CN107058131A - 一株纺锤链霉菌及其应用 - Google Patents

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徐剑宏
史建荣
寇程坤
王刚
徐丽梅
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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Abstract

本发明提供一株纺锤链霉菌（Streptomyces netropsis AFKCK‑10），其保藏号为CCTCC NO:M2016752，该菌菌丝呈丝状，无横隔，革兰氏染色阳性，轮生孢子，孢子柱形，表面光滑；可制备成液体孢子液或可湿性粉剂，用以防治小麦赤霉病、降低小麦中赤霉毒素含量；其在解决小麦赤霉毒素污染的过程中，没有毒副产品的产生，不存在二次污染，从而促进农产品质量安全，确保人畜的食用安全。

Description

一株纺锤链霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是一株纺锤链霉菌（Streptomyces netropsis AFKCK-10）及其应用。
背景技术
小麦赤霉病是一种典型的气候型病害，在世界范围内均有发生，在我国的长江中下游地区尤为严重，且近年来赤霉病的发生频率和发病严重度逐渐增加，根据小麦赤霉病的发病特点，该病又被称为烂麦头、红麦头、麦穗枯等。随着全球气候的变化、农业耕作中免耕、秸秆还田种植技术的改变，小麦赤霉病的发病率呈逐年上升趋势，已经成为小麦生产中的主要病害。自20世纪90年代起，赤霉病给美国农业造成了极大的影响，损失多达30亿美元，很少有单个农业病害能带来如此庞大的损失。在我国，赤霉病的波及范围和危害也极大，其中发生频率高、损失最大的是长江中下游地带。但近年来，小麦赤霉病在华北麦区也逐渐流行，增加趋势明显，发病面积逐步扩大。
赤霉病菌感染赤霉病后可以产生多种毒素，其中最主要为呕吐毒素（DON）和玉米赤霉烯酮毒素（ZEN）。DON毒素会对人畜造成毒害，使动物产生包括嗜睡、食欲丧失、呕吐、肠道损伤、皮肤坏死、胃肠功能障碍、免疫功能障碍和繁殖功能障碍等症状。
目前针对小麦赤霉病及其产生的毒素污染问题，主要采取的是化学药剂防治的方法，如：多菌灵、氰烯菌酯、福美双、甲基硫菌灵等，这些方法尽管在一定程度上控制了小麦赤霉病的病害，但是化学药剂本身会造成小麦中化学药剂的残留，摄入后影响人体健康，而且由于单一化学药剂的长期使用，产生了大量的抗性菌株，使得赤霉病发病没法得到有效控制。同时一些在小麦收获前期没有发病，但是收获的时候受到感染，这些染病小麦籽粒看起来很健康，但其中已含有大量毒素，误食后严重危害人体健康。因此，利用微生物制剂控制赤霉病菌的生长和产毒是一种比较理想的选择。
微生物数量大、种类多、基因资源丰富、而且干净彻底、无二次污染，因此，利用微生物来控制毒素是解决赤霉毒素污染的最好办法。纺锤链霉菌（Streptomyces netropsis）作为一种生防菌，属于放线菌属，孢子萌发后产生气生菌丝和基内菌丝，基内菌丝非常纤细，可以产生色素，改变培养基的颜色；气生菌丝成熟后可以产生成链的孢子，孢子丝成轮生状；现有报道的纺锤链霉菌可以产生多种的抗菌活性物质，有的物质具有抗真菌和抗肿瘤的作用，可以控制病原菌的生长。目前尚未有将纺锤链霉菌用于赤霉病防控、减少DON毒素和ZEN毒素产生的相关报道。
发明内容
针对上述小麦中赤霉病病害和赤霉毒素严重污染的问题，本发明提供一株对赤霉病菌具有防控作用的纺锤链霉菌，用于控制小麦赤霉病，减少小麦中DON毒素和ZEN毒素的含量，本发明是这样实现的：
一株纺锤链霉菌（Streptomyces netropsis），其保藏号为CCTCC NO:M2016752；所述纺锤链霉菌菌丝呈丝状，无横隔，革兰氏染色阳性，轮生孢子，孢子为柱形，表面光滑；其电镜照片如图1所示，16SrDNA 序列如SEQ ID NO.1所示。
一种保藏号为CCTCC NO:M2016752的纺锤链霉菌在防治小麦赤霉病或降低小麦中赤霉毒素含量中的应用。
进一步，将所述纺锤链霉菌制成纺锤链霉菌液体菌剂或纺锤链霉菌可湿性粉剂，用于防治小麦赤霉病或降低小麦中赤霉毒素含量；其中，所述纺锤链霉菌液体菌剂OD600不低于5.0，使用时，加水稀释后喷施于小麦穗部，纺锤链霉菌液体菌剂（原液）施用量为5-20ml/m2，用于防治小麦赤霉病或降低小麦中赤霉毒素含量；
所述纺锤链霉菌可湿性粉剂OD600不低于5.0，使用时，加水制成悬浮剂，喷施于小麦穗部，纺锤链霉菌可湿性粉剂的施用量为15-60 g/m2，用于防治小麦赤霉病或降低小麦中赤霉毒素含量。
进一步，本发明所述所述纺锤链霉菌应用中，纺锤链霉菌液体菌剂是这样获得的：
A）将所述纺锤链霉菌接种于PDA培养基中, 30℃试管斜面培养6天后，用无菌水洗下试管斜面表面的孢子，稀释成浓度107个/ml的孢子悬液，然后按照1%的体积比（ml/ ml）接种到PDB培养基中，30℃培养至孢子浓度大于108个/ml（约6天左右），获得一级种子液；
B）将一级种子液按照10%体积比（ml/ ml）的接种量接种至含有发酵培养基的种子罐中，温度28-32℃，搅拌速率150-180rpm，培养菌种至对数生长期（约60-72h），培养期间通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，获得二级种子液；
C）将二级种子液按照10%体积比（ml/ ml）的接种量接种至含有发酵培养基的发酵罐中，28-32℃， 150-180rpm搅拌培养至发酵液的OD600不低于5.0（约60-72h）；发酵培养期间向发酵罐中通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，即获得所述纺锤链霉菌液体菌剂；
发酵培养基：葡萄糖20g,酵母粉10g, (NH4)2SO4 1g, MgSO4 0.2g, 酪蛋白3g, 蒸馏水1L，pH值为7.2-7.5。
进一步，本发明所述所述纺锤链霉菌应用中，所述纺锤链霉菌可湿性粉剂是将所述纺锤链霉菌液体菌剂与硅藻土、凹凸棒土按质量比1:1:1混合后获得的。
本发明中所述赤霉毒素是指DON毒素和ZEN毒素。
本发明通过对赤霉菌拮抗菌的筛选，获得能够同时抑制赤霉菌生长、同时减少DON毒素和ZEN毒素产生的纺锤链霉菌，并保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编：430072；保藏号为CCTCC NO：M2016752；保藏日期为2016年12月14日。
本发明提供的纺锤链霉菌不但能有效地抑制赤霉病菌的生长，而且还能控制赤霉毒素的产生；同时在解决毒素污染的过程中，也没有毒副产品的产生，不存在二次污染，从而提高农产品的质量，确保人畜的食用安全；以该菌种制备的液体菌剂和固体菌剂，用于小麦赤霉病的防控，降低小麦中DON毒素和ZEN毒素含量，生产使用成本低，适宜推广使用。
附图说明
图1为纺锤链霉菌电镜照片。
图2为实施例纺锤链霉菌对禾谷镰刀菌的抑制效果示意图。
具体实施方式
实施例涉及的培养基配方：
PDB培养基：马铃薯200g/L,葡萄糖20 g/L，余量为蒸馏水；
PDA培养基：马铃薯200g/L,葡萄糖20 g/L,琼脂15 g/L，余量为蒸馏水；
发酵培养基：葡萄糖20g,酵母粉10g, (NH4)2SO4 1g, MgSO4 0.2g, 酪蛋白3g, 蒸馏水1L，pH值为7.2-7.5。
实施例中涉及的禾谷镰刀菌GZ3639菌株由美国农业部真菌毒素研究中心馈赠。
实施例1 筛选菌株
从安徽淮北水稻地采集土壤样品，加入无菌水，混匀后，进行系列稀释，把不同浓度的稀释液分别涂布于PDA培养基上，30℃条件下培养5天后，挑取平板上不同的菌落，验证不同菌株对禾谷镰刀菌的拮抗能力。选择抑制禾谷镰刀菌生长的菌株，在小麦的扬花前期把拮抗菌喷施到麦穗上，等小麦成熟后收获小麦种子，按照国标SN/3136-2012的方法检测小麦中的DON毒素，按照NY/T2070-2011的方法检测小麦中的ZEN毒素，最终获得能够同时抑制镰刀菌生长和降低赤霉毒素产生的菌株，申请人将所获得的菌株命名为AFKCK-10，向AFKCK-10培养基中加入甘油，在-70℃冰箱保存。
经检测，AFKCK-10菌株主要生物学特性为：菌丝呈丝状，无横隔，革兰氏染色阳性，轮生孢子，孢子柱形，表面光滑（其电镜照片如图1所示）, 在培养过程中可以产生可溶性色素，色素的颜色由褐色变为绿色。
克隆AFKCK-10菌株的16SrDNA序列（其序列如SEQ ID NO.1所示），进行测序，构建AFKCK-10的系统发育进化树，通过对AFKCK-10的生理生化特征结果和系统发育进化地位等鉴定结果，申请人最终把AFKCK-10鉴定为纺锤链霉菌（Streptomyces netropsis）。
申请人于2016年12月14将AFKCK-10菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（ChinaCenter for Type Culture Collection，简称CCTCC)），地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072，保藏号为CCTCC NO：M2016752，其分类名称为Streptomyces netropsis AFKCK-10。
实施例2 制备纺锤链霉菌液体菌剂
（a）将实施例1获得的纺锤链霉菌菌株AFKCK-10在培养皿中活化，接种于PDA培养基，于30℃，30℃试管斜面培养6天后，用无菌水洗下试管斜面表面的孢子，稀释成107个/ml 孢子悬液；
（b）按照1%的体积比将孢子悬液加入到含有PDB培养基的三角瓶中，30℃，180rpm搅拌培养得到纺锤链霉菌的一级种子液，一级种子液中的孢子浓度大于108/ml，培养时间为6天左右；
（c）将一级种子液按照体积比10%的接种量接种至500L含灭菌发酵培养基的种子罐中，在28-32℃温度下，搅拌培养至对数生长期，搅拌速率为150-180rpm，培养时间为60-72h，培养期间通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，获得二级种子液；
（d）向5吨的发酵罐中加入4吨发酵培养基， 然后在121℃、1.1kg/cm2的环境中灭菌20分钟，冷却至33℃以下，然后将步骤（c）获得的种子液接种入发酵罐中，所接入菌种体积为发酵培养基体积的10%，于28-32℃，搅拌培养60-72h，搅拌速率为150-180rpm，发酵培养期间向发酵罐中通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，获得纺锤链霉菌液体菌剂，其OD600不低于5.0。
实施例3 制备纺锤链霉菌可湿性粉剂
将实施例2获得的纺锤链霉菌液体菌剂、硅藻土、凹凸棒土按质量比1：1：1混合均匀，即获得纺锤链霉菌的可湿性粉剂。
实施例4 AFKCK-10抑制禾谷镰刀菌生长的实验
在PDA平板中滴2uL实施例2获得的纺锤链霉菌液体菌剂，30℃培养24h，然后每块平板喷洒200μL禾谷镰刀菌GZ3639的孢子液，孢子液浓度为105个/mL,结果如图2所示，可见，纺锤链霉菌AFKCK-10对禾谷镰刀菌的生长具有抑制效果。
实施例5 AFKCK-10液体菌剂防治小麦赤霉病、降低赤霉病毒素产生的田间试验
试验地点：江苏省农科院六合小麦实验基地
试验时间：2016年4月～6月
小麦的抽穗扬花期，在实验组小麦穗部喷施实施例2获得的液体菌剂的10倍稀释液（用自来水按体积比稀释），施用量以液体菌剂原液（即稀释前的液体菌剂）计为5mL/m2；对照组喷灭菌的发酵培养基的10倍稀释液。
喷施1小时后，再喷施禾谷镰刀菌GZ3639的孢子液，孢子液浓度为105个/mL, 喷施量为5mL/m2，20天后统计小麦赤霉病发病的病小穗率：
病小穗率%=发病小穗数×100/总小穗数；
防效%=100（对照组-实验组）/对照组；
小麦成熟收获后，按照国标SN/3136-2012的方法检测小麦中的DON毒素，按照NY/T2070-2011的方法检测小麦中的ZEN毒素，检测结果如表1所示：
表1 AFKCK-10液体菌剂对小麦赤霉病和赤霉毒素防控的田间使用效果
处理方式 病小穗率（%） DON毒素浓度（ug/L） 玉米赤霉烯酮毒素浓度（ug/L）
实验组 39.65 1086.3 76.5
对照组 92.32 2562.3 145.3
防效（%） 57.05 57.60 47.35
由表1可以看出，喷施AFKCK-10液体菌剂的小麦的赤霉病发病率明显降低，这就说明该液体菌剂对小麦赤霉病的发生具有较高的防治作用，防效可达到57.05%；同时收获小麦中DON毒素减少了57.60%，玉米赤霉烯酮毒素含量减少了47.35%，由此可见，该液体菌剂对小麦赤霉病和赤霉毒素都具有很好的防控效果。
实施例6 AFKCK-10可湿性粉剂防治小麦赤霉病、降低赤霉病毒素产生的田间试验
试验地点：江苏省农科院六合小麦实验基地
试验时间：2015年4月～6月
小麦的抽穗扬花期，在实验组小麦穗部喷施实施例3获得的可湿性粉剂悬浮于自来水中，稀释倍数为20倍，喷施于小麦穗部，以可湿性粉剂的施用量（稀释前）计，喷施量为 20g/m2,对照组喷等量的自来水；
喷施1小时后，再喷施禾谷镰刀菌GZ3639的孢子液，孢子液浓度为105个/mL, 喷施量为5mL/m2，20天后统计小麦赤霉病发病的病小穗率，小麦成熟收获后，测定不同处理小麦中DON毒素和玉米赤霉烯酮毒素的含量，检测结果如表2所示：
表2 AFKCK-10可湿性粉剂对小麦赤霉病和赤霉毒素防控的田间使用效果
处理方式 病小穗率（%） DON毒素浓度（ug/L） 玉米赤霉烯酮毒素浓度（ug/L）
实验组 47.12 1375.2 69.5
对照组 89.48 2387.9 127.1
防效（%） 47.34 42.41 45.32
由表2可以看出，喷施AFKCK-10可湿性粉剂的小麦赤霉病发病率明显降低，这就说明该可湿性粉剂对小麦赤霉病的发生同样具有较高的防治作用，防效可达到47.34%；同时收获小麦中DON毒素减少了42.41%，玉米赤霉烯酮毒素含量减少了45.32%，由此可见，该可湿性粉剂可有效防控小麦赤霉病和赤霉毒素。
在具体实施过程中，可以根据小麦田病情，调整纺锤链霉菌液体菌剂/可湿性粉剂的施用量，一般而言，只要保证液体菌剂（稀释前）施用量在5-20ml/m2范围内，可湿性粉剂（稀释前）施用量在15-60g/m2范围内，均可实现本发明防治小麦赤霉病及降低小麦中赤霉毒素含量的目的。
以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据权利要求的描述，结合本领域的基本常识，利用AFKCK-10菌株防治赤霉病的发生、减少赤霉毒素的产生都应该属于本发明的保护范畴。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一株纺锤链霉菌及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工筛选
<400> 1
cctttcgggg tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggcaatct gcccttcact 60
ctgggacaag ccctggaaac ggggtctaat accggatacg acctgcctcc gcatgggggt 120
gggtggaaag ctccggcggt gaaggatgag cccgcggcct atcagcttgt tggtggggta 180
atggcctacc aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acactgggac 240
tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgaa 300
agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag 360
cagggaagaa gcgagagtga cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc 420
agccgcggta atacgtaggg cgcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagagctcgt 480
aggcggcttg ttgcgtcgga tgtgaaagcc cggggcttaa ccccgggtct gcattcgata 540
cgggcaggct agagtgtggt aggggagatc ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca 600
gatatcagga ggaacaccgg tggcgaaggc ggatctctgg gccattactg acgctgagga 660
gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgttgg 720
gaactaggtg ttggcgacat tccacgtcgt cggtgccgca gctaacgcat taagttcccc 780
gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 840
agcggagcat gtggcttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacatata 900
ccggaaacgg ccagagatgg tcgccccctt gtggtcggta tacaggtggt gcatggctgt 960
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgttctg 1020
tgttgccagc atgcctttcg gggtgatggg gactcacagg agactgccgg ggtcaactcg 1080
gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tgccccttat gtcttgggct gcacacgtgc 1140
tacaatggcc ggtacaatga gctgcgatac cgtgaggtgg agcgaatctc aaaaagccgg 1200
tctcagttcg gattggggtc tgcaactcga ccccatgaag ttggagttgc tagtaatcgc 1260
agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca 1320
cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc 1350

Claims (6)

1.一株纺锤链霉菌（Streptomyces netropsis AFKCK-10），其保藏号为CCTCC NO:M2016752；所述纺锤链霉菌菌丝呈丝状，无横隔，革兰氏染色阳性，轮生孢子，孢子为柱形，表面光滑。
2.如权利要求1所述纺锤链霉菌在防治小麦赤霉病或降低小麦中赤霉毒素含量中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述在防治小麦赤霉病或降低小麦赤霉毒素含量中的应用是指，将所述纺锤链霉菌制成纺锤链霉菌液体菌剂或纺锤链霉菌可湿性粉剂，用于防治小麦赤霉病或降低小麦中赤霉毒素含量。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述纺锤链霉菌液体菌剂OD600不低于5.0，喷施于小麦穗部，5-20ml/m2，用于防治小麦赤霉病或降低小麦中赤霉毒素含量；
所述纺锤链霉菌可湿性粉剂OD600不低于5.0，喷施于小麦穗部，15-60g/m2，用于防治小麦赤霉病或降低小麦中赤霉毒素含量。
5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述纺锤链霉菌液体菌剂是这样获得的：
A）将所述纺锤链霉菌接种于PDA培养基中, 30℃试管斜面培养6天后，以无菌水稀释成浓度107个/ml的孢子悬液，然后接种到PDB培养基中，30℃培养至孢子浓度大于108个/ml，获得一级种子液；
B）将一级种子液接种至含有发酵培养基的种子罐中，温度28-32℃，搅拌速率150-180rpm，培养菌种至对数生长期，培养期间通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，获得二级种子液；
C）将二级种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，28-32℃， 150-180rpm搅拌培养至OD600达到5.0；发酵培养期间向发酵罐中通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，即获得所述纺锤链霉菌液体菌剂；
发酵培养基：葡萄糖20g,酵母粉10g, (NH4)2SO4 1g, MgSO4 0.2g, 酪蛋白3g, 蒸馏水1L，pH值为7.2-7.5。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述纺锤链霉菌可湿性粉剂是将所述纺锤链霉菌液体菌剂与硅藻土、凹凸棒土按质量比1:1:1混合后获得。
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