CN108060087A - 一种小麦赤霉病轻简化接种方法 - Google Patents

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杨继芝
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龚国淑
陈华保
尚静
胡玉婷
李涛
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Abstract

本发明公开了一种小麦赤霉病轻简化接种方法，它包括下述步骤：(1)配制PDA培养基；(2)配置小麦赤霉病菌孢子悬浮液：(3)制备带菌牙签：(4)赤霉病菌的接种与套袋：以步骤(3)中制备的带菌牙签进行牙签接种、套袋；(6)观察、记录与统计：在接种后第21天时，调查统计标记小麦穗的总小穗数、发病小穗数，并计算出病小穗率。本发明中所公开的小麦赤霉病轻简化接种方法，该接种方法是用牙签接种的方法，简化了田间的接种步骤，轻简化了接种鉴定方法，提高了育种效率,为早期鉴定、筛选材料提供方法和标准。

Description

一种小麦赤霉病轻简化接种方法
技术领域
本发明涉及一种小麦赤霉病的接种方法，特别涉及一种小麦赤霉病轻简化 接种方法。
背景技术
小麦是我国主要粮食作物之一，我国小麦的种植面积大约占总粮食种植面 积的1/4，总产量仅次于水稻。因此，小麦生产对中国的粮食保障起着十分重要 的作用，影响着我国乃至全世界的农业和社会经济发展。小麦赤霉病(Fusarium Head Blight,FHB)是小麦生产中的重要病害之一，其严重程度仅次于条锈病， 国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)将赤霉病确定为小麦产量中的一个主要限制 因素。小麦赤霉病菌侵入寄主后，不仅造成产量的损失，同时引起严重的毒素 污染，被毒素污染的麦粒对人畜都有较大的危害。
选育抗小麦赤霉病的小麦优良品种，是最有效、环保的防治小麦赤霉病的 方法。选育优良的抗赤霉病的小麦品种，需要对小麦进行抗性鉴定。因此，小 麦赤霉病的抗性鉴定技术一直是人们关注的问题，目前国内外报道的赤霉病抗 性评价方法主要有5种:
1)自然鉴定法。小麦在自然条件下发病，不进行人工接种，但是该方法鉴 定结果的一致性、稳定性较差，精确的表型鉴定非常困难。
2)花期喷雾鉴定法。在小麦抽穗扬花期将赤霉菌孢子液喷雾接种，该法较 自然鉴定法略好，但同时也存在表型鉴定难以精确和个体间发病率差异较大的 问题。喷雾接种时小麦所处的发育时期、喷雾接种次数、孢子浓度以及温湿度 等因素都是影响迷雾鉴定可靠性的重要因素。如果孢子浓度过稀，造成发病极 不一致的情形，即便感病的品种，也会有发病率极轻甚至不发病，出现所谓的 假抗性品种或“假免疫”类型品种，因此该法适合育种材料的大规模初步筛选。
3)土表接种法。在抽穗扬花期在田块表面撒带赤霉菌的玉米粒、燕麦粒或 粉碎的秸秆，配合喷雾设施，进行接种鉴定。该法模拟自然侵染法，但较自然 侵染法略好，适合抗病材料的大规模初步筛选和鉴定，不宜做精确鉴定和遗传 分析。
4)组织叶片离体鉴定法。利用病菌侵染离体的叶片组织，根据病斑的大小 鉴定抗感。由于赤霉病主要发生在穗部而非叶片，因此该法有多大程度反应品 种本身的抗性(尤其是扩展抗性)，有待商榷。
5)单花滴注法。此方法是目前已经成熟并广泛应用于实践中的抗性鉴定 技术主要是花期单花滴注法，其主要特征为：于小麦始花期在选取小麦的中下 部小穗，滴注赤霉菌孢子液10uL于小穗上，孢子液浓度C≥1×105。每个株 系接种10-15穗。田间接种后，用塑料袋套住穗部，保湿3d后去除，温室接 种后，控温控湿条件下,弥雾保湿3d。接种后21天观察并统计小麦发病小穗数 和总小穗数，计算出发病率、病情指数等抗病性鉴定指标。但是该方法在田间 进行大量接种试验时，具有耗时、耗力、接种方法繁复、易受环境影响等缺点。
评价赤霉病抗性鉴定方法优劣的主要指标有：1)是否受环境因素的影响大； 2)发病率，小麦赤霉病菌是半腐生菌，只要接种方法得当，理论或期望发病普 遍率应该达到100％；3)评价结果的稳定性和一致性，。评价结果在环境间、重 复间以及同一基因型个体间应具有重复性；4)是否环境友好；5)接种方法的 易操作性、效率和成本。
以往田间小麦赤霉病的接种试验大多都采用技术较为成熟的单花滴注方法 进行试验，由于田间赤霉病接种量大，此方法虽然准确，却步骤繁琐且耗时耗 力。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦赤霉病轻简化接种方法，该接种方法是用牙 签接种的方法，简化了田间的接种步骤，轻简化了接种鉴定方法，提高了育种 效率,为早期鉴定、筛选材料提供方法和标准。
本发明的发明目的是由以下技术方案来实现的：
一种小麦赤霉病轻简化接种方法，包括下述步骤：
(1)配制PDA培养基；
(2)配置小麦赤霉病菌孢子悬浮液：采用绿豆培养基制作小麦赤霉病孢子 悬浮液，获得光学显微镜10×10倍镜每个视野下20-30个孢子的孢子悬浮液；
(3)制备带菌牙签：将长度一致的牙签进行灭菌后，在无菌条件下，用牙 签蘸取步骤(2)中配置好的小麦赤霉病菌孢子悬浮液后转入步骤(1)中配置 的PDA培养基上，在20℃-30℃恒温培养箱中培养4.5d-5.5d；
(4)赤霉病菌的接种与套袋：在小麦有40％-60％麦穗杨花时，选取长势良 好的同一品种的小麦植株标记挂牌，以步骤(3)中制备的带菌牙签进行牙签接 种、套袋，牙签接种至少设10个重复；
(5)观察、记录与统计：在接种后第21天时，调查统计标记小麦穗的总 小穗数、发病小穗数，并计算出病小穗率。
进一步的，所述步骤(1)中的PDA培养基的制备方法为：称取马铃薯，将 其去皮后切成小块，然后加蒸馏水进行水煮，待马铃薯煮软后，采用6层纱布 过滤；然后加入葡萄糖和琼脂粉，所述马铃薯、葡萄糖和琼脂粉之间的质量比 为：18-22：2：1；化开后加蒸馏水定容，在温度为115℃-125℃进行湿热灭菌 25min-35min。
进一步的，所述马铃薯、葡萄糖和琼脂粉之间的质量比为：20：2：1。
进一步的，所述步骤(2)中，配置小麦赤霉病菌孢子悬浮液包括下述步骤：
①制备绿豆培养基：将绿豆加入蒸馏水煮28min-35min后定容，绿豆和定容 体积之间的质量(g)：体积比(L)为30：1，过滤后分装至锥形瓶中，进行灭 菌；
②在无菌条件下，接入小麦赤霉病菌菌饼，在温度为25℃-30℃、 100r/min-200r/min的摇床中培养2.5d-3.5d，然后用纱布过滤菌丝，获得高浓 度小麦赤霉病菌孢子悬浮液；
③在无菌条件中用显微镜观察步骤②中高浓度小麦赤霉病菌孢子悬浮液，并 通过不断稀释获得光学显微镜10×10倍镜每个视野下20-30个孢子的孢子悬浮 液。
进一步的，所述步骤(3)中的牙签在蘸取步骤(2)中配置好的小麦赤霉 病菌孢子悬浮液之前，需要将牙签截断为2cm长，在121℃温度下进行湿热灭菌 30min。
进一步的，所述步骤(3)中，用牙签蘸取步骤(2)中配置好的小麦赤霉 病菌孢子悬浮液后转入步骤(1)中配置的PDA培养基上后，是在25℃恒温培养 箱中培养5d。
进一步的，所述步骤(4)中，是在小麦有50％麦穗杨花时，选取长势良好 的同一品种的小麦植株标记挂牌。
进一步的，所述步骤(4)中，牙签接种方法设20个重复。
进一步的，所述步骤(4)中，牙签接种方法接种套袋是采用宽16cm×长 20cm的透明食品袋。
本发明的有益效果：
本发明中的小麦赤霉病轻简化接种方法，该接种方法是用牙签接种的方法， 该牙签接种的方法与单花滴注接种方法获得的结果差异不显著，但是在田间接 种大量的赤霉病菌时，牙签接种比单花滴注方法更为轻简、便捷。该接种方法 简化了田间的接种步骤，轻简化了接种鉴定方法，提高了育种效率,为早期鉴定、 筛选材料提供方法和标准。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
1、选用小麦品种“蜀麦969”中颗粒饱满的种子于2016年10月进行田间 播种，并做好田间管理措施。
2、进行本发明牙签接种的同时以禾谷镰刀菌单花滴注接种为对照试验。
具体步骤为：
(1)配制PDA培养基：
称取200g马铃薯，将其去皮后切成小块，然后加蒸馏水进行水煮，待马铃 薯煮软后，采用6层纱布过滤；然后加入20g葡萄糖和10g琼脂粉；化开后加 蒸馏水定容至1L，在温度为121℃进行湿热灭菌30min；
(2)菌种的活化：选取致病力强的禾谷镰刀菌菌株接种于步骤(1)中配 置的PDA培养基上，在25℃恒温培养箱中活化扩繁；
(3)配置小麦赤霉病菌孢子悬浮液：采用绿豆培养基制作小麦赤霉病孢子 悬浮液，获得光学显微镜10×10倍镜每个视野下20-30个孢子的孢子悬浮液， 具体的步骤为：
①制备绿豆培养基：将30g绿豆加入蒸馏水煮30min后定容至1L，过滤后 分装至150ml的锥形瓶中，进行灭菌；；
②在无菌条件下，接入5mm的小麦赤霉病菌菌饼5个，在温度为28℃、 150r/min的摇床中培养3d，然后用纱布过滤菌丝，获得高浓度小麦赤霉病菌孢 子悬浮液；
③在无菌条件中用显微镜观察步骤②中高浓度小麦赤霉病菌孢子悬浮液，并 通过不断稀释获得光学显微镜10×10倍镜每个视野下20-30个孢子的孢子悬浮 液；
(4)制备带菌牙签：将牙签截断为2cm长，在121℃温度下进行湿热灭菌 30min，然后在无菌条件下，用牙签蘸取步骤(3)中配置好的小麦赤霉病菌孢 子悬浮液后转入步骤(1)中配置的PDA培养基上，在25℃恒温培养箱中培养 5d；
(5)赤霉病菌的接种与套袋：在2017年3月底4月初，小麦有50％麦穗杨 花时，选取长势良好的同一品种的小麦植株标记挂牌，以步骤(4)中制备的带 菌牙签进行牙签接种、套袋，同时设置对照组，对照组是以步骤(2)中活化繁 殖后的禾谷镰刀菌单花滴注接种、套袋，两种接种方法各设20个重复；前述两 种接种方法接种套袋均是采用宽16cm×长20cm的透明食品袋，该透明食品袋有 手提部分，采用有手提部的透明食品袋可不用塑料绳扎捆直接打结固定，提高 工作效率；
(6)观察、记录与统计：在接种后第21天时，调查统计标记小麦穗的总 小穗数、发病小穗数，并计算出病小穗率，记录结果如下表1所示。
表1实施例1中牙签接种和单花滴注接种试验结果统计表
实施例1中牙签接种和单花滴注接种试验结果及原始数据见上述表1。牙签 接种法和单花滴注接种法两个不同接种方法的处理，在接种第21天时的平均病 小穗率分别达到89.13％和86.06％。采用配对两个不同接种方法的处理t检验 法对试验数据进行统计分析，得到df＝19；t＝0.8003；p＝0.4334。以上结果表明： 牙签接种和单花滴注接种之间的平均防治效果差异不显著。
通过以上试验结果及分析可得出结论：牙签接种与单花滴注获得的结果差 异不显著，但是在田间接种大量的赤霉病菌时，牙签接种比单花滴注方法更为 轻简、便捷。
实施例2：
1、选用小麦品种“蜀麦969”中颗粒饱满的种子于2016年10月进行田间 播种，并做好田间管理措施。
2、进行本发明牙签接种的同时以禾谷镰刀菌单花滴注接种为对照试验。
具体步骤为：
(1)配制PDA培养基：
称取180g马铃薯，将其去皮后切成小块，然后加蒸馏水进行水煮，待马铃 薯煮软后，采用6层纱布过滤；然后加入20g葡萄糖和10g琼脂粉；化开后加 蒸馏水定容至1L，在温度为121℃进行湿热灭菌30min；
(2)菌种的活化：选取致病力强的禾谷镰刀菌菌株接种于步骤(1)中配 置的PDA培养基上，在25℃恒温培养箱中活化扩繁；
(3)配置小麦赤霉病菌孢子悬浮液：采用绿豆培养基制作小麦赤霉病孢子 悬浮液，获得光学显微镜10×10倍镜每个视野下20-30个孢子的孢子悬浮液， 具体的步骤为：
①制备绿豆培养基：将30g绿豆加入蒸馏水煮30min后定容至1L，过滤后 分装至150ml的锥形瓶中，进行灭菌；；
②在无菌条件下，接入5mm的小麦赤霉病菌菌饼5个，在温度为30℃、 150r/min的摇床中培养3d，然后用纱布过滤菌丝，获得高浓度小麦赤霉病菌孢 子悬浮液；
③在无菌条件中用显微镜观察步骤②中高浓度小麦赤霉病菌孢子悬浮液，并 通过不断稀释获得光学显微镜10×10倍镜每个视野下20-30个孢子的孢子悬浮 液；
(4)制备带菌牙签：将牙签截断为2cm长，在121℃温度下进行湿热灭菌 25min，然后在无菌条件下，用牙签蘸取步骤(3)中配置好的小麦赤霉病菌孢 子悬浮液后转入步骤(1)中配置的PDA培养基上，在25℃恒温培养箱中培养 5d；
(5)赤霉病菌的接种与套袋：在2017年3月底4月初，小麦有55％麦穗杨 花时，选取长势良好的同一品种的小麦植株标记挂牌，以步骤(4)中制备的带 菌牙签进行牙签接种、套袋，同时设置对照组，对照组是以步骤(2)中活化繁 殖后的禾谷镰刀菌单花滴注接种、套袋，两种接种方法各设20个重复；前述两 种接种方法接种套袋均是采用宽16cm×长20cm的透明食品袋；
(6)观察、记录与统计：在接种后第21天时，调查统计标记小麦穗的总 小穗数、发病小穗数，并计算出病小穗率，记录结果如下表2所示。
表2实施例2中牙签接种和单花滴注接种试验结果统计表
实施例2中牙签接种和单花滴注接种试验结果及原始数据见上述表2。牙签 接种法和单花滴注接种法两个不同接种方法的处理，在接种第21天时的平均病 小穗率分别达到90.58％和86.09％。
通过以上试验结果及分析可得出结论：牙签接种与单花滴注获得的结果差 异不显著，但是在田间接种大量的赤霉病菌时，牙签接种比单花滴注方法更为 轻简、便捷。
在本发明的实施例1和实施例2中均是采用光学显微镜来观察孢子悬浮液 是否达到了配置标准，当然也可以采用其他类型的显微镜来观察。
当然，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员应 该可以根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应 属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种小麦赤霉病轻简化接种方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)配制PDA培养基；
(2)配置小麦赤霉病菌孢子悬浮液：采用绿豆培养基制作小麦赤霉病孢子悬浮液，获得光学显微镜10×10倍镜每个视野下20-30个孢子的孢子悬浮液；
(3)制备带菌牙签：将长度一致的牙签进行灭菌后，在无菌条件下，用牙签蘸取步骤(2)中配置好的小麦赤霉病菌孢子悬浮液后转入步骤(1)中配置的PDA培养基上，在20℃-30℃恒温培养箱中培养4.5d-5.5d；
(4)赤霉病菌的接种与套袋：在小麦有40％-60％麦穗杨花时，选取长势良好的同一品种的小麦植株标记挂牌，以步骤(3)中制备的带菌牙签进行牙签接种、套袋，牙签接种至少设10个重复；
(5)观察、记录与统计：在接种后第21天时，调查统计标记小麦穗的总小穗数、发病小穗数，并计算出病小穗率。
2.根据权利要求1所述的小麦赤霉病轻简化接种方法，其特征在于：所述步骤(1)中的PDA培养基的制备方法为：称取马铃薯，将其去皮后切成小块，然后加蒸馏水进行水煮，待马铃薯煮软后，采用6层纱布过滤；然后加入葡萄糖和琼脂粉，所述马铃薯、葡萄糖和琼脂粉之间的质量比为：18-22：2：1；化开后加蒸馏水定容，在温度为115℃-125℃进行湿热灭菌25min-35min。
3.根据权利要求2所述的小麦赤霉病轻简化接种方法，其特征在于：所述马铃薯、葡萄糖和琼脂粉之间的质量比为：20：2：1。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的小麦赤霉病轻简化接种方法，其特征在于：所述步骤(2)中，配置小麦赤霉病菌孢子悬浮液包括下述步骤：
①制备绿豆培养基：将绿豆加入蒸馏水煮28min-35min后定容，绿豆和定容体积之间的质量(g)：体积比(L)为30：1，过滤后分装至锥形瓶中，进行灭菌；
②在无菌条件下，接入小麦赤霉病菌菌饼，在温度为25℃-30℃、100r/min-200r/min的摇床中培养2.5d-3.5d，然后用纱布过滤菌丝，获得高浓度小麦赤霉病菌孢子悬浮液；
③在无菌条件中用显微镜观察步骤②中高浓度小麦赤霉病菌孢子悬浮液，并通过不断稀释获得光学显微镜10×10倍镜每个视野下20-30个孢子的孢子悬浮液。
5.根据权利要求4所述的小麦赤霉病轻简化接种方法，其特征在于：所述步骤(3)中的牙签在蘸取步骤(2)中配置好的小麦赤霉病菌孢子悬浮液之前，需要将牙签截断为2cm长，在121℃温度下进行湿热灭菌30min。
6.根据权利要求5所述的小麦赤霉病轻简化接种方法，其特征在于：所述步骤(3)中，用牙签蘸取步骤(2)中配置好的小麦赤霉病菌孢子悬浮液后转入步骤(1)中配置的PDA培养基上后，是在25℃恒温培养箱中培养5d。
7.根据权利要求6所述的小麦赤霉病轻简化接种方法，其特征在于：所述步骤(4)中，是在小麦有50％麦穗杨花时，选取长势良好的同一品种的小麦植株标记挂牌。
8.根据权利要求7所述的小麦赤霉病轻简化接种方法，其特征在于：所述步骤(4)中，牙签接种方法设20个重复。
9.根据权利要求8所述的小麦赤霉病轻简化接种方法，其特征在于：所述步骤(4)中，牙签接种方法接种套袋是采用宽16cm×长20cm的透明食品袋。
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