CN104540849A - 新的干扰素λ4(IFNL4)蛋白、相关核酸分子、及其用途 - Google Patents

新的干扰素λ4(IFNL4)蛋白、相关核酸分子、及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种干扰素类似物(IFNL4)蛋白的鉴定以及与自发清除丙型肝炎病毒(HCV)感染和响应HCV感染的治疗的遗传相关性。

Description

新的干扰素λ4(IFNL4)蛋白、相关核酸分子、及其用途
技术背景
本发明涉及一种新的人类干扰素的鉴定，其指定为干扰素λ4(IFNL4)，及使用其mRNA、蛋白质表达或蛋白质活性而预测个体中HCV感染的临床结局的方法。其还涉及新的蛋白用于鉴定新的用于治疗HCV感染的化合物的用途。
发明背景
丙型肝炎病毒(HCV)是黄病毒科(Flaviviridae)病毒家族中的一种单链RNA病毒。据估计全世界约1.7亿人，美国有至少4百万人，感染了HCV(Thomas DL,Astemborski J,Rai RM,Anania FA,Schaeffer M,Galai N,Nolt K,Nelson KE,Strathdee SA,Johnson L,Laeyendecker O,Boitnott J,Wilson LE,Vlahov D.,The Natural History of Hepatitus C Virus Infection.JAMA 2000；284(4):450-456)。在美国，死于HCV的人比死于HIV感染的人更多(Ly,K.,Xing J,Klevens RM,Jiles RB,Ward JW,Holmberg SD.The Increasing Burden ofMortality From Viral Hepatitis in the United States Between 1999and 2007.Annals of Internal Medicine 156,271-278(2012)。这样，HCV的感染代表了一个重大的全世界健康问题。
在多数人中，HCV的急性感染通常导致轻微的症状如疲劳、食欲下降、以及流行性感冒样症状。按照惯例，急性肝炎指肝炎的临床征候或症状在推测的接触时间之后存在了6个月或更短的时期。然而在某些情况下，新感染的个体保持无症状。尽管一些个体能够自发清除病毒，约85％的HCV感染者会患上慢性丙型肝炎，其定义为首次接触后至少6个月发生的持久的病毒血症(Blackard JT,Shata MT,Shire NJ,Sherman KE.,Acute Hepatitus C VirusInfection:A Chronic Problem.,Hepatology 2008；47(1):321-331)。HCV慢性感染是肝癌和晚期肝病的主要原因。其也是美国肝移植最常见的原因。目前，对HCV感染的标准治疗是聚乙二醇化干扰素(IFN-α)联合利巴韦林(ribavirin)。成功的治疗解决慢性HCV感染，由此显著地减少了HCV相关的发病率和死亡率，但乙二醇化干扰素/利巴韦林疗法在低于45％的患者中有效，昂贵且有许多不良反应。更新近地，包含聚乙二醇化干扰素α(pegylated-IFN-α)、利巴韦林、和HCV蛋白酶抑制剂的三联疗法被推荐。虽然这种新疗法应该比用乙二醇化干扰素/利巴韦林的治疗更有效，但相当大比例的患者可能没有响应，并且以这种疗法治疗的患者会经历乙二醇化干扰素/利巴韦林疗法所见的不良反应。因此，鉴定对基于干扰素疗法的治疗不太可能响应的患者的方法是迫切需要的，以使这些患者能免于与无效治疗相关的花费及不良反应。此外，一些患者没有响应治疗表明了需要新的对丙型肝炎感染的治疗。
越来越多的证据表明，宿主的遗传因素对慢性HCV感染的自然病程和对治疗的响应都有影响(Lauer G M,Walker B D.Hepatitis C virus infection.NEngl J Med 2001Jul.5；345(1):41-52；Manns M P,McHutchison J G,Gordon SC,Rustgi V K,Shiffman M,Reindollar R等.Peginterferon alfa-2b plus ribavirincompared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronichepatitis C:a randomised trial.Lancet 2001Sep.22；358(9286):958-965；FriedM W,Shiffman M L,Reddy K R,Smith C,Marinos G,Goncales F L,Jr等.Peginterferonα-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection.N Engl JMed 2002Sep.26；347(13):975-982；Kau A,Vermehren J,Sarrazin C.Treatmentpredictors of a sustained virologic response in hepatitis B and C.J Hepatol 2008October；49(4):634-651)。例如，在相似条件下从以单株HCV污染的免疫球蛋白制备物受到感染的两个孕妇群体中，一半自发清除了感染而一半进展到慢性丙型肝炎(Grakoui A,Shoukry N H,Woollard D J,Han J H,Hanson H L,Ghrayeb J等.HCV persistence and immune evasion in the absence of memory Tcell help.Science 2003Oct.24；302(5645):659-662；Knapp S,Yee L J,FrodshamA J,Hennig B J,Hellier S,Zhang等.Polymorphisms in interferon-induced genesand the outcome of hepatitis C virus infection:roles of MxA,OAS-l and PKR.Genes Immun 2003September；4(6):411-419)。在慢性感染的患者中，即使在具有相似HCV-RNA水平和相同基因型的病例之间，对于治疗的响应也是不同的(Thio C L.Host genetic factors and antiviral immune responses to hepatitisC virus.Clin Liver Dis 2008August；12(3):713-26,xi.；Yee L J.Host geneticdeterminants in hepatitis C virus infection.Genes Immun 2004June；5(4):237-245；Muller R.The natural history of hepatitis C:clinical experiences.JHepatol 1996；24(2Suppl):52-54)。响应率与种族有很强的关系(Conjeevaram,H.S.等.Peginterferon and ribavirin treatment in African American and CaucasianAmerican patients with hepatitis C genotype 1.Gastroenterology,131:470-7(2006))。此前的报道揭示了干扰素刺激基因以及人类白细胞抗原(HLA)(Sheppard,P.等.IL-28,IL-29and their class II cytokine receptor IL-28R.NatImmunol 4,63-8(2003)；Robek,M.D.,Boyd,B.S.&Chisari,F.V.Lambdainterferon inhibits hepatitis B and C virus replication.J.Virol.79,3851-3854(2005))、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-like receptors,KIRs)(Lauterbach,H等.Mouse CD8alpha+DCs and human BDCA3+DCs aremajor producers of IFN-lambda in response to Poly I:C.J Exp Med 207,2703-17)、细胞因子(WO 00/08215)、趋化因子和白细胞介素的遗传多态性对HCV感染结局的影响(Lasfar,A.等.Characterization of the mouse IFN-lambdaligand-receptor system:IFN-lambdas exhibit antitumor activity against B16melanoma.Cancer Res 66,4468-77(2006)；Phillips,J.E.&Corces,V.G.CTCF:master weaver of the genome.Cell 137,1194-211(2009)；Shyu,A.B.,Wilkinson,M.F.&van Hoof,A.Messenger RNA regulation:to translate or to degrade.EMBO J 27,471-81(2008)；Conjeevaram,H.S.等.Peginterferon and ribavirintreatment in African American and Caucasian American patients with hepatitis Cgenotype 1.Gastroenterology 131,470-7(2006)；Ghany,M.,Nelson,D.R.,Strader,D.B.,Thomas,D.L.&Seeff,L.B.An update on treatment of genotype 1chronic hepatitis c virus infection:2011practice guidelines by the Americanassociation for the Study of Liver Diseases.Hepatology,Dec 12(doi:10.1002/hep.25524)(2011))。
此前的研究已使用了基于基因在HCV感染中的潜在作用的现有知识的候选基因法。然而，此前的数据不允许精确预测自发清除或对治疗的响应(Robek,M.D.,Boyd,B.S.&Chisari,F.V.Lambda interferon inhibits hepatitis Band C virus replication.J.Virol.79,3851-3854(2005))。2009年，一些团体报道了来自独立的全基因组相关性研究(genome-wide association studies,GWAS)的结果，其鉴定了IFNL3(IL28B)基因区中的单核苷酸多态性(SNPs)，所述单核苷酸多态性与患有慢性丙型肝炎的患者中聚乙二醇化IFN-α/利巴韦林治疗以及HCV感染的自发清除相关。例如，Bochud等的美国专利公布No.2011/0165124(通过提述以其整体并入本文)，公开了许多与基于干扰素的HCV治疗及自发清除相关的SNPs。在这些GWAS中鉴定的SNPs里，基于rs12979860的基因型目前被接受为自发清除和治疗响应的最佳预测物(Rauch,A.等.Genetic variation in IL28B Is associated with chronic hepatitis C andtreatment failure:a genome-wide association study.Gastroenterology 138,1338-1345(2010)；Thomas,D.L.等.Genetic variation in IL28B and spontaneousclearance of hepatitis C virus.Nature 461,798-801(2009)；Ge,D.等Geneticvariation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance.Nature461,399-401(2009)；Suppiah,V.等.IL28B is associated with response tochronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy.Nat Genet 41,1100-4(2009)；Tanaka,Y.等.Genome-wide association of IL28B with response topegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C.NatGenet 41,1105-9(2009))。单核苷酸多态性(SNP)rs12979860位于IFNL3(IL28B)翻译起始位点上游约3kb处。基于rs12979860的商业性实验室测试目前可用于预测患者对治疗响应的概率。
与欧洲祖先的人相比，非裔美国患者慢性丙型肝炎频率更高且对IFN-α/利巴韦林治疗的响应更差。GWAS标记物rs12979860的频率中的种族差异没有完全解释这些不一致。对在所有群体组中具有最佳的预测值的遗传标记物的鉴定会改善慢性丙型肝炎治疗的临床决策模型并有助于将个体化药品递送于所有HCV感染的患者。
尽管已证明当前的测试在对慢性HCV感染的治疗的响应物的鉴定中是有用的，对更加强力且精确预测自发清除和对治疗响应的测试的需求依然存留。此外，当前的测试需要从个体分离核酸分子并对其进行基因分型。最后，如上所示，存留有一定百分比的群体对用当前治疗法的慢性HCV感染治疗没有响应。因而，对这些病人存在新的方法和治疗的需求。本发明满足了这些需求并且还提供了其他益处。
发明概要
所述发明涉及对一种新的人类蛋白干扰素λ4(IFNL4)的鉴定，和相关核酸分子(例如DNA、mRNA)，以及它们与自发清除HCV感染和对HCV感染的治疗的响应的关系。
在一个实施方案中，所述发明提供了包含连续氨基酸的分离蛋白，所述连续氨基酸来自选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:8。在具体的实施方案中，所述分离蛋白激活JAK/STAT信号转导途径。在具体的实施方案中，所述分离蛋白包含至少约30、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约110、至少约140个连续氨基酸，所述连续氨基酸来自选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含至少50个连续氨基酸的序列，其中所述至少50个连续氨基酸的序列在其全长上与至少50个连续氨基酸序列至少92％相同，所述连续氨基酸序列来自选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含至少150个连续氨基酸的序列，所述序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2的至少150个连续氨基酸序列至少92％相同。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含至少50个连续氨基酸的序列，其中所述至少50个连续氨基酸序列在其全长上与来自选自由SEQ ID NO:2组成的组的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸序列至少92％相同，并进一步包含至少一个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置51的位置处的谷氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置62的位置处的半胱氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置76的位置处的半胱氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置87的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
z.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
aa.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
bb.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
cc.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在其全长上与选自下组的氨基酸序列至少92％相同：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8，其中所述分离蛋白包含至少一个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含在其全长上与SEQ ID NO:2至少92％相同的氨基酸序列，其中所述分离蛋白包含至少一个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置51的位置处的谷氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置62的位置处的半胱氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置76的位置处的半胱氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置87的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
z.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
aa.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
bb.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
cc.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述蛋白具有至少一个选自下组的活性：引发选择性结合由SEQ ID NO:2组成的蛋白的抗体、选择性结合针对由SEQ ID NO:2组成的蛋白而产生的抗体、选择性结合与结合于由SEQ ID NO:2组成的蛋白的化合物、激活JAK/STAT途径的表达、和诱导图15中列出的至少1个ISG(immune serum globulin,免疫血清球蛋白)的表达。
在一个实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，其包含选自编码本发明的分离蛋白的核酸序列的核酸序列，和与其完全互补的核酸序列。在一些实施方案中所述核酸分子包含选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,和SEQ ID NO:9。本发明的一个实施方案提供含有本发明的分离核酸分子的质粒。类似地，所述发明的另一个实施方案提供含有本发明的分离核酸分子的病毒。
所述发明的一个实施方案是选择性结合到所述发明的IFNL4蛋白的分离抗体。所述发明的另一个实施方案提供分离的抗体，所述分离抗体抑制选择性结合到所述发明的IFNL4蛋白的抗体的结合。
本发明的一个实施方案是用于通过如下预测个体自发清除HCV感染的可能性的方法：从个体获得生物样品，并分析样品以确定本发明的IFNL4蛋白或mRNA存在或缺乏。在这个方法中，缺乏IFNL4mRNA或IFNL4蛋白表明个体自发清除HCV感染的可能性增加。在这个方法中，存在IFNL4蛋白或mRNA表明个体自发清除HCV感染的可能性减少。
本发明的一个实施方案是用于通过如下预测个体响应于HCV感染治疗的可能性的方法：从个体获得生物样品并分析样品以确定本发明的IFNL4蛋白或mRNA存在或缺乏。在这个方法中，缺乏本发明的IFNL4mRNA或IFNL4蛋白表明个体响应于HCV感染治疗的可能性增加。或者，在这个方法中存在IFNL4mRNA或IFNL4蛋白表明个体响应于HCV感染治疗的可能性减少。在一个实施方案中，存在IFNL4蛋白表明预测个体不能响应于HCV感染的治疗。
本发明的一个实施方案是用于通过如下预测个体自发清除HCV感染的可能性的方法：从个体获得生物样品并确定样品中存在的IFNL4mRNA或IFNL4蛋白的水平，如果有的话。在这个实施方案中，样品中存在的IFNL4mRNA或IFNL4蛋白的水平表明了个体自发清除HCV感染的可能性。在这个方法中，样品中IFNL4mRNA或IFNL4的水平低于已知能清除HCV感染的受试者中存在的IFNL4mRNA或IFNL4蛋白的水平表明预测个体能清除HCV感染。在这个方法中，样品中IFNL4mRNA或IFNL4的水平高于已知不能清除HCV感染的受试者中存在的IFNL4mRNA或IFNL4蛋白的水平表明预测个体不能清除HCV感染。
本发明的一个实施方案是用于通过如下治疗罹患慢性丙型肝炎病毒感染的患者的方法：从个体获得生物样品，并分析样品以确定样品中本发明的IFNL4mRNA或IFNL4蛋白存在、缺乏或其水平，并在样品中IFNL4mRNA或IFNL4蛋白的存在、缺乏或其量的基础上确定是否施用治疗。
本发明的一个实施方案是对确定样品中IFNL4蛋白存在、缺乏或其水平有用的试剂盒。所述试剂盒包含特异性识别本发明的IFNL4蛋白的抗体。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于确定个体自发清除HCV感染的能力的说明书(instructions)。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于确定个体应答对于HCV感染的治疗的能力的说明书。
在一个实施方案中，本发明提供了变体IFNL4多肽，其与选自下组的蛋白质具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性：IFNL4-p179,p131和p107(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8)，其中所述变体多肽具有至少1个氨基酸取代，使用SEQ ID NO:2的编号系统，所述氨基酸取代选自下组：A10P,A11P,L13M,V15F,C17Y,V19M,I20V,A21P,R26G,L28M,L35M,L40M,G116R,A121P,A126P,P128A,G129A,S130P,R132G,P135A,K139R,R140G,K143E,R146K,S149P,P150A,K154E,A155P,S156G,V158I,F159V,L162M,L164M,和L169F。
在一个实施方案中，本发明提供变体IFNL4多肽，所述变体IFNL4多肽与选自下组的蛋白质具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性：IFNL4p179,p131和p107(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8)，其中所述变体多肽具有至少1个氨基酸取代，使用SEQ ID NO:2的编号系统，所述氨基酸取代选自下组：A10P,A11P,L13M,V15F,C17Y,V19M,I20V,A21P,R26G,L28M,L35M,L40M,E52K,L55M,W57R,R60P,N61H,S63P,F64V,R65G,D69H,P70S,P71T,R72G,G116R,A121P,A126P,P128A,G129A,S130P,R132G,P135A,K139R,R140G,K143E,R146K,S149P,P150A,K154E,A155P,S156G,V158I,F159V,L162M,L164M,和L169F。
在一个实施方案中，本发明提供变体IFNL4多肽，所述变体IFNL4多肽与选自下组的蛋白质具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性：IFNL4-p179,p131和p107(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8)，其中所述变体多肽具有至少1个氨基酸取代，使用SEQ ID NO:2的编号系统，所述氨基酸取代选自下组：A10P,A11P,L13M,V15F,C17Y,V19M,I20V,A21P,R26G,L28M,L35M,L40M,E52K,L55M,W57R,R60P,N61H,S63P,F64V,R65G,D69H,P70S,P71T,R72G,R78G,V92M,L93I,L101M,L102F,G116R,A121P,A126P,P128A,G129A,S130P,R132G,P135A,K139R,R140G,K143E,R146K,S149P,P150A,K154E,A155P,S156G,V158I,F159V,L162M,L164M,和L169F。
附图简述
图1：用50μg/ml的PolyI:C激活0、1、2、4、8或24小时的正常人类原代肝细胞中的RNA-测序(RAN-seq)结果。结果呈示了人类19号染色体150Kb基因组区，其含有IFNL1(IL29)、IFNL2(IL28A)、IFNL3(IL28B)和一些其他用作无关对照的基因。相关的遗传变体rs12979860和rs8099917的位置已指出。
图2：通过RNA-seq鉴定编码干扰素-λ4蛋白的新的IFNL4基因，所述基因位于IFNL3(IL28B)基因上游。RNA-seq显示了PolyI:C处理的人类原代肝细胞中新的转录区和IFNL3(IL28B)的时间依赖性激活。
图3：10个新转录物(NCBI登录号在图4中呈示)的剪接体系结构。GWAS标记物rs12979860定位在内含子1内，而有TT或ΔG等位基因的新标记物ss469415590定位于外显子1内并且是所有转录物共有的。翻译起始位点通过箭头标记；ORFs(open reading frames,开读框)加蓝色阴影；aa,氨基酸。IFNL4特异性蛋白编码框由ss469415590的ΔG缺失等位基因在IFNL4mRNA转录物的第一个外显子中生成。107、131或179个氨基酸的IFNL4蛋白同种型(isoforms)由具有3、4或5外显子的转录物生成。
图4：IFNL4区内鉴定并提交至NCBI Genbank的转录物的信息。
图5：人类肝细胞样品中全长IFNL4同种型的mRNA表达，其对于遗传变体ss469415590的ΔG或TT等位基因是纯合的，并且用PolyI:C激活0、2、4和24小时。缺失(ΔG)等位基因引进了移码，所述移码生成107、131或179个氨基酸的蛋白。插入(TT)等位基因生成了一些过早终止的转录物，其可能通过无义介导的降解(nonsense-mediated decay)而被降解。引物检测IFNL4的全长扩增子，包括起始和终止密码子。同样显示的是IFNL3(IL28B)和IFNL1(IL29)转录物，其在有两种基因型的样品中通过PolyI:C处理而被诱导。在相同样品中内源性对照PPIA的表达被用作加载对照(loading control)。所有样品用DNAse I处理并且信号应当仅对RNA表达特异。
图6：IFNL4-p179蛋白和2类细胞因子家族(class-2cytokine family)的选择的成员之间的比较。
图7：IFNL4蛋白同种型p179、p131和p107、以及人IFNL1(IL29)、IFNL2(IL28A)、IFNL3(IL28B)和IFN-α蛋白的氨基酸序列比对。加阴影—相同氨基酸；IFNL3(IL28B)蛋白(C16-C115,C50-C148,C167-C174)中涉及二硫键的半胱氨酸的位置通过箭头标记；移码变体ss469415590、对于与IL-28R1(#27,33,34,36,37,44,53,155,158)及与IL-10R2(*97,*100)的相互作用重要的氨基酸已指示；编号是基于去除前导肽后成熟的IFNL3(IL28B)蛋白(Q8IZI9)(Gad H,Dellgren,C等.Inteferon-λis functionally an interferon but structurally related tothe interleukin-10family,the Journal of Biological Chemistry,2009)。螺旋形蛋白结构根据Trivella等.Structure and function of interleukin-22and othermembers of the interleukin-10family,Cell.Mol.Life Sci.,2010而标记。同样指示的为IFNL4遗传变体的位置。
图8：通过小鼠抗-IFNL4单克隆抗体的Western印迹蛋白检测。所用蛋白：4种浓度的纯化重组体IFNL4-p179、来自用IFNL4-p179–Halo表达构建体瞬时转染的HepG2细胞的原始裂解物或条件培养基、以及纯化的IFNL4-p107、IFN-α和IFNL3(IL28B)蛋白。
图9：用抗-IFNL4小鼠单克隆抗体或用IFNL4-Halo表达构建体瞬时转染的HepG2细胞中的抗-Halo抗体的IFNL4表达的共聚焦成像；两种抗体都类似地检测IFNL4的细胞内表达。
原代人类肝细胞(PHH)里内源性表达的IFNL4的共聚焦成像，所述PHH来自对于ss469415590杂合的个体，所述IFNL4表达是通过用PolyI:C的治疗或HCV的体外(in-vitro)感染诱导的。
图10：来自ss469415590的不同基因型(TT/TT,TT/ΔG或ΔG/ΔG)的携带体(carriers)的PHHs中的共聚焦成像，其用50μg/ml的PolyI:C处理0、2、4、8或24小时。红色，IFNL4；绿色，细胞骨架(α-微管蛋白)，蓝色，核。细胞内IFNL4表达仅在来自风险基因型(TT/ΔG或ΔG/ΔG)的携带体的PHH中检测到。
图11：小鼠和兔抗-IFNL4单克隆抗体概览：对应的表达构建体在HepG2细胞中瞬时转染后的不同蛋白同种型的检测样式和蛋白内定位。
图12：使用荧光素酶报告构建体的途径发现分析(Pathway FinderAnalysis)，表示HepG2细胞中45个人信号传导途径。所述细胞用表达构建体或空载体进行瞬时转染，或用10ng/ml的重组体纯化的IFN-α、IFNL3、IFNL4或用PBS处理。所有结果表示两种独立生物转染和/或处理复制体的平均值。误差线，标准偏差(s.d.)。矩形标记用IFN-α、IFNL3处理和用IFNL4构建体瞬时转染显著诱导的报告基因/蛋白(reporter)(ISRE-Luc和IRF3-Luc)。
图13：在用ISRE-Luc报告基因/蛋白瞬时转染的HepG2细胞系中用表达IFNL4,p131或p107的构建体转染和用重组纯化的IFN-α或IFNL3处理后的荧光素酶活性。结果标准化至用空载体(模拟物)转染后所见的活性，并代表8个生物复制体的平均值。在稳定表达ISRE-Luc报告基因/蛋白的HepG2细胞系中在用表达IFNL4、p131或p107的构建体瞬时转染后的荧光素酶活性。结果标准化至用空载体(模拟物)转染后所见的活性，并代表11个生物复制体的平均值。对瞬时转染入稳定表达亚基因组的荧光素酶-表达HCV复制子(HCV-Luc)的Huh7-Lunet细胞的IFNL4、p131和p107表达构建体的抗病毒效果的测试，与用空载体(模拟物)转染后所见的效果相比。结果代表4个生物复制体的平均值。误差线，标准测量误差(s.e.m)。
图14：在Tyr701处磷酸化的STAT1(pSTAT1)和在Tyr689磷酸化的STAT2(pSTAT2)在HepG2细胞中的Western印迹分析，所述在HepG2细胞用表达6个蛋白同种型的构建体(包括IFNL4-p179-Halo)瞬时转染。所有构建体与Halo标签融合，并产生可用Halo-标签的抗体检测的蛋白质；针对IFNL4的兔单克隆抗体识别p179以及非功能的同种型p131和p107。
图15：HepG2细胞中由IFNL4构建体的瞬时过表达激活的个体转录物和最经典途径的分析，所述分析基于全局RNA-seq分析(global RNA-seq analysis)。
HepG2细胞中选择的ISGs在不同条件下的表达在未处理或用空载体(模拟物)转染的细胞中进行分析；IFNL4-p179、IFNL4-p131或IFNL4-p107；或用10ng/ml的IFN-α或IFNL3(IL28B)单独处理或在用模拟物或IFNL4-p179转染后处理。用特异的测定法通过qRT-PCR对ISGs的表达进行分析，并将所述表达标准化至同样品中测量的4个内源性对照的表达水平。数据以log2标度呈示—较低的负值指示较高的表达。误差线指示有95％置信区间的平均值。
图16：用ISRE-Luc Cignal报告基因/蛋白瞬时转染入HepG2、293T和HeLa细胞测试JAK/STAT途径的激活。通过瞬时共转染IFNL4-p179、p107和p131表达构建体或通过指示浓度的重组纯化的IFN-α和IFNL3(IL28B)蛋白来激活。倍数响应是用于与模拟物对照(用空载体转染的)的比较。误差线表明了4-8个独立生物复制体的有95％置信区间的平均值。
图17：IFNL4的83个定位突变体的分析。将IFNL4的蛋白序列与IFNL3比对且将保守氨基酸加阴影；IFNL4在特定位置的单点突变以氨基酸数目(序列上方)及变化类型(序列下方)标记。生物活性定义为激活JAK/STAT途径的能力，所述能力测量为在HepG2细胞中对瞬时转染的ISRE-Luc Cignal报告基因/蛋白构建体的诱导，其对于每个构建体是用4个生物复制体。所有突变体的结果均标准化至WT-IFNL4的活性。
图18：特定类型中的83个IFNL4突变体的生物活性—IFNL3和IFNL4之间的半胱氨酸残基(n＝7)和非半胱氨酸残基保守的(n＝38)或非保守的(n＝38)。6个非多态性的半胱氨酸中任何一个的突变消除IFNL4的活性。例外的是天然的遗传变体Cys17Tyr，其不影响IFNL4激活ISRE-Luc报告基因/蛋白的能力。在IFNL3和IFNL4之间保守的残基比例显著更高(对于两侧非配对T检验，p＝0.005)，这表示这些残基对于保持IFNL4的生物活性是关键的。发现了7个非保守的IFNL4特异性残基对于IFNL4的生物活性是重要的。
图19：由IFNL4基因内的遗传变体引起的氨基酸变化。每个氨基酸变化属于特定的单元型，所述单元型携带ss460415590变体的ΔG等位基因，因而，这些氨基酸变化仅在产生IFNL4蛋白时存在。当不产生IFNL4蛋白时，在有ss460415590的TT等位基因的单元型上不发生氨基酸变化。
图20：基于33个涉及抗病毒响应的转录物表达的主成分分析(Principalcomponents analysis,PCA)，所述主成分分析通过在用特定等位基因蛋白构建体(WT-IFNL4、Cys17Tyr、Arg60Pro和Pro70Ser)瞬时转染的HepG2中的qRT-PCR来测量，其在3个生物复制体中。PCA图表显示Pro70Ser突变体与WT-IFNL4蛋白和其簇相互接近的Cys17Tyr和Arg60Pro突变体的组都不同。
图21：在HepG2细胞中，表达被IFNL4等位基因蛋白构建体(WT-IFNL4、Cys17Tyr、Arg60Pro和Pro70Ser)的瞬时转染显著影响的转录物的热图(Heatmap plot)，所述热图是基于图20上所示的实验结果。突变体Cys17Tyr和Arg60Pro在这些转录物上显示了相似的效果，而Pro70Ser显示了与WT-IFNL4最多的差异，其与用WT-IFNL4转染的细胞相比引起了IL15、IL18、CTSB、FOS和SPP1转录物的较低表达，以及与用WT-IFNL4转染的细胞相比有DAK,IRF7,DHX58和APOBEC3G转录物的较高表达。对应于由与WT-IFNL4相比的突变体引起的log2标度表达变化的色彩图表。
实施方案描述
本发明通常涉及称为IFNL4的新的干扰素基因及对应的mRNA和蛋白，其在携带ss460415590遗传变体的至少一个缺失(ΔG)等位基因的个体中产生。其同样涉及使用IFNL4mRNA或蛋白来确定个体自发清除HCV感染或响应于HCV感染的治疗性处理的可能性的方法。更具体地，本发明涉及如下发现，所述发现为个体产生的IFNL4mRNA或IFNL4蛋白的量与个体自发清除HCV感染或响应于HCV感染的治疗的可能性相关联。本发明同样涉及用IFNL4蛋白来鉴定可用于治疗有HCV感染的个体的化合物。
本发明是对发明人此前的工作的延伸，所述此前的工作在美国临时申请No.61/543,620，现国际申请No.PCT/US12/59048(2012年10月5日提交)中有详细描述，通过提述以其整体并入本文。在他们此前的工作中，发明人发现了称为ss469415590的新的化合物多态性(NCBI登录号NC_000019.9:[g.39739154delT；g.39739155T>G])。所述ss469415590多态性由发生在人类19号染色体上39,739,154和39,739,155位置处的2个核苷酸变异组成，其坐标是基于2009年2月的人类基因组参考(GRch37/hg19)。更具体地，所述ss469415590多态性由单碱基缺失多态性(T/Δ)和单碱基取代多态性(T/G)组成，它们完全连锁不平衡(r2＝1.0)。发明人还发现，在用PolyI:C处理之后，新的mRNA转录物从此区产生(图1)。对这些转录物的分析导致对单转录物位点、随后是蛋白翻译起始位点的鉴定，表明新的蛋白从此区产生(图2)。而且，在位置39,739,154处胸腺嘧啶核苷的缺失在推定蛋白的氨基酸22处引起移码，从而改变了下游的读框(图3)。对来自这个区域的转录物的分析显示，这种移码导致产生6个推定蛋白，包括3个新的相关蛋白：179个氨基酸的蛋白(本申请称为IFNL4-p179)，以及有131和107个氨基酸的IFNL4的两个同种型(分别为p131和p107)，其差异在于含有可变外显子(alternative exons)。在IFNL4区域中总计检测到10个转录物，并存放入NCBI GenBank(图4)。IFNL4mRNA的表达仅在PolyI:C激活的肝细胞中检测到，所述肝细胞来自对于风险ss460415590ΔG等位基因纯合的个体而非来自对于非风险TT等位基因纯合的个体(图5)。对IFNL4-p179序列的分析显示，所述蛋白与人类IFN-λ蛋白，特别是与IFNL3(IL28B)，以及一些其他的2类细胞因子家族蛋白(图6、图7)具有强相似性。
因此，本发明的一个实施方案是包含来自选自下组氨基酸序列的至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸、至少约80个连续氨基酸、至少约90个连续氨基酸、或至少约100个连续氨基酸的分离蛋白：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。在一个实施方案中，所述分离蛋白包含来自选自下组氨基酸序列的至少约110个连续氨基酸、至少约120个连续氨基酸、或至少约130个连续氨基酸：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5。在一个实施方案中，所述分离蛋白包含来自SEQ ID NO:2的至少约140个连续氨基酸或至少约150个连续氨基酸。对于氨基酸序列，如本申请所使用的，术语“约”意为连续氨基酸的数量能变动多达5％。因而，约40个连续氨基酸意为分离蛋白能包含38-42个连续氨基酸。在一个实施方案中，所述分离蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。
在描述进一步的实施方案之前，应注意的是，本申请所用的所有技术和科学术语都具有与本申请主题所属领域的技术人员通常理解相同的含义，除非另有定义。而且，为了帮助读者，提供了下列的一般定义以促进对本发明的理解。
值得注意的是，术语“一个/一种(a)/(an)”“一个或多个”和“至少一个”本申请可以交换使用。术语“包含/包括(comprising)”“含有(including)”和“具有(having)”也可以交换使用。此外，短语“选自下组”指的是随后列表中的组的一个或多个成员，包括两个或更多成员的混合(即组合)。如本申请所使用的，“至少一个”意为一个或多个。术语“包含/包括(comprise)”通常以“含有(including)”的意义来使用，也就是说“准许一个或多个特征或组分的存在”。进一步理解的是，当各种实施方案的描述使用了术语包含/包括时，本领域技术人员会理解，在一些具体的实施例中，能选择性地使用短语“基本上由……组成(consisting essentially of)”来描述一个实施方案。
如本申请所使用的，术语分离/分离的(isolated)、分离(isolating)、纯化/纯化的(purified)，诸如此类，不一定指本发明的细胞或分子的纯度。这些术语改为指已从其自然环境、或从产生它们的环境的组分分出的细胞或分子。例如，存在于活的动物(包括人类)中的天然存在的细胞或分子(例如DNA分子、蛋白、等等)不是分离的。然而，从所述动物中的共存材料分出的同样的细胞或分子，被认为是分离的。如进一步的例子，根据本发明，来自个体的血样中存在的蛋白分子被认为是分离的。应注意的是，用进一步纯化步骤从这种血样中获得的蛋白分子也被称为是分离的，其与“分离的不是指细胞的纯化程度”的概念一致。而且，本发明的分离蛋白能够从例如其自然来源(例如人类)获取，用重组DNA技术生产，或以化学方法合成。
本领域的技术人员已理解，蛋白序列可能变动，或可能被改变，而对该蛋白的活性很少或没有影响。根据本发明，这种蛋白被称为变体、等位变体、突变体、同种型、或同源物。由于个体携带编码等位变体的2个不同的等位基因，这些变体能自然出现，或它们能用技术如遗传工程来构建。对于蛋白及其变体的命名，可以任意地将一个形式的蛋白称作参考型(例如野生型)而其他形式称作突变体、变体、同种型或同源物。例如，如果一个具体的等位基因及其编码的蛋白与具体的表型特征相关(例如没有一种疾病)，或发现其在群体中占大多数，则蛋白的编码形式可称为“野生型形式”，而其他形式可以称为突变体、变体、同种型、或同源物。对于本发明，包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的序列的蛋白被认为是野生型(wt)蛋白。
因而，本发明的一个实施方案是IFNL4蛋白变体。更具体地说，本发明的一个实施方案是包含至少50个连续氨基酸的序列的分离蛋白，其中所述至少50个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的至少50个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同。在进一步的实施方案中，所述分离蛋白包含至少100个连续氨基酸的序列，其中所述至少100个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的至少100个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同。在更进一步的实施方案中，所述分离蛋白包含至少150个连续氨基酸的序列，其中所述至少150个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2的至少150个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同。在一个实施方案中，所述分离蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在其全长上与选自下组的氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8。确定两种蛋白或核酸分子之间的百分比同一性的方法对于本领域技术人员是已知的。
对于这些变体，只要变体保持至少一个本申请所述的IFNL4蛋白活性，氨基酸序列中任何类型的改变都是允许的。这些变体例子包括但不限于，氨基酸缺失、氨基酸插入、氨基酸取代及其组合。例如，本领域技术人员已熟知，一个或多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9或10个)氨基酸经常能从蛋白的氨基和/或羧基端移除，而对该蛋白的活性没有显著影响。类似地，一个或多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9或10个)氨基酸经常能插入蛋白，而对所述蛋白的活性没有显著影响。
正如所注意的，本发明的分离的变体蛋白与本申请公开的IFNL4野生型相比也可以包含氨基酸取代。只要所述蛋白没有被显著影响，任何氨基酸取代都是允许的。就此而言，值得本领域重视的是，氨基酸可以基于它们的物理性质来分组。这些组的例子包括但不限于，带电荷氨基酸、不带电荷氨基酸、极性不带电荷氨基酸、和疏水氨基酸。优选的含有取代的变体是氨基酸被来自同一组的氨基酸所取代的那些。这些取代被称为保守取代。
天然存在的残基可以基于通常的侧链性质而被划分为几类：
(1)疏水的：Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守取代可涉及这些种类中的一个的成员换成来自另一类的成员。在优选的实施方案中，这些取代的残基可引入人IFNL4蛋白的与IFN-α和IFN-λ蛋白不同源的区域内。
在进行氨基酸改变的过程中，可以考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathic index)。每个氨基酸基于其疏水性和带电荷特性而分配得到亲疏水性指数。所述亲疏水性指数为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。亲疏水性氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物功能方面的重要性是本领域通常理解的(Kyte等,1982,J.Mol.Biol.157:105-31)。已知某些氨基酸能够用其他具有相似亲疏水性指数或评分的氨基酸取代而保持相似的生物活性。在基于所述亲疏水性指数进行改变的过程中，亲疏水性指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的那些是特别优选的，而在±0.5以内的那些是甚至更加特别优选的。
同样为本领域所知的是，在亲水性的基础上能有效地进行相似氨基酸的取代，具体是当由此生成的生物功能性上等同的蛋白或肽意欲用于免疫的实施方案，如本案例中时。蛋白最大的局部平均亲水性是由其临近的氨基酸的亲水性所决定的，并与其免疫原性和抗原性(即与所述蛋白的生物活性)相关联。下列亲水性值分配给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；以及色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的那些是特别优选的，而在±0.5以内的那些是甚至更加特别优选的。还可基于亲水性从一级氨基酸序列来鉴定表位。
本领域技术人员能在需要这些取代时确定所需的氨基酸取代(无论保守或非保守)。例如，氨基酸取代能用于鉴定IFNL4蛋白的重要残基，或增加或减少本文所述的IFNL4蛋白的亲和力。例示的氨基酸取代在如下表1中显示。
表1
因而，在本发明的一个实施方案中，所述IFNL4蛋白变体包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代是保守取代。在一个实施方案中，所述初始氨基酸用表1中显示的例示取代所取代。
对于氨基酸取代，据此前讨论，本发明的IFNL4蛋白与人类IFNL-λ蛋白有高达29％的同一性(以及40％的序列相似性)。而且，为本领域技术人员所知的是，干扰素蛋白具有一些保守的氨基酸。目前公开的IFNL4蛋白含有很多这些保守的氨基酸。这些氨基酸在图7中显著标识。氨基酸27,33,34,36,37,44,53,155和158对于IFNL3(IL28B)与其第一受体IFNLR1(IL28R1)的相互作用是重要的，而氨基酸97和100对于其与第二受体IL10R2是重要的(Gad H,Dellgren,C等，Inteferon-λis functionally an interferon but structurally related tothe interleukin-10family,the Journal of Biological Chemistry,2009)。因而，在各种实施方案中，本发明的分离的变体蛋白含有至少一个或全部的这些保守干扰素残基。相应地，本发明的一个实施方案是包含至少50个连续氨基酸的序列的分离蛋白，其中所述至少50个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的至少50个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，并且其中所述至少50个连续氨基酸序列包含至少一个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
一个实施方案，所述分离蛋白包含序列元素a-y中任意至少2,3,4,5,5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25项。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含至少50个连续氨基酸的序列，其中所述至少50个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:8的至少50个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，并且其中所述分离蛋白包含：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含至少100个连续氨基酸的序列，其中所述至少100个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2、SEQID NO:5或SEQ ID NO:8的至少100个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，并且其中所述至少100个连续氨基酸序列包含至少一个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含序列元素a-y中任意至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25项。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含至少100个连续氨基酸的序列，其中所述至少100个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2、SEQID NO:5或SEQ ID NO:8的至少100个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，并且其中所述分离蛋白包含：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含至少130个连续氨基酸的序列，其中所述至少130个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2或SEQID NO:5的至少130个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，并且其中所述至少130个连续氨基酸序列包含至少一个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置51的位置处的谷氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置62的位置处的半胱氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
p在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
z.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
aa.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含序列元素a-aa中任意至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26或27项。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含至少130个连续氨基酸的序列，其中所述至少130个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2或SEQID NO:5的至少130个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，并且其中所述分离蛋白包含：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置51的位置处的谷氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置62的位置处的半胱氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
p在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
z.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
aa.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含至少150个连续氨基酸的序列，其中所述至少150个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2的至少150个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，并且其中所述至少150个连续氨基酸序列包含至少一个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置51的位置处的谷氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置62的位置处的半胱氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置76的位置处的半胱氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置87的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
z.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
aa.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
bb.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
cc.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中所述分离蛋白包含序列元素a-cc中任意至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28或29项。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含至少150个连续氨基酸的序列，其中所述至少150个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2的至少150个连续氨基酸序列至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，并且其中所述分离蛋白包含：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置51的位置处的谷氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置62的位置处的半胱氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置76的位置处的半胱氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置87的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
z.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
aa.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
bb.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
cc.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
本发明的一个实施方案是包含氨基酸序列的分离蛋白，其中所述氨基酸序列在其全长上与SEQ ID NO:8至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，其中所述分离蛋白包含至少一个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含序列元素a-y中任意至少2,3,4,5,5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25项。
本发明的一个实施方案是包含氨基酸序列的分离蛋白，其中所述氨基酸序列在其全长上与SEQ ID NO:8至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，其中所述分离蛋白包含：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
本发明的一个实施方案是包含氨基酸序列的分离蛋白，其中所述氨基酸序列在其全长上与SEQ ID NO:5至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，其中所述分离蛋白包含至少一个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置51的位置处的谷氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置62的位置处的半胱氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
p在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
z.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
aa.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中所述分离蛋白包含序列元素a-aa中任意至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26或27项。
本发明的一个实施方案是包含氨基酸序列的分离蛋白，其中所述氨基酸序列在其全长上与SEQ ID NO:5至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，其中所述分离蛋白包含：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置51的位置处的谷氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置62的位置处的半胱氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
p在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
z.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
aa.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在其全长上与SEQ ID NO:2至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，其中所述分离蛋白包含至少一个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置51的位置处的谷氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置62的位置处的半胱氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置76的位置处的半胱氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置87的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
z.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
aa.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
bb.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
cc.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中所述分离蛋白包含序列元素a-cc中任意至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28或29项。
在一个实施方案中，所述分离蛋白包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在其全长上与SEQ ID NO:2至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，其中所述分离蛋白包含：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置51的位置处的谷氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置62的位置处的半胱氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置76的位置处的半胱氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置87的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
z.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
aa.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
bb.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
cc.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
如上所记录的，本发明中的IFNL4蛋白拥有特别的活性，所述活性能使它们成为诊断、及开发对感染HCV的个体和有这种感染风险的个体的治疗的有用工具。这种活性的例子包括：
1)引发抗体的能力，所述抗体选择性结合由SEQ ID NO:2组成的蛋白；
2)选择性地结合抗体，所述抗体是针对由SEQ ID NO:2组成的蛋白产生的；
3)选择性地结合化合物，所述化合物结合由SEQ ID NO:2组成的蛋白，和；
4)IFNL4诱导JAK/STAT途径的能力。
诱导JAK/STAT途径的测量方法是本领域技术人员所知的。一个这样的方法是基于IFNL4蛋白刺激干扰素刺激基因(ISGs)的表达的能力的测定法。
在一个实施方案中，本发明的分离蛋白能引发选择性结合由SEQ ID NO:2组成的蛋白的抗体。在一个实施方案中，产生特异性小鼠抗-IFNL4抗体以识别与人IFNL4的44-74位氨基酸对应的合成肽。特异性检测是使用重组纯化的IFNL4蛋白通过Western印迹(图8)以及来自通过用PolyI:C处理或通过HCV体外感染激活的对于ss469415590杂合的个体的原代人肝细胞和用IFNL4-Halo构建体瞬时转染的HepG2细胞的共聚焦成像(图9)来证实的。因而，本发明的实施方案包括特异性识别和结合到IFNL4蛋白的抗体或其片段的抗体(图11)。在一个具体的实施方案中，所述抗体可为在小鼠或者兔中产生的单克隆抗体。
在一个实施方案中，本发明的分离蛋白能结合化合物，所述化合物结合由SEQ ID NO:2组成的蛋白。在一个实施方案中，本发明的分离蛋白能诱导JAK/STAT途径。
如本申请所使用的，短语“对蛋白活性没有显著影响”意为所述变体具有由SEQ ID NO:2组成的蛋白的至少80％、至少90％或至少95％的活性。因而，在一个实施方案中，所述分离蛋白具有由SEQ ID NO:2组成的蛋白的至少80％、至少90％或至少95％的活性。在一个实施方案中，所述分离蛋白具有由SEQ ID NO:2组成的蛋白的至少98％的活性。在一些情况中，所述分离蛋白的氨基酸序列中的变异提高蛋白活性。因而，本发明的一个实施方案是一种分离蛋白，所述分离蛋白具有由SEQ ID NO:2组成的蛋白的至少1.25X、至少1.5X、至少1.75X、至少2X、至少4X、至少6X、至少8X或至少10X的活性水平。这些活性的测量和比较能用本领域已知的方法完成。例如引发抗体抗一种蛋白的能力通常通过用本发明的分离蛋白来免疫动物(例如小鼠)，然后测试所得的抗体的选择性结合蛋白，如由SEQ ID NO:2组成的蛋白的能力来完成。如本申请所使用的，术语选择性地、选择性的、特异(性)的等指示所述抗体对分离的IFNL4蛋白比对与IFNL4无关的蛋白有更大的亲和性。更具体地说，术语选择性地、选择性的、特异(性)的等指示，如用标准测定法(例如ELISA)所测量的，所述抗体对分离的IFNL4蛋白的亲和性比其对阴性对照(例如无关蛋白，如，例如白蛋白)的亲和性在统计学上显著更高。同样地，存在用于测量化合物结合本发明的IFNL4蛋白的能力相似技术，其为本领域技术人员所知。
除测试引发抗体的能力之外，还能测试本发明的IFNL4蛋白激活JAK/STAT途径的能力。这些测定法通常通过测量JAK/STAT系统组分的活性来进行。例如荧光素酶测定法可用于测量报告基因的活性，所述报告基因充当JAK/STAT活性的量度。在这些测定法中，荧光素酶蛋白被用作在干扰素刺激响应元件(ISRE)调节下的报告基因。在测试的45个人信号传导途径中，只有ISRE-Luc和IRF3Luc报告基因被I和III型干扰素(IFN-α和IFNL3)及瞬时转染的IFNL4表达构建体所激活，而不被纯化的重组IFNL4蛋白或其它蛋白同种型的表达构建体所激活(图12)。这通过在瞬时或稳定转染ISRE-Luc的HepG2细胞中的个体ISRE-Luc测定法来验证(图13)。在具体的实验中在表达与亚基因组的HCV复制子连锁的荧光素酶报告基因/蛋白的Huh7细胞系中，IFNL4也显示抗病毒响应。在另一个实施方案中，可测量JAK/STAT途径中蛋白组分的蛋白活性(例如通过Western印迹测量)。例如，STAT1蛋白的酪氨酸磷酸化可以通过Western印迹测量，作为细胞因子受体信号传导途径活性的指示物。在另一个实施方案中，JAK/STAT途径的活性可通过干扰素刺激基因ISGs的表达水平来测量，即测量直接或间接地受干扰素刺激而导致JAK/STAT途径激活的基因的基因表达水平。只有瞬时转染的IFNL4而非其它蛋白同种型才导致STAT1和STAT2的磷酸化，这与由IFNL3引发的情况相似(图14)。
用于测定IFNL4蛋白生物活性的合适技术在本申请公开并且为本领域技术人员所知。这些测定法可为体内或体外测定法。有用测定法的例子包括但不限于，酶联免疫测定法、竞争性酶联免疫测定法、放射性免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光测定法、侧向流测定法(lateral flow assay)、流通测定法(flow-through assay)、凝集测定法、基于微粒的测定法(例如用微粒如但不限于，磁性颗粒或塑料聚合物如胶乳或聚苯乙烯珠)、免疫沉淀测定法、免疫印迹测定法(例如Western印迹)、磷光测定法、流通测定法、色谱测定法、基于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的测定法、表面等离子体共振测定法、分光光度测定法、基于微粒的测定法、电子传感测定法及流式细胞仪测定法。实施这些测定法的方法是本领域技术人员熟知的。测定法可经设计以给出定性、定量或半定量结果，其取决于如何使用它们以及所需结果的类型。
虽然本发明中的分离蛋白能完全由本申请公开的序列及其公开的变体组成，所述蛋白变体也可以额外地含有未赋予IFNL4活性但具有其它有用功能的氨基酸序列。任何有用的额外的氨基酸序列都能添加到所述分离蛋白序列，前提是所述额外序列没有对蛋白的以下能力产生不想要的影响：引发针对由SEQID NO:2组成的蛋白的抗体的能力；选择性地结合选择性结合于由SEQ ID NO:2组成的蛋白的抗体的能力；结合结合于由SEQ ID NO:2组成的蛋白的化合物的能力；或激活JAK/STAT途径的表达的能力。例如，本发明的分离蛋白能包含对可视化和纯化所述肽有用的氨基酸序列。这些序列起标志(例如酶)或标签(抗体结合位点)的作用。这些标志和标签的例子包括但不限于β-半乳糖苷酶、荧光素酶、谷胱甘肽-s-转移酶、硫氧还蛋白、HIS-标签、生物素标签、以及荧光标签。其它有用的用于对蛋白进行标志或标签的序列为本领域技术人员所知。
除上述修饰之外，本发明的分离蛋白还能被进一步修饰，前提是这些修饰对蛋白的如下能力没有显著影响：引发针对由SEQ ID NO:2组成的蛋白的抗体的能力；选择性地结合选择性结合于由SEQ ID NO:2组成的蛋白的抗体的能力；结合结合于由SEQ ID NO:2组成的蛋白的化合物的能力；或激活JAK/STAT途径的表达的能力。可进行这些修饰以例如增加蛋白的稳定性、溶解性或可吸收性。这些修饰的例子包括但不限于聚乙二醇化、糖基化、磷酸化、乙酰化、十四烷基化、棕榈酰化、酰胺化和/或所述肽的其它化学修饰。
本发明分离蛋白能从自然界获得(例如从植物、动物或微生物中获得)或它们能在实验室中产生(例如重组地和合成地)。同样包括的还有作为天然和合成分子的组合的肽。产生分离重组的或合成的肽的一般方法是本领域已知的。
本发明的蛋白是由本发明的分离核酸分子编码的。根据本发明，分离核酸分子是已经从其自然环境中移出的核酸分子(即已经过人为操作的)。据此，“分离的”并不反映所述核酸分子纯化的程度。本发明的分离核酸分子能从其自然来源作为完整的(即完全的)基因或作为其编码本发明的分离蛋白的部分获得。或者，本发明的分离核酸分子能通过合成(例如化学合成、固相合成、聚合酶链式反应)获得。此外，本发明的分离核酸分子可为从自然来源中获得的分子和通过合成(例如克隆编码本发明分离蛋白的基因组片段)获得的分子的组合。另外，本发明的分离核酸分子能包括DNA、RNA或其衍生物。
本发明的分离核酸分子能用本领域技术人员所知的许多方法来生产(参见，例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，2001，在此通过提述以其整体并入)。例如核酸分子能用多种技术修饰，其包括但不限于经典的诱变技术和重组DNA技术，如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、核酸片段的限制性酶切、核酸片段的连接、聚合酶链式反应(PCR)、核酸序列的选定区域扩增和/或诱变、寡核苷酸混合物的合成和混合物组的连接以“构建”核酸分子混合物及其组合。核酸分子变体能通过筛选由所述核酸编码的蛋白的功能(例如，引发针对由SEQ ID NO:2组成的蛋白的抗体的能力；结合结合于由SEQ ID NO:2组成的蛋白的化合物的能力；或激活JAK/STAT途径的表达的能力)而从修饰的核酸的混合物选择，这些筛选方法已在本申请描述，并由本领域技术人员常规实施。
因而，本发明的一个实施方案是包含核酸序列的核酸分子，所述核酸序列编码包含来自选自下组的氨基酸序列的至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸、至少约80个连续氨基酸、至少约90个连续氨基酸、或至少约100个连续氨基酸的分离蛋白：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。在一个实施方案中，所述分离核酸分子包含编码分离蛋白的核酸序列，所述分离蛋白包含来自选自下组的氨基酸的至少约110个连续氨基酸、至少约120个连续氨基酸或至少约130个连续氨基酸：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5。在一个实施方案中，所述分离核酸分子包含编码分离蛋白的核酸序列，所述分离蛋白包含来自SEQ ID NO:2的至少约140个连续氨基酸或至少约150个连续氨基酸。在一个实施方案中，所述分离核酸分子包含来自选自下组的核酸序列的至少90个、100个、125个、150个、175个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个连续核苷酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQID NO:7。还涵盖包含与本发明的核酸分子中存在的核酸序列完全互补的核酸序列的核酸分子。因而，本发明的一个实施方案是包含来自选自下组核酸序列的至少90个、100个、125个、150个、175个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个连续核苷酸的分离核酸分子：SEQ ID NO:3、SEQID NO:6和SEQ ID NO:8。
如已经讨论的，本发明涵盖包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5,或SEQ IDNO:8的序列的蛋白的变体。因而，本发明的一个实施方案是编码包含至少50个连续氨基酸的序列的蛋白的分离核酸分子，其中所述至少50个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的至少50个连续氨基酸序列至少92％，至少94％、至少96％或至少98％相同。在一个进一步的实施方案中，所述分离核酸分子编码包含至少100个连续氨基酸的序列的蛋白，其中所述至少100个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的至少100个连续氨基酸序列至少92％，至少94％、至少96％或至少98％相同。在又一个实施方案中，所述分离核酸分子编码包含至少150个连续氨基酸的序列的蛋白，其中所述至少150个连续氨基酸序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2的至少150个连续氨基酸序列至少92％，至少94％、至少96％或至少98％相同。在一个实施方案中，所述分离核酸分子编码包含氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列在其全长上与选自下组的氨基酸序列至少92％，至少94％、至少96％或至少98％相同：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:8。在一个实施方案中，所述分离核酸分子包含至少90、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、或至少500个连续核苷酸，所述连续核苷酸在其全长上与来自选自下组核酸序列的至少90、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500个连续核苷酸至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同：SEQIDNO:1、SEQIDNO:4和SEQIDNO:7。在多种实施方案中，所述核酸分子编码包含本申请公开的保守氨基酸的蛋白。
本发明也含有核酸分子，所述核酸分子是在严格条件下能与编码IFNL4蛋白或其变体的至少一部分的本发明的其它的(优选更长的)核酸分子的互补区杂交的寡核苷酸。优选的寡核苷酸是在严格条件下能与能够编码包含来自SEQ ID NO:2的至少30个连续氨基酸的蛋白或其变体蛋白的核酸分子杂交。一些优选的寡核苷酸能与包含来自选自下组核酸序列或其互补序列的至少90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个连续核苷酸的核酸分子杂交：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7。优选的寡核苷酸是在其全长上与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的至少一部分有至少92％、至少94％、至少96％或至少98％的同一性的那些。
本发明的寡核苷酸能是RNA、DNA或任一者的衍生物。这些寡核苷酸最小的大小是在给定的寡核苷酸与本发明另一个核酸分子上的互补序列之间形成稳定杂交所需要的大小。所述寡核苷酸的大小也必须足够用于寡核苷酸根据本发明的使用。本发明的寡核苷酸能用于各种应用中，其包括但不限于，作为鉴定额外的核酸分子的探针、作为扩增或延伸核酸分子的引物或在治疗性应用中抑制例如IFNL4蛋白的表达。这些治疗性应用包括将这些寡核苷酸用于例如反义、三联体形成(triplex formation)、核酶和/或基于RNA药物的技术。这些技术是本领域技术人员已知的。因此，本发明包括这些寡核苷酸，以及通过用一种或多种这样的技术来干扰IFNL4产生的方法。
本发明也包括重组构建体，其包含插入任何能将核酸分子递送入宿主细胞的载体中的本发明的核酸分子。这种构建体含有异源的核酸序列，其为与本发明的编码IFNL4蛋白的核酸序列并不天然邻近的核酸序列。所述载体可为RNA或DNA，原核的或真核的，且通常为病毒或质粒。重组的载体能用于克隆、测序和/或以其他方式操作本发明的IFNL4核酸分子和/或IFNL4蛋白。本申请称为重组分子并在下文更具体描述的一种类型的重组构建体能用于本发明的核酸分子的表达中。优选的重组载体能在转化的细胞系中复制。
包括于本发明的重组载体中的优选的核酸分子是编码本发明的至少一种IFNL4蛋白或其变体的至少一部分的核酸分子。包括于重组载体中的具体核酸分子是这样的核酸分子，所述核酸分子编码来自选自下组的氨基酸序列或其变体的至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸、至少约80个连续氨基酸、至少约90个连续氨基酸、或至少约100个连续氨基酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。据此，还包括的是包含来自选自下组的核酸序列、其互补链及其变体的至少90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个连续核苷酸的核酸分子：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:7。
在一个实施方案中，本发明的IFNL4蛋白通过培养能在有效产生所述蛋白的条件下表达所述蛋白的细胞并回收所述蛋白来产生。优选的用于培养的细胞是能表达IFNL4蛋白的重组细胞，所述重组细胞通过用一个或多个本发明的核酸分子转化宿主细胞来产生。核酸分子进入细胞的转化能用任何能将核酸分子插入细胞中的方法来完成。转化技术包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、脂转染、吸附和原生质体融合。重组细胞能保持为单细胞或能生长成组织、器官或多细胞生物体。本发明的转化的核酸分子以保持它们的表达能力的方式能留在染色体外或能整合到转化的(即重组的)细胞的染色体内一个或多个位点中。用于转化宿主细胞的核酸分子如本申请所公开的用于包括在本发明的重组载体中。
适合转化的宿主细胞包括任何能被转化并能表达引入的IFNL4蛋白的细胞。因此，这些细胞在用至少一个本发明的核酸分子转化后能产生本发明的IFNL4蛋白。宿主细胞能是未被转化的细胞，也能是已经用至少一个核酸分子转化的细胞。本发明合适的宿主细胞能包括细菌、真菌(包括酵母)、昆虫、动物和植物细胞。优选的宿主细胞包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞，尤其优选的是细菌(例如大肠杆菌(E.coli))和昆虫(例如夜蛾属(Spodoptera))细胞。
优选通过用一个或多个重组分子转化宿主细胞来产生重组细胞，每个所述重组分子包含一个或多个本发明的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接于含有一个或多个转录调控序列的表达载体。术语“可操作地连接”是指核酸序列以这样的方式插入到表达载体中使得所述分子在转化入宿主细胞时能够被表达。如本申请所使用的，表达载体是能够转化宿主细胞并能影响特定的核酸分子表达的DNA或RNA载体。优选的是，所述表达载体也能在宿主细胞中复制。表达载体能是原核的或是真核的，并且通常为病毒或质粒。本发明的表达载体包括任何在本发明的重组细胞中有功能(即直接基因表达)的载体，包括在细菌、真菌、昆虫、动物和/或植物细胞中。据此，本发明的核酸分子能被可操作地连接到表达载体，所述表达载体含有调节序列如启动子、操纵基因、阻遏物(repressors)、增强子、终止序列、复制起点、以及其它与重组细胞相容且控制本发明的核酸分子表达的调控序列。如本申请所使用的，转录调控序列包括能调控转录起始、延伸和终止的序列。尤为重要的转录调控序列是控制转录起始(如启动子、增强子、操纵基因和阻遏物序列)的那些。合适的转录调控序列包括任何能在本发明的至少一个重组细胞中有功能的转录调控序列。多种这样的转录调控序列是本领域的技术人员已知的。优选的转录调控序列包括在细菌、酵母、寄生虫(helminth)、昆虫和哺乳动物细胞中有功能的那些，如，但不限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、噬菌体λ(如λpL、λpR和包含这些启动子的融合体(fusions))、噬菌体T7，T7lac，噬菌体T3，噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫蛋白、α接合因子(alpha matingfactor)、毕赤酵母属(Pichia)醇氧化酶、甲病毒属亚基因组启动子(alphavirussubgenomic promoters)(如Sindbis病毒亚基因组启动子)、杆状病毒、玉蜀黍果穗夜蛾(Heliothis zea)昆虫病毒、牛痘病毒(vaccinia virus)、疱疹病毒(herpesvirus)、痘病毒、腺病毒、猿猴病毒40(simian virus 40)、逆转录病毒肌动蛋白、逆转录病毒的长末端重复、劳斯氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、热休克、磷酸盐和硝酸盐的转录调控序列，以及其它能在原核或真核细胞中控制基因表达的序列。其他合适的转录调控序列包括组织特异性启动子和增强子以及可被淋巴因子诱导的启动子(如可被干扰素和白细胞介素诱导的启动子)。本发明的转录调控序列也能包括与编码IFNL4蛋白的DNA序列自然相关的天然存在的转录调控序列。
本发明的表达载体也能含有使表达的蛋白能从所述细胞中分泌出来的分泌信号(即信号片段核酸序列)或任何能指导本发明的IFNL4蛋白分泌的异源信号片段，包括融合蛋白。优选的信号片段包括但不限于组织纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)、干扰素、白细胞介素、生长激素、组织相容性和病毒外壳糖蛋白信号片段。
本发明的表达载体也能含有导致本发明插入核酸分子表达为融合蛋白的融合序列。作为本发明核酸分子的一部分，融合序列的包涵体(inclusion)能在产生、储存和/或使用所述核酸编码的蛋白的过程中增强稳定性。此外，融合片段能作为简化对IFNL4蛋白的纯化的工具起作用，如用亲和层析法使对产出的融合蛋白的纯化变得可能。适合的融合片段能是具有所需功能(如提高了的稳定性和/或纯化工具)的任何大小的结构域。使用一个或多个的融合片段是在本发明的范围内的。融合片段能连接到IFNL4蛋白的氨基和/或羧基末端。融合片段和IFNL4蛋白之间的连接能被构建为对切割易感的(susceptible to cleavage)，以便能够直接回收所述IFNL4蛋白。优选通过培养重组细胞来产生融合蛋白，所述重组细胞用编码含有附接于IFNL4蛋白的羧基和/或氨基末端的融合片段的蛋白的融合核酸序列来转化。
本发明的重组分子是能包含此前描述为可操作地连接任何转录调控序列中的至少一个的任何核酸分子中的至少一个的分子，所述转录调控序列能有效调控要转化的细胞中核酸分子的表达。优选的重组分子包括一个或多个编码来自选自下组氨基酸序列或其变体的至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸、至少约80个连续氨基酸、至少约90个连续氨基酸、或至少约100个连续氨基酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。尤其优选的包含在重组分子中的核酸分子如本申请所公开的用于包含在本发明的重组载体中。
本发明的重组细胞包括任何用本发明的核酸分子中任意至少一种来转化的细胞。优选的重组细胞是转化了至少一种核酸分子的细胞，所述核酸分子编码来自选自下组的氨基酸序列或其变体的至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸、至少约80个连续氨基酸、至少约90个连续氨基酸、至少约100个连续氨基酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。
本领域的技术人员了解用重组DNA技术能提高被转化的核酸分子的表达，所述提高是通过操作例如宿主细胞中的核酸分子的所述拷贝数，那些核酸分子被转录的效率，产出的转录物被翻译的效率，以及翻译后修饰的效率。对增加本发明核酸分子的表达有用的重组技术包括但不限于，可操作地将核酸分子连接到高拷贝数的质粒上，将核酸分子整合入一个或多个宿主细胞染色体中，将载体稳定性序列添加到质粒上，取代或修饰转录调控信号(例如启动子、操纵基因、增强子)，取代或修饰翻译控制信号(例如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)，对本发明的核酸分子进行修饰以适于所述宿主细胞的密码子选择，删除使转录不稳定的序列，以及使用在发酵期间将重组细胞的生长与重组蛋白的生产暂时分离的控制信号。本发明表达的重组蛋白的活性可以通过将所得蛋白片段化、修饰或衍生化来提高。
根据本发明，重组细胞能被用于生产本发明的IFNL4蛋白，所述生产是通过在有效生产这种蛋白的条件下培养并回收所述蛋白来进行的。有效生产蛋白的条件包括但不限于允许蛋白生产的适当的培养基、生物反应器、温度、pH和氧环境。适当的，或有效的培养基指的是其中本发明的细胞在培养时能产生IFNL4蛋白的任何培养基。这种培养基通常为包含可同化的碳水化合物、氮和磷酸盐源、以及适当的盐、矿物、金属及其它营养物(如维生素)的水性培养基。所述培养基可以包含复杂的营养物或可以是定义的基本培养基。
本发明的细胞能在传统的发酵生物反应器中培养，所述生物反应器包括但不限于分批、补料分批、细胞再循环和连续发酵罐。培养也能在摇瓶、试管、微量滴定盘和陪替氏皿(petri plates)中进行。培养在适于所述重组细胞的温度、pH和氧含量中实施。这些培养条件完全在本领域普通技术人员的专业技能之内。
取决于生产所用的载体和宿主系统，产出的IFNL4蛋白能够或是保留在重组细胞内；被分泌到发酵培养基中；被分泌到2层细胞膜之间的空间中，如大肠杆菌的周质空间中；或被保留在细胞或病毒膜的外表面。术语“回收蛋白”指单纯收集含有的所述蛋白的全部发酵培养基，并且无须暗示的额外的分离或纯化步骤。本发明IFNL4蛋白能用各种标准的蛋白纯化技术纯化，如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、层析聚焦和差别增溶(differential solubilization)。
本发明也包括分离的(即从它们的自然环境中移出的)抗体，所述分离抗体选择性地结合到本发明的分离IFNL4蛋白和/或存在于个体或来自个体的样品中的IFNL4蛋白。本发明的分离抗体能包括血清中的抗体，或纯化至不同程度的抗体。本发明的抗体能是多克隆的或单克隆的，或者能是功能上的等同物，如抗体片段和遗传工程改造的抗体，包括能结合一个或多个本发明的IFNL4蛋白表位的单链抗体或嵌合抗体。生产对本发明中的用途有效的抗体的方法包括：(a)对动物施用有效量的IFNL4蛋白或其片段以生产所述抗体和，(b)回收所述抗体。针对限定的蛋白或片段而产生的抗体能够是有利的，因为这些抗体基本上不会被抗其它物质的抗体污染，否则所述其他物质可能导致诊断性测定法中的干扰。生产这些抗体的方法为本领域所知，并在Harlow等，Antibodies,a Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Labs Press,1988)中详细描述，并且包括免疫动物以生产多克隆抗体制备物，所述所述多克隆抗体是从例如腹水中回收并用本领域所知的方法纯化，以产出对IFNL4蛋白为反应性的制备物。许多物种具有含相关序列的蛋白，因此可能难以用标准的免疫学实验方案来生产识别来自仅一种物种的蛋白的抗体。因此，还期望对用于产生抗体的标准方法进行修改，例如消减杂交技术(subtractive hybridizationtechniques)，这些修改是本领域的技术人员所知的。在另一种方法中，用于本发明中的用途的抗体是通过Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Labs，1989)中公开的技术重组生产的。
本发明的一个实施方案是选择性结合到IFNL4蛋白变体上的抗体。在一个实施方案中，所述抗体选择性结合选自下组的变体：Cys17Tyr)、Arg60Pro)和Pro70Ser)。
其它合适的方法包括生产单克隆抗体。简言之，从来自免疫动物的脾细胞和产生杂交瘤的骨髓瘤细胞的融合体生产单克隆抗体。能筛选生产合适抗体的杂交瘤，然后培养并收获所述抗体。生产和筛选这种杂交瘤的方法是本领域技术人员所知的，并在Harlow等,见上文中描述。此外，制备与IFNL4蛋白反应的抗体的方法是本领域技术人员所知的，并在例如Harlow等,见上文中描述。用于注射到所述动物中的抗原材料的制备包括任何本领域所知的技术，并包括例如使用所述全长蛋白，使用选自所述蛋白免疫原区的肽，通过下列方法修饰抗原，例如二硝基酚偶联、甲基砷酸二钠偶联，抗原变性，将抗原偶联到蛋白运载体上例如钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemacyanin)、含有II类T细胞(Class II-T-cell)受体结合位点的肽，将抗原偶联于小珠(beads)，或本领域所知的任何其它方法。参见Harlow等,见上文。
本发明的抗体能包括多功能的抗体，例如具有至少一个功能性部分的双功能抗体，所述功能性部分特异地结合于IFNL4蛋白。这种多功能抗体能包括例如嵌合分子，所述嵌合分子包含结合到IFNL4蛋白的分子的一部分，以及能使所述嵌合分子结合于基质或使所述嵌合分子以对IFNL4蛋白的结合不受损的方式被检测到的另一部分。合适的另一部分的实例包括但不限于免疫球蛋白分子的片段、荧光蛋白或酶。
本发明用到的抗体能包含在配制物中。例如抗体能与缓冲液组合，在所述缓冲液中抗体是溶解的和/或带有运载体。合适的缓冲液和运载体是本领域技术人员所知的。合适的缓冲液的例子包括任何缓冲液，在所述缓冲液中抗体能够起作用以选择性结合到IFNL4蛋白，如但不限于磷酸缓冲盐水、水、盐水，磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸缓冲盐水)、TES缓冲液(Tris-EDTA缓冲盐水)，Tris缓冲液和TAE缓冲液(Tris-乙酸-EDTA)。运载体的例子包括但不限于聚合物基体、类毒素、和血清白蛋白如牛血清白蛋白。运载体能与抗体组合或缀合(即附接)于抗体，以这种方式使得基本上不干扰抗体的所述选择性结合IFNL4蛋白的能力。
如所述的，IFNL4蛋白是作为携带ss469415590多态性的特定等位基因(即缺失等位基因)的个体的结果而产生的。同样如所述的，发明人此前已经发现，携带所述ss469415590多态性的至少一个缺失等位基因提高个体不能自发清除HCV感染的可能性，以及个体不响应HCV感染的治疗的可能性(如美国临时申请No.61/543,620，现国际申请No.PCT/US12/59048(2012年10月5日提交)中所述)。因而，个体中IFNL4蛋白的存在、缺乏和/或其水平能用来确定个体自发清除HCV感染的可能性和/或个体响应HCV感染的治疗的可能性。
于是，本发明的一个实施方案是用于预测个体自发清除HCV的感染的可能性的方法，所述方法是通过分析来自个体的生物样品以确定样品中本发明IFNL4蛋白的存在或者缺乏。样品中存在本发明的IFNL4蛋白表明个体较不可能自发清除HCV感染。
在一个实施方案中，样品中缺乏IFNL4蛋白表明预测所述个体较可能自发清除HCV感染。在一个实施方案中，样品中存在IFNL4蛋白表明预测所述个体较不可能自发清除HCV感染。
本发明的另一个实施方案是用于预测个体响应HCV感染的治疗的可能性的方法，所述方法是通过分析来自个体的生物样品以确定所述个体中本发明IFNL4蛋白的存在或者缺乏。存在本发明的IFNL4蛋白表明所述个体将不响应HCV的感染的治疗或不会从HCV感染的治疗的实施中获益的可能性。
在一个实施方案中，样品中缺乏本发明的IFNL4蛋白表明表明预测所述个体较可能响应HCV感染的治疗。在一个实施方案中，样品中存在IFNL4蛋白表明预测所述个体较不可能响应HCV感染的治疗。
如所述的，IFNL4蛋白由人类19号染色体上的基因编码。本领域的技术人员应当了解，因为哺乳动物的染色体是成对的，所以它们有这个基因的两个拷贝，其序列不一定相同。也就是说，当一个染色体上的这个区域能含有一个多态性的等位基因(例如rs67272382)时，另一个染色体的相同区域可以含有同样的或不同的那种多态性的等位基因。在个体中的两个基因座含有不同序列(例如一个等位基因及野生型序列，两个不同的等位基因)的情况中，所述个体被称为对于那个基因座是杂合的。在同体的两个基因座含有相同的序列(例如都含有相同的等位基因)的例子中，所述个体被称为对于那个基因座是纯合的。与同一多态性存在两个拷贝相比，多态性存在一个拷贝能对自发清除HCV感染或响应HCV治疗具有不同的影响。例如，如果两个染色体都含有插入等位基因(并因此没有缺失等位基因)，所述个体不会产生IFNL4蛋白，然而，如果一个染色体含有所述插入等位基因，而且其姐妹染色体含有所述缺失等位基因，个体会产生一定量的IFNL4蛋白。最后，如果个体有两个拷贝的所述缺失等位基因，这样的个体可以产生比对于该等位基因杂合的个体更多的IFNL4蛋白。所以，有两个拷贝的插入等位基因的个体比只有一个这样的等位基因拷贝的个体有更大的可能性来自发清除HCV的感染或响应HCV感染的治疗。同样地，有一个拷贝的插入等位基因和一个拷贝的缺失等位基因的个体比有两个拷贝的缺失基因的个体有更大的可能性来自发清除HCV的感染或响应HCV感染的治疗。
在一个实施方案中，对于本发明的插入等位基因为杂合的个体比不携带这种等位基因的个体有更大的可能性清除HCV感染或响应HCV的治疗。在另一个实施方案中，对于本发明的插入等位基因为纯合的个体比对于这种等位基因是杂合体的个体有更大的可能性清除HCV感染或响应HCV的治疗。在一个实施方案中，对于本发明的缺失等位基因为杂合的个体比没有携带任何本发明的缺失基因的个体有更小的可能性来自发清除HCV感染或响应HCV感染的治疗。在另一个实施方案中，对于本发明的缺失等位基因为纯合的个体比对于本发明的缺失等位基因为杂合的个体有甚至更小的可能性来自发清除HCV感染或响应HCV感染的治疗。
于是，本发明的一个实施方案是预测个体自发清除HCV的感染的可能性的方法，所述方法是通过分析来自个体的生物样品以确定样品中存在的IFNL4mRNA或蛋白的水平，如果有的话。所述样品中存在的IFNL4蛋白的水平表明所述个体自发清除HCV的感染的可能性。
本发明的另一个实施方案是预测个体响应HCV感染治疗的可能性的方法，所述方法是通过分析来自个体的生物样品来确定样品中存在的IFNL4mRNA或蛋白的水平，如果有的话。所述样品中存在的IFNL4蛋白的水平表明个体响应HCV感染治疗的可能性。
术语“个体”、“受试者”、和“患者”是本领域所公认的，并且在本申请可互换地用于指哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，并且最优选的是人。在一些实施方案中所述受试者需要丙型肝炎治疗。例如，在一个实施方案中，受试者感染了HCV。然而，在其他实施方案中，受试者没有感染HCV。在一个实施方案中，受试者处于感染HCV的风险。在一个实施方案中，受试者已暴露于HCV。如本申请所使用的，术语“暴露的”、“暴露”等表明所述受试者已接触了另一个感染HCV的个体的体液。接触能通过这些事情发生，例如针刺，性接触或分娩过程。
术语“个体”、“受试者”、和“患者”本身不表示具体的年龄、性别、种族等。因而，任何年龄的个体，无论是男性还是女性都意欲被本公开所覆盖。同样地，本发明的方法能应用于任何种族，包括例如高加索人(白种人)、非裔美国人(黑人)、美洲原住民、夏威夷原住民、西班牙人、拉丁美洲人、亚洲人和欧洲人。在本发明的一些实施方案中，这些特性是有意义的。在这些案例中，所述有意义的特性(年龄、性别、种族等)将会被指出。
术语“丙型肝炎病毒”或“HCV”在本申请用于定义RNA病毒种，其病原株病毒种引起丙型肝炎，也称为非甲、非乙型肝炎。基于HCV分离株之间的遗传学差异，所述丙型肝炎病毒种被归入六个主要的基因型(1-6)，其每个基因型有几个亚型。基于它们的遗传学差异，亚型被进一步地拆分为准物种。HCV基因型的优势和分布在全球范围内是变化的。例如，在北美，基因型1a占主导地位，然后是1b,2a,2b和3a。在欧洲，基因型1b占主导地位，然后是2a,2b,2c和3a。而在非洲发现几乎仅有基因型4和5。所述病毒基因型可能在临床上对于确定对基于干扰素的治疗的潜响应及这种治疗所需的持续期是重要的。基因型1和4通常比其他基因型(2,3,5和6)更少响应于基于干扰素的治疗。值得注意的是，基因型5和6在美国人口中罕见。
如本申请所使用的，丙型肝炎是影响肝脏的感染性疾病，其由丙型肝炎病毒(HCV)导致。HCV最初的感染可产生急性的症状，或所述个体可能是无症状的(没有症状)，但是一旦确患，慢性丙型肝炎感染能进展到肝结疤(纤维化)，以及通常在多年后明显的进展后结疤(肝硬化)。在一些病例中，患有慢性丙型肝炎的那些会继续患上肝衰竭或其它的丙型肝炎并发症，包括肝癌。
根据本发明，慢性丙型肝炎指持续超过6个月的HCV感染。在临床上，其经常没有临床症状且常是意外发现的。慢性丙型肝炎的自然病程在不同的人之间变化相当大。虽然几乎所有感染HCV的人在肝脏活检中都有炎症证据，但肝结疤(纤维化)的进展速率在个体间显示出显著的变化性。对于其随时间变化的风险的精确评估是很难建立的，因为测试这种病毒的可用时间有限。
在一些实施方案中，所述个体被至少一个其它的生物体共同感染，例如乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和/或人类免疫缺陷病毒(HIV)。
如本申请所使用的，自发清除指被感染的个体不需要施用目的为帮助清除的治疗性治疗而从他们血液里清除HCV的能力。如果个体能自发清除HCV感染，则这种清除在急性感染期间典型地被观察到。权威的临床综述通常引用低至10％-15％的清除率。
如本申请所使用的，术语“治”、“治疗”等指的是治疗性的治疗和预防性的治疗或预防性的措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不为所需的生理学病况或疾病，或获得有益的或所需的临床结果。就此而言，治疗指的是施用治疗剂以减缓或预防不为所需的生理学病况或疾病，或与上述病况或疾病相关的症状。在一个实施方案中，所述治疗是帮助响应这种治疗的患者降低他们体内存在的HCV RNA量的治疗。通过联系，这种降低反映了所述患者体内存在的HCV水平的降低。在一个实施方案中，所述治疗在疗程期间降低了患者体内HCV RNA量的至少50％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一个实施方案中，治疗从患者身上完全清除了HCV RNA。
关于HCV的治疗，本发明的方法能用来预测对任何一种对HCV感染有用的治疗剂的响应。通常地，HCV感染的治疗是基于干扰素的治疗。因而，在一个实施方案中，治疗是基于干扰素的治疗。在各种优选的实施方案中，所述基于干扰素的治疗选自下组：IFN-α、IFN-λ或任何聚乙二醇化的干扰素。在另一个实施方案中，所述基于干扰素的治疗与利巴韦林组合。在各种实施方案中，进一步的组合能包括抗蛋白酶药物和其它抗病毒药物。在一个实施方案中，所述治疗包含IFN、利巴韦林和HCV蛋白酶抑制剂。
虽然能施用HCV感染的治疗以帮助患者清除HCV感染，但不是所有的都响应这种治疗。也就是说，在一些患者中，虽然所述治疗可引起一定量的HCVRNA水平的降低，然而并不导致持续性的病毒学响应。对其的治疗没有导致持续性的病毒学响应的患者被称为无响应者。同样地，对其的治疗导致持续性的病毒学响应的患者被称为响应者。持续性的病毒学响应定义为在所述治疗停止24周后血液中缺乏HCV RNA。在确定这种结果的过程中，典型地在疗程期间的一些时间点处测量HCV RNA的水平以便测量治疗的响应。在这些时间点处的HCV RNA水平越低，患者获得持续性的病毒学响应的可能性越大。
如本申请所使用的，预测临床响应指的是在HCV感染的急性阶段之前或期间知道患者自发清除HCV感染的可能性。其也指在对患者施用治疗之前知道HCV感染的治疗将在患者中引起足够的HCV RNA水平降低的可能性。关于本发明，预测所述临床响应可以也指确定患者对HCV感染治疗的响应或不响应的敏感性，或患者自发清除病毒的敏感性。
如本申请所使用的，术语“敏感的”、“敏感性”等是指个体自发清除HCV感染或响应这种感染的治疗的可能性或概率。也能将这种可能性指为一种倾向。在本发明的文本中，所述自发清除HCV感染和/或响应治疗的可能性无须是绝对的。也就是说，例如，当患者人群中IFNL4蛋白在个体中的存在减少了个体自发清除HCV感染或响应治疗的可能性，所述患者全都携带ss469415590缺失等位基因(并因此产生mRNA或IFNL4蛋白)，这种人群中的一些比例可能自发清除HCV感染或响应治疗。这可能是由于与其它因素的组合，例如病毒的基因型、个体的种族、年龄、性别和个体在基因座(除IFNL4基因中的那些基因座之外)处的遗传学组成。因而，在一个实施方案中，来自个体的样品中缺失IFNL4蛋白表明所述个体比产生所述IFNL4mRNA和蛋白的个体更可能自发清除HCV感染。在一个实施方案中，来自个体的样品中缺失IFNL4蛋白表明所述个体比产生所述IFNL4蛋白的个体更可能响应HCV感染的治疗。因而，不产生所述IFNL4蛋白的患者比产生IFNL4的患者更可能从治疗的施用中获益。在另一些实施方案中，来自个体的样品中存在IFNL4蛋白表明所述个体比不产生IFNL4的患者更不可能自发清除HCV感染。在又一个实施方案中，来自个体的样品中存在IFNL4mRNA和蛋白表明所述个体比不产生IFNL4mRNA和蛋白的患者有更不可能响应HCV感染的治疗。因而，产生IFNL4蛋白的患者比没有此特点的患者更不可能从治疗的施用中获益。
因而，本领域的技术人员了解“可能性”、“敏感性”、“倾向/素因(predisposition)”等是相关术语。定量和报告对治疗的响应或自发清除HCV感染的方法和术语是本领域技术人员所知的。例如，这些方法中的一种是相对的指征，所述指征通过比较产生IFNL4mRNA和蛋白并且自发清除HCV感染的个体数与不产生IFNL4mRNA和蛋白并且也自发清除HCV感染的个体数来确定。在产生IFNL4蛋白并且响应HCV感染治疗的个体与不产生IFNL4蛋白并且响应HCV感染治疗的个体数量之间能作类似的比较。这种相对比较能用倍数增长来阐明；例如1.5倍(1.5X)、2X、3X、5X等。这样的相对比较能用百分比增长阐明。例如，如果不产生IFNL4蛋白并且响应HCV感染治疗或自发清除HCV的患者数，是产生IFNL4蛋白并且响应HCV感染治疗或自发清除HCV的患者数的两倍的话，可认为缺乏所述IFANAN蛋白的个体响应治疗或自发清除HCV的可能性多100％。因而，在各种实施方案中，不产生IFNL4蛋白的个体是至少1.5X(倍)、2.0X、2.5X、3.0X、4.0X、或5.0X。因而，如果个体被确定为自发清除HCV感染的可能性多出2X，这种相对数量意味着在代表所述个体的人群中，预期自发清除HCV感染的个体是不自发清除HCV感染个体数量的两倍。
相对比较也能用比值比来阐明，所述比值比是当研究主题的选择是基于所关注的临床结局时而使用的用于相对比较的统计学方法。在一个实施方案中，个体自发清除HCV感染或响应HCV治疗的可能性的比值比为至少约1.2、至少约1.4、至少约1.6、至少约1.8、至少约2.0、至少约2.2、至少约2.4、至少约2.6、至少约2.8、至少约3.0、至少约3.2、至少约3.4、至少约3.6、至少约3.8、至少约4.0、至少约4.2、至少约4.4、至少约4.6、至少约4.8、或至少约5.0。计算比值比的方法为本领域技术人员所知并在Rothman,Kenneth J.；Greenland,Sander；Lash,Timothy L.(2008).Modern Epidemiology,LippincottWilliams&Wilkins,(第三版)中例示，其在此以其整体并入。
在各种实施方案中，样品中IFNL4蛋白的水平与IFNL4蛋白的参考水平进行比较(也称为参考标准)。这些参考标准能从各种来源获得。例如，所述参考标准能来自已知能自发清除HCV感染或响应HCV感染治疗的个体。在另一个例子中，所述参考标准能来自已知不能自发清除HCV感染或响应HCV感染治疗的个体。理想状态下，参考标准代表了个体的人群中存在的蛋白的平均水平，其中所述个体能或不能清除HCV感染或响应HCV感染治疗。
在一个实施方案中，如果来自第一个个体的样品中存在的IFNL4的水平低于来自第二个个体(或这种个体的人群)的以参考标准水平存在的IFNL4蛋白水平，所述第二个个体已知能清除HCV感染或响应HCV感染的治疗，则预测所述第一个个体能清除HCV感染或响应HCV感染的治疗。在一个实施方案中，如果来自第一个个体的样品中存在的IFNL4的水平高于来自第二个个体(或这种个体的人群)的以参考标准水平存在的IFNL4蛋白水平，所述第二个个体已知能清除HCV感染或响应HCV感染的治疗，则预测所述第一个个体不能清除HCV感染或响应HCV感染的治疗。
如本申请所使用的，生物样品是指来自个体的任何液体或组织，所述液体或组织能被用于分析IFNL4蛋白的活性，包括所述IFNL4蛋白的表达水平、蛋白水平或生物活性。能用于实践本发明的样品类型的例子，包括但不限于，血样、尿样、泪水样品、组织样品、和口腔拭子。用于提取DNA和基因分型的优选样品是血液和口腔拭子样品。对于检测mRNA和蛋白的存在、缺失或其水平有用的样品为本领域的技术人员所知。而且，获得这些样品的方法也为本领域的技术人员所知。IFNL4的表达可以在被HCV感染的和风险基因型携带者的肝活检中确定。
一旦获得样品，则所述样品被分析以确定本发明的IFNL4mRNA和蛋白的存在、缺失或其水平。如本申请所使用的，术语“确定”、“确定所述IFNL4mRNA和蛋白的水平”、“确定所述IFNL4mRNA和蛋白的量”、“确定IFNL4mRNA和蛋白的水平”等，意为涵盖任何能用于检测和测量样品中IFNL4的存在的技术。在此语境中，IFNL4是分析物的一个例子。这些技术能给出定性的和定量的结果。IFNL4的水平能通过检测整个IFNL4mRNA和蛋白或通过检测IFNL4的片段、降解产物或者反应产物来确定。在一个优选的方法中，IFNL4的水平是用合适的IFNL4结合化合物来确定的。
根据本发明，在用于确定响应HCV感染治疗或对这种治疗的抗性可能性的方法的情况中，本发明的IFNL4蛋白的存在、缺失或其水平表明所述个体响应这种治疗的可能性。根据本发明，在用于确定自发清除HCV感染的可能性的方法的情况中，本发明的IFNL4蛋白的存在、缺失或其水平表明所述个体自发清除HCV感染的可能性。
只要所述方法检测IFNL4蛋白的存在、缺失或其量，任何针对分析物的样品分析的已知方法都能用来实践本发明。这些方法的例子包括但不限于免疫学检测测定法和非免疫学检测方法(例如酶检测测定法)。在免疫学检测测定法中，用于检测分析物的存在、缺失和其水平的样品与结合分子(如抗体)接触。如本申请所使用的，“接触”、“被接触”、“接触的”等是指对推定含有IFNL4的样品到IFNL4结合化合物的引入，例如通过将IFNL4结合化合物与所述样品组合或混合。IFNL4结合化合物的一个例子是选择性结合IFNL4的抗体。然而，同样涵盖其它结合IFNL4的分子。例如，结合到IFNL4的受体能在本发明的测定法中用作IFNL4结合化合物。
当于所述样品中存在IFNL4时，则形成IFNL4化合物复合物。这种复合物的形成涉及IFNL4结合化合物以选择性结合IFNL4从而形成能被检测到的稳定复合物的能力。检测可以是定性的、定量的或半定量的。样品中结合到IFNL4结合化合物的IFNL4是在适合复合物形成的条件下完成的。这些条件(例如，适当的浓度、缓冲液、温度、反应时间)，以及优化这些条件的方法是本领域技术人员所知的。结合可以用各种标准化的方法来测量，所述方法包括但不限于酶免疫测定(例如ELISA)、免疫沉淀法、免疫印迹测定法及其他所述的免疫测定法，例如在Sambrook等,见上文以及Harlow等,见上文中所述。这些参考文献也提供了复合物形成条件的例子。
在一个实施方案中，所述IFNL4/IFNL4结合化合物复合物(本申请也称为IFNL4化合物复合物，或简称为复合物)能在溶液中形成。在另一个实施方案中，当所述IFNL4结合化合物被固定在(例如覆盖到)基质(substrate)上时，能够形成复合物。固定技术为本领域技术人员所知。合适的基质材料包括但不限于塑料、玻璃、凝胶、赛珞璐，织物(fabric)、纸和微粒材料。基质材料的例子包括但不限于胶乳、聚苯乙烯、尼龙、硝化纤维、琼脂糖、棉、聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)和磁性树脂。合适的基质材料形状包括但不限于，孔(例如微量滴定板孔)、微量滴定平板、浸渍片(dipstick)、条、珠、侧向流装置、膜、过滤器、管、皿、赛洛璐类的基质、磁性微粒和其它微粒。尤其优选的基质包括但不限于，ELISA板、浸渍片、免疫斑点条(immunodotstrip)、放射性免疫测定板、琼脂糖珠、塑料珠、乳胶珠、海绵、棉线、塑料碎片、免疫印迹膜、免疫印迹纸和流通膜。在一个实施方案中，基质(如微粒)能包括可检测的标记。对基质材料例子的描述，参见例如Kemeny,D.M.(1991)A Practical Guide to ELISA,Pergamon Press,Elmsford,N.Y.pp 33-44,和Price,C.和Newman,D.编Principles和Practice of Immunoassay,第二版(1997)Stockton Press,NY,N.Y.，二者都在此通过提述以其整体并入。
在一个实施方案中，IFNL4结合化合物被固定在基质上，所述基质如微量滴定板孔、浸渍片、免疫斑点条或侧向流装置。将收集自个体的样品应用于所述基质，并在适于(即足以)允许复合物在结合化合物和样品中存在的任何IFNL4之间形成的条件下温育。
根据本发明，所述复合物一旦形成就被检测到。如本申请所使用的，术语“检测化合物形成”是指鉴定复合到IFNL4上的IFNL4结合化合物的存在。如果复合物形成，形成的复合物的数量能够但无须被定量。推定的IFNL4组合物与IFNL4结合化合物之间的复合物形成或选择性结合能用本领域的各种标准方法(参见例如Sambrook等，见上文)来测量(即检测、确定)，其实施例在本申请公开。复合物能以各种方式检测，包括但不限于用一个或多个如下测定法：酶联免疫测定法、竞争性酶联免疫测定法，放射性免疫测定法，免疫荧光测定法、化学发光测定法、侧向流测定法、流通测定法、凝集测定法、基于微粒的分析测定法(例如用微粒如但不限于，磁性颗粒或塑料聚合物如胶乳或聚苯乙烯珠)、免疫沉淀测定法、BIACORETM测定法(例如用胶体金)、免疫斑点测定法(如CMG’s免疫斑点系统，Fribourg,Switzerland)，免疫印迹测定法(例如Western印迹)、磷光测定法、流通测定法、色谱测定法、基于PAGE的测定法、表面等离子体共振测定法、分光光度测定法、基于微粒的测定法、及电子传感测定法。这些实验的方法是本领域技术人员所熟知的。
测定能用于给出定性的或定量的结果，这取决于如何使用它们。所述测定结果能以检测整个IFNL4分子或片段、IFNL4的降解产物或反应产物为基础。一些测定如凝集反应、微粒分离和免疫沉淀法能在视觉上观察到(例如或通过肉眼或通过机器如光密度计或分光光度计)，而不需要可检测的标记。
在其他测定中，可检测的标记对于抗IFNL4化合物或选择性结合抗IFNL4化合物的试剂的缀合(即附着)有助于检测复合物的形成。可检测的标记能被缀合到所述抗IFNL4化合物或试剂的一个位点处，所述位点不干扰抗IFNL4化合物结合IFNL4蛋白的能力。缀合的方法为本领域技术人员所知。可检测的标记的例子包括但不限于放射性标记、荧光标记、化学发光标记、发色团标记、酶标记、磷光标记、电子标记、金属溶胶标记、有色珠、物理标记、或配体。配体指的是选择性结合另一分子的分子。优选的可检测标记包括但不限于荧光素、放射性同位素、磷酸酶(例如，碱性磷酸酶)、生物素、抗生物素蛋白、过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)、β-半乳糖苷酶、和生物素相关化合物或者抗生物素蛋白相关化合物(例如，抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)或IMMUNOPURETM中性抗生物素蛋白(IMMUNOPURETM NeutrAvidin))。
检测这些标记的办法为本领域技术人员所熟知。因而，例如放射性同位素标记能用照相胶片或闪烁记数器检测；荧光标记能用光探测器检测发出的光来检测。酶标记典型地通过提供带底物的酶和检测通过酶作用于底物而产生的反应产物来检测，而比色标记是通过简单地可视的所述有色标记来检测的。
在一个实施方案中，IFNL4化合物复合物能通过使样品与特异性抗所述化合物的抗体进行接触来检测，其中所述抗体是缀合到可检测的标记上的。也能将可检测的标记缀合到抗IFNL4抗体或其它结合IFNL4结合化合物的化合物上，以此方式从而不阻碍所述抗化合物的抗体或其它化合物结合到正在被检测的IFNL4结合化合物上的能力。优选的可检测标记包括但不限于荧光素、放射性同位素、磷酸酶(例如碱性磷酸酶)、生物素、抗生物素蛋白、过氧化物酶(辣根过氧化物酶)、β-半乳糖苷酶、和生物素相关化合物或者抗生物素蛋白相关化合物(例如，抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)或IMMUNOPURETM中性抗生物素蛋白(IMMUNOPURETM NeutrAvidin))。
在另一个实施方案中，通过使复合物与指示物分子接触来检测所述复合物。合适的指示物分子包括能结合到IFNL4/IFNL4结合分子复合物或IFNL4蛋白上的分子。据此，指示物分子能包含，例如IFNL4结合试剂，如抗体。优选的指示物分子为抗体，包括，例如与来自产生抗IFNL4抗体的动物物种的抗体进行反应的抗体。指示物分子本身能附接于本发明的可检测标记上。例如，抗体能附接于生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素上。
本发明能进一步地包含一种或更多层级或类型的二级分子或其它能检测指示物分子的存在的结合分子。例如，未加标签(即未与可检测标记缀合的)且选择性结合指示物分子的二级抗体能被连接到加标签的(即与可检测标记缀合的)三级抗体上，所述三级抗体选择性结合到所述二级抗体。本领域的技术人员能容易地选择合适的二级抗体、三级抗体和其它二级或三级分子。本领域的技术人员基于所述二级分子的特性也能选择优选的三级分子。相同的策略能应用到后续的层级中。
优选的是，所述指示物分子缀合到可检测的标记上。如果需要，则添加显影剂，并将所述基质提交检测装置用于分析。在一些实验方案中，在一个或两个复合物的形成步骤之后添加洗涤步骤以移除过量的试剂。如果使用这些步骤，它们涉及本领域工作人员已知的条件，如移除过量的试剂但保留复合物。
本发明的一个实施方案涉及侧向流测定法的使用，其实施例在U.S.Patent No.5,424,193,1995.6.13，Pronovost等；U.S.Pat.No.5,415,994,1995.5.16；Imrich等；WO 94/29696,1994.12.22,Miller等；和WO 94/01775,1994.1.20，Pawlak等中描述，上述全部在此通过提述并入。侧向流检测是一步法测定的例子。在一步法中，一旦获得样品并将其制备好以供测试，就使用者而言只有一个行动是检测分析物所必需的。例如，所述样品以其整体或部分能应用于测量样品中分析物的装置中。在一个实施方案中，将样品置于侧向流仪器中，所述仪器包括以下组件：(a)限定流径的支撑结构；(b)标志试剂，所述标志试剂包含缀合在特异性抗体上的小珠，所述标志试剂浸在标志区内的所述支撑结构中；和(c)捕获试剂。优选的抗体包括本申请公开的那些。所述捕获试剂定位于捕获区内的标志试剂下游，所述捕获区流动性地与标志区相连，以此方式从而使标志试剂能从所述标志区流到捕获区。所述支撑结构包含一个不妨碍所述小珠从所述标志区流到捕获区的材料。用作支撑结构的合适的材料包括离子(即阴离子或阳离子)材料。这些材料的例子包括但不限于硝酸纤维，PVDF，或羧甲基纤维素。所述支撑结构限定了侧向且划分为区域的流径，也就是标志区和捕获区。所述仪器能进一步地包括位于流径沿途的样品接收区，优选的是标志试剂的上游。所述支撑结构中的流径通过使捕获区下游的支撑结构的一部分(优选的是在所述流径的末端)与一种能吸收来自标志和捕获区的过量液体的吸收剂相连而生成。
在另一个实施方案中，用于检测IFNL4的侧向流仪器包括：(a)限定流径的支撑结构；(b)标志试剂，所述标志试剂包含如上所述的抗IFNL4抗体，所述标志试剂浸在标志区内的所述支撑结构中；和(c)捕获试剂，所述捕获试剂位于捕获区内的标志试剂下游，所述捕获区流动性地与标志区相连，以此方式从而使标志试剂能从所述标志区流到捕获区。优选的仪器也包括位于流径沿途的样品接收区，优选的是标志试剂的上游。优选的仪器也包括位于流径末端的吸收剂。一个优选的实施方案包括包含抗IFNL4抗体的捕获试剂。
本发明的一个实施方案是能检测个体中IFNL4的“浸渍片”装置。浸渍片可通过各种方式构建，所述方式部分地取决于如何使用它们。可直接将其置于样品中(如尿液流(urine stream))、直接浸泡在收集容器中盛装的样品中，或将样品涂在塑料匣或平台中所含的带上。另一个浸渍片的例子是“流通(flow-through)”装置，其一个例子是基于捕获抗体的异源免疫检测系统，所述捕获抗体是固定在附着于吸收容器的膜上的。“小珠”指的是由如乳胶或聚苯乙烯的基质构成的微粒基质，其能共价或非共价地与检测分子交联。一个优选的“浸渍片”测定的实施方案是免疫测定系统，其在U.S.Pat.No.5,656,502,发布于Aug.12,1997,授予MacKay和Fredrickson,以及U.S.Pat.No.6,001,658,发布于Dec.14,1999to Fredrickson中有描述，二者在此均通过提述并入。尤其优选的是IMMUNODIPTM装置，其可获自Diagnostic ChemicalsLtd.,PEI,CA。
一旦已经分析样品以确定IFNL4的存在、缺失或其水平，能或不能自发清除HCV感染或响应这种感染的治疗的个体就能被挑选出或鉴定出来。这种挑选是用来自公开方法的分析步骤而进行的。例如，获得了分析步骤的结果的人，就能决定此人能是否能响应HCV感染的治疗以及，如果不能的话，决定换用一个治疗。作为一个进一步的例子，复查从分析步骤中获得的数据的人，就能决定此人是否能自发清除HCV感染以及，如果不能的话，决定开始施用治疗。在一个实施方案中，所述挑选是用一个装置制进行的。例如一个装置能设计以便于当所述样品中存在IFNL4蛋白，所述装置的输出信息就表明个体不能自发清除HCV感染或响应这些感染的治疗。在一个实施方案中，所述装置是电子装置。例如，能分析ELISA测定的结果的装置能被设计用于显示关于个体自发清除HCV感染或响应这些感染治疗的能力的结果。在一个实施方案中，所述装置包含微处理器。在一个实施方案中，所述装置是计算机。
本申请已公开，当通过ss469415590-ΔG等位基因生成IFNL4，所述蛋白可携带非同义的变体，所述变体影响蛋白的生物学活性。这些变体的例子包括(外显子1中的rs73555604(Cys17Tyr)、外显子2中的rs142981501(Arg60Pro)和rs117648444(Pro70Ser))。本领域的技术人员了解，当序列中的这些变体存在于IFNL4基因座的编码部分时，其可能影响IFNL4活性并由此改变个体清除病毒或响应治疗的能力的总体影响。例如，在一个有限人群的研究中，与缺少rs117648444(Pro70Ser)的个体相比，其的存在显得与自发清除的增长率是相关的。进一步地，与rs142981501(Arg60Pro)和rs117648444(Pro70Ser)的概貌(profile)相比，这种异体有具有显著不同的热图概貌(图21)。因而，在一个实施方案中，如果检测到IFNL4，则所述方法包含分析检测到的IFNL4中一个或多个序列变体的存在的进一步步骤，其中所述一个或多个序列变体的存在表明个体自发清除HCV感染的可能性和/或个体响应HCV感染治疗的可能性。
由于本发明的方法能用于预测个体对治疗性治疗的响应，这些方法能并入到治疗计划中。因而，本发明的一个实施方案是治疗罹患慢性丙型肝炎病毒感染的患者的方法，所述方法通过分析来自个体的生物学样品来确定所述生物样品中存在的IFNL4蛋白的存在、缺失或其水平。对个体施用丙型肝炎感染治疗的决定是基于样品中存在的IFNL4蛋白的存在、缺失或其量的。
在一个实施方案中，患者有急性HCV感染。在一个实施方案中，患者有慢性HCV感染。在一个实施方案中，样品中缺失IFNL4蛋白表明个体可能响应HCV感染的治疗，并因而施用治疗。在另一个实施方案中，样品中存在IFNL4蛋白表明所述个体不太可能响应针对HCV感染的治疗的施用，并且不施用治疗。在一个实施方案中，样品中存在的IFNL4蛋白水平少于来自另一个体的参考样品中观察到的水平，或少于来自已知响应治疗的个体群(pool)中观察到的水平，表明个体可能响应HCV感染的治疗，并因而施用治疗。在一个实施方案中，样品中存在的IFNL4蛋白的水平高于来自已知不能响应治疗或以其他方式缺少对HCV感染的治疗的响应的另一个体或个体群的参考样品中观察到的水平，表示所述个体不太可能响应HCV感染的治疗，并且因而施用治疗。
对罹患慢性丙型肝炎的患者中IFNL4水平的确定会使医疗人员能为该患者确立最好的慢性丙型肝炎治疗疗法(例如性质、剂量和丙型肝炎治疗持续期和/或其他抗病毒药物)。例如，如果上述方法揭示了所述患者产生IFNL4蛋白，其表示受试者不太可能响应丙型肝炎的治疗，那么这个受试者可认为是更新的治疗策略(如用更高剂量的目前可用药物的治疗、用目前可用药物治疗更长的持续期和/或用新药物)的良好候选者。
本发明也涵盖用本发明的分子来治疗的其他方法。例如，正如目前所了解的，个体中IFNL4蛋白的存在导致个体不能自发清除HCV感染或响应这种感染的治疗。没有受理论所约束，本发明者认为这种效果是由于IFNL4蛋白在一个或多个免疫途径中的作用，例如对JAK/STAT途径的激活。所以，消除这种作用会移除所述效果。因而，产生IFNL4并且因而不能自发清除HCV感染或响应这种感染的治疗的个体，在施用消除IFNL4活性的治疗性化合物时，应能自发清除HCV感染或响应这种感染的治疗。于是，本发明的一个实施方案是治疗HCV感染的患者的方法，所述方法包括对所述患者施用化合物，其中所述化合物在患者中选择性结合到IFNL4蛋白，而其中这些结合导致患者体内IFNL4活性降低或清除。
这种治疗性化合物的一个例子是本发明的选择性结合IFNL4的抗体。施用这种抗体导致抗体结合并与IFNL4形成复合物。这种结合通过两种方式中的至少一种来消除IFNL4活性。抗体对IFNL4的物理性结合能导致对IFNL4实际上的物理抑制。第二，IFNL4抗体复合物被身体所识别并从其中移除。用本发明的方法鉴定的IFNL4结合化合物也能用于清除或降低患者体内的IFNL4活性。
除了IFNL4结合化合物，对IFNL4的活性的降低还能通过降低或消除编码IFNL4的mRNA转录产物而实现。这些降低或消除能通过施用对编码IFNL4的mRNA分子特异性的小干扰RNA而实现。于是，本发明的一个实施方案是治疗HCV感染的患者的方法，所述方法包含对患者施用小干扰RNA，其中所述小干扰RNA是选择性针对编码IFNL4的mRNA的，这种施用藉此而导致患者体内IFNL4活性的降低或消除。
本发明也包含对调节IFNL4活性的化合物的鉴定方法。这些化合物指调节剂。例如，如此前所讨论，发明者已经显示，IFNL4激活JAK/STAT途径，这是一种能用ELISA测定的形式很容易地进行的反应。因而，IFNL4活性的调节物能通过进行JAK/STAT途径激活的测定并向测定添加测试化合物，用本发明的IFNL4蛋白来鉴定。这种测定的结果随后与没有任何测试化合物的第二个JAK/STAT激活测定的结果进行比较，或与添加了已知不影响IFNL4活性的化合物的所述测定结果比较。于是，本发明的一个实施方案是用于鉴定IFNL4蛋白活性的调节物的方法，所述方法是通过在允许对IFNL4蛋白的活性测量的条件下温育并测量IFNL4蛋白的活性。然后可以在初始的蛋白活性测定所用的相同条件下且存在测试化合物的情况下温育IFNL4蛋白，并测量产出的IFNL4蛋白的活性。然后比较两个蛋白活性。如果在缺失和存在检验化合物的情况下获得的IFNL4活性之间的统计学差异是显著的，则所述测试化合物被鉴定为IFNL4活性调节物。
如本申请所使用的，调节物指影响IFNL4蛋白在体外和/或体内的功能性活性的化合物。调节物可以是IFNL4蛋白的激动剂和拮抗剂，并且可以是通过表达、通过翻译后修饰，以直接与IFNL4蛋白相互作用的方式或其他方式来发挥对IFNL4的影响的化合物。IFNL4蛋白的激动剂是这样的分子，当所述分子连接到IFNL4蛋白上时，则提高或延长所述蛋白的功能性活性。IFNL4蛋白的激动剂包括蛋白、核酸、糖类、小分子或任何其它能激活IFNL4蛋白的分子。IFNL4蛋白的拮抗剂是这样的分子，当所述分子连接到IFNL4蛋白上时，则减少蛋白功能的活性的量或持续期。IFNL4蛋白的拮抗剂包括蛋白、核酸、糖类、抗体、小分子，或任何其它能减少IFNL4蛋白活性的分子。
术语“调节(modulate)”，如本申请出现的，是指IFNL4蛋白活性的改变。例如调节能引起IFNL4蛋白的功能性活性、结合特性或其它任何生物的、功能性的或免疫学特性的提高或降低。
IFNL4活性调节物或是在利用天然或遗传操作产出(如重组细胞)的表达IFNL4的细胞的测定(基于细胞的测定)中鉴定，或是在用分离的IFNL4蛋白的测定(无细胞测定)中鉴定。各种测定中能利用IFNL4蛋白的各种变体(例如全长IFNL4蛋白、IFNL4蛋白的生物活性片段，或包含全部或部分IFNL4蛋白的融合蛋白)。所述测定可以是结合测定，所述结合测定需要直接或间接测量检验化合物或已知的IFNL4蛋白配体的结合。所述测定也可以是活性测定，活性测定需要直接或间接的测量IFNL4蛋白的活性。所述测定还可以是表达测定，表达测定需要直接或间接测量编码IFNL4蛋白的mRNA的表达或IFNL4蛋白自身的表达。
用于本发明的筛选测定中的用途的合适的检验化合物能从任何合适的来源获得，例如常规的化合物文库(library)。检验化合物也能用许多方法中的任一种在本领域已知的组合的文库中来获得，包括：生物文库；空间寻址平行固相或液相文库(spatially addressable parallel solid phase or solution phaselibraries)；需要去卷积的合成物文库法(synthetic library methods requiringdeconvolution)；“一珠一化合物”文库法(the"one-bead one-compound"librarymethod)；及用亲和层析法选择的合成文库法(synthetic library methods usingaffinity chromatography selection)。所述生物文库的方式限于肽文库，而另外四个方式可应用于肽、无肽低聚物或化合物的小分子文库。分子文库的合成方法的例子能在本领域找到。化合物文库可在溶液中或小珠、细菌、孢子、质粒或噬菌体上存在。
本发明也包括对实践本发明公开的方法有用的试剂盒。因而，本发明的一个实施方案是确定受试者响应丙型肝炎治疗的可能性，根据本发明，所述试剂盒包含i)用于选择性检测从受试者获得的样品中至少IFNL4mRNA或蛋白的存在、缺失或其水平的试剂和ii)使用所述试剂盒的说明。
本发明的一个实施方案是用于确定感染丙型肝炎病毒的受试者中自发清除所述病毒的可能性的试剂盒。根据本发明，所述试剂盒包含i)用于选择性检测从受试者获得的样品中至少IFNL4mRNA或蛋白的存在、缺失或其水平的试剂和ii)使用所述试剂盒的说明。
本发明的试剂盒含有确定IFNL4蛋白的存在、缺失或其水平所需的试剂中的至少一些。用于本发明试剂盒的试剂能包括但不限于，本发明的分离核苷酸、本发明的IFNL4蛋白、IFNL4结合化合物(例如，选择性结合IFNL4的抗体)。在一些实施方案中，IFNL4蛋白和/或IFNL4结合化合物可被固定在固体基质上。所述试剂盒可进一步包含控制蛋白。本领域的技术人员根据通常的要求，不需要过多实验便能从本申请公开的内容里选择必需的试剂。所述试剂盒的试剂也可以包含分子标志或标签。
本发明的试剂盒也能包含各种实践本发明的方法所必需的试剂，如缓冲液如本领域所知。这些试剂或缓冲液可以，例如对提取和/或纯化从受试者获得的生物样品中的IFNL4mRNA/蛋白是有用的。所述试剂盒也可以含有所有的必需的材料，如实践本发明的方法所必需的微量离心管。
对具体实施方案中的前述充分地揭示了本发明总的性质，以至于其他人能通过应用本领域技术内的知识而容易地修改和/或调整这些具体实施方案的各种应用，而不需要过多实验，不脱离本发明的总的观点。因此，基于本申请呈示的教导和指导，这些调整和修改属于所公开的实施方案的相等物方案的意义和范围内。据理解，本申请的措辞和术语是为了描述而非限制，这样，本说明书中的术语或措辞能由技术人员依据所述教导和指导来解释。
应注意的是，虽然与本申请描述的那些相似或相等的方法和材料能用于实践或检验本发明，但合适的方法和材料在下文描述。本申请提到的所有的出版物、专利申请、专利和其他的参考文献通过提述以其整体并入。本申请讨论的出版物和申请仅是因其公开日先于本申请的申请日而提供。本申请不可解释为承认本发明由于在先发明而没有先于这些公开的资格。此外，所述材料、方法和例子只用作说明而非限制。
实施例
实施例1：人原代肝细胞中IFNL3(IL28B)区域的可诱导表达图谱(landscape)分析
正常人肝细胞的激活
从无HCV感染的肝脏中刚分离的正常人肝细胞的原代培养物是从Lonza(Walkersville,MD)公司购买的。细胞被铺在六孔的、胶原蛋白铺涂的、组织培养平板上并表现出高生存能力。随后用中浓度为50μg/mL的PolyI:C处理细胞0、1、2、4、8或24小时。PolyI:C(聚肌苷酸：聚胞嘧啶核苷酸)是模拟病毒感染的Toll-样受体-3(TLR3)激动剂(Alexopoulou L,Holt AC,Medzhitov R,Flavell RA.(2001)Recognition of double-stranded RNA and activation ofNF-kappa B by Toll-like receptor 3.Nature 413(6857):732-8)。PolyI:C在结构上类似双链RNA，所述双链RNA代表了多种类型病毒复制周期的中期。PolyI:C广泛地用作模拟病毒感染的合成试剂，并且其在许多细胞类型中诱导I型(IFN-α)和III型(IFN-λ)干扰素的表达(Doyle SE,Vaidya SA,O'Connell R,Dadgostar H,Dempsey PW,Wu T,Rao G,Sun R,Haberland ME,Modlin RL,Cheng G.(2002)IRF3mediates a TLR3/TLR4-specific antiviral gene program.Immunity 17(3):251-63；Doyle SE,O'Connell R,Vaidya SA,Chow EK,Yee K,Cheng G.(2003)Toll-like receptor 3mediates a more potent anti-viral responsethan Toll-like receptor 4.J.Immunol.170(7):3565-71)。用PolyI:C将肝细胞培养物处理够指示的时间后收获所述细胞，并通过标准方法制备DNA和RNA提取物。通过Nanodrop和Bioanalyzer测量DNA和RNA的质量和数量。
RNA测序
总RNA中的1微克被用于每个用PolyI:C处理0、1、2、4、8、24小时的肝细胞样品。在PolyA mRNA的挑选后，用标准的Illumina实验方案将RNA样品片段化，并连接到65bp的接头(adaptor)上以制备含有200-250bp片段的成对末端(PE)cDNA文库。所述文库通过12个PCR循环而富集并在4.5pM的浓度下测序，每个样品用一个基因分析仪(Genome Analyzer)(GAII)的泳道，生成107bp的测序读段(reads)。平均每个样品生成47.2±6.6百万的PE RNA测序读段。用于分析的人类参考基因组用Bowtie软件基于UCSC hg19索引构建。测序读段用IlluminaPipeline OLB 1.9.0和CASAVA 1.7.0处理，并在根据标准质量控制设定来移除一些读段后，将其用TopHat v1.2.0与参考基因组比对。用来自Ensemble数据库的所有人源转录物文库(GRCh37.61版:useast.ensembl.org/info/data/ftp/index)来产生外显子连接点(junction)和重建剪接体的文库。缺省TopHat算法将映射到(mapto)多于一个基因组区域的RNA测序读段从分析中移除。考虑到IFNL3(IL28B)基因的周围区域的复杂性，我们执行了一个特殊策略。为了允许读段的非专有地映射至高相似性的区域，如IFNL1(IL29)、IFNL2(IL28A)、IFNL3(IL28B)，我们改变了TopHat的设置以允许多重比对(多达10个)。所述映射鉴定了表达簇，其代表潜在的外显子。基于生成的潜在剪接点(splice junctions)数据库，此前未映射的读段用by TopHat v1.2.0来重新映射。为了检测新转录物，用Cufflinksv0.9.3来处理最终比对的读段文件。转录物的相对丰度用每百万映射的片段映射到外显子的每一千碱基对上的片段数算法(fragments per kilobase of exon permillion fragments mapped algorithm,FPKM)来测量。FPKM评估的置信区间用贝叶斯推理方法算出。在存在剪接体的情况下，每个基因的最高表达的形式定为比率1，并且至少表达主要形式1％水平的其他所有形式都被用于分析。TopHat比对算法限缓(brakes)测序读段为25-bp的片段，所述片段是独立映射的，并且若所有个体的片段都被正确映射则所述被重建回测序读段中。为了发现可能的遗传变体，我们允许每个片段有2或3个错配。用UCSC基因浏览器和整合基因组学查看器(Integrative Genomics Viewer,IGV)的本地拷贝：broadinstitute.org/igv/。区域中的遗传变体通过IGV而可视化并进行手动检查。此分析的结果显示在图1中。
对IFNL3(IL28B)基因周围150kb的区域的详细分析显示，在0或1小时处理后已知的IFN-λ基因IFNL1(IL29)、IFNL2(IL28A)、IFNL3(IL28B)没有表达，但在2-24小时的处理后这些基因被强烈激活(图1、2)。此分析也导致了对一个新的、约2.5kb的位于rs12979860附近的长转录区域的鉴定(图1,2,3)。在没有PolyI:C处理或经1小时PolyI:C处理后没检测到这个区域的表达，但在2、4或8小时后其被诱导并随后在24小时强烈下降。对成对末端RNA测序读段的分析鉴定了一个在此区域内所有推定转录物中都存在的剪接点位点。此序列用作5’RACE分析的起始位点。这些分析得出了对单转录起始点的鉴定，所述单转录起始点后是227bp下游处的蛋白翻译起始点(图3)。
实施例2.IFNL4mRNA表达的分析
设计了用于对IFNL4mRNA进行定量的等位基因-特异性TaqMan测定，所述涉及是用Primer Express Software并通过Applied Biosystems按照要求来进行的。测定由下列引物组成：
IFNL4-p179_正向:GCCTGCTGCAGAAGCAGAGAT(SEQ ID NO:13)；
IFNL4-p179_反向:AGCCGAGCGCAGGACGA(SEQ ID NO:14)；和探针
IFNL4_VIC AA(无风险等位基因):ATCGCAGAAGGCC(SEQ ID NO:15)和
IFNL4FAM–C(风险等位基因):ATCGCAGCGGCCC(SEQ ID NO:16)。
这个测定应提供带有cDNA的255bp片段并且产物不应该用DNA获得。测定对转录物编码的IFNL4-p179高度特异，并且不检测任何其它的转录物(IFNL4-p131、p107等)。FAM荧光团标记了缺失等位基因，并且因而对IFNL4-p179的表达是特异的，而带有VIC荧光团的检测起阴性对照的作用，而mRNA转录物中应当未检测到带有插入等位基因的IFNL4p179。
由于特异性极高，这个测定甚至在无DNAse I处理的RNA样品也允许进行检测。可供选择的表达测定是：
IFNL4_alt_正向:GCCTGCTGCAGAAGCAGAGAT(SEQ ID NO:17)；
IFNL4_alt_反向:GCTCCAGCGAGCGGTAGTG(SEQ ID NO:18)；和探针
IFNL4_alt_VIC AA(无风险等位基因):ATCGCAGAAGGCC(SEQ ID NO:19)；IFNL4_alt FAM–C(风险等位基因):ATCGCAGCGGCCC(SEQ ID NO:20)。
这个测定比IFNL4-p179效率更高，但特异性更低。FAM荧光团检测带有风险等位基因的所有型以及VIC-带有非风险等位基因的所有型(VIC)的表达。
实施例3.新IFNL4基因的鉴定和序列分析
IFNL4转录物的全长开读框用如下引物从PolyI:C处理的原代人肝细胞的cDNA进行PCR扩增：
IFNL4正向:ATGCGGCCGAGTGTCTGGGCC(SEQ ID NO:21)；
IFNL4反向:GAGGCAAGGCCCAGAGTGTGCAG(SEQ ID NO:22)。
添加另外的序列到引物里以克隆为特异性载体。由于这个扩增子(amplicon)的GC含量非常高，PCR反应用AmpliTaq Gold 360Master Mix和360GC Enhancer，用降落PCR(touchdown PCR)程序进行，所述降落PCR程序包括初始的变性步骤：95℃10分钟，然后是20个循环(在95℃30秒，从70℃经60℃温度处每一步降1℃45秒2个循环，在72℃45秒)；25个另外的循环(在95℃30秒，在60℃45秒，和在72℃45秒)；以及在72℃7分钟的最后扩增时间。
将凝胶纯化的PCR片段(图5)克隆到C末端有pFC14A–Halo的标签的表达载体(Promega)中并测序以确认。与RNA序列数据相符，检测到了IFNL4转录物的3个剪接体，分别包含5、4、3个外显子并编码179(SEQ ID NO:2)、131(SEQ ID NO:5)和107(SEQ ID NO:8)个氨基酸的开读框。如下图6和表2列出了分配给所述各种开读框和相关的核酸分子以及本申请公开的其他序列的序列标识符。
表2.序列标识符
所有IFNL4剪接体的第一个外显子都包含此前未报道的二核苷酸变体(ss469415590)的ss469415590-ΔG等位基因，所述二核苷酸变体有两个等位基因：TT(插入等位基因)和ΔG(缺失等位基因)。通过BLAST和ClustalW的蛋白分析鉴定了IFNL4-p179蛋白和IFN-λ蛋白之间有强相似性，而IFNL3(IL28B)是最相似的蛋白，其中有29.1％和40.8％的氨基酸同一性和相似性(图6)。p179和IFN-λ蛋白之间的强同一性在对应所述IFN-λA和F螺旋的蛋白序列中被发现，IFN-λA和F螺旋代表第一IFN-λ受体IFNLR1(IFN28R1)的结合位点。然而，对应于第二IFN-λ受体结合位点的p179区域与在IFNL-λ蛋白中发现的那个是高度差异的(图7)。因此，与新的p179蛋白相关与干扰素λ家族和其它已知的2类细胞因子相关但不同。
实施例4.重组IFNL4蛋白的产生及用抗IFNL4单克隆抗体对其的检测
携带全长cDNA形式IFNL4-p179、p131和p107的C-末端His-标签融合构建体被转导入杆状病毒株sf9。因为在细胞培养基中未检测到表达，所以蛋白从细胞纯化。通过几轮纯化达到高纯度(85-90％)并用Coomassie染色确定，并用抗His和抗IFNL4的抗体进行Western印迹分析(图8)。
实施例5.小鼠抗IFNL4单克隆抗体的开发
将对应IFNL4-p179蛋白的氨基酸44-74的合成肽KALRDRYEEEALSWGQRNCSFRPRRDSPRPS(SEQ ID NO:23)与KLH(钥孔戚血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin))缀合用于免疫小鼠，以及与牛血清白蛋白(BSA)缀合用于筛选。通过抗(against)BSA缀合肽的直接酶免疫测定法(EIA)，从三只小鼠中用尾部流出血的血清样品得到免疫后的滴度。选择一只有最佳IFNL4特异性滴度的小鼠来生产单克隆抗体。分离来自选定动物中的脾脏B细胞并与骨髓瘤伴细胞(partner)融合生成IgG杂交瘤细胞。收集35个杂交瘤克隆的上清并进行筛选以识别纯化的重组IFNL4蛋白，这得到了对称为Mu抗-hu IFNL44G1的单克隆抗体的分离。表达Mu抗-hu IFNL44G1的杂交瘤细胞于2012年2月23日以ATCC登录号PTA-12575保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,)。这个实施例阐明了IFNL4的特异性检测，所述特异性检测是通过Western印迹和共聚焦成像通过抗IFNL4单克隆抗体的4G1克隆进行的(图8、9、10)。抗IFNL4抗体不识别IFN-α、IFNL3(IL28B)或IFNL4-p107，但对检测IFNL4-p179和可能的p131(至少通过共聚焦成像)是特异性的。对肝细胞瘤HepG2细胞中瞬时转染的IFNL4表达构建体和在用Poly I:C激活的原代人肝细胞中的内源IFNL4表达的共聚焦成像显示了细胞内的表达(图10)。通过阴性同种型对照—抗IgG抗体未检测到IFNL4。在转染了IFNL4-p179构建体的HepG2细胞中，通过用于融合IFNL4-Halo蛋白的抗Halo抗体和通过抗IFNL4抗体都检测到相似的细胞定位。小鼠和兔的抗IFNL4抗体的表位定位和特异性检测模式在图11中指出。
实施例6.IFNL4蛋白激活JAK/STAT途径的能力
IFNL4表达构建体和IFNL4重组纯化蛋白以及其他5个蛋白同种型表达构建体的生物活性，被评估为在瞬时转染的HepG2细胞中将45个用于人类信号传导途径的报告基因/蛋白构建体激活的能力。根据说明书(Qiagen,测试的报告基因/蛋白的完全列表可于本申请获取：http://www.sabiosciences.com/reporter_assay_product/HTML/CCA-901L.html)来使用荧光素酶Cignal 45-途径寻找报告阵列(Luciferase Cignal 45-PathwayFinder Reporter Arrays)。用表达构建体p179、p170、p143、p131、p124和p107转染细胞，或用纯化的重组蛋白—10ng/ml的IFN-α或IFNL3和/或IFNL4-p179处理细胞24小时。所有检验的构建体和蛋白，只有用IFNL4表达构建体的瞬时转染和纯化的IFN-a(I型干扰素)和IFNL3(III型干扰素)的处理激活了感染刺激响应元件(ISRE)-Luc和IRF3-Luc报告基因/蛋白(图12)。
I干扰素(IFN-α和-β)和III型干扰素(IFN-λ)通过JAK/STAT信号转导途径的STAT1和STAT2组分介导信号传输。ISRE-Luc Cignal报告基因/蛋白(Qiagen)在与串联的重复连接的最小(m)CMV启动子的控制下编码萤火虫荧光素酶报告基因，所述串联重复由构成ISRE的STAT1/STAT2结合位点(TAGTTTCACTTTCCC)n组成。用组成型表达的海肾荧光素酶共转染细胞，其作为内部对照用于将转染效率标准化(normalizing)和监测细胞生存能力。一些细胞也用表达IFNL4蛋白的构建体(p179,p131和p107)或空载体(模拟构建体)来共转染72小时。其他细胞用纯化的重组蛋白—1,10或100ng/ml的IFN-α或IFNL3(IL28B)，或IFNL4-p179,p107处理24h。所有研究用至少8个生物复制物进行。在特定的时间段后，测量荧光素酶和花虫(renilla)的表达水平并计算相对于转染模拟物的样品的荧光素酶/花虫比值。
个体ISRe-Luc测定(图13)的分析结果显示了显著的剂量-响应信号传输，所述信号传输是通过IFN-α或IFNL3以及通过转染的IFNL4-p179的激活，但不是通过转染的p107、p131激活，其显示的IFNL4-p179蛋白活性低于25％。所有研究用至少8个生物复制物进行。通过用Luciferase Cignal Lenti ISRE报告基因/蛋白构建体(Qiagen)来转导细胞和在有1x抗菌-抗真菌素(LifeTechnologies)和2ug/mL嘌呤霉素的DMEM+10％FBS中培育以选择阳性克隆来构建稳定表达相同ISRE-Luc报告基因/蛋白构建体的HepG2细胞系。通过测试纯化的重组IFN-α和IFNL3来鉴定最好的HepG2-ISRE-稳定的克隆。通过45个报告基因/蛋白筛选检测出的结果通过在HepG2稳定的ISRE-Luc细胞系中的瞬时转染来独立验证(图13)。与非功能蛋白同种型p131或p107或空的GFP载体(模拟物)相比，瞬时转染IFNL4构建体也诱导Huh7-Lunet细胞中的抗病毒活性，所述Huh7-Lunet细胞携带连接了荧光素酶报告基因/蛋白的亚基因组HCV复制子。实验是在48孔板里进行的，而荧光素酶的表达是在转染后48小时后测量的(图13)。
实施例7.STAT1/STAT2磷酸化分析
6孔板中的HepG2细胞是未处理的或用表达构建体或空Halo标签载体转染的，或是用50ng/ml的重组IFNL3在37℃处理1小时。等量的转染后48小时制备的全细胞裂解物(50μg/泳道)用于通过Western印迹的分析。用兔抗磷酸化-Tyr701-STAT1(Cell Signaling Technology)及兔抗磷酸化-Tyr689-STAT2(Millipore)抗体进行检测。剥离印迹，并用兔抗STAT1和抗STAT2抗体(SantaCruz Biotechnology)重新标记以测量总STAT1和STAT2蛋白的水平。只有用IFNL3的处理和用IFNL4构建体的瞬时表达诱导STAT1和STAT2的磷酸化(图14)。
实施例8.对转录物组和途径分析以及细胞内表达的IFNL4蛋白诱导干扰素刺激基因(ISGs)表达的能力的总体分析。
HepG2细胞用IFNL4-Halo表达构建体或用空的Halo-标签载体进行模拟转染。从转染的细胞(48小时)制备的高质量的RNA(RIN～10)用于HiSeq 2000(Illumina)的测序，每个样品生成约300M的读段。标准分析鉴定了535个在表达上＞2倍不同且FDR＜0.05的转录物。在这个套组上进行的精巧途径分析(Ingenuity Pathway Analysis,IPA)命名了一些途径和具体的转录物(图15)。根据说明书(Qiagen)用基于途径的RT2分析器(Profiler)PCR阵列在4个生物复制物中评估了选定的转录物的mRNA在特定条件下的表达(图15)。HepG细胞是未被处理或转染了空载体(模拟物)的；IFNL4–p179、IFNL4-p131或IFNL4-p107；或单独/在转染了模拟物或IFNL4-p179后用10ng/ml的IFN-α或IFN-λ处理24小时。转染的或未转染的细胞用IFN-α或IFN-λ在相同的时间点处理，对应于转染后24小时，并在相同的时间收获。通过qRT-PCR途径分析器阵列用个体特异性测定法来分析阵列(n＝90)上所有转录物的表达，并将其标准化至相同样品中测出的四个内源性对照(ACTB,GAPDH,HPRT1andRPL13A)的表达。数据以log2标度呈示，负值越小表明表达越高，误差线表明有95％置信区间的平均值(图15)。
IFNL4构建体的瞬时转染激活了同一套干扰素诱导的ISGs。在已经在表达IFNL4的样品里，不能通过额外的干扰素处理达到ISGs的进一步激活。
实施例9.人细胞系中ISRE-Luc报告基因/蛋白的差别激活。
将ISRE-Luc报告基因/蛋白与空载体或非功能形式p131或107的IFNL4构建体一起瞬时共转染到HepG2(肝细胞瘤)、293T(胚胎肾)和HeLa(宫颈癌)细胞系中。或者，用指明浓度的干扰素来处理ISRE-Luc报告基因/蛋白转染的细胞。通过IFNL4的ISRE-Luc的激活仅在HepG2和293T细胞中诱导(图16)。
实施例10.IFNL4的定点诱变。
进一步地，生成了83个IFNL4-p179的单点突变体，并在HepG2细胞里瞬时表达后评估他们的活性，所述评估是用ISRE-Luc报告基因/蛋白并与IFNL4-p179的活性比较来进行的(图17)。用QuikChange快速定点诱变试剂盒(QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent))来进行定点诱变。为使特定的IFNL4氨基酸突变，设计引物来改变密码子的第一个碱基。用原始的IFNL4-p179质粒作为个体PCR与诱变引物对反应的模版。用DpnI酶消化PCR产物以消除原始的未突变模版，将得到的质粒汇集并转化入OneShot TOP10Competent细胞中。将个体的克隆测序用于验证。图17和表3显示IFNL4突变体的类型和分布，以及他们反向激活ISRE-Luc报告基因/蛋白构建体的相对潜力。
表3.HepG2细胞中IFNL4突变体对于瞬时转染的ISRE-Luc报告基因/蛋白构建体的诱导。突变体的活性与IFNL4-p179相关。
对分成3组的83个IFNL4突变体的分析：IFNL3中有半胱氨酸(n＝7)，非半胱氨酸保守残基的(n＝38)以及非保守的(n＝38)。分析显示个非多态性半胱氨酸对于IFNL4的生物活性非常重要，因为它们的突变消除了IFNL4的生物活性。只有一个对应于天然遗传多态性Cys17Tyr的半胱氨酸是不影响IFNL4的生物活性的。在IFNL3和IFNL4之间保守的残基的突变体显示了对IFNL4生物活性更强的影响(图18)。
实施例11.IFNL4的3种天然多态性变体的生物活性分析
当IFNL4通过ss469415590-ΔG等位基因而生成，该蛋白可以携带3个额外的编码性的非同义变体(外显子1中的(rs73555604(Cys17Tyr)，外显子2中的rs142981501(Arg60Pro)和rs117648444(Pro70Ser))，全都存在于不同的IFNL4单体型(haplotypes)中(图19)。这些变体(Cys17Tyr、Arg60Pro和Pro70Ser)的生物活性与用于野生型IFNL4的构建体在3个生物复制物中进行比较，所述比较是在将全部表达构建体在HepG2细胞中瞬时表达之后。在转染后48小时提取RNA，并转变成cDNA并进行96qRT-PCR测定的测定法，所述96qRT-PCR测定法包含于抗病毒的qPCR面板(Qiagen)中。将所有转录物的表达标准化至4个内源性对照的表达。转染WT-IFNL4与突变体的细胞之间转录物显著不同(n＝33)，而突变体被用于采用主要成分分析(PCA)的进一步分析。主要成分分析(PCA)是基于33个涉及抗病毒响应的转录物的表达，在用特定等位基因蛋白构建体瞬时转染的HepG2细胞中通过qRT-PCR在3个生物复制物里测量的。PCA图显示，Pro70Ser突变体影响转录物的表达使其与WT-IFNL4和Cys17Tyr及Arg60Pro突变体的组都不同，后两者彼此聚近。被HepG2细胞中IFNL4等位基因蛋白构建体(WT-IFNL4,Cys17Tyr,Arg60Pro和Pro70Ser)的瞬时表达显著影响了表达的转录物的热图(heatmap)基于图20的实验结果。突变体Cys17Tyr和Arg60Pro显示出对这些转录物相似的影响，而Pro70Ser显示出与WT-IFNL4最大的不同，其与转染WT-IFNL4的细胞相比引起了IL15,IL18,CTSB,FOS和SPP1转录物的较低表达，以及与转染WT-IFNL4的细胞相比DAK,IRF7,DHX58和APOBEC3G转录物的较高表达。彩色图表对应于log2标度的由突变体引起的表达差异(与WT-IFNL4相比)。
本发明的广度和范围不应被任何前述的典型实施方案所限制，而应当仅根据下列权利要求及其等同物而限定。

Claims (38)

1.一种包含至少约30个连续氨基酸的分离的蛋白，所述连续氨基酸来自选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。
2.权利要求1的分离的蛋白，其中所述蛋白能够激活JAK/STAT信号转导途径。
3.权利要求1的分离的蛋白，其中所述分离的蛋白包含至少约40个连续氨基酸，所述连续氨基酸来自选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQID NO:5和SEQ ID NO:8。
4.权利要求1的分离的蛋白，其中所述分离的蛋白包含至少约60个连续氨基酸，所述连续氨基酸来自选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQID NO:5和SEQ ID NO:8。
5.权利要求1的分离的蛋白，其中所述分离的蛋白包含至少约80个连续氨基酸，所述连续氨基酸来自选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQID NO:5和SEQ ID NO:8。
6.权利要求1的分离的蛋白，其中所述分离的蛋白包含至少约100个连续氨基酸，所述连续氨基酸来自选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQID NO:5和SEQ ID NO:8。
7.权利要求1的分离的蛋白，其中所述分离的蛋白包含至少约110个连续氨基酸，所述连续氨基酸来自选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和SEQID NO:5。
8.权利要求1的分离的蛋白，其中所述分离的蛋白包含至少约140个连续氨基酸，所述连续氨基酸来自SEQ ID NO:2。
9.一种包含至少50个连续氨基酸的序列的分离的蛋白，其中所述至少50个连续氨基酸序列在其全长上与来自选自下组氨基酸序列的至少50个连续氨基酸序列是至少92％相同的：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。
10.权利要求9的分离的蛋白，其中所述分离的蛋白包含至少150个连续氨基酸的序列，所述序列在其全长上与来自SEQ ID NO:2的至少150个连续氨基酸序列是至少92％相同的。
11.权利要求9的分离的蛋白，其中所述至少50个连续氨基酸序列包含至少1个选自下组的序列特征：
a.在对应于SEQ ID NO:2的位置27的位置处的半胱氨酸残基；
b.在对应于SEQ ID NO:2的位置29的位置处的亮氨酸残基；
c.在对应于SEQ ID NO:2的位置30的位置处的丝氨酸残基；
d.在对应于SEQ ID NO:2的位置32的位置处的酪氨酸残基；
e.在对应于SEQ ID NO:2的位置34的位置处的丝氨酸残基；
f.在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的脯氨酸残基；
g.在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的亮氨酸残基；
h.在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的丙氨酸残基；
i.在对应于SEQ ID NO:2的位置44的位置处的赖氨酸残基；
j.在对应于SEQ ID NO:2的位置48的位置处的天冬氨酸残基；
k.在对应于SEQ ID NO:2的位置50的位置处的酪氨酸残基；
l.在对应于SEQ ID NO:2的位置111的位置处的亮氨酸残基；
m.在对应于SEQ ID NO:2的位置112的位置处的亮氨酸残基；
n.在对应于SEQ ID NO:2的位置118的位置处的天冬氨酸残基；
o.在对应于SEQ ID NO:2的位置120的位置处的丙氨酸残基；
p.在对应于SEQ ID NO:2的位置122的位置处的半胱氨酸残基；
q.在对应于SEQ ID NO:2的位置152的位置处的半胱氨酸残基；
r.在对应于SEQ ID NO:2的位置157的位置处的缬氨酸残基；
s.在对应于SEQ ID NO:2的位置160的位置处的天冬酰胺残基；
t.在对应于SEQ ID NO:2的位置161的位置处的亮氨酸残基；
u.在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置处的精氨酸残基；
v.在对应于SEQ ID NO:2的位置165的位置处的亮氨酸残基；
w.在对应于SEQ ID NO:2的位置166的位置处的苏氨酸残基；
x.在对应于SEQ ID NO:2的位置173的位置处的丙氨酸残基；和
y.在对应于SEQ ID NO:2的位置178的位置处的半胱氨酸残基。
12.权利要求9的分离的蛋白，其中所述分离的蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在其全长上与选自下组的氨基酸序列至少92％相同：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。
13.权利要求1的分离的蛋白，其中所述分离的蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。
14.权利要求1的分离的蛋白，其中所述蛋白具有至少一种选自下组的活性：引发抗体，所述抗体选择性地结合由SEQ ID NO:2组成的蛋白；选择性地结合化合物，所述化合物结合由SEQ ID NO:2组成的蛋白；激活JAK/STAT途径的表达；以及诱导图15中列出的至少一种免疫血清球蛋白(ISG)的表达。
15.权利要求1的分离的蛋白，其中所述蛋白激活所述JAK/STAT途径。
16.一种包含选自下组的核酸序列的分离的核酸分子：
a.编码权利要求1的分离的蛋白的核酸序列；以及
b.与(a)的核酸序列完全互补的核酸序列。
17.权利要求16的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQID NO:7，和SEQ ID NO:9。
18.一种包含权利要求16的核酸分子的质粒。
19.一种包含权利要求16的核酸分子的病毒。
20.一种分离的抗体，所述分离的抗体抑制抗体的结合，所述抗体选择性结合权利要求9的分离的蛋白。
21.一种分离的抗体，其选择性结合权利要求9的分离的蛋白。
22.一种变体IFNL4多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与IFNL4-p179,p131和p107(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8)具有至少90％，至少95％，至少97％，至少98％或至少99％序列同一性，其中所述变体多肽：
(a)与SEQ ID NO:2相比具有至少一个氨基酸取代，选自：A10P,A11P,L13M,V15F,C17Y,V19M,I20V,A21P,R26G,L28M,L35M,L40M,E52K,L55M,W57R,R60P,N61H,S63P,F64V,R65G,D69H,P70S,P71T,R72G,R78G,V92M,L93I,L101M,L102F,G116R,A121P,A126P,P128A,G129A,S130P,R132G,P135A,K139R,R140G,K143E,R146K,S149P,P150A,K154E,A155P,S156G,V158I,F159V,L162M,L164M和L169F；
(b)与SEQ ID NO:2相比具有至少一个氨基酸取代，选自：A10P,A11P,L13M,V15F,C17Y,V19M,I20V,A21P,R26G,L28M,L35M,L40M,E52K,L55M,W57R,R60P,N61H,S63P,F64V,R65G,D69H,P70S,P71T,R72G,G116R,A121P,A126P,P128A,G129A,S130P,R132G,P135A,K139R,R140G,K143E,R146K,S149P,P150A,K154E,A155P,S156G,V158I,F159V,L162M,L164M和L169F；
(c)与SEQ ID NO:2相比具有至少一个氨基酸取代，选自：A10P,A11P,L13M,V15F,C17Y,V19M,I20V,A21P,R26G,L28M,L35M,L40M,G116R,A121P,A126P,P128A,G129A,S130P,R132G,P135A,K139R,R140G,K143E,R146K,S149P,P150A,K154E,A155P,S156G,V158I,F159V,L162M,L164M和L169F；或
(d)与SEQ ID NO:2相比具有至少一个氨基酸取代，选自：C27G,S34P,P37A,D48H,C62R,A87P,D118H,A120P,C122G,C152G,V157L,N160D,L161F,L164M,L165F,T166P,L169F和A173P。
23.一种用于预测个体自发清除HCV感染的可能性的方法，所述方法包括：
(a)从所述个体获得生物样品；以及
(b)分析所述样品以确定本发明的IFNL4mRNA或蛋白的存在或缺失；
其中本发明的IFNL4蛋白的存在指示所述个体自发清除HCV感染的可能性。
24.权利要求23的方法，其中IFNL4mRNA或蛋白的缺失指示预测所述个体自发清除HCV感染。
25.权利要求23的方法，其中IFNL4mRNA或蛋白的存在指示预测所述个体不能自发清除HCV感染。
26.一种用于预测个体应答对于HCV感染的治疗的可能性的方法，所述方法包括：
(a)从所述个体获得生物样品；以及
(b)分析所述样品以确定本发明的IFNL4蛋白的存在或缺失；
其中本发明的IFNL4蛋白的存在指示所述个体应答对于HCV感染的治疗的可能性。
27.权利要求26的方法，其中IFNL4蛋白的缺失指示预测所述个体应答对于HCV感染的治疗。
28.权利要求26的方法，其中IFNL4蛋白的存在指示预测所述个体不能应答对于HCV感染的治疗。
29.一种用于预测个体自发清除HCV感染的可能性的方法，所述方法包括：
(a)从个体获得生物样品；以及
(b)确定所述样品中存在的IFNL4蛋白的水平，如果存在的话；
其中所述样品中存在的IFNL4蛋白的水平指示所述个体自发清除HCV感染的可能性。
30.权利要求29的方法，其中样品中IFNL4的水平低于已知能够清除HCV感染的受试者中存在的IFNL4蛋白的水平，指示预测所述个体能够清除HCV感染。
31.权利要求29的方法，其中样品中IFNL4的水平高于已知不能清除HCV感染的受试者中存在的IFNL4蛋白的水平，指示预测所述个体不能清除HCV感染。
32.一种用于治疗罹患慢性丙型肝炎病毒感染的患者的方法，所述方法包括：
(a)从所述个体获得生物样品；以及
(b)分析所述样品以确定所述样品中IFNL4蛋白的存在、缺失或水平；以及，
(c)基于样品中IFNL4蛋白的存在、缺失或量来确定是否施用治疗。
33.一种用于鉴定IFNL4蛋白活性的调节因子的方法，所述方法包括：
(a)在允许测量IFNL4蛋白活性的条件下温育IFNL4蛋白；
(b)测量所得的IFNL4活性；
(c)在步骤(a)中使用的条件下，在测试化合物存在下温育IFNL4蛋白；
(d)测量所得的IFNL4活性；以及
(e)比较步骤(b)中获得的IFNL4活性与步骤(d)中获得的IFNL4活性；
其中如果步骤(b)中获得的IFNL4活性与步骤(d)中获得的IFNL4活性之间的差异是统计学上显著的，则将测试化合物鉴定为IFNL4活性的调节因子。
34.权利要求23、26或29的方法，其中如果检测到IFNL4，所述方法进一步包括分析所述检测到的蛋白中1个或多个突变的存在。
35.权利要求34的方法，其中所述突变选自下组：Cys17Tyr、Arg60Pro和Pro70Ser。
36.一种用于确定样品中IFNL4蛋白的存在、缺失或水平的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求21的抗体。
37.权利要求36的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于确定个体自发清除HCV感染的能力的说明书。
38.权利要求36的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于确定个体应答对于HCV感染的治疗的能力的说明书。
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