 딕킨슨 제조)로 세포를 고정한다. FACS 캘리버(calibur)(벡톤 딕킨슨 제조)를 사용하여 각 샘플 2×10⁴개의 세포의 형광치를 측정한다. 세포 표면 분자의 발현량은 각 샘플의 형광치를 일차 항체가 없는 대조(control) 샘플의 형광치로 보정하여 구한다(다음 수학식 1).

도 l에 도시된 바와 같이 화합물 A(50, 500ng/㎖)는 HUVEC의 인테그린 α2 발현량을 감소시킨다.

[참고예 2] 항 인테그린 α2 항체 및 화합물 A의 관강 형성에 대한 영향

24웰 플레이트에 I형 콜라겐 겔을 분주(分注)하여 겔화한 다음, HUVEC를 10ng/㎖ EGF(GIBCO BRL)과 20ng/㎖ bFGF(GIBCO BRL) 또는 20ng/㎖ VEGF[와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤(Wako Pure Chemical Industries Ltd.)]를 함유하는 무혈청 배지(인간 내피-SFM 기초 성장 배지, GIBCO BRL)에 현탁하고 1 내지 1.2×10⁵세포/웰의 밀도로 인큐베이팅한다. 37℃에서 밤새 배양하여 I형 콜라겐 겔을 중층하여 겔화시킨 다음, 약제(항 인테그린 α2 항체 또는 화합물 A)를 함유하는 무혈청 배지(EGF와 bFGF 또는 VEGF를 포함한다)를 가하여 다시 37℃에서 4일 동안 배양한다. 또한, 항 인테그린 α2 항체의 작용에 관해서는 96웰 플레이트를 사용하여 실험을 수행한다.

배양 후, 세포를 MTT로 발색시켜 HUVEC가 형성하는 관강을 현미경하에 사진 촬영한다. 사진을 스캐너로 수납하며 화상 해석 소프트웨어 Mac SCOPE 2.56[미타니(MITANI)]을 사용하여 관강의 길이를 측정함으로써 HUVEC의 관강 형성을 정량한다.

도 2에 도시된 바와 같이 항 인테그린 α2 항체는 HUVEC의 bFGF에 의해 유도되는 관강 형성을 억제하며 bFGF에 의한 관강 형성에 인테그린 α2가 관여하는 것으로 나타난다. 또한, 도 3에 도시된 바와 같이 화합물 A는 HUVEC의 bFGF 또는 VEGF에 의해 유도되는 관강 형성을 억제한다. 참고예 2의 결과와 아울러 화합물 A가 인테그린 α2 발현을 억제함으로써 관강 형성을 억제한다고 생각된다.

[실시예 1] 화합물 A의 종양 체적 증가 억제작용과 혈소판 인테그린 α2 발현 억제작용의 관계

KP-1(인간 췌장암 세포주)의 PBS 현탁액(5×10⁷세포/㎖) 100㎕를 마우스(SLCKSN, 암컷, lot. 085605376)의 피하에 이식한다. 이식한지 1주 후로부터 0.5% 메틸셀룰로스 수용액(부형제) 또는 화합물 A 100 또는 200mg/kg(0.5% 메틸셀룰로스 현탁액)을 하루에 두번 경구 투여한다. 체중 및 종양 체적을 매일 측정한다. 마우스를 디에틸 에테르로 마취하여 눈 밑에서 모세관을 사용하여 채혈을 수행한다. 혈액 4㎖를 0.0038% 나트륨 시트레이트 수용액을 함유하는 PBS 396㎕로 희석한다. 항 마우스 CD49b FITC 표지된 항체(Phramingen, Cat. 09794D, lot. M006073)를 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 30배 희석한다. 이러한 항체 10㎕를 희석한 혈액 90㎕에 가한다. 실온에서 60분 동안 반응시켜 필터(FALCON, Cat. 2235)에 통과시킨다. PBS 900㎕를 가하여 플로우 사이토미터(벡톤 딕킨슨, FACS 캘리버)로써 전방 산란광 및 측방 산란광에 의해 혈소판 분획을 분리하고, 혈소판 위의 형광강도를 측정한다.

도 4에 도시된 바와 같이 화합물 A는 100mg/kg 및 200mg/kg의 용량으로 KP-1 종양 체적의 증가를 억제한다. 참고예 1 및 2의 결과와 아우르면 화합물 A는 인테그린 α2의 발현을 억제함으로써 관강 형성을 억제하며 종양에 의해 유도된 혈관 신생을 억제한 결과, 종양 체적의 증가를 억제하는 것으로 생각된다.

도 5에 도시된 바와 같이 화합물 A는 동시에 측정한 혈소판에서 인테그린 α2의 발현량을 감소시킨다. 혈소판에서 인테그린 α2의 발현량의 감소는 종양 체적 증가의 억제가 보이는 100mg/kg 및 200mg/kg의 용량으로 관찰되며 혈소판에서 인테그린 α2의 발현량이 화합물 A의 종양 체적 증가 억제작용의 대리 마커로 될 수 있음을 나타낸다.

본 발명에 따라 인테그린 발현을 억제함으로써 약효를 발현하는 약제, 예를 들면, 혈관 신생 억제제의 약효를 혈소판에서 인테그린 발현량을 대리 마커로서 모니터링할 수 있게 된다. 혈소판은 시료로서의 채취가 용이하므로 효율적으로 모니터링할 수 있게 된다.

Claims

약제를 투여받은 환자의 혈소판에서 인테그린 발현량을 측정하는 공정 및 측정된 발현량에 근거하여 혈소판 이외의 세포에서 인테그린 발현에 대한 당해 약제의 영향을 판정하는 공정을 포함하여 이루어진, 당해 약제의 인테그린 발현에 대한 영향을 검정하는 방법.
제1항에 있어서, 인테그린이 인테그린 α2인 방법.
제1항에 있어서, 인테그린 발현량을 면역화학적 방법으로 측정하는 방법.
제3항에 있어서, 면역화학적 방법이 FACS법인 방법.
제3항에 따른 방법에 사용하기 위한, 인테그린 정량 시약.
제1항에 있어서, 인테그린 발현량을 인테그린 암호화 mRNA의 양을 측정함으로써 측정하는 방법.
제6항에 있어서, mRNA의 양을 정량적 PCR로 측정하는 방법.
제6항에 따른 방법에 사용하기 위한, 인테그린 암호화 mRNA의 정량 시약.
제2항에 있어서, 약제가 화학식 I의 설폰아미드 화합물, 약리학적으로 허용되는 이의 염 또는 이들의 수화물인 방법.

화학식 I

상기식에서,

B는 치환기를 가질 수 있으며 환의 일부가 포화될 수 있는 C6-C10 아릴 환 또는 6 내지 10원 헤테로아릴 환이며,

K는 단일결합, -CH=CH- 또는 -(CR^4bR^5b)m^b-(여기서, R^4b및 R^5b는 동일하거나 상이하며, 수소원자 또는 C1-C4 알킬기이며, m^b는 1 또는 2의 정수이다)이며,

R¹은 수소원자 또는 C1-C6 알킬기이며,

Z는 단일결합 또는 -CO-NH-이며,

R은 치환기를 가질 수 있으며 환의 일부가 포화될 수 있는 C6-C10 아릴 환 또는 6 내지 10원 헤테로아릴 환이다.
제9항에 있어서, R이 인돌, 퀴놀린 또는 이소퀴놀린인 방법.
제2항에 있어서, 약제가 화학식 Ia의 설폰아미드 화합물, 약리학적으로 허용되는 이의 염 또는 이들의 수화물인 방법.

화학식 Ia

상기식에서,

A^a환은 치환기를 가질 수 있는 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 환이며,

B^a환은 치환기를 가질 수 있는 6원 불포화 탄화수소 환 또는 헤테로 원자로서 질소원자를 1개 함유하는 불포화 6원 헤테로사이클이며,

C^a환은 치환기를 가질 수 있는, 질소원자를 1 또는 2개 함유하는 5원 헤테로사이클이며,

R^1a는 수소원자 또는 C1-C6 알킬기이며,

W^a는 단일결합 또는 -CH=CH-이며,

Y^a는 탄소원자 또는 질소원자이며,

Z^a는 -N(R^2a)-(여기서, R^2a는 수소원자 또는 저급 알킬기이다) 또는 질소원자이다.
제11항에 있어서, W^a가 단일결합인 방법.
제11항에 있어서, W^a가 단일결합이며 Z^a가 -NH-이며 Y^a가 탄소원자인 방법.
제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, B^a환이 치환기를 가질 수 있는 벤젠 또는 피리딘인 방법.
제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, C^a환이 치환기를 가질 수 있는 피롤인 방법.
제11항에 있어서, A^a환이 치환기를 가질 수 있는 벤젠 또는 피리딘이며, B^a환이 치환기를 가질 수 있는 벤젠이며 C^a환이 치환기를 가질 수 있는 피롤이며 W^a가 단일결합이며, Z^a가 -NH-인 방법.
제2항에 있어서, 약제가 화학식 Ib의 설폰아미드 함유 헤테로사이클릭 화합물, 약리학적으로 허용되는 이의 염 또는 이들의 수화물인 방법.

화학식 Ib

상기식에서,

A^b는 수소원자; 할로겐 원자; 하이드록실기; 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기 또는 알콕시기; 시아노기; -(CO)_k ^bNR^2bR^3b(여기서, R^2b및 R^3b는 동일하거나 상이하며, 각각 수소원자이거나 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이며, k^b는 0 또는 1이다); 치환기를 가질 수 있는 C2-C4 알케닐기 또는 알키닐기; 또는 하기 그룹 A에서 선택된 치환기를 가질 수 있는 페닐기 또는 페녹시기이며,

B^b는 하기 그룹 A에서 선택된 치환기를 가질 수 있는 아릴기 또는 모노사이클릭 헤테로아릴기, 또는(여기서, 환 Q^b는 1 또는 2개의 질소원자를 가질 수 있는 방향족 환이며, 환 M^b는 환 Q^b와 이중결합을 공유하는 C5-C12 불포화 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 환이고, 당해 환은 질소원자, 산소원자 및 황원자로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로 원자를 가질 수 있으며, 환 Q^b및 환 M^b는 질소원자를 공유하는 경우가 있고, 환 Q^b및 환 M^b는 하기 그룹 A에서 선택된 치환기를 가질 수 있다)이며,

K^b는 단일결합 또는 -(CR^4bR^5b)_m ^b-(여기서, R^4b및 R^5b는 동일하거나 상이하며, 수소원자 또는 C1-C4 알킬기이며, m^b는 1 또는 2의 정수이다)이며,

T^b, W^b, X^b및 Y^b는 동일하거나 상이하며, =C(D^b)-[여기서, D^b는 수소원자, 할로겐 원자, 하이드록실기, 또는 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기 또는 알콕시기, 시아노기, -(CO)_n ^bNR^6bR^7b(여기서, R^6b및 R^7b는 동일하거나 상이하며, 수소원자이거나 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이며, n^b는 0 또는 1이다), 또는 치환기를 가질 수 있는 C2-C4 알케닐기 또는 알키닐기이다] 또는 질소원자이며,

U^b및 V^b는 동일하거나 상이하며, =C(D^b)-(여기서, D^b는 위에서 정의한 바와 동일하다), 질소원자, -CH₂-, 산소원자 또는 -CO-이며,

Z^b는 단일결합 또는 -CO-NH-이며,

R^1b는 수소원자 또는 C1-C4 알킬기이며,

은 단일결합 또는 이중결합이고,

그룹 A는 할로겐 원자; 하이드록실기; 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4알킬기 또는 알콕시기; 시아노기; -R^8bR^9bN(NH)_p ^b-(여기서, R^8b및 R^9b는 동일하거나 상이하며, 수소원자이거나 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이며, p^b는 0 또는 1이며, R^8b및 R^9b는 이들이 결합되어 있는 질소원자와 함께 5 또는 6원 환을 형성할 수 있으며, 당해 환은 추가로 질소원자, 산소원자 또는 황원자를 함유할 수 있으며, 치환기를 가질 수 있다); 모노 또는 디 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 아미노설포닐기; 치환기를 가질 수 있는 C1-C8 아실기; C1-C4 알킬-S(O)_s ^b-C1-C4 알킬렌기(여기서, s^b는 0, 1 또는 2의 정수이다); C1-C4 알킬 또는 치환기를 가질 수 있는 페닐설포닐아미노기; -(CO)_q ^bNR^10bR^11b(여기서, R^10b및 R^11b는 동일하거나 상이하며, 수소원자이거나 할로겐 원자 또는 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 아미노기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이며, q^b는 0 또는 1이다); 또는 치환기를 가질 수 있는 아릴기 또는 헤테로아릴기이다.
제17항에 있어서, U^b및 V^b가 =C(D^b)-(여기서, D^b는 위에서 정의한 바와 동일하다) 또는 질소원자인 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, Z^b가 단일결합인 방법.
제17항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, T^b, U^b, V^b, W^b, X^b및 Y^b중의 하나 이상이 질소원자인 방법.
제17항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, A^b가 할로겐 원자; 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기 또는 알콕시기; 시아노기; -(CO)_r ^bNR^12bR^13b(여기서, R^12b및 R^13b는 동일하거나 상이하며, 수소원자이거나 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이며, r^b는 0 또는 1이다); 또는 치환기를 가질 수 있는 C2-C4 알케닐기 또는 알키닐기인 방법.
제17항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, T^b, U^b, V^b, W^b, X^b및 Y^b중의 하나만이 질소원자인 방법.
제17항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, T^b, W^b및 Y^b중의 하나만이 질소원자인 방법.