WO2006090932A1 - スルホンアミド化合物の代理マーカー - Google Patents

スルホンアミド化合物の代理マーカー Download PDF

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WO2006090932A1
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Takashi Owa
Yoichi Ozawa
Naoto Ono
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Eisai R & D Managemant Co., Ltd.
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    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/30—Hetero atoms other than halogen
    • C07D333/34—Sulfur atoms

Definitions

  • the present invention relates to a method for assaying the effect of a sulfonamide compound that affects integrin expression.
  • E7820 has been reported to have an integrin ⁇ 2 expression inhibitory effect ( 6) . Furthermore, it has been reported that the effect of a drug on the expression of integrin in cells other than platelets can be determined by measuring the expression level of integrin in the platelets of patients receiving the drug ( 7) .
  • DNA microarrays have been used to simultaneously detect the expression level of many genes.
  • DNA microarrays have been applied for a wide range of purposes ( 8 and 9) .
  • several reports have been made on the changes in gene expression that occur when anticancer drugs are applied to tumor cells using DNA microarrays (some of which use membrane filters) ( 1 ° 1). 2) . These reports show that gene expression variability analysis is extremely useful for comprehensive study at the molecular level of biological changes caused by cell characteristics comparisons and drug treatments. It is useful.
  • An object of the present invention is to find a surrogate marker for evaluating the effect of a sulfonamide compound that affects the expression of integrin, preferably integrin 2, and has antitumor activity.
  • the inventors of the present invention have used E7820, E7070, LY186641, LY295501, LY573636 or CQS or a combination thereof in an experiment of a DNA microarray opi cancer cell line panel. It was found that the gene variation pattern and the cytostatic activity were highly correlated. In addition, in the assay to measure cell growth inhibitory activity, it was found that the cancer cell lines E7820, LY186641, LY295501, LY_ASAP, LY573636 and CQS that are resistant to E7070 are cross-resistant.
  • E7820 is an indicator of platelets in patients receiving the compound. It has been reported that measuring the expression level of infrastructure can determine the effect of the compound on integrin expression in cells other than platelets.
  • sulfonamide compounds preferably E7070, LY186641, LY295501, LY-ASAP, LY573636 or CQS, or combinations thereof, also show integrin expression in platelets of patients receiving the compound. By measuring the amount, it was found that the effect of the compound on the expression of integrin in cells other than platelets could be evaluated, and the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following.
  • the sulfonamide compound is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • E represents 1 O—, 1 N (CH 3 ) 1, 1 CH 2 _, 1 CH 2 CH 2 — or 1 CH 2 0—, D represents 1 CH 2 — or 1 O— , R la means a hydrogen atom or a halogen atom, and R 2a means a norogen atom or a trifluoromethyl group.
  • R lb represents a hydrogen atom, a halogen atom
  • R 2b has hydrogen atom, halogen atom, cyano group, _CF 3 , substituent D-Ce alkyl group which may have Ci 1 C 4 alkoxycarbonyl group which may have a substituent Ci 1 C 4 alkoxy group which may
  • R 6 b is an optionally substituted Ci_C 6 alkyl group, R 5 b is a hydrogen atom and R 7b is a halogen atom
  • R 7b is a halogen atom
  • Ci_C 6 alkyl group which may have a substituent or one CF 3 (however, either R 5 b or R? B may have a substituent Ci—C 6 alkyl group Or R? B in the case of an optionally substituted Ci—C 6 alkyl group, either R 5 b or Reb is a hydrogen atom)
  • R 5 b or R? B may have a substituent Ci—C 6 alkyl group Or R? B in the case of an optionally substituted Ci—C 6 alkyl group, either R 5 b or Reb is a hydrogen atom
  • the sulfonamide compound is N-[[((4--cyclophenyl) amino] carbonyl] — 2,3-dihydrol 1 H-indene-5-sulfonamide, N _ [[(3, 4 -Dicyclophene) amino] carbonyl] — 2, 3—dihydrobenzofuran 5-snorehonamide, N— (2,4-dicycloben Benzoinole) one 4 one-nine phenylenorenoreamide, N— (2,4-Dichlorobenzoinole) 1-Promothiophene 1-Snorephone amide and 2-Sue / Lefanyl amide 5—At least one compound selected from the group consisting of clooxaquinoline, or a drug thereof.
  • the method according to (1) which is a physically acceptable salt or a solvate thereof.
  • the sulfonamide compound is N-[[((3,4-dichlorophenyl) amino] carbonyl] 1,2,3-dihydrobenzofuran 5-sulfone amide and N- (2,4-dichlorobenzoin 1) at least one compound selected from the group consisting of 1-promothiophene 1-sulfonamide, or a pharmacologically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
  • the sulfonamide compound is N— (2,4-dichlorobenzene)
  • the method described in (1) which is a sodium salt of oral mothiophene 2-sulfonamide.
  • Any cell other than platelets is a tissue cell in which angiogenesis can occur, and the inhibitory action on the expression of intedarin is evaluated as an anti-angiogenic action. Or the method according to paragraph 1.
  • Cells other than platelets are tumor cells, and the inhibitory action on integrin expression is evaluated as a tumor growth inhibitory action, (1) to (5) I, or any one of Method.
  • a sulfonamide compound preferably E7070, LY186641, LY295501, LY-ASAP, LY573636 or CQS or a combination thereof, according to the present invention. It has become possible to determine the effect of the compound on the suppression of integrin expression.
  • the effect of the sulfonamide compound on the suppression of integrin expression in cells other than platelets can be evaluated by using the integrin expression level in blood platelets as a surrogate marker.
  • the effect of the sulfonamide compound can be easily evaluated simply by measuring the integrin expression level in platelets. It is very effective.
  • FIG. 1 shows the results of hierarchical clustering analysis on the DNA microarray in Example 1.
  • FIG. 2 shows the correlation coefficient in the DNA microarray in Example 2.
  • Figure 3 shows the hierarchical cluster in the DNA microarray in Example 2. The result of ring analysis is shown.
  • FIG. 4 shows the correlation coefficient in the DNA microarray in Example 2.
  • FIG. 5 shows the results of hierarchical clustering analysis on the DNA microarray in Example 2.
  • Fig. 6 shows HCT116-C9
  • FIG. 7 shows the growth inhibitory action of E7070 and LY573636 on HCT116-C9, HCT116-C9-C1 and HCT116-C9-C4 in the assay for measuring cytostatic activity.
  • the sulfonamide compound includes a compound represented by the following general formula (I).
  • E represents one O—, —N (CH 3 ) one, —CH 2 , one C H2 C H2— or one CH 2 0—
  • D represents one CH 2 —Or one O—
  • R la represents a hydrogen atom or a halogen atom (for example, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom)
  • R 2a represents a halogen atom or a trifluoromethyl group.
  • the compound represented by the general formula (I) of the present invention can be produced by a known method, for example, by the method described in European Patent Application Publication No. 0222475A1.
  • preferred compounds are LY186641 or LY295501.
  • LY186641 refers to N — [[((4) cyclophenyl) amino] carbonyl] 1,2,3-dihydro-1 H-indene-5-sulfonamide, whose structural formula is shown in the following formula (VII) .
  • LY186641 can be produced by a known method, for example, by the method described in European Patent Application Publication No. 0222475A1.
  • LY295501 refers to N — [[((3,4-dichlorophenyl) amino] carboninole] -1,2,3-dihydrobenzofuran-5-snorephoneamide, which has the structural formula It is shown in the following formula (VIII).
  • LY295501 can be produced by a known method, for example, by the method described in European Patent Application Publication No. 0222475A1 and Z or European Patent Application Publication No. 0555036A2.
  • the sulfonamide compound includes a compound represented by the following general formula (II).
  • J is 1O— or 1 NH—
  • R lb is a hydrogen atom, a halogen atom, or a Ci—C 6 alkyl group which may have a substituent, a substituent.
  • Ci 1 C4 alkoxy group which may have a substituent
  • Ci 1 C 4 alkylthio group which may have a substituent, 1 CF 3 , 1 OCF 3 , _S CF 3 , which may have a substituent good d _C4 alkoxycarbonyl group, a nitro group, azido group, one O (S_ ⁇ 2) CH 3, one N (CH 3) 2, hydroxyl, phenyl group, Fuweniru group having a substituent, a pyridinyl group, thienyl group, furyl A quinolinyl group or a triazole group, R3 ⁇ 4 may have a hydrogen atom, a halogen atom, a cyano group, _CF 3 , an optional
  • R? B is a halogen atom
  • R? B is a halogen atom, substituted Ci—C 6 alkyl group or one CF 3 (provided that either R 5b or R 7b When either of them is a d—C 6 alkyl group which may have a substituent or a R—b force s, a halogen atom or a d—C 6 alkyl group which may have a substituent
  • each of R 5 b and RGb is a hydrogen atom.
  • halogen atom is preferably a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.
  • C i—C 6 alkyl group means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and is not particularly limited, for example.
  • 2-trimethylpropyl group 1, 2, 2-trimethylpropyl group, 1-ethyl-1-methylpropyl group, 1-ethyl-2-methylpropyl group, etc.
  • preferred groups include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropylinole group, an n-ptynole group, an isobutinole group, a sec-putinole group, a tert-putinole group, an n-pentyl group, and an n-pentyl group.
  • a hexyl group etc. can be mentioned.
  • C: L—C 4 alkoxy group means an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, and is not particularly limited, but is preferably a methoxy group, ethoxy group Group, n-propoxy group, isopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group and the like.
  • the alkyl group is not particularly limited, but is methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert -Examples include butyl.
  • examples of “d-c 4 alkoxycarbo group” are not particularly limited, but include methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, n_propoxycarbonyl group, isopropoxy group Examples thereof include a carbonyl group, an n-butoxy carbonyl group, an isoptoxy carbonyl group, a sec-butoxy carbonyl group, and a tert-oxy carbonyl group.
  • the substituent to be introduced is not particularly limited.
  • Ci-Cs alkyl group for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isoptyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, etc.
  • d—C 4 alkoxy group for example, methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, isopropoxy group, n -butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group, etc.
  • amino group hydroxyl group
  • Substituents such as halogen atoms (for example, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom) or silyl group can be mentioned.
  • the compound represented by the general formula (II) of the present invention can be produced by a known method. For example, it can be produced by the method described in WO 02/0988848 pamphlet (WO02 / 098848). can do.
  • the preferred compound is LY-ASAP.
  • LY-ASAP refers to N— (2,4-dichlorobenzoic) -4 monochlorophenone sulfonamide, whose structural formula is shown in the following formula (XI).
  • LY-ASAP LY-ASAP can be produced by a known method.
  • LY-ASAP can be produced by the method described in WO 02/0988848 (WO02 / 098848).
  • examples of the sulfonamide compound include LY573636.
  • LY573636 refers to N— (2,4-dichlorobenzene) 15-bromothiophene-2-sulfone amide, and the structural formula is shown in the following formula (III).
  • LY573636 is preferably a sodium salt.
  • LY573636 can be produced by a known method.
  • LY573636 is commercially available in the same manner as described in WO 02/098 8 4 8 (WO02 / 098848). It can be produced from sulfonyl chloride and 2,4-dichlorobenzoic acid.
  • LY573636 can be produced by the method described in Example 63 in International Publication No. 2003/035629, Panplate (WO2003 / 035629).
  • examples of the sulfonamide compound include CQS.
  • CQS refers to 2-sulfanylamide 5-chloroquinoline, and the structural formula is shown in the following formula (IV).
  • CQS can be produced by a known method, for example, (J. Am. Chem. Soc, 1947, 71, 6-
  • examples of the sulfonamide compound include E7070.
  • E7070 refers to N— (3-chloro-1H-indole-7-yl) -4-snorefamoylbenzenesulfonamide, whose structural formula is shown in the following formula (IX).
  • E7070 can be produced by a known method.
  • Example 1 in International Publication No. 9 5 Z 0 7 2 7 6 Pamphlet (WO95 / 07276) and / or Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-165708 (JP7-165708) 9 can be produced by the method described in 9.
  • Compounds form pharmacologically acceptable salts with acids or bases In some cases.
  • the sulfonamide compound in the present invention includes these pharmacologically acceptable salts.
  • salt with acid examples include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, acetic acid, acetic acid, lactic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, citrate, and tartaric acid.
  • salts with organic acids such as benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and trifluoroacetic acid.
  • alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt
  • alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt
  • the sulfonamide compound may be an anhydride or may form a solvate such as a hydrate.
  • the solvate may be either a hydrate or a non-hydrate, but a hydrate is preferred.
  • water, alcohol (for example, methanol, ethanol, n-propanol), dimethylformamide, or the like can be used.
  • the sulfonamide compounds in the present invention include those solvates and / or optical isomers.
  • the sulfonamide compound in the present invention also includes a sulfonamide compound that undergoes metabolism such as oxidation, reduction, hydrolysis, and conjugation in vivo.
  • the sulfonamide compound in the present invention also includes a compound that generates a sulfonamide compound by undergoing metabolism such as oxidation, reduction, and hydrolysis in vivo.
  • a method for assessing the effect of a sulfonamide compound on integrin expression ie, on the platelets of a patient receiving a sulfonamide compound.
  • a method for evaluating the effect of the compound on integrin expression in cells other than platelets is provided.
  • the present invention relates to a method for evaluating the action of a sulfonamide compound on integrin expression, comprising: (a) a step of measuring the expression level of integrin in platelets of a patient receiving a sulfonamide compound; (B) including a step of evaluating the action of the compound on the expression of integrin in cells other than platelets based on the measured expression level.
  • the sulfonamide compound is as described in “1. Sulfonamide Compound”.
  • Sulfonamide Compound For example, the general formula (I), the general formula ( ⁇ ), the formula (III), the formula
  • the sulfonamide compound is preferably E7070.
  • the sulfonamide compound also includes pharmaceutically acceptable salts or solvates such as hydrates thereof.
  • the sulfonamide compound may be used as it is, or may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it is a composition containing the sulfonamide compound.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes various dosage forms containing the sulfonamide compound, such as tablets, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, suppositories, injections, ointments. And poultices.
  • patient means a patient suffering from some disease.
  • diseases in which integrin is suspected to be involved such as cancer, diabetic retinopathy, coronary arteriosclerosis disease, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, asthma, etc. It is not limited to.
  • the dosage and administration method of the sulfonamide compound to the patient are not particularly limited, and may be suitable for the purpose of administration of the sulfonamide compound.
  • the method of the present invention can be used to assay the effects of sulfonamide compounds by systemic administration such as oral administration. preferable.
  • the dosage of the sulfonamide compound of the present invention depends on the degree of symptoms, patient age, sex, body weight, sensitivity difference, administration method, administration timing, administration interval, properties of the pharmaceutical preparation, formulation, type, type of active ingredient, etc.
  • the integrin is preferably integrin 2.
  • Integrin-2 is one of the integrin families of adhesion molecules expressed on the cell surface.
  • the gene encoding human integrin 2 is a gene containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is registered with GenBank under the accession number: NM-002203.
  • the method for measuring the integrin expression level in platelets is not particularly limited, and the amount of protein may be quantified by an immunochemical method or the like, or the amount of mRNA encoding integrin may be quantified.
  • An example of a method for measuring the expression level of integrin by an immunochemical method is flow cytometry.
  • Examples of a method for quantifying the amount of mRNA encoding integrin include quantitative PCR.
  • Embodiments of the present invention are described below.
  • A Separation of platelets
  • B Quantification of the amount of integrin on the surface of platelets
  • C Quantification of the amount of integrin mRNA in platelets
  • D Sulfonamide in cells other than platelets Details are described in the order of evaluation of the action of the compound.
  • the platelet is preferably a platelet collected from a patient who has been administered a sulfonamide compound.
  • Platelets can be obtained, for example, by separating blood collected from the patient. Separation of platelets can be performed by techniques such as centrifugation, gel filtration, and flow cytometry.
  • Centrifugation 10 to blood. /. Add an amount of 3.8% aqueous sodium taenoate solution and centrifuge at 100 g, 10 min, room temperature. The upper layer is platelet-rich plasma, which is centrifuged at 1500 g for 10 min to obtain platelets from the sediment.
  • the expression level of integrin on the platelet surface can be measured by immunochemical methods such as immunohistochemical staining, ELISA, Western blot, and flow cytometry.
  • ELISA for example, a platelet is bound to an immobilized antibody against the surface antigen of platelets, washed, and then reacted with a labeled anti-integrin antibody. From the amount of bound anti-integrin antibody label, Integrins can be quantified.
  • Western blotting for example, the separated platelets are solubilized in a buffer containing SDS, then SDS-PAGE and Western blotting are performed, and the integrin blotted on the membrane is quantified with a labeled anti-integrin antibody. can do. At this time, if the amount of platelets is quantified simultaneously with an antibody against the platelet surface antigen, the amount of integrin per platelet can be quantified.
  • flow cytometry for example, whole blood collected from a patient is diluted, labeled anti-integrin antibodies are bound, and the platelet fraction is separated by forward scattered light and side scattered light, and the fluorescence intensity on the platelet surface is measured. By measuring, the amount of intedarin on the platelet surface can be quantified.
  • the flow cytometry is specifically described below, but the present invention is not limited thereby. According to flow cytometry, the amount of integrin can be quantified using whole blood without separating blood platelets.
  • An antibody against integrin labeled with FITC preferably an antibody against integrin a 2; for mouse, for example, anti-mouse CD49b FITC label (BD Pharmingen, Cat. BD-558757); for human, anti-human CD49b FITC label (BD Dilute Pharmingen, Cat.BD-555498) to an appropriate concentration with PBS containing 0.1% BSA To do. Add this antibody ⁇ ⁇ ⁇ to the diluted blood 90 / zl above. Incubate at room temperature for 60 minutes (min) and pass through a filter (FALCON, Cat. 2235).
  • PBS 900 separate platelet fraction by forward scattered light and side scattered light in flow cytometry (Becton Dickinson, FACSCalibur), measure platelet surface integrin, preferably by measuring fluorescence intensity of platelet surface
  • the amount of integrin ⁇ 2 can be quantified.
  • the present invention also provides an integrin quantification reagent containing an anti-integrin antibody for use in the evaluation method of the present invention.
  • the antibody is preferably an antibody against integrin 2.
  • an anti-mouse CD49b FITC-labeled antibody or an anti-human CD49b FITC-labeled antibody can be used.
  • the integrin quantification reagent of the present invention may contain components commonly used in general quantification reagents in addition to the antibodies described above.
  • RNA can be extracted by guanidine thiocyanate method, phenol method or the like.
  • Integrin-encoding mRNA can be quantified by techniques such as Northern plot analysis, dot blot angle analysis, RNase protection assay, comparative RT'PCR, competitive RT-PCR, and quantitative PCR. Quantification of mRNA encoding integrin is preferably quantitative PCR. Below is the quantitative PCR technology. However, the present invention is not limited thereto. Quantitative PCR can be performed using TaqMan probe and ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems) as follows.
  • the operation is performed in two steps: reverse transcription reaction and PCR reaction.
  • the first step, reverse transcription, is performed on the obtained RNA using dNTP, oligo d (T) 16 primer, RNase Inhibitor, ultiscribe Reverse Transcriptase (Perkm-Elmer Applied Biosystems)! ] Yes, hold at 25 ° C for 10 minutes, then heat at 48 ° C for 30 minutes.
  • the reaction is stopped by heating at 95 ° C for 5 minutes.
  • PCR reactions include, for example, 2.5 ng cDNA, lxTaqMan PCR buffer, 3 mM MgCl 2 , 200 / M each dATP, dCTP, dGTP, 400 ⁇ ⁇ dUTP, 200 nM primer pair, 0.01 U / ⁇ l AmpErase UNG, 0.025 W ⁇ 1 AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Perkin-Elmer Applied Biosystems) reaction is performed.
  • the reaction conditions are 50 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 10 minutes, then 95 ° C for 20 seconds ⁇ 55 ° C for 20 seconds ⁇ 72 ° C for 30 seconds in 40 cycles.
  • the present invention relates to an oligonucleotide (for example, RNA or DNA) having all or part of the base sequence of mRNA encoding integrin or all of the base sequence complementary to the mRNA for use in the evaluation method of the present invention. Also provided is a reagent for quantifying mRNA encoding an integrin, including a partial oligonucleotide (eg, RNA or DNA).
  • a partial oligonucleotide eg, RNA or DNA
  • the oligonucleotide is a primer and Z or probe used for mRNA quantification and can be designed using Primer Expression (Perkin-Elmer Applied Biosystems).
  • the oligonucleotide has a nucleic acid length (for example, 10 mer to 40 mer) suitable for a function as a primer or probe when measuring the expression level of integrin mRNA, and as long as the function is exhibited, the integrin mRNA Can be selected from all or any part of the same or complementary base sequence.
  • the reagent for quantifying mRNA of the present invention is a component commonly used in general quantification reagents (eg, buffer, ATP, GTP, TTP, CTP, Reverse Transcriptase, oligo dT, DNA polymerase, RNase, Taqman probe, etc.).
  • cells other than platelets are not particularly limited, but are preferably cells of a tissue that can undergo angiogenesis or tumor cells, and examples thereof include vascular endothelial cells of tumor tissue.
  • the cells other than platelets are preferably fibroblasts, tumor cells such as melanoma cells, to which signals such as cell proliferation, apoptosis, and differentiation are transmitted via integrin 2.
  • integrin ⁇ 2 since the expression of integrin ⁇ 2 has been confirmed in monocytes, sputum cells, and sputum cells, these cells are also included in cells other than platelets.
  • the method of the present invention is also useful for estimating the function of these cells.
  • the sulfonamide compound When the amount of integrin expressed in the platelets of patients receiving the sulfonamide compound was measured and the expression level decreased, the sulfonamide compound also inhibited the integrin expression in cells other than platelets. It can be evaluated that it may have an effect.
  • the inhibitory effect on the integrin expression of the sulfonamide compound administered to the patient can be evaluated as an angiogenesis inhibitory action.
  • the inhibitory effect on the expression of integrin of the sulfonamide compound administered to the patient can be evaluated as a tumor growth inhibitory action.
  • the sulfonamide compound could cause angiogenesis.
  • tissue cells It can be evaluated that it has an anti-angiogenic action as an action on the expression of integrins.
  • the sulfonamide compound had an effect on the integrin expression in tumor cells. Thus, it can be evaluated as having a tumor growth inhibitory action.
  • human colon cancer-derived cell line HCT116 American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA
  • human leukemia-derived cell line MOLT-4 American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA
  • HCT116 cells and MOLT-4 cells were seeded at a ratio of 2.0 ⁇ 10 6 cells and Z dishes in a 10 cm diameter cell culture dish, and the following compound treatment was performed after 24 hours of culture.
  • E7820 (0.8 ⁇ ⁇ ), ⁇ 7070 (0.8 ⁇ M), LY295501 (30 ⁇ ), CQS (8 ⁇ ), adriamycin (0.2 ⁇ ), daunomycin (0.2 ⁇ ), ICRF154 Twelve compounds (80 ⁇ ), ICRF159 (80 ⁇ ) ⁇ kenpaullone (10 ⁇ ), alsterpullone (10 ⁇ ), trichostatin ⁇ (0.1 ⁇ ), and rapamycin (80 ⁇ ) were evaluated.
  • MOLT-4 cells ⁇ 7070 (0.8 Ai M) was evaluated.
  • adriamycin and daunomycin are the types of DNA that interfere with DNA.
  • topoisomerase II inhibitors are catalytic types of DNA topoisomerase II
  • the harmful agent, rapamycin is a compound known as an mTOR / FRAP inhibitor, and the compound treatment concentration is the 50% growth inhibition concentration of each compound against HCT116 cells (for 3 days using WST-8). Based on the cell growth inhibitory activity), the concentration was set to 3 to 5 times the standard, and the cells were collected after treatment for 24 hours at the set concentration shown in parentheses following the above compound name. Cells cultured for 24 hours were also collected.
  • RNA extraction of total RNA from the collected cells was performed using TRIZOL reagent (Invitoguchigen) according to the attached procedure.
  • RNA was dissolved in sterilized water treated with 100 il diethylpyrocarbonate (DEPC) and purified using an RNeasy column (QIAGEN). Superscript Choice System (Invitrogen) and T7-d (T) 24 primer was used to synthesize double-stranded cDNA.
  • the obtained cDNA was purified with phenol / chloroform and labeled with piotinylated UTP and CTP using RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics) according to the attached procedure. After purification of the reaction product with an RNeasy column, 200 mM Trisacetic acid pH 8.1, 150 mM Magnesium acetate, 50 mM The cRNA was fragmented by heating at 94 ° C in acetic acid for 35 minutes.
  • Fragmented cRNA was added in 100 mM MES, 1 M sodium salt, 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20, 45.
  • HCT116 cells 10. /. Fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin in RPMI-1640 medium.
  • the culture and compound treatment were performed in an incubator adjusted to 5% CO 2 and 37 ° C.
  • HCT 116 cells were seeded in a 10 cm diameter cell culture dish at a ratio of 2.0 ⁇ 10 6 cells Z dish, and the following compound treatment was performed after 24 hours of culture.
  • MST16 is a catalytic type DNA topoisomerase II inhibitor
  • etoposide is a DNA topoisomerase II inhibitor that instigates the development of cleavable complex lj
  • ethoxzolamide is a carbonic anhydrase inhibitor ⁇
  • capsaicin is a tumor-specific plasma membrane NADH Oxidase Inhibition
  • trichostatin A is a histone deacetylase inhibitor
  • kenpaullone is a known compound that inhibits cyclin-dependent kinases (CDKs).
  • the compound treatment concentration was set to twice the concentration based on the 50% growth inhibitory concentration of each compound on HCT116 cells (based on the 3-day cytostatic activity using MTT). Cells were collected after treatment for 24 hours at the set concentration indicated in parentheses following the compound name. Similarly, cells cultured for 24 hours without the addition of the compound were also collected.
  • RNA extraction of total RNA from the collected cells was performed using TRIZOL reagent (manufactured by Invitrogen) according to the attached operation method.
  • this example was performed for each sample in duplicate (for convenience of experiment, each sample was identified as control-1, control-2, E7820_l, E7820- The branch number was assigned in the manner of 2). Then, gene expression change induced by each compound was analyzed using Gene Chip (Affymetri) system (Human Focus array). The RMA method (robust multi-array average method (Biostatistics (2003), 4 249-264)) was applied to the 26 “.cel” fuinole obtained in this example (13 samples x 2 of control + 12 compounds). After normalization at the probe level, the log value of the signal intensity at the gene level was calculated.
  • LY1 is LY186641
  • LY2 is LY295501
  • LY5J is LY573636
  • CAI is ethoxzolamide
  • Cap is capsaicin
  • MSTJ is MST16
  • TSA stands for trichostatin A
  • Kenp stands for kenpaullone.
  • de hclust (*," average 'c ) is a command for statistical analysis, and clustering analysis by R is performed using the average value of dupulicate experimental data. Indicates that it has been done.
  • the cancer cell lines used were DLD-1, HCT15, HCT116, HT29, SW480, SW620, WiDr (above human colon cancer cell line), A427, A549, LX-1, NCI-H460, NCI-H522, PC '9, PC-10 (above, human lung cancer cell lines), GT3TKB, HGC27, MKNl, MKN7, MKN28, MKN74 (above, human gastric cancer cell lines), AsPC-1, KP-1, KP-4, MiaPaCall , PANC-1, SUIT-2 (above, human cancer cell line), BSY-1, HBC5, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468 (above, Human breast cancer cell line), CCRF-CEM, HL60
  • HCT15 (1500 / weIl, 14.5 h)
  • HGC27 (1500 / well, 14.6 h)
  • HBC5 2000 / well, 31.8 h)
  • HT29 (2500 / weIl, 19.8 h) MKN7 (3000 / well, 37.4 h) MDA-MB231 (2000 / well, 21.6 h) SW480 (3000 / well, 19.5 h) MKN28 (2000 / well, 22.7 h) MDA-MB -435 (3000 / well, 24.4 h) SW620 (2500 / well, 17.3 h) MKN74 (4000 / well, 24.8 h) MDA-MB-468 (3000 / well, 34.2 h) WiDr (2000 / well, 18.9 h)
  • Table 1 shows the types of human cancer cell lines and the number of stagnation cells in the human cancer cell line panel. And doubling time is shown.
  • Table 2 shows the correlation coefficients between compounds (E7070, E7820, CQS, LY186641 and LY295501) in a human cancer cell line panel.
  • Example 4 Cross resistance in E7070 resistant strains
  • HCT116-C9 is derived from human colorectal cancer HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)
  • HCT116-C9-C1 and HCT116-C9-C4 are E7070-resistant substrains obtained by culturing HCT116-C9 in the presence of E7070 and gradually increasing the E7070 concentration.
  • HCT116-C9, HCT116-C9-C1 and HCT116-C9-C4 were spread on a 96-well microphone plate (flat bottom) at 3000 cells / well (50 ⁇ 1 / ⁇ 11), and a 3-fold dilution series after 24 hours was added (50 / l / well). Furthermore, after 72 hours, the cell growth inhibitory activity was evaluated by the MTT method (Mossm ⁇ T "J. Immunol. Methods, 1983, 65, 55-63). 50% growth inhibitory concentration against each cancer cell by the least squares method Asked.
  • the cell growth inhibitory activity of E7070 was 0.127 ⁇ with respect to HCT116-C9 (C9).
  • Example 5 Cross resistance in E7070 resistant strains
  • a sulfonamide compound preferably E7070, LY186641, LY295501, LY'ASAP, LY573636 or CQS or a combination thereof, is administered with the compound. It was revealed that the effect of the compound on the expression of integrin in cells other than platelets can be determined by measuring the expression level of integrin in the platelets of patients.
  • a sulfonamide compound preferably E7070, LY186641, LY295501, LY-ASAP, LY573636 or CQS or a combination thereof. It has become possible to evaluate the effect of the compound on the suppression of integrin expression in Escherichia coli.

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Abstract

インテグリンの発現に対するスルホンアミド化合物の作用を評価する方法であって、（a）前記スルホンアミド化合物の投与を受けた患者から採取された血小板におけるインテグリンの発現量を測定する工程と、（b）測定された発現量に基づき血小板以外の細胞におけるインテグリンの発現に対する前記化合物の作用を評価する工程と、を含む、前記方法。

Description

明 細 書 スルホンアミ ド化合物の代理マーカー 技術分野
本発明は、 インテグリンの発現に影響を与えるスルホンアミ ド化合物の効果を 検定する方法に関する。 背景技術
近年、 有用な抗腫瘍剤として、 スルホンアミ ド化合物が報告されている （1一 5 )。 特に、 N— ( 3—クロ口一 1 H—インドーノレ一 7—ィノレ） 一 4—スルファモイノレ ベンゼンスルホンアミ ド （以下、 「E7070J と称する場合がある） 、 N— （ 3— シァノ _ 4ーメチルー 1 H—ィンドーノレ一 7一ィル） - 3一シァノベンゼンスノレ ホンアミ ド （以下、 「E7820」 と称する場合がある） 、 N— [ [ ( 4—クロロフ ェニル） ァミノ] 力ルポ-ル] 一 2 , 3—ジヒ ドロー 1 H—インデンー 5—スル ホンアミ ド （以下、 「LY186641」 と称する場合がある） 、 N— [ [ ( 3 , 4— ジクロロフエ二ノレ） ァミノ] カノレポ二ノレ] —2 , 3—ジヒ ドロべンゾフラン一 5 ースルホンアミ ド (以下、 「LY295501」 と称する場合がある) 、 N— ( 2， 4 ージクロ口べンゾィノレ） 一 4一クロ口フエニルスノレホンアミ ド （以下、 「LY_ ASAP」 と称する場合がある） 、 N— （2，4ージクロ口べンゾィル） 一 5—ブロ モチォフェン一 2—スルホンアミ ド （以下、 「LY573636」 と称する場合があ る） 、 2—スルファニルアミ ドー 5—クロ口キノキサリン （以下、 「CQS」 と 称する場合がある） などは、 種々のタイプの腫瘍に活性を示し非常に有用である。
E7820 は、 インテグリン α 2の発現抑制作用を有することが報告されている ( 6 )。 さらに、 薬剤の投与を受けた患者の血小板におけるインテグリンの発現量 を測定することで、 血小板以外の細胞におけるインテグリンの発現に対する薬剤 の影響を判定することができることが報告されている （7 )。
近年、 種々の DNAマイクロアレイを用い、 多数の遺伝子の発現量を同時に検 出する方法が確立され、 DNA マイクロアレイは、 幅広い目的に応用されている (8および 9 ) 。 また、 DNA マイクロアレイ （一部メンブランフィルターを用いたマ クロアレイ） を用いて、 腫瘍細胞に抗癌剤を作用させた際に起こる遺伝子発現変 化を検討した報告もいくつか成されている （1°一 1 2 ) 。 これらの報告は、 遺伝子 発現の変動解析が、 複数の細胞集団の特性比較や、 薬剤の処理等により細胞に引 き起こされる生物学的な変化を、 分子レベルで包括的に研究するために極めて有 用であることを示している。
また、 米国 National Cancer Instituteの 60種類の癌細胞株パネルについて 遺伝子発現プロファイルを解析することにより、 これら細胞株を再分類し、 その 特性を検討した報告（13)、 さらに、 この 60種類の癌細胞株パネルの遺伝子発現 プロファイルと、 各細胞株の各種抗癌剤に対する感受性との間の関連について考 察した報告（14)等がなされている。
参考文献
( I ) 特開平 7— 16 5 708号公報
(2) 国際公開第 00Z5039 5号パンフレッ ト
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(6) 国際公開第 01Z56 60 7号パンフレツト
(7) 国際公開第 02/0660 73号パンフレッ ト
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( 1 3 ) Ross DT, Scherf U, Eisen MB, Perou CM, Rees C, Spellman P,
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( 1 4 ) Scherf U, Ross DT, Waltham M， Smith LH, Lee JK, Tanabe L, Kohn KW, Reinhold WC, Myers TG, Andrews DT, Scudiero DA, Eisen
MB, Sausville EA, Pommier Y, Botstein D, Brown PO, Weinstein JN, Nat Genet, 2000, 24, 236-44. 発明の開示
本発明の課題は、 ィンテグリン、 好ましくはインテグリンひ 2の発現に影響を 与え、 抗腫瘍活性を有するスルホンアミ ド化合物の効果を評価するための、 代理 マーカーを見出すことにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するため、 鋭意検討を重ねた結果、 DNAマイ クロアレイおょぴ癌細胞株パネルの実験において、 E7820、 E7070、 LY186641、 LY295501、 LY573636 もしくは CQS またはこれらの組み合わせによる遺伝子 変動パターンおよび細胞増殖抑制活性が、 高い相関を示すことを見出した。 また、 細胞增殖抑制活性を測定するアツセィにおいて、 E7070 に耐性を示す癌細胞株 力 E7820、 LY186641、 LY295501、 LY_ASAP、 LY573636および CQSに交叉 耐性を示すことを見出した。 本発明者は、 これらの結果から、 E7070、 E7820、 LY186641、 LY295501, LY_ASAP、 LY573636もしくは CQSまたはこれらの組 み合わせは、 同一または類似の作用機序を有し、 同一または類似の遺伝子変化お よぴ効果をもたらすという知見を得た。
さらに、 E7820 は、 当該化合物の投与を受けた患者の血小板におけるインテ ダリンの発現量を測定することにより、 血小板以外の細胞におけるインテグリン の発現に対する当該化合物の影響を判定できることが報告されている
(WO02/066073) 。
よって、 上記の知見により、 スルホンアミ ド化合物、 好ましくは E7070、 LY186641, LY295501, LY-ASAP、 LY573636もしくは CQSまたはこれらの組 み合わせにおいても、 当該化合物の投与を受けた患者の血小板におけるインテグ リンの発現量を測定することにより、 血小板以外の細胞におけるインテグリンの 発現に対する当該化合物の作用を評価することができることを見出し、 本発明を 完成するに至った。
すなわち本発明は、 以下に関する。
( 1 ) インテグリンの発現に対するスルホンアミ ド化合物の作用を評価する方法 であって、
前記スルホンアミ ド化合物が、
' 一般式 (I)
Figure imgf000005_0001
[式中、 Eは、 一 O—、 一 N ( C H3) 一、 一 C H2_、 一C H2C H2—または一 C H20—を、 Dは、 一 C H2—または一 O—を、 Rlaは、 水素原子またはハロ ゲン原子を、 R2aは、 ノヽロゲン原子またはト リフルォロメ.チル基をそれぞれ意 味する。 ]
で表わされる化合物、
一般式 （II)
Figure imgf000005_0002
[式中、 Jは、 一 O—または一N H—を、 R lbは、 水素原子、 ハロゲン原子、 置換基を有していてもよい C —Ceアルキル基、 置換基を有していてもよい C i_C4アルコキシ基、 置換基を有していてもよい Ci—C4アルキルチオ基、 一 CF3、 一OCF3、 一S CF3、 置換基を有していてもよい Ci_C4アルコキ シカルボニル基、 ニトロ基、 アジド基、 一O (S02) CH3、 一 N (CH3) 2、 水酸基、 フエ二ル基、 置換基を有するフヱニル基、 ピリジニル基、 チェ-ル基、 フリル基、 キノリニル基またはトリァゾール基を、 R2bは、 水素原子、 ハロゲ ン原子、 シァノ基、 _CF3、 置換基を有していてもよい d—Ceアルキル基、 置換基を有していてもよい Ci一 C4アルコキシカルボニル基、 置換基を有して いてもよい Ci一 C4アルコキシ基、 置換基を有していてもよいフエニル基また は置換基を有していてもよいキノリニル基を、 R3bは、 水素原子または置換基 を有していてもよい d— C4アルコキシ基を、 は、 水素原子または置換基 を有していてもよい d—Ceアルキル基 （但し、 R3bおよび R4bの少なく とも 一つは、 水素原子である） を、 R5bは、 水素原子、 ハロゲン原子、 置換基を有 していてもよい Ci— C6アルキル基、 一 CF3またはニトロ基を、 R6bは、 水 素原子、 ノヽロゲン原子または置換基を有していてもよい C]L—C6アルキル基
(伹し、 R6bが置換基を有していてもよい Ci_C6アルキル基のとき、 R5bは 水素原子であり、 R7bはハロゲン原子である） を、 R7bは、 ハロゲン原子、 置 換基を有していてもよい Ci_C6アルキル基または一C F3 (但し、 R5bまた は R?bのいずれか一方が、 置換基を有していてもよい Ci— C6アルキル基であ るか、 あるいは R?b ハロゲン原子または置換基を有していてもよい Ci— C6アルキル基である場合には、 R5bまたは Rebのいずれか一方が、 水素原子 である） をそれぞれ意味する。 ]
で表わされる化合物、
式 （III)
Figure imgf000006_0001
で表わされる化合物およぴ 式 （IV)
Figure imgf000007_0001
で表わされる化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、 もし くはその薬理学的に許容される塩、 またはそれらの溶媒和物であり、
(a) 前記スルホンアミ ド化合物の投与を受けた患者から採取された血小板に おけるインテグリンの発現量を測定する工程と、
(b) 測定された発現量に基づき血小板以外の細胞におけるインテグリンの発 現に対する前記化合物の作用を評価する工程と、
を含む、 前記方法。
(2) スルホンアミ ド化合物が、 N- [ [ (4—クロ口フエニル) ァミノ] カル ボニル] — 2， 3—ジヒ ドロ一 1 H—インデン一 5—スルホンアミ ド、 N _ [ [ (3， 4ージクロ口フエニル) ァミノ] カルボニル] — 2, 3—ジ ヒ ドロべンゾフラン一 5—スノレホンアミ ド、 N— （2, 4—ジクロ口ベン ゾィノレ） 一 4一クロ口フエニノレスノレホンアミ ド、 N— (2，4—ジクロロべ ンゾィノレ） 一 5—プロモチォフェン一 2—スノレホンアミ ドおよび 2—ス /レ ファニルアミ ドー 5—クロ口キノキサリンからなる群から選択される少な くとも一つの化合物、 もしくはその薬理学的に許容される塩、 またはそれ らの溶媒和物である、 （1) に記載の方法。
(3) スルホンアミ ド化合物が、 N— [ [ (3, 4—ジクロロフヱニル） アミ ノ] カルボニル] 一 2, 3—ジヒ ドロべンゾフラン一 5—スルホンアミ ド および N— （ 2,4—ジクロ口べンゾィル） 一 5—プロモチォフェン一 2— スルホンァ.ミ ドからなる群から選択される少なくとも一つの化合物、 もし くはその薬理学的に許容される塩、 またはそれらの溶媒和物である、 (1) に記載の方法。
(4) スルホンアミ ド化合物が、 N— （2,4—ジクロ口べンゾィル） ー 5—ブ 口モチォフェン一 2—スルホンアミ ドのナトリウム塩である、 （1) に記 載の方法。
(5) インテグリンの発現に対する、 式 (IX)
(IX)
Figure imgf000008_0001
で表わされる化合物、 もしくはその薬理学的に許容される塩、 またはそれらの 溶媒和物の作用を評価する方法であって、
(a) 前記式 (IX)で表される化合物、 もしくはその薬理学的に許容される塩、 またはそれらの溶媒和物の投与を受けた患者から採取された血小板におけ るィンテグリンの発現量を測定する工程と、
(b) 測定された発現量に基づき血小板以外の細胞におけるインテグリンの発 現に対する前記式 (IX)で表される化合物、 もしくはその薬理学的に許容され る塩、 またはそれらの溶媒和物の作用を評価する工程と、
を含む、 前記方法。
(6) インテグリンがインテグリン α 2である、 （1) 〜 （5) のいずれか 1項 に記載の方法。
(7) インテグリンの発現量の測定が、 免疫化学的方法により行うものである、 (1) 〜 （5) のいずれか 1項に記載の方法。
(8) 免疫化学的方法がフローサイトメ トリーである、 （7) に記載の方法。
(9) (7) または （8) に記載の方法において使用するための、 抗インテグリ ン抗体を含むィンテグリンの定量用試薬。
(10) インテグリンの発現量の測定が、 インテグリンをコードする mRNA量 を定量することにより行うものである、 （1) 〜 （5) のいずれか 1項に 記載の方法。
(1 1) mRNA量の定量が、 定量的 PCRにより行うものである、 （10) に記 載の方法。
(1 2) (10) または （1 1) に記載の方法において使用するための、 インテ ダリンをコードする mRNAの塩基配列の全部もしくは一部を有するオリゴ ヌクレオチド、 または当該 mRNAに相補的な塩基配列の全部もしくは一部 を有するオリゴヌクレオチドを含む、 ィンテグリンをコ一ドする mRNAの 定量用試薬。
( 1 3 ) 血小板以外の細胞が、 血管新生が起こり得る組織の細胞であり、 インテ ダリンの発現に対する抑制作用が血管新生抑制作用として評価されるもの である、 （1 ) 〜 （5 ) のいずれか 1項に記載の方法。
( 1 4 ) 血小板以外の細胞が腫瘍細胞であり、 インテグリンの発現に対する抑制 作用が腫瘍増殖抑制作用として評価されるものである、 （1 ) 〜 （5 ) の I、ずれか 1項に記載の方法。 本発明により、 スルホンアミ ド化合物、 好ましくは E7070、 LY186641、 LY295501, LY-ASAP、 LY573636 もしくは CQS またはこれらの組み合わせの 投与を受けた患者の血小板におけるィンテグリンの発現量を測定することにより、 血小板以外の細胞におけるインテグリンの発現抑制に対する当該化合物の影響を 判定することが可能となった。 すなわち、 本発明により、 血小板以外の細胞にお けるインテグリンの発現抑制に対する当該スルホンアミド化合物の効果を、 血小 板におけるインテグリンの発現量を代理マーカーとして利用することで評価する ことが可能となった。 血小板におけるインテグリンの発現量を代理マーカーとし て利用すると、 血小板のィンテグリンの発現量を測定するだけでスルホンアミ ド 化合物の効果を簡易に評価することが可能となるため、 本発明の方法は、 臨床上 非常に有効である。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1における DNAマイクロアレイにおける階層的クラスター リング解析の結果を示す。 ·
図 2は、 実施例 2における DNAマイクロアレイにおける相関係数を示す。 図 3は、 実施例 2における DNAマイクロアレイにおける階層的クラスター リング解析の結果を示す。
図 4は、 実施例 2における DNAマイクロアレイにおける相関係数を示す。 図 5は、 実施例 2における DNAマイクロアレイにおける階層的クラスター リング解析の結果を示す。
図 6は、 細胞増殖抑制活性を測定するアツセィにおける、 HCT116-C9、
HCT116-C9-C1 および HCT116-C9-C4 に対する E7070、 E7820、 CQS、 LY186641, LY295501および LY-ASAPの増殖抑制作用を示したものである。
図 7は、 細胞増殖抑制活性を測定するアツセィにおける、 HCT116-C9、 HCT116-C9-C1および HCT116-C9-C4に対する E7070および LY573636の増 殖抑制作用を示したものである。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態について説明する。 以下の実施の形態は、 本発明を 説明するための例示であり、 本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではな い。 本発明は、 その要旨を逸脱しない限り、 さまざまな形態で実施をすることが できる。
なお、 本明細書において引用した文献、 および公開公報、 特許公報その他の特 許文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。
1 . スルホンアミ ド化合物
本発明において、 スルホンアミ ド化合物は、 下記の一般式 （I) で表される化 合物を含む。
Figure imgf000010_0001
上記一般式 （I) において、 式中、 Eは、 一 O—、 — N ( C H3) 一、 - C H2 、 一 C H2 C H2—または一C H20—を、 Dは、 一 C H2—または一O—を、 R laは、 水素原子またはハロゲン原子 （例えば、 フッ素原子、 塩素原子、 臭素原子、 ヨウ素原子） を、 R2aは、 ハロゲン原子またはトリフルォロメチル基をそれぞれ 意味する。
本発明の一般式 （I) で表される化合物は、 公知の方法により製造でき、 例え ば、 欧州特許出願公開第 0222475A1号明細書に記載の方法によって製造するこ とができる。
—般式 （I) において、 好ましい化合物は、 LY186641 または LY295501であ る。
LY186641 とは、 N— [ [ ( 4一クロ口フエニル) ァミノ] カルボニル] 一 2， 3—ジヒドロ一 1 H—ィンデン— 5—スルホンアミ ドをいい、 その構造式を以下 の式 （VII) に示す。
Figure imgf000011_0001
LY186641
LY186641 は、 公知の方法で製造でき、 例えば、 欧州特許出願公開第 0222475A1号明細書に記載の方法で製造することができる。
本発明において、 LY295501 とは、 N— [ [ ( 3 , 4—ジクロロフエニル） ァ ミノ] カルボ二ノレ] 一 2， 3—ジヒ ドロべンゾフラン一 5—スノレホンアミ ドをい い、 その構造式を以下の式 （VIII) に示す。
Figure imgf000011_0002
LY295501
LY295501 は、 公知の方法で製造でき、 例えば、 欧州特許出願公開第 0222475A1 号明細書および Zまたは欧州特許出願公開第 0555036A2 号明細書 に記載の方法で製造することができる。
また、 本発明において、 スルホンアミ ド化合物は、 下記の一般式 （II) で表さ れる化合物を含む。
Figure imgf000012_0001
一般式 （Π) において、 式中、 Jは、 一O—または一 NH—を、 Rlbは、 水素 原子、 ハロゲン原子、 置換基を有していてもよい Ci—C6アルキル基、 置換基を 有していてもよい Ci一 C4アルコキシ基、 置換基を有していてもよい Ci一 C4ァ ルキルチオ基、 一CF3、 一 OCF3、 _S CF3、 置換基を有していてもよい d _C4アルコキシカルボニル基、 ニトロ基、 アジド基、 一 O (S〇2) CH3、 一 N (CH3) 2、 水酸基、 フエニル基、 置換基を有するフヱニル基、 ピリジニル基、 チェニル基、 フリル基、 キノリニル基またはトリァゾール基を、 R¾は、 水素原 子、 ハロゲン原子、 シァノ基、 _CF3、 置換基を有していてもよい d—Ceァ ルキル基、 置換基を有していてもよい C1—C4アルコキシカルボニル基、 置換基 を有していてもよい d— C4アルコキシ基、 置換基を有していてもよいフエニル 基または置換基を有していてもよいキノリニル基を、 R3bは、 水素原子または置 換基を有していてもよい Ci—CAアルコキシ基を、 R4bは、 水素原子または置換 基を有していてもよい Ci一 C6アルキル基 （但し、 R3bおよび R4bの少なくとも 一つは、 水素原子である） を、 R5bは、 水素原子、 ハロゲン原子、 置換基を有し ていてもよい Ci—C6アルキル基、 _C F3またはニトロ基を、 R6bは、 水素原 子、 ハロゲン原子または置換基を有していてもよい Ci一 C6アルキル基 （但し、 RGbが置換基を有していてもよい Ci_C6アルキル基のとき、 R¾は水素原子で あり、 R?bはハロゲン原子である） を、 R?bは、 ハロゲン原子、 置換基を有して いてもよい Ci— C6アルキル基または一 C F3 (但し、 R5bまたは R7bのいずれ か一方が、 置換基を有していてもよい d— C6アルキル基であるカ あるいは R ?b力 s、 ハロゲン原子または置換基を有していてもよい d— C6アルキル基である 場合には、 R5bまたは RGbのいずれか一方が、 水素原子である） をそれぞれ意味 する。 '
—般式 （II) において、 「ハロゲン原子」 は、 フッ素原子、 塩素原子、 臭素原 子、 ヨウ素原子であることが好ましい。 一般式 （II) において、 「C i— C 6アルキル基」 は、 炭素数が 1〜 6の直鎖も しくは分枝状のアルキル基を意味し、 例えば、 特に限定されるわけではないが、 メチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 イソプロピル基、 n—ブチル基、 イソブ チル基、 sec—ブチル基、 tert—プチノレ基、 n—ペンチノレ基 （ァミル基） 、 イソ ペンチノレ基、 ネオペンチル基、 tert—ペンチル基、 1ーメチノレブチル基、 2—メ チルブチル基、 1 , 2—ジメチルプロピル基、 n—へキシル基、 イソへキシル基、
1ーメチルペンチル基、 2—メチルペンチル基、 3—メチルペンチル基、 1 —ェ チルプロピル基、 1 , 1—ジメチルブチル基、 1 ， 2—ジメチルブチル基、 2， 2—ジメチルブチル基、 1 , 3—ジメチルブチル基、 2 , 3—ジメチルブチル基、 3 , 3—ジメチルブチル基、 1 一ェチルブチル基、 2—ェチルブチル基、 1 ， 1 ,
2—トリメチルプロピル基、 1 ， 2 , 2—トリメチルプロピル基、 1 —ェチル一 1 _メチルプロピル基、 1—ェチルー 2—メチルプロピル基などを意味する。 こ れらのうち好ましい基としては、 メチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 イソプ ロピノレ基、 n—プチノレ基、 イソブチノレ基、 sec—プチノレ基、 tert—プチノレ基、 n 一ペンチル基、 n—へキシル基等を挙げることができる。
一般式 （II) において、 「C ;L—C 4アルコキシ基」 は、 炭素数が 1〜 4のアル コキシ基を意味し、 特に限定されるわけではないが、 好ましくは、 メ トキシ基、 エトキシ基、 n—プロポキシ基、 イソプロポキシ基、 n—ブトキシ基、 イソブト キシ基、 sec—ブトキシ基、 tert—ブトキシ基等が挙げられる。
一般式 （II) において、 「C i_ C 4アルキルチオ基」 において、 アルキル基は 特に限定されるわけではないが、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n—プチル、 イソブチル、 sec—プチル、 tert—プチル等を挙げることができる。
—般式 （Π) において、 「d— c 4アルコキシカルボ-ル基」 の例としては、 特に限定されるわけではないが、 メ トキシカルボニル基、 エトキシカルポニル基、 n _プロポキシカルボニル基、 イソプロポキシカルボニル基、 n—ブトキシカル ポニノレ基、 イソプトキシカノレボニル基、 sec—ブトキシカノレポ-ル基、 tert—プ トキシカルボ二ル基等を挙げることができる。
一般式 （Π) において、 導入される置換基としては、 特に限定されるわけでは ないが、 例えば、 C i—C sアルキル基 （例えば、 メチル基、 ェチル基、 n—プロ ピル基、 イソプロピル基、 n—ブチル基、 イソプチル基、 sec—ブチル基、 tert —ブチル基等） 、 d— C 4アルコキシ基 （例えば、 メ トキシ基、 エトキシ基、 n 一プロポキシ基、 イソプロポキシ基、 n—ブトキシ基、 イソブトキシ基、 sec— ブトキシ基、 tert—ブトキシ基等） 、 アミノ基、 水酸基、 ハロゲン原子 （例えば、 フッ素原子、 塩素原子、 臭素原子、 ヨウ素原子） またはシリル基などの置換基を 挙げることができる。
本発明の一般式 (II)で表される化合物は、 公知の方法により製造でき、 例えば、 国際公開第 0 2 / 0 9 8 8 4 8号パンフレツ ト （WO02/098848) に記載の方法 によって製造することができる。
一般式 （II) において、 好ましい化合物は LY-ASAPである。
LY-ASAP とは、 N— （2， 4ージクロ口べンゾィル) —4一クロ口フエ二ノレ スルホンアミ ドをいい、 その構造式を以下の式 （XI) に示す。
Figure imgf000014_0001
LY-ASAP LY-ASAP は、 公知の方法で製造でき、 例えば、 国際公開第 0 2 / 0 9 8 8 4 8号パンフレッ ト （WO02/098848) に記載の方法で製造することができる。
本発明において、 スルホンアミ ド化合物には、 LY573636 を挙げることができ る。 本発明において、 LY573636 とは、 N— （ 2， 4ージクロ口べンゾィル） 一 5—ブロモチオフヱンー 2 —スルホンアミ ドをいい、 その構造式を以下の式 (III) に示す。
Figure imgf000014_0002
LY573636
LY573636は、 ナトリゥム塩であることが好ましい。 LY573636は、 公知の方法で製造でき、 例えば、 国際公開第 0 2 0 9 8 8 4 8号パンフレッ ト （WO02/098848) に記載の方法と同様にして、 市販の 5—ブ 口モチォフェン一 2—スルホニルクロライ ドと 2， 4—ジクロロ安息香酸より製 造することができる。
ま た、 LY573636 は、 国際公開第 2003/035629 号パ ン フ レ ツ ト (WO2003/035629) における実施例 6 3に記載の方法で製造することができる。 本発明において、 スルホンアミ ド化合物には、 CQS を挙げることができる。 本発明において、 CQS とは、 2—スルファニルアミ ドー 5—クロ口キノキサリ ンをいい、 その構造式を以下の式 （IV) に示す。
Figure imgf000015_0001
CQSは、 公知の方法で製造でき、 例えば、 （J. Am. Chem. Soc, 1947, 71, 6-
10) の方法で製造することができる。
さらに、 本発明において、 スルホンアミ ド化合物には、 E7070 を挙げること ができる。 E7070 とは、 N— ( 3—クロロー 1 H—インドール一 7—ィル） 一 4ースノレファモイルベンゼンスルホンァミ ドをいい、 その構造式を以下の式 (IX) に示す。
Figure imgf000015_0002
E7070 は、 公知の方法で製造でき、 例えば、 国際公開第 9 5 Z 0 7 2 7 6号 パンフレッ ト （WO95/07276) および/または特開平 7-165708 号公報 （JP7- 165708) における実施例 1 9に記載された方法によって製造することができる。 ド化合物は、 酸または塩基と薬理学的に許容される塩を形成する 場合もある。 本発明におけるスルホンアミ ド化合物は、 これらの薬理学的に許容 される塩をも包含する。 酸との塩としては、 例えば、 塩酸塩、 臭化水素酸塩、 硫 酸塩、 燐酸塩等の無機酸塩ゃ蟮酸、 酢酸、 乳酸、 コハク酸、 フマル酸、 マレイン 酸、 クェン酸、 酒石酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 p 一トルエンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸などの有機酸との塩を挙げることがで きる。 また、 塩基との塩としては、 ナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金 属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、 トリメチル ァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 ジシクロへキシルァミン、 N， N，一ジベンジルエチレンジァミン、 アルギニン、 リジン等の有機塩基との塩 (有機アミン塩） 、 アンモニゥム塩を挙げることができる。
また、 スルホンァミ ド化合物は、 無水物であってもよく、 水和物などの溶媒和 物を形成していてもよい。 溶媒和物は水和物または非水和物のいずれであっても よいが、 水和物が好ましい。 溶媒は水、 アルコール （例えば、 メタノール、 エタ ノール、 n—プロパノール) 、 ジメチルホルムアミ ドなどを使用することができ る。
また、 これら化合物の溶媒和物および Zまたは光学異性体が存在する場合には、 本発明におけるスルホンアミ ド化合物は、 それらの溶媒和物および/または光学 異性体が含まれる。 また、 本発明におけるスルホンアミ ド化合物は、 生体内で酸 ィ匕、 還元、 加水分解、 抱合などの代謝を受けるスルホンアミ ド化合物をも包含す る。 またさらに、 本発明におけるスルホンアミ ド化合物は、 生体内で酸化、 還元、 加水分解などの代謝を受けてスルホンアミ ド化合物を生成する化合物をも包含す る。
2 . インテグリンの発現に対するスルホンアミ ド化合物の作用を評価する方法 本発明により'、 インテグリンの発現に対するスルホンアミ ド化合物の作用を評 価する方法、 すなわち、 スルホンアミ ド化合物の投与を受けた患者の血小板にお けるィンテグリンの発現量を測定することにより、 血小板以外の細胞におけるィ ンテグリンの発現に対する当該化合物の作用を評価する方法が提供される。 具体的には、 本発明は、 スルホンアミ ド化合物のインテグリンの発現に対する 作用を評価する方法であって、 （a)スルホンアミ ド化合物の投与を受けた患者の 血小板におけるインテグリンの発現量を測定する工程と、 （b)測定された発現量 に基づき血小板以外の細胞におけるィンテグリンの発現に対する該化合物の作用 を評価する工程を含むことを特徴とする。
本発明において、 スルホンアミ ド化合物は、 「 1 . スルホンァミ ド化合物」 で 記載したとおりであるが、 例えば、 一般式 （I) 、 一般式 （Π) 、 式 （III) 、 式
(IV) および式 （IX) からなる群から選択される少なくとも一つの化合物であ り、 好ましくは E7070、 LY186641, LY295501、 LY'ASAP、 LY573636 および CQS からなる群から選択される少なくとも一つの化合物であり、 より好ましく は LY295501および LY573636からなる群から選択される少なくとも一つの化 合物であり、 さらに好ましくは LY573636のナトリゥム塩である。
他方、 本発明において、 スルホンアミ ド化合物は、 好ましくは E7070 である。 本発明において、 スルホンアミ ド化合物には、 その薬理学的に許容される塩ま たはそれらの水和物などの溶媒和物も包含される。
本発明において、 スルホンアミ ド化合物は、 そのまま用いてもよく、 医薬組成 物としてもよい。 医薬組成物は、 上記スルホンアミ ド化合物を含有する組成物で あれば、 特に限定されない。
例えば、 本発明における医薬組成物としては、 上記スルホンアミ ド化合物を含 む種々の剤形、 例えば、 錠剤、 散剤、 細粒剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 シロップ剤、 坐剤、 注射剤、 軟膏剤、 パップ剤等があげられる。
本発明において、 「患者」 は何らかの疾患に罹患した患者を意味する。 前記疾 患には、 インテグリンの関与が疑われる疾患、 例えば癌、 糖尿病性網膜症、 冠動 脈硬化疾患、 炎症性腸疾患、 多発性硬化症、 喘息など.を例示することができるが、 これらに限定されるわけではない。
患者へのスルホンアミ'ド化合物の投与量や投与方法は特に限定されず、 スルホ ンアミ ド化合物の投与目的に適合したものでよい。 本発明の方法は、 経口投与な どの全身的投与によるスルホンアミ ド化合物の影響を検定するのに用いることが 好ましい。
本発明のスルホンアミ ド化合物の投与量は、 症状の程度、 患者の年齢、 性別、 体重、 感受性差、 投与方法、 投与時期、 投与間隔、 医薬製剤の性質、 調剤、 種類、 有効成分の種類等によって異なり、 特に限定されないが、 例えば、 通常成人 （体 重 6 0 Kg) 1日あたり 10〜6000 mg、 好ましくは 50〜4000 mg、 さらに好まし くは 50〜2000 mgであり、 これを通常 1日 1〜 3回に分けて投与することがで さる。
本発明において、 インテグリンは、 インテグリンひ 2であることが好ましい。 インテグリンひ 2は、 細胞表面に発現される接着分子のインテグリンフアミリー の一つである。 ヒ トインテグリンひ 2をコードする遺伝子は、 配列番号： 1で表 される塩基配列を含有する遺伝子であり、 GenBank にァクセッション番号： NM— 002203で登録されている。
血小板におけるインテグリン 発現量の測定方法は、 特に限定されず、 免疫化 学的方法などによりタンパク質量を定量してもよいし、 インテグリンをコ一ドす る mRNA量を定量してもよい。
インテグリンの発現量の免疫化学的方法による測定方法としては、 例えば、 フ ローサイトメ トリ一が挙げられる。
インテグリンをコードする mRNA量の定量方法としては、 例えば、 定量的 PCRが挙げられる。
以下に本発明の実施の形態について、 （A) 血小板の分離、 （B) 血小板表面 のインテグリン量の定量、 （C) 血小板中のインテグリン mRNA量の定量、 （D) 血小板以外の細胞におけるスルホンアミ ド化合物の作用の評価、 の順に詳細に説 明する。
(A) 血小板の分離
本発明において、 血小板は、 スルホンアミ ド化合物の投与を受けた患者から採 取された血小板が好ましい。 そして、 血小板は、 例えば、 当該患者より採取した 血液を分離することにより得ることができる。 血小板の分離は、 遠心、 ゲル濾過、 フローサイトメ トリー等の技術により行うことができる。 (1)遠心分離：血液に 10 。/。 量の 3.8 % タエン酸ナトリゥム水溶液を加え、 100 g, 10 min, 室温で遠心する。 上層を多血小板血漿とし、 これを 1500 g, 10 minで遠心することにより沈查から血小板を得ることができる。
(2) フローサイトメ トリー ： PBS等にて希釈した血液をフローサイトメーター に流し、 レーザー光線あるいは類似の光線をあてる。 そのとき発生する前方散乱 光およぴ側方散乱光の強度にて血小板と他の血球とを分離することが可能である。
(B) 血小板表面のインテグリン量の定量
血小板表面のインテグリンの発現量は免疫化学的方法、 例えば、 免疫組織染色、 ELISA、 ウェスタンブロット、 フローサイ トメ トリー等の技術により測定でき る。 ELISA では、 例えば、 血小板の表面抗原に対する、 固相化した抗体に血小 板を結合させ、 洗浄後、 標識した抗インテグリン抗体を反応させて、 結合した抗 インテグリン抗体の標識の量から血小板表面のインテグリンを定量できる。 また、 ウェスタンブロットでは、 例えば、 分離した血小板を、 SDS を含む緩衝液に可 溶化後、 SDS-PAGE およびウェスタンブロットを行い、 メンブレン上にブロッ トされたインテグリ ンを、 標識した抗インテグリン抗体により定量することがで きる。 この際、 同時に血小板表面抗原に対する抗体で血小板の量を定量すれば、 血小板当たりのィンテグリンの量を定量することも可能である。
フローサイ トメ トリーでは、 例えば、 患者から採取した全血を希釈し、 標識し た抗インテグリン抗体を結合させて、 前方散乱光および側方散乱光により血小板 分画を分離し、 血小板表面の蛍光強度を測定することにより血小板表面のインテ ダリンの量を定量できる。 以下にフローサイトメトリーについて具体的に説明す るが、 本発明はこれにより限定されない。 フローサイトメ トリーによれば、 血小 板を分離することなく全血を用いて、 インテグリン量の定量が可能である。
血液 4 μ 1を 0.0038 % タエン酸ナトリゥム水溶液を含む PBS 396 ^ 1にて希 釈する。 FITC で標識したインテグリンに対する抗体、 好ましくはインテグリン a 2に対する抗体、 マウスであれば例えば抗マウス CD49b FITC 標識 （BD Pharmingen, Cat. BD-558757) 、 ヒ トであれば抗ヒ ト CD49b FITC標識 （BD Pharmingen, Cat. BD-555498)を 0.1 % BSAを含む PBSにて適当な濃度に希釈 する。 この抗体 ΙΟ μ Ι を上記の希釈した血液 90 /z l に加える。 室温にて 60 分 (min) 反応させ、 フィルター （FALCON, Cat. 2235) に通す。 PBS 900 1を 加え、 フローサイ トメ トリー (Becton Dickinson, FACSCalibur) にて前方散乱光 および側方散乱光により血小板分画を分離し、 血小板表面の蛍光強度を測定する ことにより血小板表面のィンテグリン、 好ましくはィンテグリン α 2の量を定量 することができる。
本発明は、 本発明の評価方法において使用するための、 抗インテグリン抗体を 含むインテグリンの定量用試薬も提供する。 当該抗体は、 好ましくはインテグリ ンひ 2に対する抗体であり、 例えば、 抗マウス CD49b FITC標識抗体、 抗ヒ ト CD49b FITC 標識抗体を用いることができる。 本発明のインテグリンの定量用 試薬は、 上記抗体に加えて、 一般の定量用試薬において慣用的な成分を含んでい てもよい。
(C) 血小板中のインテグリン mRNA量の定量
(1) RNAの抽出
RNA はチオシアン酸グァニジン法、 フエノール法等により抽出できる。 全血 から分離した血小板を ISOGEN 1 mlにて溶解し、 室温に 5 min放置する。 ク ロロホルム 0.2 ml を加え、 攪拌して 2 min放置する。 放置後のチューブを 13000 rpm, 15 min, 4°C (MX- 150, TOMY, Rotor TMA'll) で遠心し、 上清を 別のチューブに移す。 イソプロパノール 0.5 mlを加え、 室温に 5 min放置する。 放置後のチューブを 13000 rpm, 10 min, 4°C (MX- 150, TOMY, Rotor TMA- 11) で遠心し、 上清を捨てる。 70 % エタノール水溶液 1 ml を加え、 15000 rpm, 15 min, 4°C (MX- 150, TOMY, Rotor TMA'll) で遠心する。 上清を捨て、 RNase free H2Oにて溶解する。
(2) mRNAの定量
インテグリンをコードする mRNAはノーザンプロット解析、 ドットブロット 角军析、 RNase プロテクションアツセィ、 comparative RT'PCR、 competitive RT-PCR, 定量的 PCR等の技術により定量出来る。 インテグリンをコードする mRNAの定量は、 好ましくは定量的 PCRである。 以下に定量的 PCRの技術に ついて説明するが、 本発明はこれにより限定されない。 定量的 PCR は、 TaqMan プローブと ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Perkin- Elmer Applied Biosystems) を用い、 次のように行うことができる。
操作は逆転写反応および PCR反応の 2段階で行う。 最初の段階である逆転写 反応は、 得られた RNAに dNTP、 oligo d(T)16プライマー、 RNase Inhibitor, ultiscribe Reverse Transcriptase (Perkm-Elmer Applied Biosystems) ¾力！] え、 25°Cにて 10分間保温後、 48°Cにて 30分間加熱することにより行う。 反応 を 95°C 5分間加熱することにより停止させる。
得られた cDNAを第 2段階の PCR反応に供する。 PCR反応は、 例えば 2.5 ng cDNA、 lxTaqMan PCR buffer, 3 mM MgCl2、 200 / M each dATP, dCTP, dGTP、 400 μ Μ dUTP、 200 nM primer pair, 0.01 U/^ l AmpErase UNG、 0.025 W μ 1 AmpliTaq Gold DNA Polymerase ( Perkin-Elmer Applied Biosystems) の反応系で行う。 反応条件は 50°C 2分間、 95°C 10分間に次いで 95°C 20秒間 · 55°C 20秒間 · 72°C 30秒間を 40サイクルで行う。 プライマー とフ ローブ ί¾ Primer Expression (Perkm-Elmer Applied Biosystems) 用い て設計する。 複数検体の比較は、 定量値を各検体の転写量に変動の少ない house keeping遺伝子、 好ましくは GAPDHの mRNAレベルにより補正して行う。
本発明は、 本発明の評価方法において使用するための、 インテグリンをコード する mRNAの塩基配列の全部または一部を有するオリゴヌクレオチド （例えば、 RNAまたは DNA) または当該 mRNAに相補的な塩基配列の全部または一部を 有するオリゴヌクレオチド （例えば、 RNA または DNA) を含む、 インテグリ ンをコ一ドする mRNA の定量用試薬をも提供する。 当該オリゴヌクレオチドは、 mRNA の定量に用いられるプライマーおよび Zまたはプロープであり、 Primer Expression (Perkin-Elmer Applied Biosystems) を用レヽて設計すること力 Sでき る。 本発明において、 当該オリゴヌクレオチドは、 インテグリン mRNAの発現 量を測定する際のプライマーまたはプローブとしての機能に適した核酸長 （例え ば 10mer〜40mer) を有し、 当該機能を発揮する限り、 インテグリン mRNAと 同一または相補的な塩基配列の全部または任意の部分から選択することができる。 本発明の mRNAの定量用試薬は、 上記オリゴヌクレオチドに加えて、 一般の定 量用試薬において慣用的な成分 （例えば、 buffer, ATP, GTP, TTP, CTP, Reverse Transcriptase, oligo dT, DNA polymerase, RNase, Taqman probeなど) を含ん でいてもよい。
(D) 血小板以外の細胞におけるスルホンアミ ド化合物の作用の評価
上記のようにして測定された、 血小板におけるィンテグリンの発現量に基づい て、 血小板以外の細胞におけるインテグリンの発現に対するスルホンアミ ド化合 物の作用を評価することができる。
本発明において、 血小板以外の細胞は、 特に限定されないが、 血管新生が起こ り得る組織の細胞、 あるいは腫瘍細胞であることが好ましく、 例えば、 腫瘍組織 の血管内皮細胞が挙げられる。 また、 血小板以外の細胞は、 インテグリンひ 2を 介して細胞増殖、 アポトーシス、 分化といったシグナルが伝達される線維芽細胞、 腫瘍細胞、 例えば、 メラノーマ細胞であることが好ましい。 さらに、 インテグリ ン α 2は、 単球、 Β細胞、 Τ細胞で発現が確認されているので、 これらの細胞も 血小板以外の細胞に挙げられる。 本発明の方法には、 これらの細胞の機能を推定 するのにも役立つ。
スルホンアミ ド化合物の投与を受けた患者の血小板におけるインテグリンの発 現量を測定した結果、 発現量が減少していた場合に、 当該スルホンアミ ド化合物 は、 血小板以外の細胞においても、 インテグリンの発現に対する抑制作用を有す る可能性があると評価することができる。
例えば、 血小板以外の細胞が、 血管新生の起こり得る組織の細胞である場合、 患者に投与したスルホンアミ ド化合物のインテグリンの発現に対する抑制作用は、 血管新生抑制作用として評価することができる。 また、 血小板以外の細胞が、 腫 瘍細胞である場合は、 患者に投与したスルホンアミ ド化合物のインテグリンの発 現に対する抑制作用は、 腫瘍増殖抑制作用として評価することができる。
すなわち、 スルホンアミ ド化合物の投与を受けた患者の血小板におけるインテ ダリンの発現量を測定した結果、 コントロールと比較して発現量が減少していた 場合に、 当該スルホンアミ ド化合物は、 血管新生の起こり得る組織の細胞におけ るインテグリンの発現に対する作用として、 血管新生抑制作用を有すると評価す ることができる。 また、 スルホンアミ ド化合物の投与を受けた患者の血小板にお けるインテグリンの発現量を測定した結果、 発現量が減少していた場合に、 当該 スルホンアミ ド化合物は、 腫瘍細胞におけるインテグリンの発現に対する作用と して、 腫瘍増殖抑制作用を有すると評価することができる。 この場合、 血小板で のインテグリンの発現量の減少が大きいほど、 当該化合物の血管新生抑制作用ま たは腫瘍増殖抑制作用が強いと評価することができる。 以下に、 具体的な例をもって本発明を示すが、 本発明はこれに限られるもので はない。 実施例 1 DNAマイクロアレイ解析
( 1 ) 細胞培養、 化合物処理、 および RNAの抽出
化合物により誘導される遺伝子発現変化を DNAマイクロアレイ解析によって 調べる目的で、 ヒ ト大腸癌由来細胞株 HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA， U.S.A. ) およびヒ ト白血病由来細胞株 MOLT-4 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, U.S.A.) を、 10 %の胎児 牛血清、 100 units/ml のペニシリン、 lOO z g/ml のス トレプトマイシンを添加 した EPMI-1640培地中で培養した。 以下、 培養および化合物処理は 5%C02、 37°Cに調整されたインキュベーター内で行った。 10 cm径の細胞培養ディッシ ュに 2.0X106細胞 Zディッシュの割合で HCT116細胞および MOLT-4細胞を蒔 き、 24時間培養後に以下の化合物処理を行った。
HCT116細胞に関しては、 E7820 (0·8 μ Μ)、 Ε7070 (0.8 μ M)、 LY295501 (30 μ Μ)、 CQS (8 μ Μ), adriamycin (0.2 μ Μ)、 daunomycin (0.2 μ Μ)、 ICRF154 (80 μ Μ)、 ICRF159 (80 μ Μ)ヽ kenpaullone (10 μ Μ)、 alsterpullone (10 μ Μ)、 trichostatin Α (0.1 μ Μ)、 rapamycin (80 μ Μ)の 12化合物を評価した。 一方、 MOLT-4細胞に関しては、 Ε7070 (0.8 Ai M)を評価した。 ここで、 adriamycinお よび daunomycin は、 DNA にィ ンタ一力 レーショ ンする型の DNA topoisomerase II 阻害剤、 ICRF154 および ICRF159 は、 catalytic type の DNA topoisomerase II |¾害斉 [|、 kenpaulloneおよひ aisterpulloneは、 cyclm- dependent kinases (CDKs)阻害斉 (J、 tricho statin Aは、 histone deacetylase P且 害剤、 rapamycin は、 mTOR/FRAP 阻害剤として、 それぞれ公知の化合物であ る。 化合物処理濃度は、 各々の化合物の HCT116細胞に対する 50%増殖阻害濃 度 （WST-8 を用いた 3日間の細胞増殖抑制活性に基づく） を基準にその 3〜 5 倍の濃度として設定し、 上記化合物名に続く括弧内に示した設定濃度で 24時間 処理後に細胞を回収した。 また、 化合物を加えずに 24時間培養した細胞も同様 に回収した。
回収した細胞からの全 RNA の抽出は、 TRIZOL試薬 (ィンビト口ジェン社 製） を用いて添付の操作法に従って行った。
( 2 ) DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析
得られた RNAを 100 i lの diethylpyrocarbonate (DEPC) 処理をした滅菌 水に溶解し、 さらに RNeasyカラム （QIAGEN) を用いて精製し、 Superscript Choice System (インビトロジェン社製） および T7-d(T)24プライマーを用いて 2本鎖の cDNAを合成した。
まず 10 gの RNAに 5 Mの T7-d(T)24プライマー、 lx First strand buffer、 10 mM DTT、 500 , Μの dNTP mix, および 20 units/ μ 1の Superscript II Reverse Transcriptaseを加え、 42°Cにて 1時間反応させ、 1本鎖 DNAを合成 した。 続いて、 lx Second strand buffer, 200 μ M の dNTP mix, 67 U/ml DNA ligase、 270 U/ml DNA polymerase I、 および 13 U/ml RNase Hを添加し て、 16°Cにて 2時間反応させ 2本鎖 cDNAを合成した。 さらに、 67 U/ml T4 DNA polymerase Iを添加して、 16°Cにて 5分間反応させた後、 10 / lの 0.5 M EDTAを加え反応を停止した。
得られた cDNA をフヱノール/クロ口ホルムにて精製し、 RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics) を用い、 添付の操作法に従って、 ピオチン化 UTPならびに CTPによるラベル化反応を行った。 反応生成物を RNeasyカラム にて精製後、 200 mM トリス酢酸 pH8.1、 150 mM酢酸マグネシウム、 50 mM 酢酸力リウム中で 94°Cにて 35分間加熱して cRNAを断片化した。
断片化した cRNAを、 100 mM MES、 1 M sodium salt, 20 mM EDTA、 0.01% Tween 20 中、 45。Cにて 16 時間、 GeneChip (Affymetrix) Human Focus arra にハイブリダイズさせた。 ハイブリ ダイズ後、 GeneChip は Affymetrix fluidics stationに添付のプ口トコール Midし euk2に従い洗浄および 染色した。 染色にはス トレプトアビジン-フィコエリ ト リ ンとピオチン化抗ス ト レプトアビジンャギ抗体を用いた。 染色後の GeneChip を HP アルゴンイオン レーザー共焦点顕微鏡 （Hewlett Packard) を用いてスキャンし、 蛍光強度を測 定した。 測定は、 488 nm の波長で excitation を行い、 570 nm の波長の emissionで了つ,こ。
定量的データ解析は全て GeneChip software (Affymetrix) ならびに Gene Spring (Silicongenetics) 用レヽて行った。 GeneChip software を用レヽてィ匕合 物による遺伝子発現変化を評価する際には、 化合物処理群と未処理群の 2つの条 件間で RNAの定量値が 2倍以上解離している場合につき、 その遺伝子の発現が 有意に 「増加」 あるいは 「減少」 したと判断した。 Gene Spring を用いて、 各 化合物が誘導する遺伝子発現変化の類似性を評価する際には、 Human Focus Arrayに載っている全遺伝子の発現変化をもとに階層的クラスターリング解析を 行った。
HCT116細胞の階層的クラスターリング解析の結果を図 1に示した。
解析の結果、 同一の作用機序を有する adriamycin および daunomycin、 ICRF154およぴ ICRF159、 KenpauUoneおよび alsterpulloneは、 それぞれ類 似の遺伝子変化を引き起こした （図 1 ) 。 よって、 同一の作用機序を有する化合 物が、 互いに類似の遺伝子変化を引き起こすことが確認された。
E7070、 E7820、 LY295501 および CQS は、 類似の遺伝子変化を引き起こし た （図 1 ) 。 よって、 本解析により、 E7070、 E7820、 LY295501 および CQS は、 同一または類似の作用機序を有すると考えられ、 同一または類似の遺伝子変 化および効果をもたらすことが強く示唆された。 実施例 2 DNAマイクロアレイ解析
HCT116 細胞を、 10 。/。の胎児牛血清、 100 units/ml のペニシリン、 100 μ g/ml のストレプトマイシンを添加した RPMI-1640 培地中で培養した。 以下、 培養および化合物処理は、 5%CO2、 37°Cに調整されたインキュベーター内で行 つた。 10 cm 径の細胞培養ディッシュに 2.0X106細胞 Zディッシュの割合で HCT 116細胞を蒔き、 24時間培養後に以下の化合物処理を行った。
本実施例では HCT116細胞を用いて、 E7820 (0.16 Μ)、 Ε7070 (0.26 μ Μ)、 LY186641 (59 μ Μ)、 LY295501 (24 μ Μ)、 LY573636 (9.6 μ Μ)、 CQS (4.0 /^ Μ)、 MST16 (100 μ Μ)、 etoposide (3·6 μ Μ)、 ethoxzolamide (410 Μ)、 capsaicin (280 μ Μ)、 trichostatin A (0.16 μ Μ)、 kenpaullone (7.1 μ Μ)の 12化合物で処 理したときの遺伝子発現変化を調べた。
ここで、 MST16 は catalytic type の DNA topoisomerase II 阻害剤、 etoposideは cleavable complexの开成を誘辱する DNA topoisomerase II阻害 斉 lj、 ethoxzolamideは carbonic anhydrase阻告^ [J、 capsaicinは tumor-specific plasma membrane NADH oxidase 阻害斉 [J、 trichostatin A は histone deacetylase阻害剤、 kenpaulloneは cyclin-dependent kinases (CDKs)阻醫 として、 それぞれ公知の化合物である。
化合物処理濃度は、 各々の化合物の HCT116細胞に対する 50%増殖阻害濃度 (MTTを用いた 3日間の細胞増殖抑制活性に基づく） を基準に、 その 2倍の濃 度を設定した。 上記化合物名に続く括弧内に示した設定濃度で 24時間処理後に 細胞を回収した。 また、 化合物を加えずに 24時間培養した細胞も同様に回収し た。
回収した細胞からの全 RNA の抽出は、 TRIZOL試薬 （インビトロジェン社 製） を用いて添付の操作法に従って行った。
DNA マイクロアレイによる遺伝子発現解析は、 実施例 1中の 「 （2 ) DNA マイクロアレイによる遺伝子発現解析」 と同様に行った。
また、 本実施例は各サンプルについて duplicateで行った （実験の便宜上、 そ れぞれのサンプルは区別できるように control- 1, control- 2, E7820_l、 E7820- 2 の要領で枝番号を付した） 。 そして、 Gene Chip ( Affymetri ) system (Human Focus array)を用いて各化合物の誘導する遺伝子発現変化を解析した。 本実施例で得られた 26個 （control+ 12化合物の 13 サンプル x2) の 「.cel」 フアイノレに対し RMA法 （robust multi-array average法 (Biostatistics(2003)， 4 249-264)) を適用し、 プローブレベルでの正規分布化を行った後、 遺伝子レべ ルでのシグナル強度のログ値を算出した。 続いて、 各遺伝子の化合物処理群にお けるシグナル強度のログ値から化合物未処理群 （control-1) におけるシグナル 強度のログ値を引き、 control-l に対する化合物処理群のシグナル比のログ値を 得た。 そして、 コサイン相関係数を計算し、 実験間の相関係数とした (図 2 )。 こ の相関係数をもとに、 UPGMA 法 （Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean法） により階層的クラスターリング解析した（図 3 )。 control- 2 についても、 同様の計算を行った (図 4および図 5 )。 使用したソフトウェアは R 2.0.l(http-'//www.r-project.org/) 、 affy package 1.5.8 ( ttp 7/w w w. oioconductor.org)でめる。
図 2.〜図 5において、 「LY1」 は LY186641 を、 「LY2」 は LY295501 を、 「LY5J は LY573636 を、 「CAI」 は ethoxzolamideを、 「Cap」 は capsaicin を、 「MSTJ は MST16を、 「Etop」 は etoposideを、 「TSA」 は trichostatin Aを、 「Kenp」 は kenpaulloneを示す。 図 3およぴ図 5において、 「de hclust (*, "average'ウ」 は、 統計解析を行う時のコマンドであり、 dupulicate の実験デ ータの平均値を用いて Rによるクラスターリング分析を行ったことを示す。
解析の結果、 E7070、 E7820、 LY186641 , LY295501 , LY573636 および CQS 力 s、 HCT116 細胞に対して引き起こす遺伝子変化は非常に高い類似性を示 し、 他のどのィ匕合物 （ MST16、 etoposide、 ethoxzolamide、 capsaicin、 trichostatin A、 kenpaullone) のプロファイルとも異なることが明らかとなつ た （図 2〜図 5 ) 。 よって、 本解析により、 E7070、 E7820、 LY186641 , LY295501, LY573636 および CQS は、 同一または類似の作用機序を有すると 考えられ、 同一または類似の遺伝子変化およぴ効果をもたらすことが強く示唆さ れた。 実施例 3 癌細胞株パネル実験
36 株のヒ ト癌細胞パネルを用いて、 E7820、 E7070、 CQS、 LY186641 , LY295501 の細胞増殖抑制活性の相関を調べた。 用いた癌細胞株は、 DLD-1, HCT15, HCT116, HT29, SW480, SW620, WiDr (以上、 ヒ ト大腸癌細胞株） 、 A427, A549, LX-1, NCI-H460, NCI-H522, PC'9, PC-10 (以上、 ヒト肺癌細胞 株） 、 GT3TKB, HGC27, MKNl, MKN7, MKN28, MKN74 (以上、 ヒ ト胃癌細 胞株） 、 AsPC-1, KP-1, KP-4, MiaPaCall, PANC-1, SUIT-2 (以上、 ヒ ト脖臓 癌細胞株） 、 BSY-1, HBC5, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB- 468 (以上、 ヒ ト乳癌細胞株） 、 CCRF-CEM, HL60, K562, MOLT-4 (以上、 ヒ ト白血病細胞株） の 3 6種類であり、 全ての細胞は 10%の胎児牛血清、 100 units/ml のぺニシリ ン、 100 g/ml のス トレプトマイシンを添加した RPMI- 1640培地を用いて 5% C02条件下 37°Cにて培養した （表 1 ) 。
表 1
36 human cancer cell lines tested m 3-dav MTT assays
Colon Stomach Breast
DLD-l (1250/well, 16.8 h) GT3TKB (2000/well, 21.1 h) BSY-1 (2000/well, 46.1 h)
HCT15 (1500/weIl, 14.5 h) HGC27 (1500/well, 14.6 h) HBC5 (2000/well, 31.8 h)
HCT116 (1250/well, 13.4 h) MKNl (4000/well, 35.9 h) MCF-7 (3000/well, 29.5 h)
HT29 (2500/weIl, 19.8 h) MKN7 (3000/well, 37.4 h) MDA-MB231 (2000/well, 21.6 h) SW480 (3000/well, 19.5 h) MKN28 (2000/well, 22.7 h) MDA-MB-435 (3000/well, 24.4 h) SW620 (2500/well, 17.3 h) MKN74 (4000/well, 24.8 h) MDA-MB-468 (3000/well, 34.2 h) WiDr (2000/well, 18.9 h)
Pancreas Leukemia
Lung AsPC-l (2500/well, 28.4 h) CCRF-CEM (1500/well, 27.2 h)
A427 (2500/well, 32.4 h) KP-1 (2000/well, 24.8 h) HL60 (1500/well, 29.5 h)
A549 (1250/well, 18.9 h) KP-4 (2000/well, 16.7 h) K562 (1500/well, 20.6 h)
LX-1 (2000/well, 17.2 h) MiaPaCall (2500/well, 19.1 h) MOLT-4 (1500/well, 22.3 h) NCI-H460 (1000/well, 13.6 h) PANC-1 (2500/well, 27.9 h)
NCI-H522 (4000/welI, 80.4 h) SUIT-2 (2000/well, 15.6 h)
PC-9 (2000/well, 23.7 h)
PC-10 (2000/well, 24.0 h)
Cell line (initial cell number, doubling time) 表 1は、 ヒ ト癌細胞株パネルにおけるヒ ト癌細胞株の種類、 蒔きこみ細胞数お よび倍化時間を示す。
表 1に記載の細胞数で 96 ウェルマィクロプレート (平底） に蒔き （50 μ 1/well) 、 24時間後に 3倍希釈系列の化合物を添加した （50 1Λ^11) 。 さらに 72時間後に WST-8 ( 10 ^ 1/well) を添加し、 450 nmの吸光度を測定した。 最小 二乗法により全 36株の癌細胞に対する 50 %増殖抑制阻害濃度を求め、 そのパ ターンを各化合物間で比較した。 相関の指標としては、 Pearson's correlation coefficients ¾用レヽた (Paull, i . D. et al. Display and analysis of patterns of differential activity of drugs against human tumor cell lines: development of mean graph and COMPARE algorithm. J. Natl. Cancer Inst. 1989, 81, 1088- 1092； Monks, A. et al. Feasibility of a nigh-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines. J. Natl. Cancer Inst. 1991, 83, 757-766.) 。
その結果、 E7070、 E7820、 LY186641、 LY295501および CQSは、 各癌細胞 株に対する増殖抑制活性において、 高い相関係数を示した （表 2 ) 。 よって、 本 解析により、 E7070、 E7820、 LY186641、 LY295501および CQSは、 同一また は類似の作用機序を有すると考えられ、 同一または類似の遺伝子変化および効果 をもたらすことが強く示唆された。
表 2
E7070 E7820 CQS LY186641 LY295501
E7070 1.00 0.98 0.97 0.93 0.80
E7820 0.98 1.00 0.96 0.95 0.82
CQS 0.97 0.96 1.00 0.92 0.82
LY186641 0.93 0.95 0.92 1.00 0.81
LY295501 0.80 0.82 0.82 0.81 1.00
表 2は、 ヒ ト癌細胞株パネルにおける化合物間 （E7070、 E7820、 CQS , LY186641および LY295501) の相関係数を示す。 実施例 4 E7070耐性株における交差耐性
E7070 耐性株を用いて、 E7820、 LY186641, LY295501、 LY-ASAP および CQS の細胞増殖抑制活性を評価した。 HCT116-C9 は、 ヒ ト大腸癌由来 HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, U.S.A.) 力、ら分 離した亜株であり、 この HCT116-C9を E7070存在下で培養し、 E7070濃度を 漸次的に上昇させることにより得た E7070 耐性亜株が HCT116-C9-C1 および HCT116-C9-C4である （Molecular Cancer Therapeutics, 2002, 1， 275-286) 。
HCT116-C9, HCT116-C9-C1 , HCT116-C9-C4 の 3 細胞株を各々 3000 cells/well で 96 ウェルマイク口プレート （平底） に蒔き （50μ1/ννθ11) 、 24時 間後に 3 倍希釈系列の化合物を添加した （50/ l/well) 。 さらに、 72 時間後に MTT法 (Mossm謹 T" J. Immunol. Methods, 1983, 65， 55-63) により細胞増 殖抑制活性を評価した。 最小二乗法により各癌細胞に対する 50 %増殖抑制阻害 濃度を求めた。
その結果、 E7070 の細胞増殖抑制活性は、 HCT116-C9 (C9) に対して IC50 は 0.127μΜであった。 これに対し、 HCT116-C9-C1 (C9C1) および HCT116- C9-C4 (C9C4) に対する活性はそれぞれ IC50 = 31.9 Μおよび 26.9 μ Μであ り、 Ε7070 の C9C1および C9C4に対する細胞増殖抑制活性が顕著に低下する ことが確認された （図 6 ) 。 また、 E7820、 CQS、 LY186641、 LY295501、 LY- ASAP の細胞増殖抑制活性については、 HCT116-C9 に対する活性がそれぞれ IC50 = 0.080 Μ、 1.73μΜ、 33,6μΜ、 10·9μΜ、 1.63 Μであったのに対し、 HCT116-C9-C1および HCT116-C9-C4 に対する活性は、 HCT116-C9-C1 につ いて、 それぞれ IC50 = 51.2 ^Μ、 634 ·ίΜ、 134, Μ, 111^Μ、 113^Μであり、 HCT116-C9-C4について、 それぞれ IC50 = 52.8 μ Μ、 517μΜ、 138μΜ、 110 μΜ、 90.3 μΜ であった。 したがって、 Ε7820、 CQS、 LY186641, LY295501、 LY- ASAPの細胞増殖抑制活性については、 C9に対する活性に比べ、 C9C1およ ぴ C9C4に対する活性が顕著に低下していた （図 6 ) 。 よって、 E7070、 E7820、 LY186641、 LY295501、 LY-ASAP および CQS は、 同一または類似の作用機序 を有すると考えられ、 同一または類似の遺伝子変化およぴ効果をもたらすことが 強く示唆された。 実施例 5 E7070耐性株における交差耐性
実施例 4と全く同様にして、 E7070 耐性株を用いて LY573636 の細胞増殖抑 制活性を E7070と同時に評価した。
その結果、 E7070 の細胞増殖抑制活性は、 HCT116-C9 に対する活性に比べ (IC50 = 0.127 μ Μ) 、 HCT116-C9-C1 および HCT116-C9-C4 に対する活性 (それぞれ IC50 = 32.7 μ Μ、 28.0 μ Μ) が顕著に低下することが再度確認され た （図 7 ) 。 また、 LY573636 の細胞増殖抑制活性も、 HCT116-C9 に対する活 性に比べ （IC50 = 5.11 μ Μ) 、 HCT116-C9-C1および HCT116-C9-C4に対す る活性 （それぞれ IC50 = 264μ Μ、 240 Μ) が顕著に低下していた （図 7 ) 。 よって、 LY573636 は、 Ε7070 と同一または類似の作用機序を有すると考えら れ、 同一または類似の遺伝子変化および効果をもたらすことが強く示唆された。
これらの結果 （実施例：！〜 5 ) 力 ら、 Ε7070、 Ε7820、 LY186641、 LY295501, LY-ASAP, LY573636 もしくは CQS またはこれらの組み合わせが、 同一または類似の遺伝子変化ならびに同一または類似の作用および効果をもたら すことが明らかとなった。
よって、 Ε7820と同様に （WO02/066073の実施例 1 ) 、 スルホンアミ ド化合 物、 好ましくは E7070、 LY186641, LY295501, LY'ASAP、 LY573636 もしく は CQS またはこれらの組み合わせは、 当該化合物の投与を受けた患者の血小板 におけるインテグリンの発現量を測定することにより、 血小板以外の細胞におけ るインテグリンの発現に対する当該化合物の影響を判定することができることが 明らかになった。 産業上の利用の可能性
本発明により、 スルホンアミ ド化合物、 好ましくは E7070、 LY186641, LY295501、 LY-ASAP、 LY573636 もしくは CQS またはこれらの組み合わせの 投与を受けた患者の血小板におけるィンテグリンの発現量を測定することにより、 血小板以外の細胞におけるィンテグリンの発現抑制に対する当該化合物の作用を 評価することが可能とな όた。

Claims

1. インテグリンの発現に対するスルホンアミ ド化合物の作用を評価する方法で あって、
前記スルホンアミ ド化合物が、
一般式 （I) ョ口青
Figure imgf000032_0001
の
[式中、 Eは、 一 O—、 _N (CH3) ―、 一囲 CH2—、 一 CH2CH2—または一 CH20—を、 Dは、 一CH2—または一 O—を、 Riaは、 水素原子またはハロ ゲン原子を、 R2aは、 ハロゲン原子またはトリフルォロメチル基をそれぞれ意 味する。 ]
で表わされる化合物、
一般式 （Π)
Figure imgf000032_0002
[式中、 Jは、 一O—または—NH—を、 Ribは、 水素原子、 ハロゲン原子、 置換基を有していてもよい Ci—Ceアルキル基、 置換基を有していてもよい C 1一 C4アルコキシ基、 置換基を有していてもよい Ci一 C4アルキルチオ基、 一 CF3、 一 OCF3、 一S CF3、 置換基を有していてもよい Ci_C4アルコキ シカルボニル基、 ニトロ基、 アジド基、 一 O (S〇2) CH3、 一 N (CH3) 2、 水酸基、 フヱニル基、 置換基を有するフエ-ル基、 ピリジニル基、 チェニル基、 フリル基、 キノリニル基またはトリァゾール基を、 R2bは、 水素庹子、 ハロゲ ン原子、 シァノ基、 一 CF3、 置換基を有していてもよい Ci一 C6アルキル基、 置換基を有していてもよい d— C4アルコキシカルボニル基、 置換基を有して いてもよい d— C4アルコキシ基、 置換基を有していてもよいフエニル基また は置換基を有していてもよいキノリニル基を、 R3bは、 水素原子または置換基 を有していてもよい d— C4アルコキシ基を、 R4bは、 水素原子または置換基 を有していてもよい Cl— C6アルキル基 （但し、 R3bおよび R4bの少なくとも 一つは、 水素原子である） を、 R5bは、 水素原子、 ハロゲン原子、 置換基を有 していてもよい Ci一 C6アルキル基、 — C F3またはニトロ基を、 R6bは、 水 素原子、 ハロゲン原子または置換基を有していてもよい 一 C6アルキル基 (但し、 Rebが置換基を有していてもよい Ci一 C6アルキル基のとき、 R5bは 水素原子であり、 R7bはハロゲン原子である） を、 R7bは、 ハロゲン原子、 置 換基を有していてもよい d— C6アルキル基または一 CF3 (但し、 R5bまた は R?bのいずれか一方が、 置換基を有していてもよい Ci—C6アルキル基であ る力 あるいは R?b力 S、 ハロゲン原子または置換基を有していてもよい d— C6アルキル基である場合には、 R5bまたは R6bのいずれか一方が、 水素原子 である） をそれぞれ意味する。 ]
で表わされる化合物、
式 (III)
Figure imgf000033_0001
で表わされる化合物および
式 （IV)
Figure imgf000033_0002
で表わされる化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、 もし くはその薬理学的に許容される塩、 またはそれらの溶媒和物であり、
(a) 前記スルホンアミ ド化合物の投与を受けた患者から採取された血小板に おけるィンテグリンの発現量を測定する工程と、
(b) 測定された発現量に基づき血小板以外の細胞におけるインテグリンの発 現に対する前記化合物の作用を評価する工程と、
を含む、 前記方法。
2 . スルホンァミ ド化合物が、 N— [ [ ( 4—クロ口フエニル) ァミノ] カルボ -ル] 一 2 , 3—ジヒ ドロー 1 H—インデンー 5—スルホンアミ ド、 N— [ [ ( 3， 4—ジクロロフエニル) ァミノ] カルボニル] 一 2， 3—ジヒ ドロべンゾフラン一 5—スノレホンアミ ド、 N— ( 2 , 4ージクロ口べンゾ ィル) 一 4—クロ口フエニノレスノレホンァミ ド、 N— ( 2， 4ージクロ口ベン ゾィル） — 5—ブロモチォフェン一 2—スノレホンアミ ドおよび 2—スノレフ ァニルァミ ドー 5一クロ口キノキサリンからなる群から選択される少なく とも一つの化合物、 もしくはその薬理学的に許容される塩、 またはそれら の溶媒和物である、 請求項 1に記載の方法。
3 . スルホンアミ ド化合物が、 N— [ [ ( 3， 4—ジクロ口フエニル) ァミノ] カルボニル] - 2 , 3—ジヒ ドロべンゾフラン一 5—スノレホンアミ ドおよ び N— ( 2， 4—ジクロロべンゾィノレ) 一 5—プロモチォフェン一 2—スノレ ホンアミ ドからなる群から選択される少なくとも一つの化合物、 もしくは その薬理学的に許容される塩、 またはそれらの溶媒和物である、 請求項 1 に記載の方法。
4 . スルホンアミ ド化合物が、 N— ( 2 , 4—ジクロロべンゾィル） —5—プロ モチォフェン一 2—スルホンアミ ドのナトリゥム塩である、 請求項 1に記 載の方法。
5 . インテグリンの発現に対する、 式 (IX)
Figure imgf000034_0001
で表わされる化合物、 もしくはその薬理学的に許容される塩、 またはそれらの 溶媒和物の作用を評価する方法であって、 (a) 前記式 (IX)で表される化合物、 もしくはその薬理学的に許容される塩、 またはそれらの溶媒和物の投与を受けた患者から採取された血小板におけ るインテグリンの発現量を測定する工程と、
(b) 測定された発現量に基づき血小板以外の細胞におけるインテグリンの発 現に対する前記式 (IX)で表される化合物、 もしくはその薬理学的に許容され る塩、 またはそれらの溶媒和物の作用を評価する工程と、
を含む、 前記方法。
6 . インテグリンがインテグリンひ 2である、 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記 載の方法。
7 . インテグリンの発現量の測定が、 免疫化学的方法により行うものである、 請 求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の方法。
8 . 免疫化学的方法がフローサイトメ トリーである、 請求項 7に記載の方法。
9 . 請求項 7または 8に記載の方法において使用するための、 抗インテグリン抗 体を含むインテグリンの定量用試薬。
1 0 . インテグリンの発現量の測定が、 インテグリンをコードする mRNA量を 定量することにより行うものである、 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載 の方法。
1 1 . mRNA量の定量が、 定量的 PCRにより行うものである、 請求項 1 0に記 載の方法。
1 2 . 請求項 1 0または 1 1に記載の方法において使用するための、 インテグリ ンをコードする mRNAの塩基配列の全部もしくは一部を有するオリゴヌク レオチド、 または当該 mRNAに相補的な塩基配列の全部もしくは一部を有 するオリゴヌクレオチドを含む、 インテグリンをコードする mRNA の定量 用試薬。
1 3 . 血小板以外の細胞が、 血管新生が起こり得る組織の細胞であり、 インテグ リンの発現に対する抑制作用が血管新生抑制作用として評価されるもので ある、 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の方法。
1 4 . 血小板以外の細胞が腫瘍細胞であり、 インテグリンの発現に対する抑制作 用が腫瘍増殖抑制作用として評価されるものである、 請求項 1〜 5のいず れか 1項に記載の方法。
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