JP6023143B2 - 抗血管新生性低分子および使用方法 - Google Patents
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Description
2009年7月31日に出願された米国特許仮出願第61/230,667号に対して恩典が主張される。米国特許仮出願第61/230,667号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本開示は、抗血管新生化合物、その誘導体、ならびにこのような化合物および誘導体の使用方法に関する。
血管新生は、既存の血管から新たな血管が形成するプロセスである。血管新生は、成長および発生ならびに病理学的状態における正常かつ生命維持に必要なプロセスである。血管新生は組織発生、血管疾患、および癌において基本的に重要なために、過去数十年に渡って集中的に研究されてきた。正常な生理学的条件下では、ヒトまたは動物は極めて特殊な限られた状況でしか血管を形成しない。例えば、血管新生は、通常、胎児発生および胚発生ならびに黄体形成において観察される。出生後の血管新生は、卵巣、子宮内膜、胎盤、および創傷治癒における重要な生理機能である。血管新生の調節解除は、特に、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、子宮内膜症、アテローム発生、関節炎、乾癬、角膜血管新生、慢性関節リウマチ、腫瘍形成、および転移を含む多くのヒト疾患において主要な役割を果たしている。
本開示は、新たな一組の抗血管新生性低分子阻害剤の特定に関する。抗血管新生性低分子の発見には、細胞ベースのハイスループットスクリーニング(HTS)とケモインフォマティクスツールが適用された。本明細書に記載のスクリーニングは、HTSの標的を1種類の細胞下分子にするのではなく血管新生の細胞プロセス全体を標的とした。特に、血管新生の最も重要な2つの段階:内皮細胞増殖および管形成である2つの細胞ベースアッセイを使用した。
塩化2-ベンジリデン-3-(シクロヘキシルアミノ)-3H-インデン-1-オン(NSC150117)、デオキシボウバルジン(NSC259969)、プロパン酸(2,5-ジオキソピロール-1-イル)メチル(NSC19630)、1-ベンジルスルホニル-2,4-ジニトロベンゼン(NSC122657)、イソ酪酸マイタンシノール(NSC292222)、クロロ白金(1+);2-(4-メチルピペリジン-1-イル)エタンチオラート;脱水和物(NSC292596)、またはその薬学的に許容される塩の少なくとも1つを含む、血管新生依存性疾患を治療するための、薬学的組成物。
[1002]
[4-[(4-アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、[1001]の薬学的組成物。
[1003]
血管新生依存性疾患が、癌、網膜症、子宮内膜症、関節炎、または乾癬を含む、[1001]または[1002]の薬学的組成物。
[1004]
局部投与されるか、静脈内投与されるか、経口投与されるか、非経口投与されるか、または移植片として投与される、[1001]〜[1003]のいずれかの薬学的組成物。
[1005]
追加の血管新生阻害剤をさらに含む、[1001]〜[1004]のいずれかの薬学的組成物。
[1006]
塩化2-ベンジリデン-3-(シクロヘキシルアミノ)-3H-インデン-1-オン(NSC150117)、デオキシボウバルジン(NSC259969)、プロパン酸(2,5-ジオキソピロール-1-イル)メチル(NSC19630)、1-ベンジルスルホニル-2,4-ジニトロベンゼン(NSC122657)、イソ酪酸マイタンシノール(NSC292222)、クロロ白金(1+);2-(4-メチルピペリジン-1-イル)エタンチオラート;脱水和物(NSC292596)、またはその薬学的に許容される塩の少なくとも1つを含む、異常な血管新生を阻害するための、薬学的組成物。
[1007]
[4-[(4-アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、[1006]の薬学的組成物。
[1008]
異常な血管新生が腫瘍によって刺激される、[1006]または[1007]の薬学的組成物。
[1009]
腫瘍が良性または悪性である、[1008]の薬学的組成物。
[1010]
塩化2-ベンジリデン-3-(シクロヘキシルアミノ)-3H-インデン-1-オン(NSC150117)、デオキシボウバルジン(NSC259969)、プロパン酸(2,5-ジオキソピロール-1-イル)メチル(NSC19630)、1-ベンジルスルホニル-2,4-ジニトロベンゼン(NSC122657)、イソ酪酸マイタンシノール(NSC292222)、クロロ白金(1+);2-(4-メチルピペリジン-1-イル)エタンチオラート;脱水和物(NSC292596)、またはその薬学的に許容される塩の少なくとも1つを含む、新生物組織の成長を阻害するための、薬学的組成物。
[1011]
[4-[(4-アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、[1010]の薬学的組成物。
[1012]
血管新生依存性疾患を治療する方法であって、以下の工程を含む方法:
血管新生依存性疾患を有するか、血管新生依存性疾患の素因がある対象に、塩化2-ベンジリデン-3-(シクロヘキシルアミノ)-3H-インデン-1-オン(NSC150117)、デオキシボウバルジン(NSC259969)、プロパン酸(2,5-ジオキソピロール-1-イル)メチル(NSC19630)、1-ベンジルスルホニル-2,4-ジニトロベンゼン(NSC122657)、イソ酪酸マイタンシノール(NSC292222)、クロロ白金(1+);2-(4-メチルピペリジン-1-イル)エタンチオラート;脱水和物(NSC292596)、またはその薬学的に許容される塩の少なくとも1つを含む治療的有効量の組成物を投与する工程。
[1013]
前記組成物が、[4-[(4-アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、[1012]の方法。
[1014]
血管新生依存性疾患が、癌、網膜症、子宮内膜症、関節炎、または乾癬を含む、[1012]または[1013]の方法。
[1015]
前記組成物が、局部投与されるか、静脈内投与されるか、経口投与されるか、非経口投与されるか、または移植片として投与される、[1012]〜[1014]のいずれかの方法。
[1016]
追加の血管新生阻害剤を対象に投与する工程をさらに含む、[1012]〜[1015]のいずれかの方法。
[1017]
追加の血管新生阻害剤が、bFGF阻害剤、FGF阻害剤、またはVEGF阻害剤である、[0016]記載の方法。
[1018]
対象における望ましくない血管新生を阻害する方法であって、以下の工程を含む方法:
血管新生が望まれない対象を特定する工程;および
塩化2-ベンジリデン-3-(シクロヘキシルアミノ)-3H-インデン-1-オン(NSC150117)、デオキシボウバルジン(NSC259969)、プロパン酸(2,5-ジオキソピロール-1-イル)メチル(NSC19630)、1-ベンジルスルホニル-2,4-ジニトロベンゼン(NSC122657)、イソ酪酸マイタンシノール(NSC292222)、クロロ白金(1+);2-(4-メチルピペリジン-1-イル)エタンチオラート;脱水和物(NSC292596)、またはその薬学的に許容される塩の少なくとも1つを含む治療的有効量の組成物を対象に投与する工程。
[1019]
前記組成物が、[4-[(4-アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、[1018]の方法。
[1020]
追加の血管新生阻害剤を投与する工程をさらに含む、[1018]または[1019]の方法。
[1021]
追加の血管新生阻害剤がbFGF阻害剤、FGF阻害剤、またはVEGF阻害剤である、[1020]の方法。
[1022]
望ましくない血管新生が腫瘍血管新生を含む、[1018]〜[1021]のいずれかの方法。
[1023]
腫瘍が良性または悪性である、[1022]の方法。
[1024]
対象における新生物を阻害する方法であって、以下の工程を含む方法:
塩化2-ベンジリデン-3-(シクロヘキシルアミノ)-3H-インデン-1-オン(NSC150117)、デオキシボウバルジン(NSC259969)、プロパン酸(2,5-ジオキソピロール-1-イル)メチル(NSC19630)、1-ベンジルスルホニル-2,4-ジニトロベンゼン(NSC122657)、イソ酪酸マイタンシノール(NSC292222)、クロロ白金(1+);2-(4-メチルピペリジン-1-イル)エタンチオラート;脱水和物(NSC292596)、またはその薬学的に許容される塩の少なくとも1つを含む治療的有効量の組成物を対象に投与する工程。
[1025]
前記組成物が、[4-[(4-アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、[1024]の方法。
[1026]
新たな血管の形成が望まれない対象の組織または標的領域における血管新生を阻害する方法であって、以下の工程を含む方法:
新たな血管の形成が望まれない対象の組織または標的領域を特定する工程;および
塩化2-ベンジリデン-3-(シクロヘキシルアミノ)-3H-インデン-1-オン(NSC150117)、デオキシボウバルジン(NSC259969)、プロパン酸(2,5-ジオキソピロール-1-イル)メチル(NSC19630)、1-ベンジルスルホニル-2,4-ジニトロベンゼン(NSC122657)、イソ酪酸マイタンシノール(NSC292222)、クロロ白金(1+);2-(4-メチルピペリジン-1-イル)エタンチオラート;脱水和物(NSC292596)、またはその薬学的に許容される塩の少なくとも1つを含む有効量の組成物を組織または標的領域に直接的または間接的に導入し、それによって、組織または標的領域における血管新生を阻害する工程。
[1027]
前記組成物が、[4-[(4-アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、[1026]の方法。
[1028]
標的領域が、皮膚、腫瘍、網膜、関節、または子宮内膜組織を含む、[1026]または[1027]の方法。
[1029]
対象が、腫瘍、網膜症、子宮内膜症、関節炎、または乾癬を有するか、腫瘍、網膜症、子宮内膜症、関節炎、または乾癬を発症する素因を有する、[1026]〜[1028]のいずれかの方法。
前述および他の目的、特徴、および利点は以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。次に、図面について言及する。
37C.F.R.1.822に規定されたように、添付の配列表に列挙した核酸配列および/またはアミノ酸配列を、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語およびアミノ酸の三文字表記を用いて示した。各核酸配列の1本の鎖しか示さなかったが、表示された鎖を参照することによって相補鎖が含まれると理解される。添付の配列表にあるSEQ ID名を表13に示した。表14に列挙した(およびncbi.nlm.nih.gov/guide/においてオンラインで入手可能な)アクセッション番号に関連する配列および情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
I.略語
bFGF:塩基性線維芽細胞増殖因子
EC50:最大半量有効濃度という用語
FDA:米食品医薬品局
GFP:緑色蛍光タンパク質
HTS:ハイスループットスクリーニング
PAE:ブタ大動脈内皮
RTK:受容体型チロシンキナーゼ
SAR:構造活性相関
SM:低分子
RFP:赤色蛍光タンパク質
VEGF:血管内皮増殖因子
YFP:黄色蛍光タンパク質
特に定めにない限り、技術用語は従来の用法に従って用いられる。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Pressにより出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.により出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.により出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見られる。
溶解状態で水素原子を移動ことができる化合物。酸はカルボン酸を含むが、これに限定されない。
与えること、または適用すること、例えば、対象に与えること、または適用すること。「導入する」は「投与する」と同等であると理解される。この用語は、特に、局部、非経口、経口、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、鼻、または関節内の投与経路を含む。例として、抗血管新生剤などの治療用化合物を投与することができる。投与は局所投与または全身投与でもよく、直接投与または間接投与でもよい。
炭素および水素しか含有しない分枝アルキル基または直鎖アルキル基。ある特定の態様では、アルキル基は、1〜12個の炭素原子、特に、1〜6個の炭素原子を含有してもよい。さらに、この用語は、メチル、エチル、n-プロピル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、ピバリル、ヘプチル、アダマンチル、およびシクロペンチルなどの基によって例示される。アルキル基は非置換でもよく、1つまたは複数の置換基、例えば、ハロゲン、アルコキシ、シクロアルキル、アルキルチオ、トリフルオロメチル、アシルオキシ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、アリールオキシ、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、モルホリノ、ピペリジノ、ピロリジン-1-イル、ピペラジン-1-イル、または他の官能基によって置換されてもよい。
1つまたは複数の第一級アミノ基、第二級アミノ基、または第三級アミノ基および1つもしくは複数の酸性カルボキシル基(-COOH)を含有する部分、またはこの部分が1つもしくは複数のアミノ基(例えば、-NH2)および1つもしくは複数のエステル基(すなわち、-OC(O)-)を含有しているという意味ではアミノ酸の誘導体または残基である部分。
多細胞性の脊椎生物。例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリー。哺乳動物という用語はヒト哺乳動物および非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、「対象」という用語は、ヒト対象および獣医学的対象、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、およびウシを含む。
出芽および/または既存からの血管の成長によって新たな血管が発生する生物学的プロセス。このプロセスは、既存の血管から内皮細胞が遊走および増殖することを伴ってもよい。血管新生は出生前発生、出生後発生の間に、および成人において起こる。成人では、血管新生は、女性生殖器系、創傷治癒の正常サイクルの間に、および癌などの病理学的プロセスの間に起こる(総説については、Battegay, J. Molec. Med. 73(7): 333-346, 1995を参照されたい)。
剤が血管新生を促進または阻害する能力。血管新生活性は、血管新生アッセイ、例えば、蛍光細胞株を用いた血管新生アッセイ、ならびに本明細書および/または米国特許出願第12/060,752号(2009年4月2日にUS2009/0088341として公開され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)において開示されたアッセイにおいて測定することができる。
疾患進行のために異常な(望ましくない)血管新生の刺激に少なくとも部分的に依存する疾患。異常な血管新生は、他の点では正常な細胞における血管新生因子の異所性発現に起因することがある。異常な血管新生は、1種類または複数の種類の血管新生因子を産生する腫瘍によって刺激されることもある。
例えば、血管新生を刺激または阻害することによって、血管新生に影響を及ぼす分子。非常に多くの実験から、正常な血管新生プロセスおよび病理学的な血管新生プロセスの間に血液供給が不十分な条件下では、組織は、血管新生を分泌する因子を促進することが示唆されている。血管新生は、細胞(例えば、腫瘍細胞)またはアクセサリー細胞が分泌したた様々な因子によって開始および維持される。多くの異なる増殖因子およびサイトカインが、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞に対して走化活性、分裂促進活性、調節活性、または阻害活性を発揮することが示されており、従って、血管新生プロセスに関与すると予想することができる。例えば、血管内皮細胞の増殖、走化挙動、および/または機能活性を調節する因子には、特に、aFGF、bFGF、アンジオゲニン、アンジオトロピン(angiotropin)、上皮増殖因子、IL-8、および血管内皮増殖因子(VEGF)が含まれる。
非置換でもよく、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、メルカプト(-SH)、アルキルチオ、トリフルオロメチル、アシルオキシ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、アリールオキシ、別のアリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、モルホリノ、ピペリジノ、ピロリジン-1-イル、ピペラジン-1-イル、または他の官能基によって置換されてもよい、1個の環(例えば、フェニル)を有する一価不飽和芳香族炭素環式基、または複数の縮合環を有する一価不飽和芳香族炭素環式基(例えば、ナフチルもしくはアントリル)。
ある特定の細胞株の活性、例えば、細胞が分裂する能力、刺激に応答して遊走する能力、または細管などの三次元構造を形成する能力。ある特定の細胞株の細胞活性は、インビトロアッセイ、例えば、本明細書において開示されたアッセイを用いて評価することができる。
細胞の異常な増殖および分化を特徴とする悪性疾患。「転移性疾患」は、最初の腫瘍部位から離れ、例えば、血流またはリンパ系を介して他の身体部分に遊走した癌細胞を指す。
制御された条件下で、原核細胞または真核細胞を増殖させるプロセス。実際には、「細胞培養」という用語は、多細胞性真核生物、特に、哺乳動物細胞などの動物細胞、例えば、本明細書において開示された蛍光細胞に由来する細胞の培養を指すようになった。哺乳動物細胞を、細胞インキュベーターに入れて適切な温度および気体混合物(典型的に、37℃、5%CO2)で増殖および維持する。培養条件は細胞タイプごとに大きく異なり、ある特定の細胞タイプの条件を変えると、異なる表現型を発現させることができる。温度および気体混合物の他に、培養系において最もよく変えられる要因は増殖培地である。増殖培地の配合は、pH、グルコース濃度、増殖因子、および他の栄養成分の存在を変えることができる。培地に添加するのに用いられる増殖因子は、仔ウシ血清などの動物血液に由来するものが多い。
異常な細胞増殖を特徴とする疾患の治療において治療上有用な任意の化学剤。このような疾患には、腫瘍、新生物、および癌、ならびに乾癬などの過形成成長を特徴とする疾患が含まれる。1つの態様において、化学療法剤は血管新生阻害剤である。化学療法剤は、例えば、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition; Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer and Berkery. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer Knobf, and Durivage (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993に記載されている。併用化学療法は、癌を治療する複数の種類の剤、例えば、アルキル化剤および血管新生阻害剤の投与である。
固体または液体の形を含めて直接的な物理的関係に置くこと。接触は、インビボで、例えば、剤を対象に投与することによって行われてもよく、インビトロで、例えば、単離された細胞または細胞培養物、例えば、開示された蛍光細胞株の細胞培養物を用いて行われてもよい。
参照基準。対照とは、基底細胞活性、例えば、基底の遊走能、倍加時間、細管形成能などを示す既知の値でもよく、外因性作用物質、例えば、試験剤、1種類もしくは複数の種類の細胞株(例えば、本明細書において開示された蛍光細胞株)、血管新生因子、血管新生阻害剤などによって処理されていない対照細胞培養物、例えば、開示された蛍光細胞株の少なくとも1つを含む培養物でもよい。試験試料と対照との差は増加でもよく、逆に、減少でもよい。この差は定性的な差でもよく、定量的な差、例えば、統計的に有意な差でもよい。ある例では、差は、対照を基準にした、少なくとも約10%、例えば、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約150%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、少なくとも約300%、少なくとも約350%、少なくとも約400%、少なくとも約500%、または500%超の増加または減少である。
少なくとも1つのシクロアルキル環構造を含有する部分を含む。架橋環式構造または縮合環構造を含む1つまたは複数の環構造があってもよい。シクロアルキルは非置換でもよく、1つまたは複数の置換基、例えば、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、トリフルオロメチル、アシルオキシ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、アリールオキシ、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、モルホリノ、ピペリジノ、ピロリジン-1-イル、ピペラジン-1-イル、または他の官能基によって置換されてもよい。例示的なシクロアルキル基には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロブチル、およびデカヒドロナフチルが含まれる。
最大半量有効濃度(EC50またはEC50)という用語は、ベースラインと最大の半分の応答を誘導する薬物の濃度を指す。EC50は、薬物の効力の尺度として一般的に用いられる。
電場強度および磁場強度の周期的な同時変動によって伝わり、電波、赤外線、可視光、紫外線、X線、およびγ線を含む一連の電磁波。特定の例では、電磁放射線はレーザーにより発せられ、単色性、方向性、干渉性、偏光、および強度の特性を有してもよい。例えば、レーザーからのエネルギーが特定の励起波長を有するフルオロフォアを励起できるが、第1のフルオロフォアの励起波長とは異なる、かつ別個の特定の波長を有する第2のフルオロフォアを励起できないように、レーザーはある特定の波長の光(または比較的狭い範囲の波長にわたる光)を発することができる。
光源から発生したある特定の波長の光。特定の例では、蛍光タンパク質などのフルオロフォアがその励起波長の光を吸収した後に、フルオロフォアから発光シグナルが発せられる。
さらに高いエネルギーレベルへの電子遷移を励起するのに必要および/または十分な、ある特定の波長の光。特定の例では、励起は、蛍光タンパク質などのフルオロフォアが、励起シグナルからの波長とは異なる (例えば、さらに長い)波長を発するような状態にフルオロフォアを励起するのに必要および/または十分な、ある特定の波長の光である。
外因性作用物質は、研究しようとする標的細胞株の外側にある任意の作用物質であり、低分子、タンパク質、生物学的試料(例えば、患者試料)、および他の細胞または細胞株、例えば、標的細胞株以外の蛍光細胞株、例えば、区別可能な蛍光シグナルによって異なると特定することができる異なるタイプの細胞を含む。
遺伝子配列に関して、遺伝子の転写、適宜、結果として生じたmRNA転写物からタンパク質への翻訳を指す。従って、タンパク質コード配列の発現、例えば、蛍光タンパク質の発現は、そのタンパク質のコード配列の転写および翻訳に起因する。構成的発現は、発現が中断されないような実質的に連続した形での、タンパク質、例えば、蛍光タンパク質などの遺伝子産物の発現を指す。構成的発現の一例は、外因性刺激剤、例えば、プロモーターを活性化するのに用いられる剤の非存在下での連続発現である。安定発現は、時が経つにつれても失われない、または大幅に低下しない発現、例えば、細胞株、例えば、蛍光タンパク質を構成的に発現する細胞株を複数回継代することによって減少しない発現を指す。
蛍光分子、例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質などの蛍光分子の特徴。蛍光特性の例には、適切な励起波長でのモル吸光率、蛍光量子効率、励起スペクトルまたは発光スペクトルの形状(「蛍光スペクトル」、励起波長最大および発光波長最大、2種類の波長における励起振幅の比、2種類の波長における発光振幅の比、励起状態の寿命、または蛍光の異方性が含まれる。蛍光の定量とは、フルオロフォア、例えば、蛍光タンパク質が発した蛍光の量を求めることをいう。蛍光の量は、フルオロフォアが発した光子の量でもよい。ある例では、蛍光は、ある特定の波長、例えば、ある特定のフルオロフォア、例えば、蛍光タンパク質の発光最大の波長の蛍光シグナルの強度を測定することによって定量される。蛍光強度はまた、例えば、ある特定のフルオロフォア、例えば、ある特定の蛍光タンパク質の発光最大と重複し、それによって妨害する発光スペクトルを避けるために、ある特定のフルオロフォアの発光最大ではない波長で定量されてもよい。ある例では、蛍光シグナルは、蛍光タンパク質、例えば、このような蛍光タンパク質を含有する細胞の集団に存在する蛍光タンパク質の集団によって発せられる。例えば、このような蛍光シグナルを発する細胞の数または相対数を求めるために、このようなシグナルを定量することができる。蛍光パターンを検出するとは、蛍光シグナル、例えば、ある特定の波長の蛍光シグナルが生じる場所を決定するために、蛍光シグナルと特定の場所とを相関付けることをいう。ある例では、例えば、細管の総面積の数、細管の総数、結節の数、分岐点の数、結節あたりの管の数、またはこのような細胞によって形成される結節面積を求めるために、本明細書において開示された、および(2009年4月2日にUS2009/0088341として公開され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)米国特許出願第12/060,752号に開示された方法を用いて、蛍光パターンから、蛍光シグナルを発する細胞、例えば、蛍光タンパク質を含有する細胞の場所または形状が決まる。
検出可能な蛍光シグナルを発することができるタンパク質。蛍光タンパク質は、発光スペクトルの波長によって特徴付けることができる。例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)は、可視スペクトルの緑色部分の蛍光発光スペクトルを有する。緑色蛍光タンパク質に加えて、可視スペクトルの他の領域の蛍光を発する蛍光タンパク質、例えば、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、および遠赤色蛍光タンパク質が知られている。蛍光タンパク質の例は、以下の特許文書:米国特許第5,804,387号;同第6,090,919号;同第6,096,865号;同第6,054,321号;同第5,625,048号;同第5,874,304号;同第5,777,079号;同第5,968,750号;同第6,020,192号;同第6,146,826号;同第6,969,597号;同第7,150,979号;同第7,157,565;および7,166,444;および国際公開公報第07/085923号;国際公開公報第07/052102号、国際公開公報第04/058973号、国際公開公報第04/044203号、国際公開公報第03/062270号;および国際公開公報第99/64592号において見られる。蛍光タンパク質のさらなる例は、Living Colors(登録商標)という商品名でClonetech, Laboratories, Inc. (Mountain View, CA)から入手可能である。開示された蛍光細胞株の作製において使用するために、このような蛍光タンパク質をコードする核酸を哺乳動物発現ベクターに組込むことができる。
時間の関数とした、細胞分裂による、ある特定の細胞株の細胞の数の増加。一例では、増殖速度は、培養増殖させた細胞株が倍になる速度である。
フルオロ、ブロモ、クロロ、およびヨード置換基を指す。
このプロセスによって、ある特定の生体分子経路、例えば、血管新生経路に影響を及ぼす活性化合物、抗体、または遺伝子を迅速に特定することができる。ある特定の例では、最新のロボット工学、データ処理および管理ソフトウェア、リキッドハンドリング装置、ならびに高感度検出器、ハイスループット法を組み合わせることによって、可能性のある薬剤を短時間で迅速にスクリーニングすることができる。
哺乳動物組織に由来する細胞および細胞株などの哺乳動物細胞の組織学的検査を含む、顕微解剖学の研究および組織の分類。組織学的タイピングは、例えば、微細解剖学的起源(例えば、特に、結合組織、神経、筋肉、および循環細胞)または細胞タイプ(例えば、特に、上皮細胞、ストローマ細胞)によって組織を組織タイプに分類することを指す。細胞は、染色および/もしくは抗体との反応によって、または特有の微細解剖学的特徴によって異なる組織学タイプであると分類することができる。異なる組織学タイプの細胞が異なる染料および/または抗体と異なって相互作用する。組織学的タイピングのための方法は当技術分野において周知である。組織学を用いると、細胞が異なるタイプの細胞かどうか確かめることができる。従って、ある例では、異なる細胞株は組織学的に異なる細胞株である。
ランダムな変異または計画的な改変、例えば、テロメラーゼ遺伝子の人為的発現によって無限に増殖する能力を獲得した細胞または細胞株。特定の細胞タイプを代表する十分に確立した不死化細胞株が非常に多くある。
ある測定可能な程度まで[何かを]、例えば、血管新生を阻害することができる物質。開示された例では、血管新生の阻害は、本明細書において開示されたアッセイの1つにおいて測定される。
この用語はヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む。同様に、「対象」という用語は、ヒトおよび獣医学的対象、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含む。
細胞、例えば、本明細書において開示された細胞株が、増殖因子などの化学刺激に応答して移動する能力。遊走能は、本明細書において開示されたアッセイを用いて確かめることができる。
組織学的に異なる細胞株などの2種類以上の細胞タイプを含有する、培養細胞などの細胞の集団。異なる細胞タイプの例には、異なる胚起源の細胞(例えば、外胚葉、内胚葉、または中胚葉に由来する細胞)、異なる細胞位置に由来する細胞(例えば、上皮、内皮、または間質に由来する細胞)、異なる組織または器官に由来する細胞(例えば、肺、心筋、神経、血管、皮膚、骨、または骨格筋組織もしくは平滑筋組織に由来する細胞)が含まれる。
任意の新しくかつ異常な成長;特に、成長が無秩序かつ進行性の新しい組織成長。新生物すなわち腫瘍は有用な機能を果たさず、健康な生物を犠牲にして成長する。
新しい血管の成長。新血管新生は、通常、血管を含んでいない組織内の血管の成長でもよく、虚血性組織または他の損傷組織における血管の成長でもよい。新血管新生は、望ましくない、または病理学的プロセスを媒介する時には、例えば、網膜または角膜において起こる時には病理学的な新血管新生になり得る。
細胞の継代または分割は、少数の細胞を新しい容器に移すことを伴う。細胞を定期的に分割するのであれば、長期の高い細胞密度に関連した老化が避けられるので、細胞を長期間培養することができる。少数の細胞を含有する少量の培養物を大量の新鮮な培地で希釈すると、懸濁培養物は容易に継代される。付着培養の場合、最初に、細胞を剥離する必要がある。これは、典型的には、トリプシン-EDTAの混合物を用いて行われる。次いで、少数の剥離した細胞を用いて、新たな培養物を播種することができる。
単独で、または別の治療剤もしくは薬学的に許容される担体と組み合わせて対象に適切に投与された時に、望ましい治療効果または予防効果(例えば、血管新生の阻害)を誘導することができる化合物または組成物。薬剤には、血管新生因子、例えば、bFGFおよびVEGF、ならびに抗血管新生因子、例えば、bFGF阻害剤またはVEGF阻害剤が含まれるが、これに限定されない。例えば、適切な抗血管新生因子には、特異的なVEGF-RアンタゴニストであるSU5416、VEGF、bFGF、およびPDGFの受容体を遮断するSU6668、ならびにAvastin(登録商標)が含まれるが、これに限定されない。例えば、Liu et al., Seminars in Oncology 29 (Suppl 11): 96-103, 2002; Shepherd et al., Lung Cancer 34:S81-S89, 2001を参照されたい。薬剤という用語は、具体的には、表1に列挙した抗血管新生化合物および表10において特徴付けられた抗血管新生化合物を含めて、本明細書において議論される生理活性化合物にも適用することができる。
有用な薬学的に許容される担体は従来のものである。Remington 's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition, 1975は、本明細書において開示された組成物の薬学的送達に適した組成物および製剤について述べている。
対象から直接培養した細胞。腫瘍に由来する初代細胞を除き、ほとんどの初代細胞培養は寿命が限られている。ある特定の集団倍加数の後に、細胞は一般的に生存能力を保持しながら、老化プロセスを経て、分裂を止める。
情報を提供する物理的性質の検出可能な変化または衝動。開示された方法の文脈では、例には、電磁気シグナル、例えば、光、例えば、ある特定の量または波長の光、例えば、蛍光タンパク質が発した光の波長の光が含まれる。
分子、典型的には、1000ダルトン未満、またはある態様では、約500ダルトン未満の分子量を有する分子であって、測定可能な程度まで、ある標的分子の活性を阻害することができる分子。特定の態様において、低分子阻害剤は血管新生阻害剤であり、この活性は、当技術分野において公知の方法および/または本明細書に記載の方法を用いて試験、検出、確認、および/または測定することができる。
作用、例えば、細胞に対する作用が試験される任意の剤。ある態様において、試験剤は、抗血管新生剤、さらには生物学的特性が未知の剤などの化合物である。
治療的効果を有するのに十分な、例えば、進行をある程度まで阻害するのに十分な、または疾患を後退させるのに十分な用量、または疾患によって引き起こされる症状を緩和することができる用量。例えば、治療的有効量の血管新生阻害剤は、約0.1nM/キログラム(kg)体重〜約1μM/kg体重、例えば、約1nM〜約500nM/kg体重、または約5nM〜約50nM/kg体重でもよい。ある特定の治療/生理活性化合物の正確な用量は、化合物の効力、対象の年齢、体重、性別、および生理学的状態、治療されている疾患などに基づいて当業者によって容易に決定される。
例えば、癌などの疾患のリスクのある対象において、疾患または状態の完全発症を阻害すること。「治療」とは、疾患または病理学的状態が発症し始めた後に、疾患または病理学的状態の徴候または症状を寛解させる治療介入を指す。疾患または病理学的状態に関して「寛解させる」という用語は、治療の観察可能な有益効果を指す。有益効果は、例えば、感受性のある対象において疾患の臨床症状の開始が遅れることによって、疾患の一部もしくは全ての臨床症状の重篤度が低下することによって、疾患の進行が遅くなることによって、対象の全体の健康状態もしくは幸福が改善することによって、または特定の疾患に特異的な当技術分野において周知の他のパラメータによって立証することができる。「予防的」処置は、疾患の徴候を示さない対象または初期徴候しか示さない対象に、病気を発症するリスクを小さくする目的で投与される処置である。
細胞株がインビトロで管様構造、例えば、毛細血管などの血管に似た構造を形成する能力。細管形成能は、細管を形成するように誘導された細胞が示すパターンを求めることによって、例えば、本明細書において開示された細胞株などの蛍光タンパク質発現細胞からの蛍光パターンを求めることによって確かめることができる。
新たな一組の抗血管新生性低分子を特定するために、高度なバイオインフォマティクスマイニングツールと共に用いられた厳格なHTS戦略が本明細書において説明される。この戦略は以下を含んだ。
一組の多様な化合物(Diversity Set I)をNCI/DTP Open Chemical Repository(dtp.cancer.govにおいてオンラインで入手可能)から入手した。Diversity Set Iは1990個の化合物を含み、これらはそれぞれ、Chem-Xプログラム(Oxford Molecular Group, Oxford, UK)によって求められた、少なくとも5つの新たなファーマコフォアおよび5つ以下の回転可能な結合を含有する。Diversity Set Iはセットとしてもはや入手することができないが、個々の化合物はNIC/DTP Open Chemical Repositoryから入手することができる(だが、多量のNSC675865、NSC18877、NSC176327、NSC521777、NSC166687、およびNSC119889は入手できない)。Diversity Set Iの各メンバーは大きな分子ファミリーであり、これに関する情報は公的データベースを通じてアクセス可能なことが当業者に理解されるだろう。代表的な化合物1〜77の抗血管新生活性が本明細書において特定されたことで、それぞれの関連する分子クラスを抗血管新生活性について試験する方法が今や可能であり、同様に、このようなスクリーニングによって特定された全ての分子を抗血管新生剤として使用することができる。抗血管新生活性を潜在的に示し得るさらなる化合物を特定するために、下記のセクションVに記載のように構造活性相関分析を含む構造類似性分析が用いられる。このような分析があると、Diversity Set Iファミリーに関連しないが、公的データベースを介して入手可能な化合物をスクリーニングすることができる。
化合物1〜77のいずれかの構造と他の公知の化合物(または新たに得られた化合物)の構造を比較し、構造活性相関(SAR)または定量的構造活性相関(QSAR)分析によって類似性を求めることによって、さらなる潜在的に活性のある化合物を予測することができる。Tanimotoアルゴリズム(Dogra,「Script for computing Tanimoto coefficient」, QSARWorld, qsarworld.com/virtual-workshop.phpにおいてオンラインで入手可能, July 5, 2007)およびLeadScopeクラスタリングアルゴリズム(Leadscope Inc., Columbus, OH)を含めて、SAR分析およびQSAR分析のための公知の方法がいくつかある。SAR法およびQSAR法では分子構造を比較し、分子が共有する構造特徴を決定する。
を比較する(Cross et al., J. Med. Chem., 46:4770-4775, 2003)。クラスタリング分析を行った後に、各クラスターは、共通の骨格を有する複数の低分子を含有し、各分子はzスコア値を有する。低いzスコア値は、規定された活性、例えば、増殖または管形成について低い値を有する。従って、増殖について低いzスコア値を有する低分子は、高いzスコアを有する分子より増殖を抑える。低分子の個々のzスコア値に基づく平均zスコア値はクラスターと関連する。zスコア値が低いクラスターは、個々の低いzスコア値を有する低分子を含有する可能性が高い。本態様では、平均zスコアが-2未満のクラスターに含まれる骨格だけが考慮される。例えば、平均増殖zスコアが-2未満のクラスターにある分子は潜在的な増殖阻害剤と予測される。これらの特定された骨格は、増殖阻害および/または管形成阻害の両方について予測値を有する。
化合物1〜77、表2〜9のいずれかにおいてさらに列挙された化合物、またはその任意の誘導体の1つとの比較に基づいて、潜在的な抗血管新生化合物として新たな化合物が特定されたら、特定された潜在的な治療用化合物の生理活性を試験することができる。例として、本明細書に記載の任意の方法を使用することができる。以下のリストは、代表的であるが、非限定的な例となる生理活性アッセイを説明している。さらなるアッセイが当業者に公知であろう。例えば、さらなるアッセイが、(2009年4月2日にUS2009/0088341として公開され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)米国特許出願第12/060,752号に記載されている。
単一の細胞培養物または複数の細胞培養物(共培養)にリアルタイム増殖アッセイが適用された。開示された蛍光細胞株の培養物が発する蛍光シグナルは、培養物に存在する蛍光細胞の数に比例する。言い換えると、培養物中のあるタイプの蛍光細胞の数が倍になった時に、培養物中のそのタイプの蛍光細胞の集団からの蛍光シグナル、例えば、発光最大の強度として測定された蛍光シグナルは倍になる。逆に、培養物中のあるタイプの細胞の数が半分に分けられれば、培養物中のそのタイプの細胞の集団からの蛍光シグナル、例えば、発光最大の強度として測定された蛍光シグナルは半分になる。これらの特性は、培養蛍光細胞に対する外因性作用物質、例えば、1種類または複数の種類のさらなる細胞株または試験剤(例えば、生理活性SM)の作用を測定するのに使用することができる。ある時点で、培養物の全蛍光は、シグナルが細胞数の関数としてプラトーに達するようにシグナル飽和に達することがある。第1の蛍光細胞株に対して、さらなる細胞株(例えば、異なる細胞株)の作用を確かめることができる(これは、例えば、多重アッセイまたは3次元共培養において、複数の種類の細胞株、さらには1種類もしくは複数の種類の蛍光細胞株、またはその組み合わせにも展開することができる)。
様々な蛍光タンパク質を発現する蛍光細胞株、例えば、本明細書および(2009年4月2日にUS2009/0088341として公開され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)米国特許出願第12/060,752号において開示された蛍光細胞株の培養物を細管形成アッセイに適用することができる。新血管新生は血管新生の根底をなし、多くの薬物スクリーニングおよび細胞シグナル伝達研究の焦点である。血管の発達は固形腫瘍の発達および成長における重大な事象であり、創傷治癒、網膜症、および黄斑変性に関与する。蛍光細胞株、特に、開示された内皮蛍光細胞株は、インビトロ細胞培養アッセイを用いた血管新生の程度を評価するアッセイにおいて使用するのに理想的である(例えば、Auerbach et al. Clinical Chemistry 49:1, 32-40, 2003; Taraboletti and Giavazzi, EJC 40, 881-889, 2004を参照されたい)。蛍光/比色染色は必要とされないので、細管形成アッセイは経時的に追跡することができ、BD Pathway(商標)Bioimager(BD Bioscience, San Jose, CA)などの既存の計測装置において直接視覚化することができる。これは、この血管新生インビトロアッセイにおける、異なる細胞タイプ間の相互作用の研究あるいは関心対象のSMおよび/または1種類もしくは複数の種類の細胞タイプの間の相互作用の研究を可能にする。さらに、細管形成能に対するSMの作用は、関心対象の蛍光細胞株と、初代細胞、例えば、対象から得られた初代細胞、例えば、腫瘍細胞との共培養物についても確かめることができる。このような共培養物は、2次元共培養または3次元共培養、例えば、米国特許出願第12/802,666号に記載の共培養として樹立することができる。
使用可能な別のアッセイは細胞遊走アッセイである。これらのアッセイは、管理された環境における細胞遊走、例えば、細胞株(または多重アッセイでは複数の種類の細胞株)の遊走の差を評価する。細胞遊走は、ある特定の場所への遊走に関連した場所における蛍光シグナル(例えば、ある特定の色の蛍光シグナルまたはある特定の波長における蛍光シグナルの強度、例えば、ある特定の蛍光タンパク質の発光最大の強度)によって確かめられる。
アッセイの別の例は細胞生存率アッセイである。このようなアッセイは、細胞の細胞膜の完全性が損なわれた時に起こる、例えば、細胞が、細胞傷害剤、例えば、細胞に対して細胞傷害性の試験剤に曝露された時など細胞が死滅した時に起こる、蛍光タンパク質を構成的に発現する蛍光細胞株の細胞質からの蛍光タンパク質の放出をベースとしている。蛍光タンパク質が細胞傷害剤に曝露されると培地に遊離し、例えば、蛍光計を用いて測定することができる。培養物に存在する、細胞から遊離した蛍光タンパク質の量が多いほど、培地に存在する蛍光の強度は大きくなる。培地中の蛍光の測定値は死細胞の数に対応する。
以下の説明は血管新生アッセイのさらなる例を提供する。この血管新生アッセイは、試験化合物、例えば、化合物1〜77の1つと構造上関連する化合物(表1)、または表2〜9のいずれかに示される骨格と構造上関連する化合物、およびその誘導体の血管新生(抗血管新生)活性の測定において有用であり得る。特定の例では、これらのアッセイはまた、化合物1〜77からの少なくとも2つのSMの組み合わせ、または化合物1〜77からの少なくとも1つのSMとさらなる公知のまたは潜在的な血管新生阻害剤との組み合わせの抗血管新生活性を測定するのに使用することもできる。当業者であれば、他の血管新生アッセイも使用できることを認めるだろう。
これは、通常は無血管の角膜の新血管新生を促進する規定された物質の作用を追跡するための「最も基準となる」方法である。このアッセイには、新しい血管が容易に検出され、通常は無血管の角膜において新たに形成された血管であるのに本質的に違いないという利点がある。血管新生活性または抗血管新生活性について試験しようとする剤を、徐放される形で約1〜2μl体積の不活性のハイドロン(hydron)ペレットの中に固定する。このペレットを、麻酔をかけたC57BLマウス(またはウサギ)の角膜上皮にある、顕微解剖で作られたポケットの中に移植した。5〜7日間にわたって、血管新生因子は、血管のある隣接した角膜輪部から血管の成長を刺激する。細隙灯写真撮影(slit lamp photography)によって写真記録を行う。これらの血管の出現、密度、および程度を評価し、スコア付けした。場合によっては、麻酔をかけた動物において進行の時間経過を追跡した後に、屠殺する。血管を、長さ、密度、および血管が出ている輪部の放射状表面(文字盤の時間として表す)について評価した。
規定された量の試験試薬を含浸した不活性生体高分子スポンジを、経皮的切開を介して、皮下組織に作ったポケットの中に皮下移植する。次いで、5日〜15日間の規定された期間の後に、スポンジを取り除き、新たな血管新生を、多くの生化学的パラメータおよび組織形態計測的パラメータによって定量する。スポンジの一部を抽出し、内皮に限定された遺伝子産物、例えば、VEカドヘリン、FLK-1受容体、およびその他についてウエスタンブロットによって分析することができる。発現レベルが、スポンジに侵入した新血管の中に含まれる内皮細胞タンパク質を反映していることを確かめるために、同じ試料の凍結切片部分を免疫組織化学によって類似抗原について評価する。マウス角膜ポケットアッセイと共に、腹腔内経路または静脈内経路によって推定血管新生阻害剤を全身投与すると、様々な微小血管床における血管新生刺激に対する、これらの阻害剤の局所作用を評価および比較することができる。
別のアッセイではニワトリ絨毛尿膜が用いられる(CAMアッセイ;Wilting et al., Anat. Embryol. 183: 259, 1991を参照されたい)。CAMアッセイを用いると、ニワトリ胚絨毛尿膜(CAM)において血管新生および抗血管新生を定量することが可能になる。簡単に述べると、孵卵して2日目または3日目にニワトリ卵に窓をあけ、窓を、テープ、ろう、ガラススライド、またはPARAFILM(登録商標)ラッパーで密封する。孵卵して8日目に、窓をあけ、小さなスポンジまたは数個のゼラチン小片を、成長しているCAMの上に置く。
さらに別の血管新生アッセイは、定方向インビボ血管新生アッセイ(DIVAA; Guedez et al., American Journal of Pathology 162(5):1431-9, 2003)と呼ばれる。シリコーンチューブ(0.15mm外径、New Age Industries, Southampton, PA)を長さ1cmに切断し、各チューブの一端を液体シリコーンで閉じ、24時間乾燥させ、次いで、オートクレーブする。試験物質の希釈液を、滅菌した冷エッペンドルフチューブの中でマトリゲルに溶解して調製する。チューブをハミルトンシリンジで塞ぐ。ヌードマウスに麻酔をかけ、各動物の背側皮膚の中にポケットを作る。次いで、チューブを移植し、最初に開口端を密封し、創傷を密封する。
本明細書に記載の化合物(例えば、化合物1〜77)およびその誘導体は、対象、例えば、血管新生の調節解除が伴う疾患または状態に罹患している対象における血管新生を阻害または低下するのに特に有用である。血管新生を阻害または低下させる方法は、血管新生を阻害または低下させる剤と特定された治療的有効量の少なくとも1種類の剤(例えば、本明細書に記載の化合物1〜77のいずれか)を対象に投与する工程を含む。従って、ある態様において、血管新生を減少させる生理活性化合物を含有する薬学的組成物は、対象、例えば、血管新生を低下させることによって治療される癌または別の疾患もしくは状態を有する対象に投与される。ある態様において、対象はヒト対象である。血管新生を減少させる少なくとも1種類の生理活性化合物を含有する薬学的組成物は、公知の従来の治療、例えば、癌治療と共に、例えば、治療的有効量の化学療法剤と共に投与することができる。
例えば、腫瘍(悪性でも良性でも)、網膜症、乾癬、子宮内膜症、関節炎、もしくは血管新生の阻害が有益な他の任意の疾患を有する、または腫瘍(悪性でも良性でも)、網膜症、乾癬、子宮内膜症、関節炎、もしくは血管新生の阻害が有益な他の任意の疾患を発症するリスクのある対象(または対象のある領域)における血管新生を阻害するための方法が本明細書において開示される。この方法は、この領域に(または全身に)治療的有効量の抗血管新生化合物(例えば、化合物1〜77のうちの1つ)を導入し、それによって対象における血管新生を阻害する工程を含む。
本実施例は、細胞ベースのHTS法を用いた抗血管新生性低分子の特定および最初の特徴付けについて述べる。
スクリーニングされた低分子ライブラリーはNCI Diversity Set I(dtp.nci.nih.gov/branches/dscb/diversity_explanation.htmlにおいてオンラインで入手可能)であった。このライブラリーはDTP/NCIから入手した(dtp.nci.nih.gov/においてオンラインで入手可能)。このライブラリーは、同じ数の構造ファミリーの代表メンバーである1974個の低分子(SM)を含有する。構造ファミリーはそれぞれ様々な数のメンバーを含有する。NCI Diversity Set Iに含まれるSMは、約72,000個のSMからなるライブラリーの中に見られる構造多様性の概要を示すように選択された。96ウェルプレートの中に入っているライブラリーを入手し、プレートごとのDMSO希釈液を200μMのストック濃度で調製した。
図2は、全てのHTSアッセイの基本的な実験デザインを示す。増殖アッセイおよび管形成アッセイの両方に同じスキームを適用した。底が透明な黒色96ウェルプレートにおいて全てのアッセイを行った。プレートは、常に、陰性対照の縦列(縦列1)、陽性対照の縦列(縦列12)、および80個の化合物を評価するための10個の縦列を含むように並べられた。HTSアッセイにおけるストリンジェンシーを高め、偽陽性を避けるために、1μMという低い最終濃度で全ての化合物を試験した。
以前に、本発明者らは、レポーター細胞株の蛍光発光と培養されているレポーター細胞株の数との間には直線的な相関関係があると証明した。要約すると、1,000個の細胞/ウェルを前記の96ウェルプレートに播種した。縦列2〜12には細胞を10%FBSの中に播種し、縦列1(陰性対照)には細胞を0%FBSの中に播種した。縦列2〜11には、低分子(プレート1個あたり80個)を最終濃度1μMで添加した(陽性対照および陰性対照を、試験化合物を含有するウェルの中で同じパーセントのDMSOに曝露した)。各ウェルが発する蛍光を、5〜7日間、24時間ごとに、分光光度計(Infinite M200, TECAN(登録商標), Mannedorf, Switzerland)によって測定した。アッセイの質は、プレートごとにZ'スコア(Zhang et al., J. Biomol. Screen 4(2):67-73, 1999)を計算することによって評価した(Z'>0.5のプレートのみを考慮した)。
要約すると、20,000個の細胞/ウェルを、予めゲル化したGELTREX(登録商標)ゲルマトリックス(Invitrogen, Carlsbad, CA)50μlの上に播種した。全ての細胞を10%FBSの中に播種した。縦列1の細胞(陰性対照)には、25μMのスラミン(suramine)(内皮管形成阻害剤と知られている抗血管新生因子)を曝露した。縦列2〜11には1μMの最終濃度の低分子(80個/プレート)を添加した(陽性対照および陰性対照は、試験化合物を含有するウェルの中で同じパーセントのDMSOに曝露した)。プレートを5〜7時間インキュベートし、モーター駆動ステージを備えた落射蛍光顕微鏡(Axiovert(登録商標)200M, Zeiss)およびAxio Vision(登録商標)(Zeiss)ソフトウェアの助けを借りて自動画像化した。Angio Application(登録商標)ソフトウェア(下記を参照されたい)を用いて画像を解析した。
増殖HTSおよび管形成HTSから得られたデータを、HTS Correctorソフトウェア(Makarenkov et al., Bioinformatics 23(11):1408-0409, 2007)を用いて処理した。データは、「ウェル補正(well correction)」(Makarenkov et al., Bioinformatics 23(13):1648-1657, 2007)を用いて基準化し、「平均二乗クラスター内距離の合計(sum of the average squared inside-cluster distances)」(Gagarin et al., J. Biomol. Screen 11(8):903-914, 2006)によるクラスタリングを用いてヒットが特定された。ヒット検出のために、偽陽性を避けるために厳格な閾値(σ3.5)が適用された。
図3は、PAE細胞を用いた増殖HTSに含まれた1個のプレート(4143-11)における結果を示す。プロットは、7日間にわたる96ウェル全ての蛍光発光を示す。予想したとおり、蛍光値は経時的に増加するが、様々なウェルが様々な蛍光値を示す。96ウェル全ての合成画像も示した(増殖4日目)。陽性対照を右端のウェル縦列に示した。予想したとおり、これらの対照は(プロットの中で)蛍光最大値を示し、ウェルの中で高い細胞密度を示した。陰性対照を左のウェル縦列に示した。これらはプロットの中で低い蛍光値を示し、ウェルの中で低い細胞密度を示した。さらに、PAE増殖をブロックする化合物の一例を1番目の横列、左から4番目の縦列に示した。蛍光値は低く、ウェルの中に細胞はほとんどなかった。さらに、PAE増殖を阻害しない化合物の一例を7番目の横列、4番目の縦列に示した。この場合、高い蛍光値がプロットの中に示され、ウェルの中に多数の細胞があった。
同じプロトコールに従って、PAE細胞、BEC細胞、A549細胞、およびMCF7細胞に対するHTS増殖実験を行った。これらの実験は、異なる解剖学的起源からの腫瘍細胞と比較して、内皮細胞における阻害活性を有するSMの特異性を探索するためにデザインされた。
図4に示したヒートマップでは、内皮細胞または腫瘍細胞の増殖を優先的に阻害するSMを区別することは難しい。この可能性を研究するために、内皮細胞および腫瘍細胞の平均増殖活性値を二変量散乱プロットにおいて比較した。SMのほとんどは、試験したどの細胞株にも増殖に影響を及ぼさず、散乱プロットの中心部に集まる(プロットの中心にある中間サイズの楕円の中に示される)。また、増殖阻害活性を有するほとんどのSMは腫瘍細胞および内皮細胞に対して似た効力で影響を及ぼし、左下の四分円に集まる(最も大きな楕円の中に示される)。興味深いことに、数個のSMが腫瘍細胞において増殖阻害活性を示し、内皮細胞において増殖阻害活性を示さなかった(小さな楕円;表10も参照されたい)。これらの低分子の増殖活性を横のプロットに示した(低分子はプレートの中の位置によって特定される;表10はプレート位置とNSC番号を互いに関係づけている)。内皮細胞に対して特異的な阻害活性をもつSMは発見されなかった。
PAE細胞を用いて関心対象のSM全てについて用量反応曲線を作成した。GraphPad Prism (GraphPad software, Inc.)を用いて、データを非直線シグモイド曲線にフィッティングした。このアッセイは、(1)関心対象のSMの生理活性の確認、(2)増殖阻害活性の用量反応の確認、および(3)最大半量阻害濃度(IC50)の計算を目的とした多目的実験としてデザインした。初回スクリーニングが1μMの最終SM濃度を用いて行われたので、ほとんどの化合物のIC50が10-12〜10-9Mの範囲内であると確かめられた(図6)。このことは、本プロジェクトにおいて発見された全てのSMが内皮細胞において高い増殖阻害効力を示すことを裏付けている(表10を参照されたい)。
HTS増殖アッセイにおいて得られた結果の評価からは、特定された生理活性化合物が細胞毒性によって増殖を阻害するかどうかに関する情報が得られない。細胞傷害性は、非ペプチド性低分子薬物に関連する一般的な問題である。関心対象のSMの細胞傷害能を探索するために、新規のハイスループット細胞傷害アッセイが以前に開発された(米国特許出願第12/060,752号;2009年4月2日にUS2009/0088341として公開された)。このアッセイは、細胞傷害性が細胞膜への損傷を伴い、細胞膜が損傷すると細胞質内容物が細胞環境に放出されるという事実に基づいている。本明細書において用いられたレポーター蛍光細胞は、細胞質に存在する蛍光タンパク質を構成的に合成するので、培地への蛍光の遊離は細胞傷害性の評価として使用することができる。
抗血管新生化合物を評価するためにHTS管形成アッセイも使用した。内皮細胞を播種した後に、マトリゲル上に均一に分布させる。だんだんと細胞は遊走し、他の内皮細胞と相互作用して、インビボの脈管構造によく似た管様構造を形成する。管形成は、血管新生プロセスのいくつかの重要な段階:内皮細胞活性化、細胞遊走、マトリックス分解、細胞分極、細胞間相互作用、および(特に)管形成を再現する。
管形成アッセイのHTS形式への適合において遭遇する主な障害は、管形成の形態学的定量分析の実施である。このために、AngioApplication(商標)と呼ばれる画像分析プログラムを開発した(米国特許出願第12/060,752号において詳述され;2009年4月2日にUS2009/0088341として公開された)。このソフトウェア(図9)は、管の長さ、結節の面積、分岐点、フラクタル次元、および空隙性を含む(が、これに限定されない)管形成画像にある様々な測定項目を迅速に評価することができる。
全ての管形成阻害剤SMについてIC50を計算した。予想したとおり、ほとんどのIC50は10-9〜10-12Mの範囲にあるので、これらの化合物は極めて効果的な管形成阻害剤であった。図12は、化合物NSC119889を用いて作成した用量反応の一例を示す。
図13は、内皮細胞の増殖HTSおよび管形成HTSにおいて得られた結果をまとめたものである(特定の化合物に関する情報については、表10を参照されたい)。化合物の2.4%(48)は増殖阻害剤であり、1.75%(35)は管形成阻害剤であった。興味深いことに、化合物の0.5%(11)が増殖阻害活性および管形成阻害活性を両方とも示した。これらのSMはネットワーク薬理学の目から見ると特に興味深い。非常に選択性の高い化合物は多標的薬物と比較して、望ましい臨床的有効性より低い臨床的有効性を示すことがあることが示唆されている(Hopkins, Nat. Chem. Biol. 4(11):682-690, 2008)。しかしながら、薬物のような特性を維持しながら多標的薬物をデザインすることは難しい。ここでは、本発明者らは、増殖阻害活性および管形成阻害活性を両方とも示す11個のSMを特定した(表10を参照されたい)。
本明細書において特定された抗血管新生性SMの構造を、アノテートされた利用可能なSMデータベース、例えば、特に、PubChem、DrugBank、LeadScope、およびFDA Marketed Drugsの中にあるアノテートされた化合物と比較した。LeadScopeソフトウェアを用いて構造分類を行った。本発明者らのSMのうちごくわずかしか、他のデータベースの中にあるアノテートされた化合物と構造上関連しなかった(図14の括弧の中にある数字)。これは、本プロジェクトにおいて用いられた新規の創薬法によって説明することができ、予想したとおり、新規のSARが発見された。本明細書において発見された抗血管新生性SMはどれも公知の抗血管新生性SMと構造上関連しないことは特に興味深い。これは、これらの新たに発見された抗血管新生性SMの新規性を裏付けており、新たなSARによって新たな細胞抗血管新生経路が活用されることを強調している。
生理活性
1 内皮細胞増殖阻害剤
2 管形成阻害剤
3 増殖阻害剤+管形成阻害剤
4 特異的な腫瘍細胞増殖阻害剤
****増殖阻害活性と管形成阻害活性を有し、有意な細胞傷害性の無い化合物
本実施例は、本明細書に記載の選択された低分子の投与による、腫瘍異種移植片における血管新生のインビボ阻害を示す。
マウス異種移植片を作製するために、雌無胸腺ヌードマウスの左後半身に、5x106個のA549細胞またはSK-ML-1細胞(100μl/マウス)を注射した。結果として生じた腫瘍を週3回測定し、体重を週2回測定した。腫瘍細胞を注射した14日後に、腫瘍量が100mm3より大きいマウスまたは50mm3より小さいマウスを研究から除いた。残りのマウスを無作為化して群(10匹の動物/群)に分け、100μlの10μM滅菌薬物溶液(4℃で保管)を用いて4週間にわたって週3回(月曜日/水曜日/金曜日)処置した。滅菌薬物溶液はIP注射を介して投与した。さらに4週間にわたって週3回(月曜日/水曜日/金曜日)腫瘍を測定し、さらに4週間にわたってマウスの体重を週2回(火曜日/木曜日)測定した。6週目または腫瘍が2cmを超えた時に、マウスを安楽死させた。全身剖検を行い、異常組織を瞬間凍結した(-80℃)。腫瘍を摘出し、4つの部分に分けた。2つの部分を2%ホルマリンに入れて4℃で一晩固定し、冷PBSでリンスし、パラフィン包埋のために調製した。他の2つの部分をドライアイスまたは液体窒素で瞬間凍結し、-80℃で保管した。
インビボ異種移植片実験のために前記の77個のSMのうち7個を選択した。SMは、阻害のタイプ(管形成-NSC19630、NSC292222、NSC259969;または管形成+増殖-NSC122657、NSC150117、NSC48300、NSC292596)、阻害パーセント、低い細胞傷害性レベル、および入手可能性に基づいて選択した。腫瘍異種移植片のために、2種類の異なるヒト癌モデルを選択した。A549は、皮下腫瘍において、ほとんど腫瘍周囲脈管構造だけを誘導する肺癌腫である。対照的に、SK-ML-1は、高レベルの腫瘍内血管新生を誘導する平滑筋肉腫である。全ての実験に負の対照PBSならびに陽性対照として公知の抗血管新生薬AVASTIN(登録商標)を含めた。AVASTIN(登録商標)は、A549ならびにSK-ML-1の両方の増殖を有意に阻害することが以前に示された。
多くの公知の抗血管新生薬はチューブリンに結合し、その重合を妨害する。同様に、チューブリン重合を妨害する分子は潜在的に抗血管新生性であることも示されている。対照的に、前記のSAR分析から、実施例2において異種移植片アッセイにおいて抗血管新生性であることが示された7つの低分子はどれもチューブリン重合を阻害しないと予測された。本実施例はこの予測を裏付けている。
現在、FDAによって認可されている抗血管新生療法のほとんど(例えば、AVASTIN(登録商標)またはスニチニブ)は受容体型チロシンキナーゼ(RTK)活性を標的とする。最近、独立したグループ(Paez-Ribes et al., Cancer Cell, 15: 220-231, 2009; Ebos et al., Cancer Cell, 15: 232-239, 2009)によって、RTK阻害剤は、転移刺激および薬物により阻害される血管新生経路以外の別の血管新生経路を含む二次的な有害作用を有することが提案されている。本実施例は、本明細書に記載の低分子のサブセットのRTK阻害活性の特徴付けを示す。
本実施例は、血管新生経路にある遺伝子の発現に対する本明細書に記載の抗血管新生性低分子の作用を示す。
遺伝子発現研究のために、試験した各SMについて3回の独立した実験を行った。90,000個の細胞/ウェル(6個のウェル/処理)の皮膚微小血管内皮細胞(Lonza, Walkersville, MD)を、24ウェルプレートの中にある、重合させたGELTREX(登録商標)ゲルマトリックス(Invitrogen, Carlsbad, CA)の上に播種した。直ぐに、ウェルを等量の1μM SMまたはPBSで処理した。37℃および5%CO2で24時間のインキュベーション後に、Cell Recovery Solution(BD Biosciences, San Jose, CA, カタログ番号354253)を用いて細胞を抽出した。総RNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, カタログ番号74104)を用いて抽出し、SUPERSCRIPT(登録商標)First-Strand逆転写酵素(Invitrogen, Carlsbad, CA, カタログ番号11904-018)を用いて逆転写した。Opticon 2サイクラー(MJ Research, Waltham, MA)においてリアルタイムPCR反応を行った。増幅は、2μlのcDNA(逆転写反応からの1:10希釈液)ならびに2μlのプライマー混合物(それぞれ10μMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー)を含有する最終体積25μlにおいて行った。試料を以下の通り増幅した。95℃2分の初回変性の後に、95℃30秒、60℃30秒、および72℃45秒で46サイクルの反応を行った。サイクルごとに蛍光を測定し、PCR後に、50〜96℃まで(0.5℃刻み)温度を上昇させることによって融解曲線を作成した。全てのアンプリコンについて規定されたシングルピークが得られ、従って、増幅の特異性が確かめられた。
実施例2において示されたインビボ研究において使用した7つの低分子の作用機序をさらによく理解するために、管形成中の初代内皮細胞における血管新生遺伝子発現に対する、これらの分子の作用を研究した。モニタリングする遺伝子は、血管新生プロセスとの関連性に基づいて選択した。リアルタイムPCRにおいてアッセイした遺伝子および使用したプライマーを表12および表13に示した。全ての実験を3回繰り返して行った。結果を図17のボルケイノプロットに示した。X軸にLog2変化倍率を示し、Y軸にはlog10 P値を示した。これらの結果を下記の表14にもまとめた。
腫瘍が抗血管新生療法に対して耐性になることは周知である(Bergers and Hanahan, Nature Reviews: Cancer, 8:592-603, 2008)。腫瘍血管新生には複数の経路が関与する。現行の抗血管新生薬(例えば、AVASTIN(登録商標))はある経路をうまく阻害した後に、腫瘍内の血管新生プロセスを再開する別の経路が活性化される。薬物耐性をさらにうまく避けるために、複数の血管新生経路を阻害する多標的戦略が期待される。
Claims (15)
- プロパン酸(2,5−ジオキソピロール−1−イル)メチル(NSC19630)、またはその薬学的に許容される塩を含む、血管新生依存性疾患を治療するための、薬学的組成物であって、前記血管新生依存性疾患が、網膜症、または子宮内膜症である前記薬学的組成物。
- [4−[(4−アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
- 局部投与されるか、静脈内投与されるか、経口投与されるか、非経口投与されるか、または移植片として投与されるように用いられる、請求項1または2記載の薬学的組成物。
- 追加の血管新生阻害剤をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- プロパン酸(2,5−ジオキソピロール−1−イル)メチル(NSC19630)、またはその薬学的に許容される塩を含む、異常な血管新生を阻害することにより網膜症または子宮内膜症を治療するための、薬学的組成物。
- [4−[(4−アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、請求項5記載の薬学的組成物。
- プロパン酸(2,5−ジオキソピロール−1−イル)メチル(NSC19630)、またはその薬学的に許容される塩を含む、対象における望ましくない血管新生を阻害することにより網膜症または子宮内膜症を治療するための、薬学的組成物。
- [4−[(4−アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、請求項7記載の薬学的組成物。
- 追加の血管新生阻害剤をさらに含む、請求項7または8記載の薬学的組成物。
- 追加の血管新生阻害剤が、bFGF阻害剤、FGF阻害剤、またはVEGF阻害剤である、請求項9記載の薬学的組成物。
- プロパン酸(2,5−ジオキソピロール−1−イル)メチル(NSC19630)、またはその薬学的に許容される塩を含む、新たな血管の形成が望まれない対象の網膜、または子宮内膜組織における血管新生を阻害することにより網膜症または子宮内膜症を治療するための薬学的組成物であって、
組織または標的領域に直接的または間接的に導入するように用いられ、それによって、組織または標的領域における血管新生を阻害する、薬学的組成物。 - [4−[(4−アルソノフェニル)メチル]フェニル]アルソン酸(NSC48300)またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、請求項11記載の薬学的組成物。
- プロパン酸(2,5−ジオキソピロール−1−イル)メチル(NSC19630)、またはその薬学的に許容される塩を含む、血管新生依存性疾患を治療するための薬学的組成物であって、
血管新生依存性疾患が、関節炎または乾癬である、薬学的組成物。 - プロパン酸(2,5−ジオキソピロール−1−イル)メチル(NSC19630)、またはその薬学的に許容される塩を含む、新たな血管の形成が望まれない対象の組織または標的領域における血管新生を阻害するための薬学的組成物であって、
組織または標的領域に直接的または間接的に導入するように用いられ、それによって、組織または標的領域における血管新生が阻害され、該組織または標的領域が皮膚または関節である、薬学的組成物。 - 対象が、関節炎または乾癬を有する、請求項14記載の薬学的組成物。
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