CN109868282A

CN109868282A - 一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcEXO70及应用

Info

Publication number: CN109868282A
Application number: CN201910246620.6A
Authority: CN
Inventors: 李桂华; 加娜尔; 孙姣; 孙晨浩; 秦庆明; 张明哲; 佰娜尔古丽·居马汗; 迪丽拜尔·麦麦提
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2019-06-11
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN109868282B

Abstract

一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcEXO70及应用属微生物基因工程技术领域，本发明提供的来自灰霉病菌的控制致病性基因BcEXO70，其DNA序列如SEQ ID No:1所示，由2067个核苷酸组成；提供的BcEXO70基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，由654个氨基酸组成；BcEXO70基因可在植物抗灰霉病基因工程领域中应用；通过对灰霉病菌控制致病性的基因BcEXO70进行敲除，而使其致病力发生缺陷，可在降低灰霉病菌致病性中应用。

Description

一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcEXO70及应用

技术领域

本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及植物保护领域中控制真菌致病性的基因及其编码蛋白质的应用。

背景技术

灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又称作灰葡萄孢，属于子囊菌门(Ascomycota)真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染1400多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树。寄主从苗期、挂果期到贮存期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的典型症状表现为“V”形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病害的发生和蔓延与环境的湿度、温度存在密切的关系，在20℃-23℃，相对湿度90％以上时发生严重。因此，灰霉病属低温高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，世界上每年因该病导致的经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分子研究技术成熟，灰霉病菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。

灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等，这些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞，并分解死亡的寄主组织作为营养。自然条件下，灰霉病菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常以菌丝体、分生孢子或菌核附着在植物病残体上，或在土壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵染来源。当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗，并产生大量的分生孢子。成熟的分生孢子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低温高湿条件下，分生孢子萌发形成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主要从衰败的花器、伤口以及坏死组织侵入。

当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形成的附着胞侵入；伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓1-4天，此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。灰霉病菌侵入寄主细胞后，将会直接面临寄主组织内敌对环境的挑战，病原菌必须迅速做出调整，一方面抑制植物的防御反应，另一方面要积极适应寄主细胞内物理、化学环境，做到这两方面，灰霉病菌才有望成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通过改变自身的代谢途径，并分泌相关效应因子(如毒素)来实现上述目标的，但参与相应过程的基因、蛋白及代谢产物及其调控的分子机制仍所知甚少。对该领域进行深入研究，鉴定灰霉病菌用以适应寄主内环境的关键因子，不仅有助于揭示灰霉病菌这种死体营养型病原真菌致病的分子机制，还有可能从中发现可以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理论和技术基础。

胞吐体(exocyst)是真核细胞的一种保守的亚细胞结构，由八个不同的蛋白质亚基组装而成，Exo70是其中核心组分之一。在活体营养型植物病原真菌稻瘟病菌中，Exo70参与细胞质效应因子向寄主植物的分泌，并介导该病原真菌对寄主植物的侵入过程。Exo70蛋白质在死体营养型病原真菌灰霉病菌中同样存在，但功能尚未获得鉴定，通过分析灰霉病菌Exo70编码基因的致病功能，评价该基因在灰霉病菌发育及致病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛选新型杀灰霉病菌药剂。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种控制致病性的基因及其编码的蛋白质。

本发明所提供的控制致病性基因来源于灰霉病菌，名称为BcEXO70，其具有序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。该DNA序列为BcEXO70基因开放阅读框，由2067个核苷酸组成，其中包含3个外显子，分别位于SEQ ID No:1的5’端第1位至259位核苷酸之间、第312位至396位核苷酸之间和第447位至2067位核苷酸之间，组成的编码区长度合计为1965个核苷酸。

本发明提供了BcEXO70基因所编码的蛋白质，其具有序列表中SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，该序列由654个氨基酸组成。

来自灰霉病菌的控制致病性基因BcEXO70可应用于植物抗灰霉病基因工程领域。

来自灰霉病菌的控制致病性基因BcEXO70，对BcEXO70进行敲除而使其致病力发生缺陷，可在降低灰霉病菌致病性中应用。

本发明证明了BcEXO70基因的缺失导致灰霉病菌致病力显著降低，说明BcEXO70基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，即本发明所提供的BcEXO70基因的一个重要用途是：该基因的表达与其编码的蛋白质产物的表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于降低灰霉病菌致病性。

附图说明

图1为BcExo70蛋白质的结构域分析示意图

其中：标记为Exo70的阴影部分为胞吐体蛋白质Exo70的保守结构域；

图2为灰霉病菌BcEXO70基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图

其中：WT为野生型菌株B05.10，pEXO70-ko为敲除载体，BcEXO70-KO为BcEXO70基因缺失突变体；引物P1、P2、F1、R1用于验证突变体；

图3为BcEXO70基因缺失突变体菌株的PCR验证电泳图

其中：P1、P2、F1、R1为所用引物，相应位置见图2；M1、M2分别为两株独立获得的BcEXO70基因缺失突变体，WT为野生型菌株B05.10；

图4为BcEXO70基因的缺失突变体与野生型菌株B05.10的培养特征对比照片

其中：所用培养基为PDA，20℃培养，接种后3天观察拍照；WT为灰霉病菌野生型菌株B05.10，M1、M2分别为两株独立获得的BcEXO70基因缺失突变体。

图5为BcEXO70基因的缺失突变体与野生型菌株B05.10所形成菌落大小的定量分析

其中：受测菌株及培养条件同上，接种3天后对菌落直径进行测量计算，换算成相对大小。**表示在p<0.01水平上差异显著。

图6为BcEXO70基因的缺失突变体与野生型菌株的致病力比较照片

其中：所选择寄主为菜豆，采用离体叶片接种菌饼的方法，接种3天后进行评价；WT为灰霉病菌野生型菌株B05.10，M1、M2分别为两株独立获得的BcEXO70基因缺失突变体；

图7为BcEXO70基因的突变体与对照菌株侵染寄主所产生病斑大小的定量分析

其中：受测菌株及接种方法同上，接种3天后对叶片病斑面积进行测量计算，换算成相对大小，用以比较各菌株致病力的强弱。***表示在p<0.001水平上差异显著。

具体实施方式

为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1BcEXO70基因的相关性分析

灰霉病菌BcEXO70基因的开放阅读框由2067个核苷酸组成，包含3个外显子，编码区cDNA全长为1965个核苷酸，编码的蛋白质产物由654个氨基酸组成。结构域分析发现，BcExo70蛋白质包含一个保守的Exo70结构域(见图1)。

实施例2BcEXO70基因的敲除

1)敲除载体的构建

采用引物EXO70-UP-F(5'-CTCGAGTGTGGGAAATGTGGGATG-3')与EXO70-UP-R(5'-GAATTCGCACGCTAGACCTAATGC-3')，以灰霉病菌菌株B05.10的基因组DNA为模板扩增BcEXO70基因上游791bp片段，采用EXO70-DN-F(5'-TCTAGACCTGTGGGTGAGACGAGA-3')与EXO70-DN-R(5'-AAGCTTAATGCGAAATGCGAAACT-3')扩增灰霉病菌BcEXO70基因下游751bp片段，反应体系为：10mmol/L dNTP Mixture，0.5μL；10×PCR buffer，2.5μL；上下游引物各1μL(10μmol/mL)；模板DNA，1μL；Ex-Taq，0.2μL(5U)；ddH₂O，18.8μL；扩增程序为：94℃预变性3分钟，然后(1)94℃，变性50秒；(2)56℃，退火50秒；(3)72℃，延伸60秒；(4)循环30次；(5)72℃延伸10分钟。将上述两段DNA扩增产物先后克隆至pXEH载体的Xho I、EcoR I位点与Xba I、HindIII位点，构建成敲除载体pEXO70-ko(见图2)，并进行测序验证。

本发明所使用的灰霉病菌(Botrytis cinerea)菌株B05.10，购买自美国真菌遗传材料保藏中心(Fungal Genetics Stock Center，FGSC)，其他人员如需要该菌株，可从该保藏中心购买获得，相关保藏信息如下：

菌株编号：FGSC 10317。

保藏中心地址：Fungal Genetics Stock Center，Department of PlantPathology，Kansas State University，4024Throckmorton Plant Sciences Center，Manhattan,KS 66506USA。

网址：http://www.fgsc.net/scripts/StrainSearchReturnPage.asp？OrgID＝23812。

2)灰霉病菌的转化

a.根癌农杆菌的培养

挑取含有双元载体pEXO70-ko的根癌农杆菌菌株Agl-1单菌落，接种至含50μg/ml卡那霉素、10μg/ml利福平的MM液体培养基(磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.2％)中，250rpm、28℃振荡培养48h；4000rpm，离心5分钟，弃上清，IM液体培养基(磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.2％，200μM AS，MES0.854％，甘油0.5％)重悬，4000rpm离心5分钟，弃上清；IM培养基重悬，28℃，250rpm振荡培养6h，进行预诱导。

b.灰霉病菌的产孢培养

选用B05.10菌株，取少量孢子涂布于PDA培养基(马铃薯20％煮烂过滤，葡萄糖2％，琼脂1.5％)，置28℃培养8h令孢子快速萌发，然后转移至20℃培养3-5天，待菌体表面被灰色孢子覆盖之后，用IM液体培养基刮取、收集孢子，显微镜观察，利用血球计数器调节孢子浓度为1×10⁶/mL。

c.根癌农杆菌与灰霉病菌分生孢子共培养及转化子筛选

将在IM液体培养基中预先诱导6h的根癌农杆菌菌液和灰霉病菌孢子液等体积混合，加入AS，使终浓度达到500μM，混匀，然后按250～350μL/皿，均匀涂抹至铺有玻璃纸的IM培养基上，22℃黑暗培养48h；共培养完毕后，将玻璃纸转移至含有100μg/mL潮霉素的PDA培养基上，相同条件下继续培养。4～7天后挑取扩展的菌落到含有同样抗生素的筛选培养基上。

3)缺失突变体的验证

选用两对引物通过PCR扩增对转化子进行筛选。扩增结果符合如下结果的，确定为BcEXO70基因缺失突变体：潮霉素抗性基因的引物P1(5'-ATGATGCAGCTTGGGCGCA-3')与下游同源臂之外基因组上的引物P2(5'-AACCCGCAACAACCATAAAC-3')配对可以扩增到预期大小(1.6kb)的重组片段(野生型菌株无扩增条带)；而编码区内部引物F1(5'-CCGCCACGGTTCCAATGAC-3')与R1(5'-TTCCCAAAGCAGGCTTACCA-3')无扩增条带(野生型菌株可扩增到0.3kb片段)。结果，从转化子中筛选到2株独立的BcEXO70基因缺失突变体：M1与M2菌株，用于后续功能分析(见图3)。

实施例3BcEXO70基因在灰霉病菌的菌丝生长过程中的作用

采用平板培养法，评价BcEXO70突变体的菌丝生长等相关表型的变异情况。使用无菌打孔器打取待测菌株菌饼，分别接种于PDA培养基的中心，20℃黑暗培养。三天后观察发现，突变体的菌落形态基本正常，但生长速度显著减慢(见图4)。两株独立获得的突变体菌株的菌落大小非常接近，均显著小于野生型菌落。对各菌株的菌落直径进行测量计算，发现突变体的菌落大小只有野生型的62％左右(见图5)。上述结果表明，BcEXO70基因具有维持菌丝正常生长的能力。

实施例4BcEXO70基因在灰霉病菌致病性方面的作用

采用离体叶片接种法，评价BcEXO70突变体的致病力变化情况。从温室培养的菜豆植株上采集成熟叶片，水平放置容器中，使用打孔器打取待测菌株菌饼，正面朝下反扣至叶片上，20℃保湿黑暗培养，3天后评价待测菌株的致病力。实验结果显示，BcEXO70突变体基本丧失了致病能力，只能在接种点附近发现微小病斑，且不扩展。与此形成鲜明对照的是，野生型可成功侵染菜豆叶片，并迅速蔓延至大半个叶面(见图6)。两株独立获得的突变体菌株侵染菜豆叶片产生的病斑大小非常接近，均显著小于野生型引起的病斑。对叶片病斑面积进行测量计算，比较各菌株致病力，发现BcEXO70突变体侵染引起的病斑面积只有野生型引起的20％左右(见图7)。该研究结果表明，BcEXO70是一个关键的致病基因，是灰霉病菌侵染寄主所必需的，如果该基因或其编码的蛋白质丧失活性，灰霉病菌侵染寄主引发病害的能力将受到极大抑制。

序列表

SEQ ID No:1的序列

（i）序列特征：（A）长度：2067 bp；（B）类型：核苷酸；（C）链性：单链

（ii）分子类型：DNA

（iii）序列描述：SEQ ID No:1

1 ATGTACTCCG TACCCGTTGG TAGAAGAGCT TGGTCACTCA CATCTTCAAA TATGGCTGTG

61 GGTTTAGGAG GACGACAAGC TGCCGACGAG GAGGCACGAG CTGAAGTCGA TGTATTGAAA

121 AGTCGATTGG AAAAGACGAG CCAATTGACC AAGAAAATTC AAGCCAGTTT AGGGAGATTA

181 GATGCGACTG GAAAGGGGGT GCAAGAAGCT ATTGGGCCAA TTTATGGGAA TACTCAAAAG

241 CTTCAAATTT TAGGACAGAG TAAGTTTTCG ACCACGCGAC CTACTTGGCT CATTCTCATA

301 TACATGCGCA GATATCGATG GAGTTATCGC GGCAATCGAC AGAATACGAC AACCATCAGA

361 TATCAAAACC AATGAAGAGG ATATCATTAG GAAAGGGTAT GTCGCATAAC TCCCAGCAAC

421 CTGCAGACGT CACTAATACA TCATAGCCCC GAAGCCGTCG GATTGGCCGT TTTCCTCAGT

481 TCTGTTAAGC GTGTTAATAA AGCTCTCGCC GATATGAAAC GATCGAATCT ACGATCGAAT

541 CAACAAGCTA TGGTTGAGCT TAGCAAATTA TCAAAGTCGG GAAATACACA AATGGAATCA

601 TATTTTCAAG GACTTCTACA AGAAGATTCT CAACCACTCG AACCTTTACA CTATATCACC

661 AAAAATCAAC CATTTCCTCT ATTATCTCAA GATAAAACTA CAAGATTGGG TCTCATTACG

721 AATTATATTG GTTCAGTTGT TAGACAATCT GGATTTGTTA CGGAATCGCC GGTCATGCAA

781 TCATATGCAA GTGTTAGGGG ACCTTTTCTG AAGACTACGT TACAAAATCT CGCGTCAGCA

841 TCGATGAATA CCGCAAAGAA GAAGACACCG GATGCTATGT ATCGACAAGG AACTAATGGA

901 ATTGGAACAT ATGCGATGGG TATGGAAGGC GCATTTTTGG CGGAATACGA TAATATATGC

961 GCTCTTTTTA CTCGCGATGA ATGGGGGAAA GTTTTCAATT TGACTTGTCA AGGAGCCATT

1021 GCGGAATTAT CACGAACCCT TCGAGAATTA AACAACCACA TCAAGTCAAA TTTAACAACG

1081 GACTGTTACC TTGCTTATGA GATTGTTGAG ATTGTTTCAA ATCTATCTTC AAACCTGGAA

1141 AGTAGGACAG GGGAGTTGAA ACCTTCCTTC GCATCAGCTC TCAAACCAAT CAGAGAAACC

1201 GCCAAAGGCT CATTAGCTGA TCTCCTGGAT GATACTCGAC GAAGAATTAA CCTCCTACAG

1261 ACATTACCTC CTGATGCCGC CACGGTTCCA ATGACTACCG AAACCATGAT GCGATTACAA

1321 ACTATGGTTG AATTCCTTCG ACCAATCTCA AGTATTATGA TCTCTATCGG TGATGGTGGT

1381 TGGAAATCTA GCGCCACTCC TCAGGGTTCA ACCGACCAAA TCCCTAGTCT TAAATCTTTC

1441 GATGTTAATG CGGATGGAAA ACAAATTTTT GCAAATTACT GCATCGACAC AATCGAAGCT

1501 CTTCTTACAA GCTTAGATCA AAAAGCAAAG GCATTACTCA AAGGTGGTAA GCCTGCTTTG

1561 GGAATTTTCA TTGCGAATAA TGCGACAATT GTGAAGCGCA TGATTGAAAC GAGTGATTTA

1621 AATGGATTAC TAGCACCAAA AATGGGAGAG GTAGAAAGAT GGATCAAAAC GGGCACAACT

1681 CTTTACTCAG CTGCATGGCG TGAGCCATCT GGTTATCTAC TGGACGTTCA ATACACAAAC

1741 CGCGGTAATG TACGCCCACA ATCTGGTTCC GGCAATACTG GTATCGATAG TGCAGCGGTT

1801 GTTAAGGCAC TTGGTTCCAA GGAGAAAGAC CAAATCAAGG AAAAATTCAA GATGTTCAAT

1861 CAATCTTTCG ATGACTTAAT ACAGAAACAC AAGTCATTAA TGATGGAGAA AGAAGTCAGA

1921 GAAATTTTGG CAAGACAAAT TTCAAGCTTG ATAAAACCAT TATATGATCG ATTTTATGAT

1981 AAGTATTATG AAATTGATAA AGGAAAGGGG AAGTATGTTA AGTGGGATAA AGCTGCTATG

2041 AACGCTGTAT TCTCCAGTTT GGCATGA

SEQ ID No:2的序列

（i）序列特征：（A）长度：654个氨基酸；(B)类型：氨基酸；（C）链性：单链。

（ii）分子类型：多肽

（iii）序列描述：SEQ ID No:2

1 MYSVPVGRRA WSLTSSNMAV GLGGRQAADE EARAEVDVLK SRLEKTSQLT KKIQASLGRL

61 DATGKGVQEA IGPIYGNTQK LQILGQNIDG VIAAIDRIRQ PSDIKTNEED IIRKGPEAVG

121 LAVFLSSVKR VNKALADMKR SNLRSNQQAM VELSKLSKSG NTQMESYFQG LLQEDSQPLE

181 PLHYITKNQP FPLLSQDKTT RLGLITNYIG SVVRQSGFVT ESPVMQSYAS VRGPFLKTTL

241 QNLASASMNT AKKKTPDAMY RQGTNGIGTY AMGMEGAFLA EYDNICALFT RDEWGKVFNL

301 TCQGAIAELS RTLRELNNHI KSNLTTDCYL AYEIVEIVSN LSSNLESRTG ELKPSFASAL

361 KPIRETAKGS LADLLDDTRR RINLLQTLPP DAATVPMTTE TMMRLQTMVE FLRPISSIMI

421 SIGDGGWKSS ATPQGSTDQI PSLKSFDVNA DGKQIFANYC IDTIEALLTS LDQKAKALLK

481 GGKPALGIFI ANNATIVKRM IETSDLNGLL APKMGEVERW IKTGTTLYSA AWREPSGYLL

541 DVQYTNRGNV RPQSGSGNTG IDSAAVVKAL GSKEKDQIKE KFKMFNQSFD DLIQKHKSLM

601 MEKEVREILA RQISSLIKPL YDRFYDKYYE IDKGKGKYVK WDKAAMNAVF SSLA

Claims

1.BcEXO70基因在降低灰霉病菌致病性中的应用，其特征在于，具体通过敲除BcEXO70基因来降低致病性，所述BcEXO70基因的DNA序列如SEQ ID No:1所示。