CN105647816A - 一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法 - Google Patents

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

本发明涉及粮食选种育种领域，公开了一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法，通过自制麦穗培养盒，通过离体培养观察，杜绝了田间接种可能会对环境造成的污染；改善了之前田间操作困难的缺点；优化了实验培养步骤及鉴定标准，仅需第五天的数据记录，相比以往田间接种经常长达14-21天的记录周期缩短了鉴定周期，能够更早确定品种抗病能力。

Description

一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法
技术领域
本发明涉及粮食选种育种领域，特别是一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法。
背景技术
小麦赤霉病是主要由禾谷镰刀菌引起的世界性的疾病，它不仅能导致小麦减产绝产，还会产生毒素，危及人和动物的健康。在我国，小麦赤霉病原本多发于江浙一带温暖湿润的地区，但近些年由于全球气候变暖及秸秆还田等因素的影响，小麦赤霉病发病逐渐北移，在2012年以来在黄淮麦区也有爆发。所以小麦赤霉病的防治与抗病品种的选育是一个亟待解决的问题，然而在小麦抗病品种鉴定的实验方法上还存在着很大不足。
首先，传统的田间鉴定方法直接将病菌带入自然环境中，易引发环境污染、病情爆发；其次，在田间常用的接种方法包括喷雾法和单花滴注法，其中喷雾法已被证实其针对的抗侵入性没有单花滴注法针对的抗扩展性稳定性高，所以，将病菌注入小麦内部是现阶段要证实小麦抗赤霉病能力的必然操作，而这种要将孢子悬浮液注入小穗内的操作十分细致，不仅要先剪去颖壳尖部，还易注射在小穗外，若要将悬浮液全部注射进去，常常需要调整针头进入小穗不同的腔或缝隙内，所以在田间进行大量材料的接种有很大的困难；再次，小麦接种赤霉病菌的最佳时期是抽穗扬花期，这个时期也正是易出现降雨的季节，在田间进行试验不能保证环境湿度、温度和光照起码的恒定，使鉴定不够严谨；最后，在实验数据记录上除了有田间观察不便的问题，传统的统计方法通常要观察直至材料完全发病为止，在田间常常需要长达二至三周的时间，而且要每隔3-5天观察一次，不仅观察周期长，次数也多。综上，传统的鉴定方法包括耗时长、操作繁琐、易污染、不严谨等众多问题，尤其是在鉴定材料量非常庞大的时候更突显了这些缺点，所以实验工具与方法都需要优化和改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法，以满足小麦幼苗抗病害能力的快速鉴定。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法，鉴定方法的具体步骤如下：
禾谷镰刀菌培养：在25％PDA培养基环境下培养禾谷镰刀菌7天，切3毫米见方的带有菌丝的PDA块7-10块，放入150mL2％的绿豆汤培养基，置于摇床以150rpm的速度培养7天，使其产孢，制作孢子悬浮液，过滤得到孢子，加入无菌水使其浓度达到5x105个/mL，放4℃冰箱保存；
麦穗离体培养：剪小麦麦穗放入培养盒内(含穗长，长度为23-25cm)，培养盒内注水，水深4-5cm；每5支麦穗放入一个培养盒内间隔网中；共需培养5天，可根据实际情况在第三天的时候换水、剪去泡在水中的麦梗部；
抗病实验：使用异形注射器，采用单花滴注法将10微升孢子悬浮液注射在麦穗中部小穗，将接种的小麦放入培养盒中，恒温25℃，恒湿90％，24小时后将湿度调低至70％，连续培养，记录第五天数据。
其中，麦穗离体培养中麦穗培养盒为自制培养盒，麦穗培养盒具有多层结构，包括了培养盒盒体、培养盒盒盖、培养室、可调节间隔网、恒温恒湿组件室、注射器室、温度-湿度感应器、透气孔、控制中心，培养盒盒体与培养盒盒盖通过铰链连接，培养盒盒体中设置有培养室、恒温恒湿组件室和注射器室，恒温恒湿组件室和注射器室位于培养室下方，温度-湿度感应器安装于培养室内，透气孔和控制中安装于培养盒盒盖内侧。
其中，异形注射器注射针内直径为0.2mm，前口封闭，设置6-8个注射孔在注射针壁，分布在针壁1.5cm范围内，注射孔直径为0.1mm。
其中，鉴定方法还包括有鉴定标准，鉴定标准如下：
0级:没有可见症状；
1级:l个病小穗；
2级:2个病小穗；
3级:3个病小穗；
4级:大于3个病小穗小于1/4的穗面积；
5级:病穗小于l/3的穗面积；
6级:小于1/2的穗面积；
7级:小于2/3的穗面积,梗部轻微变色；
8级:小于3/4的穗面积,局部梗变色；
9级:大于3/4的穗面积,扩展性梗变色,穗枯死；
由所调查的病级计算各品种每次调查的病情指数,具体公式为:
病情指数(％)＝∑ax/nT×100,其中:a为发病级数；x为发病穗数；n为发病最高级数(9)；T为调查样本数。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过自制麦穗培养盒，通过离体培养观察，，杜绝了田间接种可能会对环境造成的污染；改善了之前田间操作困难的缺点。
2.优化了实验培养步骤及鉴定标准，仅需第五天的数据记录，相比以往田间接种经常长达14-21天的记录周期缩短了鉴定周期，能够更早确定品种抗病能力。
附图说明
图1为本发明中麦穗培养盒结构示意图。
1：培养盒盒体，2：培养盒盒盖，3：培养室，4：可调节间隔网，5：恒温恒湿组件室，6：注射器室，7：温度-湿度感应器，8：透气孔，9：控制中心
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
如图1所示，本发明公开了一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法，鉴定方法的具体步骤如下：
禾谷镰刀菌培养：在25％PDA培养基环境下培养禾谷镰刀菌7天，切3毫米见方的带有菌丝的PDA块7-10块，放入150mL2％的绿豆汤培养基，置于摇床以150rpm的速度培养7天，使其产孢，制作孢子悬浮液，过滤得到孢子，加入无菌水使其浓度达到5x105个/mL，放4℃冰箱保存；
麦穗离体培养：剪小麦麦穗放入培养盒内(含穗长，长度为23-25cm)，培养盒内注水，水深4-5cm；每5支麦穗放入一个培养盒内间隔网中；共需培养5天，可根据实际情况在第三天的时候换水、剪去泡在水中的麦梗部；
抗病实验：使用异形注射器，采用单花滴注法将10微升孢子悬浮液注射在麦穗中部小穗，将接种的小麦放入培养盒中，恒温25℃，恒湿90％，24小时后将湿度调低至70％，连续培养，记录第五天数据；
鉴定标准：
0级:没有可见症状；
1级:l个病小穗；
2级:2个病小穗；
3级:3个病小穗；
4级:大于3个病小穗小于1/4的穗面积；
5级:病穗小于l/3的穗面积；
6级:小于1/2的穗面积；
7级:小于2/3的穗面积,梗部轻微变色；
8级:小于3/4的穗面积,局部梗变色；
9级:大于3/4的穗面积,扩展性梗变色,穗枯死；
由所调查的病级计算各品种每次调查的病情指数,具体公式为:
病情指数(％)＝∑ax/nT×100,其中:a为发病级数；x为发病穗数；n为发病最高级数(9)；T为调查样本数。
其中，麦穗离体培养中麦穗培养盒为自制培养盒，麦穗培养盒具有多层结构，包括了培养盒盒体1、培养盒盒盖2、培养室3、可调节间隔网4、恒温恒湿组件室5、注射器室6、温度-湿度感应器7、透气孔8、控制中心9，培养盒盒体1与培养盒盒盖2通过铰链连接，培养盒盒体1中设置有培养室3、恒温恒湿组件室5和注射器室6，恒温恒湿组件室5和注射器室6位于培养室3下方，温度-湿度感应器7安装于培养室3内，透气孔8和控制中安9装于培养盒盒盖2内侧。
其中，异形注射器注射针内直径为0.2mm，前口封闭，设置6-8个注射孔在注射针壁，分布在针壁1.5cm范围内，注射孔直径为0.1mm。
实施例2
实验目的及方法：评测本发明快速鉴定方法的实用性，具体操作步骤同实施例1相同，此处不再赘述，试验样品数目为10种，其中麦穗选自亲本为晋麦47×豫麦18的小麦RIL群体，分别为RIL1-10，禾谷镰刀菌为山东小麦病穗上分离的禾谷镰刀菌。
实验结果：如表1-4所示
表1第三天病级及病情指数
表2第五天病级及病情指数
表3第七天病级及病情指数
表4第九天病级及病情指数
针对上述10中小麦品种进行检测，所得到结果与真实情况相符。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法，其特征在于，所述的鉴定方法的具体步骤如下：
禾谷镰刀菌培养：在25％PDA培养基环境下培养禾谷镰刀菌7天，切3毫米见方的带有菌丝的PDA块7-10块，放入150mL2％的绿豆汤培养基，置于摇床以150rpm的速度培养7天，使其产孢，制作孢子悬浮液，过滤得到孢子，加入无菌水使其浓度达到5x105个/mL，放4℃冰箱保存；
麦穗离体培养：剪小麦麦穗放入培养盒内(含穗长，长度为23-25cm)，培养盒内注水，水深4-5cm；每5支麦穗放入一个培养盒内间隔网中；共需培养5天，可根据实际情况在第三天的时候换水、剪去泡在水中的麦梗部；
抗病实验：使用异形注射器，采用单花滴注法将10微升孢子悬浮液注射在麦穗中部小穗，将接种的小麦放入培养盒中，恒温25℃，恒湿90％，24小时后将湿度调低至70％，连续培养，记录第五天数据。
2.如权利要求1所述的一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法，其特征在于：所述的麦穗离体培养中麦穗培养盒为自制培养盒，所述的麦穗培养盒具有多层结构，包括了培养盒盒体、培养盒盒盖、培养室、可调节间隔网、恒温恒湿组件室、注射器室、温度-湿度感应器、透气孔、控制中心，所述的培养盒盒体与培养盒盒盖通过铰链连接，所述的培养盒盒体中设置有培养室、恒温恒湿组件室和注射器室，所述的恒温恒湿组件室和注射器室位于培养室下方，所述的温度-湿度感应器安装于培养室内，所述的透气孔和控制中安装于培养盒盒盖内侧。
3.如权利要求1或2所述的一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法，其特征在于：所述的异形注射器注射针内直径为0.2mm，前口封闭，设置6-8个注射孔在注射针壁，分布在针壁1.5cm范围内，注射孔直径为0.1mm。
4.如权利要求3所述的一种小麦赤霉病安全快速鉴定方法，其特征在于：所述的鉴定方法还包括有鉴定标准，所述的鉴定标准如下：
0级:没有可见症状；
1级:l个病小穗；
2级:2个病小穗；
3级:3个病小穗；
4级:大于3个病小穗小于1/4的穗面积；
5级:病穗小于l/3的穗面积；
6级:小于1/2的穗面积；
7级:小于2/3的穗面积,梗部轻微变色；
8级:小于3/4的穗面积,局部梗变色；
9级:大于3/4的穗面积,扩展性梗变色,穗枯死；
由所调查的病级计算各品种每次调查的病情指数,具体公式为:
病情指数(％)＝∑ax/nT×100,其中:a为发病级数；x为发病穗数；n为发病最高级数(9)；T为调查样本数。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107619853A (zh) * 2017-11-21 2018-01-23 山东农业大学 一种小麦赤霉病抗性鉴定方法
CN107619852A (zh) * 2017-11-21 2018-01-23 山东农业大学 一种粗山羊草赤霉病抗性鉴定方法
CN109601287A (zh) * 2019-01-16 2019-04-12 漯河市农业科学院 小麦钵体移栽苗期单株室内鉴定抗病育种方法

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