CN103931432A - 一种茄子黄萎病的接种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种茄子黄萎病的接种方法，将茄子种子浸种处理后进行培养催芽得到幼苗，再经自然伤根或人工伤根后接种于孢子悬浮液中浸泡，然后移栽至丹麦品氏泥炭土基质中，用双层遮阴网覆盖，从第2天开始正常管理，7天后即可观察到植株开始发病。本发明简便、快速、安全、准确，是茄子黄萎病较理想的接种方法，能广泛用于植物黄萎病的抗性鉴定研究，能有效缩短黄萎病的潜伏期和接种试验周期，且能提高发病率，最终准确、快速地获得病原菌致病性测定结果。

Description

一种茄子黄萎病的接种方法
技术领域
本发明涉及一种茄子黄萎病的接种方法，属于植物病理学研究技术领域。
背景技术
茄子黄萎病（Eggplant Verticillium Wilt）是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）和黑白轮枝菌（Verticillium alboatrum Reinke et Berth.）引起的一种植物维管束土传病害，是威胁茄子生产的主要病害之一。
目前，研究人员一般通过人工接种鉴定对茄子黄萎病开展抗病性研究。已有研究主要采用实验室人工接种鉴定，一般需在光照培养箱或人工气候箱内进行，该方法存在试验条件要求高的问题，且由于循环利用导致废弃物不易收集、处理；此外，存在接种方法较单一、接种周期长，一般15～20天才能观察到发病情况，30～60天才能调查病情指数，不能及时有效对茄子黄萎病进行抗病性研究，难于防控黄萎病对茄子生产的危害。
发明内容
为解决现有技术在对茄子黄萎病开展抗病性研究时，存在接种茄子黄萎病周期长、成本高，难于有效防控黄萎病对茄子生产危害等问题，本发明提供一种茄子黄萎病的接种方法。
本发明通过下列技术方案实现：一种茄子黄萎病的接种方法，其特征在于经过下列各步骤：
（1）将茄子种子置于40目的尼龙种子袋中，用质量浓度为2%的次氯酸钠溶液消毒10～15min，再用无菌水冲洗3次，然后在50～60℃的温水中浸种30min，再用浓度为1000mg/L的GA3（Gibberellin A3，赤霉素）溶液浸种36h；
（2）将步骤（1）处理后的种子置于温度为25～30℃、湿度为70～75%的条件下进行培养催芽，每天用清水冲洗种子1～2次，待出芽后播入已灭菌的丹麦品氏泥炭土基质中，直至长出3～4片真叶，得到幼苗；
（3）将黄萎病病菌的菌落用无菌水冲洗干净，再经过滤后调整为2×107 CFU/mL（CFU, Colony FormingUnits；CFU/mL指每毫升样品中含有的细菌群落总数)的孢子悬浮液；
（4）将步骤（2）的幼苗拔出，并在拔出过程中完成自然伤根，或者在拔出后进行人工伤根，之后接种于步骤（3）所得孢子悬浮液中浸泡30min后，移栽至丹麦品氏泥炭土基质中，并向每株幼苗施加50mL孢子悬浮液，再用双层遮阴网覆盖，接种后第1天不浇水，使幼苗根部与孢子悬浮液充分接触，从第2天开始正常管理，7天后即可观察到植株开始发病，以对茄子黄萎病的抗性进行鉴定研究。
发病率计算公式为：（染病株数/调查总株数）×100%。
病情指数计算公式为：病情指数=[∑各级病株数/ (总株数×最高病级)]×100）。
病情分级标准为：
0级，无病症；
1级，仅第一片真叶萎蔫或出现坏死；
2级，3片真叶萎蔫；
3级，仅心叶正常，老叶坏死，并有落叶；
4级，老叶全部落叶，仅剩新叶；
5级，植株死亡。
所述步骤（4）的人工伤根是：将植株主根的根尖部分切去0.5～1cm，切去3～5个侧根的根尖1～2cm。
所述步骤（4）的接种是在日、夜平均气温分别为25℃和15℃、空气相对湿度为50～90%时进行。
本发明简便、快速、安全、准确，20天后即可统计发病率达100%，病情指数高达80以上。是茄子黄萎病较理想的接种方法，能广泛用于植物黄萎病的抗性鉴定研究。通过本发明在黄萎病病菌生理小种以及茄子品种抗病性鉴定中的应用，有助于筛选出抗性较好的优良品种，解决目前生产上黄萎病抗性品种缺乏的问题，对茄子抗黄萎病育种研究具有重要的推动作用。本发明操作简便，节约成本和空间，且操作、处理过程中产生的废弃物易于收集，从而避免造成污染；此外，本发明将自然伤根、人工伤根、菌液浸根和菌液灌根结合应用，能有效缩短黄萎病的潜伏期和接种试验周期，且能提高发病率，最终准确、快速地获得病原菌致病性测定结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
（1）将茄子种子置于40目15×10cm的尼龙种子袋中，用质量浓度为2%的次氯酸钠溶液消毒15min，再用无菌水冲洗3次，然后在55℃的温水中浸种30min，再用浓度为1000mg/L的GA3（Gibberellin A3，赤霉素）溶液浸种36h；
（2）将步骤（1）处理后的种子置于温度为30℃、湿度为70%的条件下进行培养催芽，每天用清水冲洗种子2次，待出芽后播入已灭菌的丹麦品氏泥炭土基质中，直至长出3片真叶，得到幼苗；
（3）将PDA培养基上的黄萎病病菌的菌落用无菌水冲洗干净，再经孔径为25μm双层纱布过滤后用16×25的血球计数板调整为2×107 CFU/mL（CFU, Colony FormingUnits；CFU/mL指每毫升样品中含有的细菌群落总数)的孢子悬浮液；
（4）将步骤（2）的幼苗拔出，并在拔出过程中完成自然伤根，然后在日夜平均气温分别为25℃和15℃、空气相对湿度为90%时接种于步骤（3）所得孢子悬浮液中浸泡30min，然后移栽至装有丹麦品氏泥炭土基质的塑料杯（底部带有3个直径为0.5cm的圆洞）中，并向每株幼苗施加50mL孢子悬浮液，再用双层遮阴网覆盖，接种后第1天不浇水，使幼苗根部与孢子悬浮液充分接触，从第2天开始正常管理，7天后即可观察到植株开始发病。20天后统计发病率可达100%，病情指数高达80以上。有助于筛选出抗性较好的优良品种。
实施例2
（1）将茄子种子置于40目15×10cm的尼龙种子袋中，用质量浓度为2%的次氯酸钠溶液浸种12min，再用无菌水冲洗3次，然后在50℃的温水中浸种30min，再用浓度为1000mg/L的GA3（Gibberellin A3，赤霉素）溶液浸种36h；
（2）将步骤（1）处理后的种子置于温度为25℃、湿度为72%的条件下进行培养催芽，每天用清水冲洗种子1次，待出芽后播入已灭菌的丹麦品氏泥炭土基质中，直至长出4片真叶，得到幼苗；
（3）将PDA培养基上的黄萎病病菌的菌落用无菌水冲洗干净，再经孔径为25μm双层纱布过滤后用16×25的血球计数板调整为2×107 CFU/mL（CFU, Colony FormingUnits；CFU/mL指每毫升样品中含有的细菌群落总数)的孢子悬浮液；
（4）将步骤（2）的幼苗拔出，并在拔出后进行人工伤根，即植株主根的根尖部分切去0.5cm，选取3个侧根切去2cm，然后在日夜平均气温分别为25℃和15℃、空气相对湿度为70%时接种于步骤（3）所得孢子悬浮液中浸泡30min，然后移栽至装有丹麦品氏泥炭土基质的塑料杯（底部带有3个直径为0.5cm的圆洞）中，并向每株幼苗施加50mL孢子悬浮液，再用双层遮阴网覆盖，接种后第1天不浇水，使幼苗根部与孢子悬浮液充分接触，从第2天开始正常管理，7天后即可观察到植株开始发病。20天后统计发病率可达100%，病情指数高达80以上。有助于筛选出抗性较好的优良品种。
实施例3
（1）将茄子种子置于40目15×10cm的尼龙种子袋中，用质量浓度为2%的次氯酸钠溶液浸种10min，再用无菌水冲洗3次，然后在60℃的温水中浸种30min，再用浓度为1000mg/L的GA3（Gibberellin A3，赤霉素）溶液浸种36h；
（2）将步骤（1）处理后的种子置于温度为26℃、湿度为75%的条件下进行培养催芽，每天用清水冲洗种子2次，待出芽后播入已灭菌的丹麦品氏泥炭土基质中，直至长出4片真叶，得到幼苗；
（3）将PDA培养基上的黄萎病病菌的菌落用无菌水冲洗干净，再经孔径为25μm双层纱布过滤后用16×25的血球计数板调整为2×107 CFU/mL（CFU, Colony FormingUnits；CFU/mL指每毫升样品中含有的细菌群落总数)的孢子悬浮液；
（4）将步骤（2）的幼苗拔出，并在拔出过程中完成自然伤根，然后在日夜平均气温分别为25℃和15℃、空气相对湿度为50%时接种于步骤（3）所得孢子悬浮液中浸泡30min，然后移栽至装有丹麦品氏泥炭土基质的塑料杯（底部带有3个直径为0.5cm的圆洞）中，并向每株幼苗施加50mL孢子悬浮液，再用双层遮阴网覆盖，接种后第1天不浇水，使幼苗根部与孢子悬浮液充分接触，从第2天开始正常管理，7天后即可观察到植株开始发病。20天后统计发病率可达100%，病情指数高达80以上。有助于筛选出抗性较好的优良品种。

Claims (3)

1.一种茄子黄萎病的接种方法，其特征在于经过下列各步骤：
（1）将茄子种子置于40目的尼龙种子袋中，用质量浓度为2%的次氯酸钠溶液消毒10～15min，再用无菌水冲洗3次，然后在50～60℃的温水中浸种30min，再用浓度为1000mg/L的GA3溶液浸种36h；
（2）将步骤（1）处理后的种子置于温度为25～30℃、湿度为70～75%的条件下进行培养催芽，每天用清水冲洗种子1～2次，待出芽后播入已灭菌的丹麦品氏泥炭土基质中，直至长出3～4片真叶，得到幼苗；
（3）将黄萎病病菌的菌落用无菌水冲洗干净，再经过滤后调整为2×107 CFU/mL的孢子悬浮液；
（4）将步骤（2）的幼苗拔出，并在拔出过程中完成自然伤根，或者在拔出后进行人工伤根，之后接种于步骤（3）所得孢子悬浮液中浸泡30min后，移栽至丹麦品氏泥炭土基质中，并向每株幼苗施加50mL孢子悬浮液，再用双层遮阴网覆盖，接种后第1天不浇水，从第2天开始正常管理，7天后即可观察到植株开始发病。
2.根据权利要求1所述的茄子黄萎病的接种方法，其特征在于所述步骤（4）的人工伤根是：将植株主根的根尖部分切去0.5～1cm，切去3～5个侧根的根尖1～2cm。
3.根据权利要求1或2所述的茄子黄萎病的接种方法，其特征在于所述步骤（4）的接种是在日、夜平均气温分别为25℃和15℃、空气相对湿度为50～90%时进行。
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