BR112012017055B1 - Métodos para conferir um traço de enraizamento profundo a uma planta, para produção de plantas, para avaliar se uma planta tem um fenótipo de enraizamento profundo, e para selecionar uma planta, bem como dna e usos dos mesmos, e célula transformada - Google Patents

Métodos para conferir um traço de enraizamento profundo a uma planta, para produção de plantas, para avaliar se uma planta tem um fenótipo de enraizamento profundo, e para selecionar uma planta, bem como dna e usos dos mesmos, e célula transformada Download PDF

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Abstract

patente de invenção: "gene dr01 de controle das características de planta de raíz profunda e utilização do mesmo". a presente invenção refere-se a um gene que controla a enraizamento profundo de uma planta, uma planta transgênica introduzida com o gene, um método para controlar a enraizamento profundo de uma planta usando o gene, e tais, análise de articulação de alta resolução foi realizada para um local genético (local de dr01) capaz de controlar o enraizamento profundo de uma planta, que foi detectado entre um cultivar de arroz enraizado raso ir64 e um cultivar de arroz enraizado profundo kinandang patong em uma população de segregação de grande escala. com um resultado, foi revelado que a região de gene de dr01 está localizada em uma região de 6.0 kpb intercalada entre dr01-indel09, que é um marcador de indel, e dr01-caps05, que é marcador de caps. além disso, foi confirmado que uma planta transgênica transformada com o gene de dr01 do tipo kinandang patong mostra uma proporção significantemente alta de enraizamento profundo. foi confirmado que uma planta tendo o gene de dr01 do tipo kinandang patong é resistente à estiagem.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA CONFERIR UM TRAÇO DE ENRAIZAMENTO PROFUNDO A UMA PLANTA, PARA PRODUÇÃO DE PLANTAS, PARA AVALIAR SE UMA PLANTA TEM UM FENÓTIPO DE ENRAIZAMENTO PROFUNDO, E PARA SELECIONAR UMA PLANTA, BEM COMO DNA E USOS DOS MESMOS, E CÉLULA TRANSFORMADA.
Campo Técnico
A presente invenção refere-se a um novo gene que controla a morfologia da raiz da planta e métodos para controlar a morfologia da raiz da planta usando o gene. Mais especificamente, a presente invenção se relaciona a um novo gene relacionado ao enraizamento profundo de plantas e métodos para controlar o enraizamento profundo de plantas usando o gene. Técnica Anterior
Atualmente, a população mundial está continuando a aumentar, principalmente nos países em desenvolvimento, e é essencial aumentar a produção de alimento para alimentar a população. Contudo, tem sido difícil para as terras agrícolas terem precipitação atmosférica devido às alterações do clima nos anos recentes, tais como aquecimento global e desertificação. Como um resultado, as estiagens devido à redução da precipitação atmosférica têm causado vários danos na produção de colheita por todo o mundo. Em particular, grãos, tais como arroz, trigo, e milho, que são na maioria das vezes cultivados somente pela água da chuva, são mais severamente danificados pelas estiagens. Portanto, um objetivo importante na geração de grão é conferir resistência à estiagem às plantas de colheita.
Para plantas de colheita, a raiz é um fenótipo essencial, e está envolvida na produção que depende da absorção de água e nutriente ou tal, bem como planta localizada acima da superfície da terra que aloja resistência e evita estiagem. A planta de arroz é uma monocotiledônea, e forma um sistema de raiz com um número de raízes de coroa que se prolongam de internodos após desenvolvimento de raiz seminal. Adistribuição de sistema de raiz de arroz é determinada de acordo com o comprimento de raiz de coroa e sua direção de crescimento (Shigenori Morita, Ne no Dezain (Raiz
Petição 870180161977, de 12/12/2018, pág. 6/21
1a/81 design), pp. 107, 2003 (Documento de Não-Patente 1)). Dos dois, a direção de crescimento da raiz de coroa é particularmente importante na distribuição do
Segue-se folha 2/81
2/81 sulta em um enraizamento raso, enquanto que o crescimento vertical resulta em enraizamento profundo. Quando comparadas às plantas com enraizamento raso, as plantas de enraizamento profundo têm mais raízes distribuídas nas camadas de solo mais profundas. Desse modo, quando as plantas são expostas às condições secas, as plantas podem evitar estiagem pela absorção de água das camadas de solo mais profundas. Consequentemente, o enraizamento profundo é um traço importante (Yoshida and Hasegawa, Drought Resistance in crops with emphasis on rice, p. 97-114. 1982 (Documento de Não-Patente 2); Shigenori Morita, Ne no Hatsuikugaku (Study on root development) pp. 132, 2000 (Documento de Não-Patente 3)). Desse modo, é esperado que a resistência à estiagem possa ser conferida a plantas pela alteração de plantas de colheita com raiz rasa em plantas de colheita do tipo raiz profunda para aperfeiçoar o impedimento da estiagem.
Existem três tipos de resistência à estiagem em plantas de colheita: escape de estiagem, tolerância à estiagem, e impedimento de estiagem. Em geral, as plantas de colheita são mais vulneráveis à dessecação entre os estágios de formação de panícula e emergência de espiga. O tipo de escape de estiagem é obtido pela alteração das plantas de colheita em um tipo de maturação precoce, de modo que o período de baixa precipitação atmosférica não se sobrepõe ao período de estágio de formação de panícula a estágio de emergência de espiga. Este é o método mais comum para desenvolvimento de cultivares resistentes à estiagem. Existe um número de genes isolados que podem ser usados para controlar a regulação de emergência de espiga (WO 01/032881 (Documento de Patente 1); Publicação Kokai de Pedido de Patente Japonesa No. (JP-A) 2002-153283 (pedido de patente japonês publicado, não-examinado) (Documento de Patente 2); JP-A (Kokai) 2003-339382 (Documento de Patente 3); JP-A (Kokai) 2004-089036 (Documento de Patente 4); JP-A (Kokai) 2004-290190 (Documento de Patente 5); JP-A (Kokai) 2005-110579 (Documento de Patente 6)). Contudo, o estágio de emergência de espiga é determinado para cada cultivar, e seria efetivo se a mudança na precipitação atmosférica durante o período de cultivo fosse consistente todo ano. O problema é que as plantas serão afetadas
3/81 pela estiagem se a alteração do clima dispara a estiagem entre os estágios de formação de panícula e emergência de espiga. Quando exposto a estiagem, o tipo tolerante à estiagem tem a natureza de tolerar estiagem pelo controle da pressão osmótica da célula, ou tal. A tolerância à estiagem pode ser avaliada simplesmente por plantas de não desaguamento. Desse modo, um número de genes relacionado ao tipo tolerante à estiagem foi isolado por experimentos de biologia molecular (JP-A (Kokai) 2007-222129 (Documento de Patente 7); para um revisão, Tran et al., Methods in Enzymology 428: 109-28. 2007 (Documento de Não-Patente 4)). Contudo, a classificação para o tipo tolerante à estiagem sob condições de campo não é simples, visto que é difícil controlar as condições ambientais, tal como o teor de água no solo. Desse modo, a geração de cultivares do tipo tolerante à estiagem é menos avançada. Além disso, enquanto que o tipo tolerante à estiagem tem a capacidade de tolerar estiagem, o crescimento da planta é suprimido, e a planta é eventualmente morta quando o período de estiagem é prolongado, visto que a planta não pode absorver água e nutrientes a partir do solo. Isto se torna um problema na produção de colheita, onde o produto final é o grão, e é importante para maximizar o rendimento da colheita, preferivelmente do que preservar as plantas. O tipo impedimento de estiagem tem a natureza de adquirir resistência à estiagem evitando-se o estresse da estiagem. O enraizamento profundo acima descrito é de tal natureza. No campo, a estiagem geralmente progride da superfície do solo para as camadas de solo mais profundas. Em terras agrícolas comuns, as camadas de solo mais profundas contêm água. Desse modo, as plantas de enraizamento profundo podem evadir dessecação sob condições de estiagem pelo uso de água nas camadas de solo mais profundas. No Japão, cultivares com o enraizamento profundo foram desenvolvidos em cultivo de arroz em terreno elevado para evitar dano de estiagem, com um resultado de baixa precipitação atmosférica/luz solar, em seguida ao final da estação chuvosa. Yumenohatamochi, um cultivar de raiz profunda, foi desenvolvido como uma variedade de arroz de terreno elevado altamente resistente à estiagem com excelente aroma (Hideo Hirasawa et a/., Breeding Science 48: 415-419. 1998 (Documento de
4/81
Não-Patente 5)). Contudo, o isolamento do gene que objetiva aperfeiçoar o enraizamento profundo não foi reportado.
Uma variedade de genes relacionados a tropismo, que é um fator importante que controla a direção de crescimento de raiz, foi isolada por técnicas de biologia molecular usando mutantes, e similares. Tropismo se refere ao crescimento de raiz com extensão curvada em resposta a estímulo ambiental extrínseco. O tropismo inclui gravitropismo, fototropismo, hidrotropismo, haptotropismo, galvanotropismo, magnetotropismo, e quimiotropismo. Os genes identificados Arabidopsis incluem um número de genes de gravitropismo (para uma revisão, Morita and Tasaka Current Opinion in Plant Biology 7(6): 712-718. 2004 (Documento de Não-Patente 6)), bem como genes de hidrotropismo MIZ1 (Kobayashi et aí, Proc. Natl. Acad. Scí. USA 104(11): 4724-4729. 2007 (Documento de Não-Patente 8)) e MIZ2 (Miyazawa et aí., Plant Physiology 149(2): 835-840. 2009 (Documento de Não-Patente 9)). Com relação à planta de arroz, existe somente um pequeno número de relatórios publicados em genes relacionados ao tropismo de raiz. O gene de fototropismo CPT1 (Haga et al., Plant Cell 17(1): 103-115. 2005 (Documento de Não-Patente 7)), e o gene de formação de raiz de coroa Crl1 (Inukai et ai., Plant Cell 17(5): 1387-1396. 2005 (Documento de Não-Patente 10)) foi reportado por ser relacionado ao gravitropismo. Muitos dos genes foram isolados usando mutantes der perda de função, ou similares. Não existe relatório que descreve que o enraizamento profundo pode ser conferido às plantas de colheita pela alteração destes genes.
Existem relatórios de estudos genéticos no enraizamento profundo de planta de milho e planta de arroz com o objetivo de evitar estiagem. Com relação ao milho, Tuberosa et al. and Trachsel et al. Descobriram um local de traço quantitativo (QTL) relacionado ao comprimento de raiz (Tuberosa et al., Plant Molecular Biology 48: 697-712. 2002 (Documento de Não-Patente 11); Trachsel et al., Theoretical and Applied Genetics DOI 10.1007/s00122-009-1144-9. 2009 (Documento de Não-Patente 12)). Entre os cultivares de planta de arroz, existem uma ampla faixa de mutações espontâneas em termos de traços, tais como o enraizamento profundo, com
5/81 primento de raiz, ou espessura de raiz (Uga Trachsel et aí, Breeding Science 59: 87-93. 2009 (Documento de Não-Patente 13)). Vários locais de traço quantitativos (QTL) correlacionados com mutações morfológicas de raiz observados entre os cultivares foram identificados pela análise genética usando marcadores moleculares (para uma revisão, Price et aí., Journal of Experimental Botany 53: 989-1004. 2002 (Documento de Não-Patente 14)). O enraizamento profundo é determinado por dois traços: comprimento de raiz e direção (ângulo) de crescimento de raiz. Muitos relatórios no QTL envolvidos no enraizamento profundo são relacionados a comprimento de raiz (para uma revisão, Price et aí., Journal of Experimental Botany 53: 989-1004. 2002 (Documento de Não-Patente 14); Courtois et aí., Euphytica 134: 335-345. 2003 (Documento de Não-Patente 15); Zheng et aí., Theoretical and Applied Genetics 107: 1505-1515. 2003 (Documento de Não-Patente 16); Li et aí., Theoretical and Applied Genetics 110: 1244-1252. 2005 (Documento de Não-Patente 17)). Somente um QTL simples no milho foi reportado por ser envolvido no ângulo de crescimento de raiz; contudo, foi simplesmente previsto por um procedimento estatístico, e o gene não tinha sido ainda identificado/isolado (Omori F. and Mano Y. Planta Root 1: 57-65. 2007 (Documento de Não-Patente 18)). Conforme descrito acima, não existe relatório na identificação/isolamento de gene bem sucedido para o QTL relacionado a raiz nas mutações espontâneas. Uma explanação plausível é que diferente com traços na parte aérea, é difícil avaliar precisamente e reprodutivelmente o fenótipo da morfologia do sistema de raiz. Além disso, outro problema é que estudos experimentais sob condições de campo são esforços intensivos (Yadav et aí., Theoretical and Applied Genetics 95: 619-632. 1997 (Documento de Não-Patente 19)).
Os métodos conhecidos para avaliar o enraizamento profundo de plantas incluem o método de abrir trincheiras, método de monolito, e método de amostragem de núcleo. Estes métodos são adequados para avaliar o enraizamento profundo no campo (Nemoto et aí., Breeding Science 48: 321-324. 1998 (Documento de Não-Patente 20); Masakata Hirayama et aí., Nihon Sakumotsu Gakkai Kiji (Japanese Journal of Crop Science) 76:
6/81
245-252. 2007 (Documento de Não-Patente 21)). O método de abrir trincheiras é um método que determina a espessura e número de raízes em cada profundidade, após o cultivo da planta e, em seguida, remoção do solo do campo. Contudo, o método de abrir trincheiras requer esforços consideráveis para remover o solo, e, portanto, não é adequado para avaliar um grande número de plantas. No método de monolito, duas estruturas de ferro são acionadas no solo no pé da planta cultivada. O monolito quadrado resultante (por exemplo, com largura de 30 cm x espessura de 5 cm x profundidade de 30 cm) é escavado, e uma porção de solo é cortada para avaliar o comprimento e número de raízes em cada profundidade. No método de amostragem de núcleo, tubos cilíndricos metálicos com um diâmetro de 5 a 8 cm e um comprimento de 30 a 50 cm, são acionados no solo no pé da planta ou entre plantas; e as raízes são expostas por lavagem das amostras de solo resultantes para avaliar o comprimento e número de raízes. A amostragem é mais simples em ambos os métodos do que no método de abrir trincheiras; contudo, estes métodos não podem avaliar precisamente a condição das raízes no solo porque existem erros de amostragem dependendo do local. Como um método para avaliar um grande número de plantas sob um ambiente artificial, tal como em uma estufa, um método para avaliar o enraizamento profundo sob uma condição de estresse de estiagem em que plantas são plantadas e cultivadas em um recipiente de cultivo cilíndrico (com um diâmetro de 5 to 10 cm), preenchido com um meio de cultivo, foi desenvolvido (WO 2006/123392 (Documento de Patente 8)). Este método revelou que o grau de senescência de folha foi menor em cultivares tendo o enraizamento profundo do que em cultivares com raízes rasas quando as plantas foram expostas a estresse de estiagem pelo abaixamento do nível da água em uma maneira por etapas durante o período de cultivo. Conforme visto a partir do resultado descrito acima, este método avalia o enraizamento profundo não diretamente, mas baseado na senescência da parte aérea. Uma vantagem do método é a simples avaliação do enraizamento profundo sem a etapa de lavagem do solo fora das raízes. Contudo, no caso de cultivares cujas raízes são longas, mas se prolongam horizontalmente, os cultivares podem ser for
7/81 temente avaliados por terem o enraizamento profundo porque suas raízes se prolongam para baixo junto com o cilindro após alcançar. Desse modo, embora este método possa ser usado para avaliar o comprimento de raiz que é uma das propriedades que constituem o enraizamento profundo, é difícil usar este método para avaliar a direção de crescimento da raiz.
O método de cesta foi desenvolvido para avaliar trigo (Oyanagi et al., Nihon Sakumotsu Gakkai Kiji (Japanese Journal of Crop Science) 62: 565-570. 1993 (Documento de Não-Patente 22)), como um método quantitativo simples para avaliação da direção de crescimento da raiz apenas Além disso, um relatório anterior descreve que o método de cesta foi usado para avaliar plantas de arroz para o enraizamento profundo (Kato et al., Plant Soil 287: 117-129. 2006 (Documento de Não-Patente 23)). Neste método, uma cesta de malha é preenchida com solo, e colocada em um campo ou pote. Após um certo período de cultivo, o enraizamento profundo é avaliado por medição do ângulo de crescimento da raiz que se prolonga através da cesta relativo a superfície do solo. Este método capacita a avaliação simples do ângulo de crescimento; contudo, ele requer mais espaço e controle extensivo de água quando da avaliação de um grande número de amostras em um tempo para a proposta de isolamento de gene.
Sob as circunstâncias acima descritas, é essencial isolar genes que estão relacionados ao enraizamento profundo usando variantes naturais, e para elucidar o efeito de impedimento de estiagem dos genes para desenvolvimento eficiente de cultivares com capacidade aperfeiçoada de se evitar estiagem.
Dro1 (Deeper Rooting 1) é um QTL relacionado ao enraizamento profundo, que foi estatisticamente previsto estar localizado no braço longo do cromossomo 9 por análise de QTL com linha de progenia (BC2F2) resultante de cruzamentos posteriores do cultivar de arroz de terreno elevado de tropical japonica, Kinandang Patong, usando um cultivar de arroz de marca arroz com casca IR64 como uma origem recorrente (Uga et aí, The 2nd lnternational Conference on Plant Molecular Breeding. 2007 (Documento de Não-Patente 24); Uga et al., Nihon Ikusyu Gakkai Dai 112 Kai Kouenkai
8/81
Youshisyu (112nd Meeting of The Japanese Society of Breeding, Program and Abstracts) PP. 188, 2007 (Documento de Não-Patente 25); Uga et al., Dai 27 Kaí Ne Kenkyu Syukai (27th Research Meeting of The Japanese Society for Raiz Research), 2007 (Documento de Não-Patente 26); Uga et al. The 5th 5 International Crop Science Congress Abstracts 243 p. 2008 (Documento de s Não-Patente 27)). IR64 é um cultivar difícil para introdução de gene pelo método de transformação de Agrobacterium. Atualmente, o método de transformação de Agrobacterium, em que tecidos de cultura diferenciados (por exemplo, calos) são usados como uma amostra de planta, é comumente 10 usado para plantas de arroz (Patente Japonesa No. 2649287 (Documento de
Patente 9)). Com relação a IR64, contudo, o método usando calos somente dá uma eficiência de transformação muito baixa. Portanto, o método de transformação de Agrobacterium à base de calo não foi ainda estabelecido para IR64 (Hiei and Komari, Nature Protocols 3: 824-834. 2008 (Documento 15 de Não-Patente 28)). Hiei e Komari reportaram um método usando embriões imaturos ao invés de calos como uma amostra de planta para alcançar transformação de IR64. Contudo, desde que o método de embriões imaturos requer embriões imaturos após antese, é necessário preparar a planta sempre em um campo de arroz com casca, ou em uma estufa, de modo que 20 embriões imaturos possam ser feitos disponíveis imediatamente quando necessário. Por exemplo, sementes podem ser plantadas de duas em duas semanas de modo que embriões imaturos estejam sempre disponíveis; portanto, uma vasta área de cultivo e força de operação significante são essenciais para manter as plantas. Desse modo, o estabelecimento de transferên25 cia de gene em IR64 baseado no método de transformação de Agrobacterium à base de calo é muito importante para alcançar o uso prático de geração molecular.
Documentos da Técnica Anterior
Documentos de Patente
Documento de Patente 1 WO 01/032881 (Plant photosensitive gene Hd1 and usethereof)
Documento de Patente 2 JP-A (Kokai) 2002-153283 (Plant
9/81 anthesis-inducing gene Hd3a and use thereof)
Documento de Patente 3 JP-A (Kokai) 2003-339382 (Plant anthesis-enhancing gene Ehd1 and use thereof)
Documento de Patente 4 JP-A (Kokai) 2004-089036 (Plant
A anthesis-enhancing gene RFT1 and methods for predicting the time of bloom) Documento de Patente 5 JP-A (Kokai) 2004-290190 (Plant anthesis-controlling gene Lhd4 and use thereof)
Documento de Patente 6 JP-A (Kokai) 2005-110579 (Plant photosensitive gene Hd5 and use thereof)
Documento de Patente 7 JP-A (Kokai) 2007-222129 (Methods for producing plants resistant to environmental stress)
Documento de Patente 8 WO 2006/123392 (Methods for assessing deep rooting of plants)
Documento de Patente 9 Patente Japonesa No. 2649287
Documentos de Não-Patentes
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Documento de Não-Patente 23 Kato Abe J., Kamoshita A., Yamagishi J. (2006) Genotypic variation in growth root angle in rice (Oryza sativa L.) and its association with deep root development in upland fields with different water regimes. Plant Soil 287: 117-129.
Documento de Não-Patente 24 Uga Y, K. Okuno e M. Yano (2007) Relationship between QTLs for vascular system and vertical distribution of roots on chromosome 9 of rice. The 2nd International Conference on Plant Molecular Breeding.
Documento de Não-Patente 25 Yusaku Uga, Kazutoshi Okuno, e Masahiro Yano, (2007) Ine Dai 9 Sensyokutai jyouni Miidasareta Shinkonsei nikansuru QTL (QTL involved in the deep rooting, found on rice chromosome 9), Nihon Ikusyu Gakkai Dai 112 Kai Kouenkaí Youshisyu (112nd Meeting of The Japanese Society of Breeding, Program and Abstracts) 188 p.
Documento de Não-Patente 26 Yusaku Uga, Kazutoshi Okuno, e Masahiro Yano, (2007) Ine Shinkonsei kanren Idenshiza Dro2 no Fain Mappingu (Fine mapping of deep rooting rice-related locus Dro1), Dai 27 Kai Ne Kenkyu Syukai (27th Research Meeting of The Japanese Society for Raiz Research).
Documento de Não-Patente 27 Uga Y, K. Okuno e M. Yano (2008) Fine mapping of a deeper-rooting QTL, Dro1, on chromosome 9 in rice. The 5íh International Crop Science Congress Abstracts 243 p.
Documento de Não-Patente 28 Hiei Y, Komari T (2008) Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli
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Documento de Não-Patente 29 Yano M., 2nd International Symposium on Genomics of Plant Genetic Resources (Italy), Apr. 24, 2010
Documento de Não-Patente 30]Yano M., Gatersleben Lecture (Institute of Plant Genetics e Crop Plant Research (Germany), Apr. 29, 2010
Documento de Não-Patente 31 Yano M., Third International Conference of Plant Molecular Breeding, Sep. 7, 2010
Documento de Não-Patente 32 Yusaku Uga, Nihon Ikusyu Gakkai Dai 118 Kai Kouenkai (118th Meeting of The Japanese Society of Breeding), Sept. 24, 2010; Ikusyugaku Kenkyu Dai 12 Gou Bessatsu 2 Gou (Breeding Research No. 12, supplement No. 2), pp. 21
Documento de Não-Patente 33 Yusaku Uga, CIAT (International Center of Tropical Agriculture, Colombia) niokeru Teiki Semina (Regular Meeting of CIAT), Oct. 29, 2010
Sumário da Invenção
Problemas a serem Solucionados pela Invenção
A presente invenção foi alcançada em vista das circunstâncias acima. Um objetivo da presente invenção é proporcionar métodos para alterar a morfologia da raiz da planta para conferir resistência à estiagem às plantas pelo aperfeiçoamento da capacidade de se evitar estiagem. Mais especificamente, um objetivo da presente invenção é proporcionar um novo gene relacionado ao enraizamento profundo de plantas, plantas transformadas tendo um traço de enraizamento profundo, métodos para produção de tais plantas, e métodos para avaliar se ou não uma planta tem um traço de enraizamento profundo.
Meios para Solucionar os Problemas
Uma região candidata para Dro1 está localizada no interior de uma região cromossomal de 1.443 kpb entre marcadores de inserção-anulação (InDel) ID07_14 e ID07_17 (baseado na sequência de nucleotídeo em Nipponbare). A região foi prevista para conter 166 genes de RAP-DB. Estes genes não se comprovaram incluir qualquer gene previamente reportado para ser relacionado ao enraizamento profundo de planta de
14/81 arroz, ou outras plantas, ou homólogos destes. Desse modo, seria impossível prever candidatos de gene baseado nas funções dos genes putativos. Além disso, desde que as sequências de nucleotídeo dos dois cultivares, IR64 e Kinandang Patong, não foram determinadas, seria difícil prever genes baseado nas diferenças nas sequências de nucleotídeo destes genes. Sob as circunstâncias acima descritas, os presentes inventores objetivam identificar e isolar o gene Dro1.
Primeiro, usando uma população de segregação de grande escala de cerca de 4.500 plantas, os presentes inventores realizaram uma análise de articulação de alta resolução para o local (local Dro1) responsável pela determinação do enraizamento profundo detectado em plantas de cruzamento IR64, um cultivar de arroz enraizado raso, com Kinandang Patong, um cultivar de arroz enraizado profundo. Um método convencional de cesta foi aperfeiçoado para testar várias centenas de plantas em um tempo para sua proporção de enraizamento profundo (percentagem de raízes que penetraram a área de fundo da cesta relativa ao número total de raízes que penetraram a cesta). Isto permite o exame de 500 plantas em um tempo. Contudo, foi impossível examinar em um tempo um número maior de plantas do que o acima. Várias linhas foram selecionadas de um grupo de linhas híbridas selecionadas da população de larga escala, e a região candidata foi estreitada etapa por etapa usando os dados de fenótipo/genótipo para 40 plantas por linha. Após estreitamento, a região candidata a partir da região de 1.443 kpb a cerca de 100 kpb, os inventores construíram e classificaram bibliotecas de cromossomo artificial bacterial (BAC) de IR64 e Kinandang Patong cobrindo a região candidata de 100-kpb. Ambos BACs para os cultivares foram analisados para identificar suas sequências de nucleotídeo. Para considerar se é possível estreitar os genes candidatos por comparação da sequência de nucleotídeo, as sequências de nucleotídeo de genes previstos-RAP-DB para os dois cultivares foram comparadas. Contudo, muitos genes têm mutações em suas sequências de nucleotídeo éxon, e, portanto, foi impossível estreitar os genes candidatos. Então, os presentes inventores realizaram análise de articulação por um total de cinco vezes, enquanto que produzindo marcadores
15/81 de DNA baseados nas mutações na sequência de nucleotídeo da região candidata. Como um resultado, a região de gene Dro1 foi estreitada a uma região de 6.0 kpb entre marcador de inserção-anulação (InDel) Dro1-INDEL09 (iniciador 5'- GCAGACGOTCGTAACACGTA-3' (SEQ ID NO: 4) e iniciador 5'- GTGGCAGCTCCATCAACTCT -3' (SEQ ID NO: 5)) e Sequências Polimórficas Amplificadas Clivadas (CAPS) marcador Dro1-CAPS05 (iniciador 5'- GCACAAGATGGGAGGAGAGT -3' (SEQ ID NO: 6) e iniciador 5'- CATGGGTGAGAATCGTGTTG -3' (SEQ ID NO: 7); o DNA amplificado foi tratado com enzima de restrição Hinf I). Esta região somente contém um gene putativo simples previsto em RAP-DB. O gene putativo foi deduzido para codificar uma proteína com função desconhecida. Desde que é muito difícil transformar IR64, antes da realização de um teste de complementação usando o método de transformação, se o gene previsto que é realmente relacionado ao enraizamento profundo foi avaliado. Primeiro, para avaliar se o gene tem uma função relacionada ao enraizamento profundo, sua função foi prevista baseada na sequência de aminoácido do gene putativo nas seguintes várias websites para pesquisa funcional:
SALAD database: Database for genome-wide comparison of plant protein sequências (salad.dna.affrc.go.jp/salad/)
Pfam: Protein domain database (pfam.janelia.org/)
PSORT: Site for predicting protein hydrophobicity and localization (www.psort.org/)
InterPro: Database for protein families, domains, functional sties (www.ebi.ac.uk/interpro/)
Contudo, nenhum domínio conservado pode ser encontrado usando-se qualquer destes locais. Em seguida, o gene foi examinado para revelar se seus exons têm variações de sequência de nucleotídeo entre IR64 e Kinandang Patong. O resultado mostrou que IR64 tinha uma anulação 1 b em éxon 4, enquanto que Kinandang Patong tinha uma adenina na mesma posição. Esta anulação 1 b causa uma alteração de estrutura, resultando em um códon de parada prematuro. Os presentes inventores suspeitaram que a anulação reduziu o nível de expressão do gene candidato em 1R64. Desse
16/81 modo, o nível de expressão foi avaliado usando lâminas de folha e uma porção superior de invólucro de folha, uma porção basal de invólucro de folha, e raízes de coroa de IR64 e Kinandang Patong nos dias 6 e 12 após germinação. O RNA total foi extraído a partir dos três tipos de tecidos, e o nível de expressão de gene foi determinado por PCR de tempo real. O resultado mostrou que nestes dois cultivares, o gene foi expresso na porção basal de invólucro de folha, mas expresso fortemente em ambas a raiz de coroa e lâmina de folha/porção superior do invólucro de folha. Os níveis de expressão foram comparados entre IR64 e Kinandang Patong. As amostras mostraram que a diferença entre os dois cultivares foi somente menos do que duas vezes ambos nos dias 6 e 12. Se o gene previsto foi o verdadeiro, o Gene Dro1 não pode ser julgado a partir do resultado no nível de expressão. Não-obstante, o gene permanece ser um candidato, porque a porção basal do invólucro de folha contém um primórdio de raiz de coroa, que é o rudimento de raiz de coroa, ou, alternativamente, porque a função do gene foi potencialmente diferente entre os dois cultivares no nível de aminoácido.
Em seguida, o gene que é relacionado ao enraizamento profundo foi avaliado baseado na correlação entre a proporção de enraizamento profundo e a anulação 1 b em éxon 4. Sessenta e quatro cultivares incluindo IR64 e Kinandang Patong, 22 linhas de cultivar IR desenvolvidas pelo International Rice Research Institute (Los Banos, Philippines; IR64 é também uma variedade desenvolvida por este Instituto), e 20 linhas tipo selvagem (sete linhas Oryza nivara, doze linhas O. rufipogon, e uma linha O. meridionalis) foram analisadas para suas sequências de nucleotídeo ao redor do local de 1 b-anulação. A comparação da sequência de nucleotídeo revelou que IR64 sozinho contém a anulação 1 b de éxon 4. Desse modo, se o gene previsto é o verdadeiro, o Gene Dro1 não pode ser julgado baseado na correlação entre a anulação 1 b e a proporção de enraizamento profundo.
A sequência de nucleotídeo de DNA complementar de Dro1 (cDNA) foi totalmente analisada para 14 variedades de japonica incluindo Kinandang Patong. A sequência de nucleotídeo foi idêntica entre todas as variedades. Por enquanto, a proporção de enraizamento profundo determi
17/81 nada pelo método de cesta variou grandemente de 15,9% (na mais inferior por Tupa729) a 83,1% (na mais superior por Kinandang Patong). Isto pode ser explanado pela presença do QTL responsável pelo enraizamento profundo. Alternativamente, algumas diferenças na sequência de nucleotídeo da região promotora pode afetar a regulação de expressão de gene. Desse modo, a sequência de nucleotídeo até cerca de 2.2 kb a montante (até 5' extremidade a montante da região candidata) foi comparada entre Kinandang Patong e Nipponbare. Mutações foram encontradas em dois lados. Uma está localizada 1.250 pb a montante da 5'-região não-transladada; o nucleotídeo nesta posição é timina na sequência de nucleotídeo de Nipponbare, e substituído com guanina em Kinandang Patong. A sequência adjacente à mutação foi analisada em PLACE (A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements; www.dna.affrc.go.jp/PLACE/), uma website para pesquisa das regiões promotoras para c/s elementos. Esta análise revelou que timina foi substituída com guanina em um motivo denominado GATA box. A outra mutação foi uma anulação de 30 pb de 1,189 pb a 1,218 pb a montante da 5' região não-transladada em Kinandang Patong. Estas mutações na sequência de nucleotídeo foram uma causa potencial da mutação de enraizamento profundo entre os cultivares.
Um cDNAde comprimento total para o gene Nipponbare previsto na região 6.0-kpb foi depositado sob AK068870. Desse modo, o sistema de busca FOX (CDNA de comprimento total que Sobre-eXpressa sistema de busca de gene) foi pesquisado para o gene Nipponbare. Como um resultado, a pesquisa revelou duas linhas de geração T1 e duas linhas de geração T2. Em seguida, a proporção de enraizamento profundo foi determinada para as quatro linhas usando cinco plantas por linha. Várias plantas demonstraram ter uma proporção de enraizamento profundo significantemente mais alta do que de Nipponbare (tipo selvagem) como um controle. Este resultado aumenta a probabilidade que o gene previsto é o verdadeiro Gene Dro1. Para verificar que o gene previsto é absolutamente o verdadeiro Gene Dro1, os presentes inventores produziram transformantes pela introdução em calos IR64 de um vetor que conduz o gene previsto (Gene de Dro1 do tipo Kinan
18/81 dang Patong). A eficiência de transformação foi 1/10 ou menos do que de um cultivar convenientemente transformado, tal como Nipponbare. Desse modo, os presentes inventores efetuaram transferência de gene após preparação de mais do que dez vezes como muitos calos para a transformação. Os transformantes de planta resultantes foram avaliados por sua proporção de enraizamento profundo. As plantas transformadas com o gene previsto demonstraram ter uma proporção de enraizamento profundo mais alta.
Estes dois experimentos descritos acima mostraram que o gene previsto na região candidata de 6.0 kpb foi o verdadeiro Dro1. Desse modo, os presentes inventores pela primeira vez identificaram com sucesso e isolaram o gene de enraizamento profundo Dro1.
Além disso, usando IR64 e uma linha quase isogênica (Dro1-N1L) que tem o mesmo antecedente genético como IR64, exceto que a região adjacente a Dro1 que foi substituída com aquela de Kinandang Patong, os presentes inventores avaliaram se o enraizamento profundo devido a Dro1 está relacionado ao aperfeiçoamento de resistência à estiagem. O resultado demonstrou que Dro1-NIL torna-se resistente a estiagem com um resultado de enraizamento profundo, conduzindo a um aumento significante no rendimento relativo para IR64.
Baseado nas descobertas descritas acima, a presente invenção proporciona:
[1] um DNA de qualquer um de (a) a (e) abaixo:
(a) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1;
(b) um DNA compreendendo uma região de codificação da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 12, 14, 16, e 17;
(c) um DNA que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3, 13, e 15;
(d) um DNA que hibridiza sob uma condição estringente a um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1,2, 12, 14, 16, e 17, etem uma atividade de conferir um fenótipo de
19/81 enraizamento profundo a uma planta; ou (e) um DNA que codifica uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido com uma ou mais substituições, anulações, adições, e/ou inserções de aminoácido na sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3, 13, e 15, e tem uma atividade de conferir um fenótipo de enraizamento profundo a uma planta;
[2] o DNA de [1], no qual a planta é uma monocotiledônea;
[3] o DNA de [2], no qual a monocotiledônea é uma planta gramínea;
[4] o DNA de [3], no qual a planta gramínea é selecionada a partir do grupo consistindo em arroz, variedade de trigo (trigo, cevada, centeio, aveia, e lágrimas de Job (hatomugi)), milho, milho miúdo, milho miúdo de rabo-de-raposa, milho miúdo japonês, sorgo, milho miúdo de dedo, milho miúdo de pérola, cereal africano, cana de açúcar, capim-rabo-de-gato, Capim-do-campo do Kentucky, grama de pomar, grama de centeio italiano, grama de centeio perenial, festuca alta, e grama da Bahia;
[5] o DNA de [3], no qual a planta gramínea é selecionada a partir do grupo consistindo em arroz, sorgo, e milho;
[6] um vetor compreendendo o DNA de qualquer um de [1] a [5];
[7] uma célula transformada que abriga o DNA de qualquer um de [1] a [5] em uma maneira expressível;
[8] uma planta transformada com o DNA de qualquer um de [1] a [5], que tem um fenótipo de enraizamento profundo;
[9] uma planta transformada produzida pela introdução em uma célula de planta do DNA de qualquer um de [1] a [5], ou o vetor de [6], que tem um fenótipo de enraizamento profundo;
[10] uma planta transformada que é obtida pelas etapas de (a) a (d) abaixo:
(a) introdução em uma célula de planta do DNA de qualquer um de [1] a [5] ou do vetor de [6];
(b) determinação do número de cópia do DNA de qualquer um de [1] a [5] na célula de planta da etapa (a);
20/81 (c) seleção de uma célula de planta transformada contendo o DNA introduzido ou vetor em uma cópia simples; e (d) regeneração de uma planta a partir da célula de planta transformada selecionada na etapa (c), e que tem um fenótipo de enraizamento profundo;
[11] a planta de qualquer um de [8] a [10], no qual a planta é uma monocotiledônea;
[12] a planta de [11], no qual a monocotiledônea é uma planta gramínea;
[13] a planta de [12], no qual a planta gramínea é selecionada a partir do grupo consistindo em arroz, variedade de trigo (trigo, cevada, centeio, aveia, lágrimas de Job (hatomugi)), milho, milho miúdo, milho miúdo de rabo-de-raposa, milho miúdo japonês, sorgo, milho miúdo de dedo, milho miúdo de pérola, cereal africano, cana de açúcar, capim-rabo-de-gato, capim-do-campo do Kentucky, grama de pomar, grama de centeio italiano, grama de centeio perenial, festuca alta, e grama da Bahia;
[14] uma planta de [12], no qual a planta gramínea é selecionada a partir do grupo consistindo em arroz, sorgo, e milho;
[15] uma planta transformada que é uma progenia ou clone da planta transformada de qualquer um de [8] a [14];
[16] uma célula isolada a partir da planta transformada de qualquer um de [8] a [15];
[17] um material de propagação da planta transformada de qualquer um de [8] a [15];
[18] um órgão isolado a partir da planta transformada de qualquer um de [8] a [15];
[19] um alimento processado preparado a partir de pelo menos uma da célula de [16], do material de propagação de [17], e do órgão de [18];
[20] um método para produção da planta transformada de qualquer um de [8], e [11] a [13], que compreende as etapas de introdução em uma célula de planta do DNA de qualquer um de [1] a [5], ou o vetor de [6], e regeneração de uma planta da célula de planta;
21/81 [21] o método de [20], que compreende adicionalmente a etapa de seleção de uma célula de planta transformada ou planta transformada, que tem o DNA de qualquer um de [1] a [5] em uma cópia simples;
[22] um método para avaliar se uma planta tem um fenótipo de enraizamento profundo, no qual uma planta de teste é julgada ter um fenótipo de enraizamento profundo quando um peso molecular ou sequência de nucleotídeo é idêntica, e que compreende as etapas de (a) a (c) abaixo:
(a) preparação de uma amostra de DNA de uma planta de teste;
(b) amplificação a partir da amostra de DNA de uma região compreendendo o DNA de qualquer um de [1] a [5]; e (c) comparação do peso molecular ou sequência de nucleotídeo do fragmento de DNA amplificado com aquele do DNA de qualquer um de [1] a [5];
[23] um método para avaliar se uma planta tem um fenótipo de enraizamento profundo, no qual uma planta de teste é julgada ter um fenótipo de enraizamento profundo quando um produto amplificado é obtido, que compreende a etapa de efetuar PCR com um iniciador compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8, e um iniciador compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 9 usando um DNA genômico preparado a partir da planta de teste como um gabarito;
[24] um método para avaliar se uma planta tem um fenótipo de enraizamento profundo, no qual uma planta de teste é julgada não ter um fenótipo de enraizamento profundo quando um produto amplificado é obtido, que compreende a etapa de efetuar PCR com um iniciador compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 10, e um iniciador compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 11 usando um DNA genômico preparado a partir da planta de teste como um gabarito;
[25] um método para selecionar uma planta tendo um fenótipo de enraizamento profundo, que compreende as etapas de (a) e (b) abaixo:
(a) produção de um cultivar por cruzamento de uma planta arbitrária com uma planta tendo um fenótipo de enraizamento profundo; e (b) avaliação pelo método de qualquer um de [22] a [24] se uma
22/81 planta obtida na etapa (a) tem um fenótipo de enraizamento profundo;
[26] uma proteína codificada pelo DNA de qualquer um de [1] a [5];
[27] um anticorpo que se liga à proteína de [26];
[28] um DNA compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos complementares ao DNA de qualquer um de [1] a [5] ou uma sequência complementar destes; e [29] um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de qualquer um de SEQ ID NOs: 4 a 11.
Efeitos da Invenção
O Gene Dro1, que controla o enraizamento profundo de plantas, tais como plantas de arroz, e plantas transformadas com o gene foram providos pela presente invenção. O gene da presente invenção pode ser usado para manipular a morfologia do sistema de raiz de planta de um enraizamento raso a enraizamento profundo, ou de um enraizamento profundo a enraizamento raso. Especificamente, a resistência à estiagem pode ser conferida pelo aperfeiçoamento da capacidade de se evitar estiagem, por exemplo, pela manipulação do Gene Dro1 para converter uma planta de enraizamento raso em uma planta de enraizamento profundo. As estiagens causam sérias reduções na produção de colheita mundial. AS empresas estrangeiras maiores têm se focalizado no desenvolvimento de plantas de colheita tolerantes à estiagem. Por outro lado, a resistência à umidade pode ser conferida através da conversão de uma planta de enraizamento profundo em enraizamento raso pela manipulação do Gene Dro1. No Japão, a alteração na política de agricultura recomenda cultivo de terreno elevado em campos de arroz sem cultivo. Contudo, desde que campos de arrozal têm pobre eficiência de drenagem, dano por umidade tem sido problemático para soja e milho sem resistência à umidade. Portanto, a conversão de plantas de colheita em um tipo de enraizamento raso tem sido estudada com o objetivo de aperfeiçoar resistência à umidade. Sob estas circunstâncias internacionais e domésticas, é muito importante desenvolver variedades de planta de colheita que sejam resistentes à estiagem ou dano de umidade pelo uso de genes
23/81 que controlam a morfologia da raiz da planta.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 apresenta uma fotografia mostrando a avaliação de cada linhagem para o enraizamento profundo usando um método de cesta aperfeiçoado. Um anel é fixado a uma cesta de aço inoxidável. O anel é disposto em uma posição de modo que as raízes são julgadas serem raízes profundas quando do alongamento em um ângulo de 50 graus, ou mais profundas com relação a superfície do solo. Em cada legenda, as primeira e segunda abreviações se referem ao nome e geração da linhagem, respectivamente.
A figura 2 apresenta um gráfico mostrando a distribuição da proporção de enraizamento profundo na geração TO dos transformantes IR64 introduzidos com um vetor que conduz Dro1 ou o vetor sozinho.
A figura 3 apresenta gráficos mostrando o relacionamento entre a proporção de enraizamento profundo e a intensidade de sinal (PCR de tempo real) de acordo com o número de cópia do vetor de transformação na geração T1 dos transformantes IR64 introduzidos com um vetor que conduz Dro1 ou o vetor sozinho. Cópia simples e multicópia se referem a uma linhagem introduzida com somente uma cópia simples de Dro1 e uma linhagem introduzida com cópias múltiplas de Dro1 na geração TO, respectivamente. Na geração T1, a linhagem de cópia simples é separada em tipo nula (0 cópia), heterozigótica (uma cópia), e homozigótica (duas cópias), e as intensidades de sinal são agrupadas em três tipos de acordo com o número de cópias. Contudo, diferente da análise de Southern, PCR de tempo real, em princípio, nem sempre dá a mesma intensidade de sinal mesmo se o número de cópia é o mesmo entre plantas. A abreviação em cada gráfico mostra o número de linhagem para o respectivo clone.
A figura 4 apresenta a gráfico mostrando as distribuições da proporção de enraizamento profundo em Fox linhagem e Nipponbare.
A figura 5 apresenta um diagrama mostrando o resultado da análise dos ortólogos de sorgo e milho. Dro1, arroz (Kinandang Patong); SbDro1L1, ortólogo de sorgo de Dro1; ZmDro1L1, ortólogo de milho de Dro1.
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A figura 6 apresenta fotografias mostrando comparação do enraizamento profundo de Dro1-NIL com aquele de IR64 e Kinandang Patong em um campo. O numeral branco mostra a profundidade do solo abaixo da superfície do solo. A linha tracejada branca indica um esboço da área de distribuição do sistema de raiz.
A figura 7 apresenta um gráfico mostrando o curso de tempo de potencial de água no solo no campo experimental para um teste de resistência à estiagem. Irrigada e Estiagem indicam a área de irrigação e área de estresse de estiagem, respectivamente. As profundidades do solo onde o potencial de água foi monitorado são mostradas em parêntese. A uma profundidade do solo de 25 cm na área de estresse de estiagem, uma rápida progressão de dessecação de solo é observada cerca de 70 dias após semeadura.
A figura 8 apresenta fotografias mostrando diferença dependente do tempo em resistência a enrolamento de folha entre IR64 e Dro1-NIL sob uma condição de estresse de estiagem. As fotografias de planta são vistas tomadas de cima. Os números de dias mostrados no topo da figura são os dias de tratamento de estresse após irrigação ser terminada na área de estresse de estiagem.
A figura 9 apresenta gráficos e fotografias mostrando diferenças na temperatura da folha, condutância estomatal, e taxa de fotossíntese entre IR64 e Dro1-NIL sob uma condição de estresse de estiagem. Conforme mostra uma imagem visível de plantas de arroz 35 dias após terminação de irrigação. As primeira e segunda linhas da direita são IR64; as terceira e quarta são Dro1-NIL. B mostra uma imagem mostrando a distribuição de temperatura das plantas de arroz 35 dias após terminação de irrigação (uma imagem de termografia de infravermelho tomada para as mesmas plantas conforme mostrado em A). As primeira e segunda linhas da direita são 1R64; a terceira e quarta são Dro1-NIL. A diferença de cor implica no seguinte: a medida que a cor é mais quente, a temperatura é mais alta; a medida que a cor é mais fria, a temperatura é mais baixa. Esta fotografia sugere que a temperatura da folha é diferente entre IR64 e Dro1-NIL (a temperatura da
25/81 folha de Dro1-NIL é em média 0,7°C mais baixa do que aquela de IR64). As cores frias são distribuídas mais amplamente em Dro1-NIL, sugerindo que a temperatura da folha de Dro1-N1L é mais baixa do que aquela de 1R64. C mostra mudanças na temperatura da folha de Dro1-NIL após terminação de irrigação na área de estresse de estiagem. Os valores são relativos à temperatura da folha de IR64, e foram determinados pela subtração da temperatura da folha média de IR64 daquela de Dro1-NIL. A temperatura da folha de Dro1-NIL foi verificada ser mais baixa do que aquela de 1R64 em muitos dados de medição. D mostra a diferença na condutância estomatal entre IR64 e Dro1-NIL após terminação de irrigação na área de estresse de estiagem. * indica que a condutância estomatal de Dro1-N1L é significantemente maior do que aquela de IR64 em um nível de 5%. E mostra diferenças na taxa de fotossíntese entre IR64 e Dro1-NIL após terminação de irrigação na área de estresse de estiagem. * indica que a taxa de fotossíntese de Dro1-NIL é significantemente maior do que aquela de IR64 em um nível de 5%.
A figura 10 apresenta diagramas e fotografias mostrando resultados de determinação de rendimento para IR64 e Dro1-NIL cultivados sob uma condição de estresse de estiagem. A mostra várias diferenças fenotípicas entre IR64 coletado e Dro1-N1L, que foram crescidos na área de estresse de estiagem. A barra vertical indica desvio padrão. *, **, ou *** indica que Dro1-NIL é significantemente maior do que IR64 a um nível de 5%, 1%, ou 0,1%, respectivamente. B apresenta fotografias mostrando as panículas médias de 1R64 e Dro1-NIL coletados na área de estresse de estiagem.
A figura 11 apresenta fotografias mostrando uma vista lateral do campo experimental dessecado para teste de resistência à estiagem, que mostra diferenças na distribuição do sistema de raiz entre IR64 e Dro1-NIL em uma área de estresse de estiagem. O painel superior para cada linhagem mostra uma vista seccional do campo experimental, e o painel inferior mostra uma imagem ampliada pela lavagem do solo superior adicional para observar se as raízes penetram o estrato de cascalho. As cabeças de seta indicam raízes de Dro1-NIL que penetraram o estrato de cascalho. É mostrado que
26/81 em IR64, não existe raiz que penetra o estrato de cascalho e alcança a camada mais profunda, mas em Dro1-N1L, muitas raízes penetram o estrato de cascalho e alcançam a camada mais profunda.
A figura 12 apresenta um gráfico mostrando o curso de tempo de potencial de água no solo de campo.
A figura 13 apresenta fotografias mostrando o aparecimento de plantas 120 dias após semeadura nas áreas de campo com ou sem fertilização. Os painéis superiores mostram a vista total incluindo as áreas respectivas. Os painéis inferiors são fotografias tomadas de cima como imagens ampliadas das respectivas áreas. Em IR64, enrolamento de folha é observada ambos nas áreas com ou sem fertilização. Por enquanto, Dro1-NIL não mostra enrolamento de folha.
A figura 14 apresenta uma fotografia mostrando os resultados de marcador de PCR para a avaliação da anulação de Gene Dro1. Em cada temperatura de recozimento, as raias esquerda e direita mostram os resultados para IR64 e Kinandang Patong, respectivamente.
Modo para Efetuar a Invenção
A presente invenção proporciona um DNA de qualquer um de (a) a (e) abaixo:
(a) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1;
(b) um DNA compreendendo a região de codificação da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 12, 14, 16, e 17;
(c) um DNA que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3, 13, e 15;
(d) um DNA que hibridiza sob uma condição estringente a um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 12, 14, 16, e 17, etem uma atividade de conferir um fenótipo de enraizamento profundo a uma planta; ou (e) um DNA que codifica uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido com uma ou mais substituições, anulações e/ou inserções de aminoácido na sequência de aminoácido de qualquer uma de
26/81 em IR64, não existe raiz que penetra o estrato de cascalho e alcança a camada mais profunda, mas em Dro1-NIL, muitas raízes penetram o estrato de cascalho e alcançam a camada mais profunda.
A figura 12 apresenta um gráfico mostrando o curso de tempo de potencial de água no solo de campo.
A figura 13 apresenta fotografias mostrando o aparecimento de plantas 120 dias após semeadura nas áreas de campo com ou sem fertilização. Os painéis superiores mostram a vista total incluindo as áreas respectivas. Os painéis inferiores são fotografias tomadas de cima como imagens ampliadas das respectivas áreas. Em IR64, enrolamento de folha é observada ambos nas áreas com ou sem fertilização. Por enquanto, Dro1-NIL não mostra enrolamento de folha.
A figura 14 apresenta uma fotografia mostrando os resultados de marcador de PCR para a avaliação da anulação de Gene Dro1. Em cada temperatura de recozimento, as raias esquerda e direita mostram os resultados para IR64 e Kinandang Patong, respectivamente.
Modo para Efetuar a Invenção
A presente invenção proporciona um DNA de qualquer um de (a) a (e) abaixo:
(a) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1;
(b) um DNA compreendendo a região de codificação da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1,2, 12, 14, 16, e 17;
(c) um DNA que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3, 13, e 15;
(d) um DNA que hibridiza sob uma condição estringente a um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 12, 14, 16, e 17, e tem uma atividade de conferir um fenótipo de enraizamento profundo a uma planta; ou (e) um DNA que codifica uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido com uma ou mais substituições, anulações, adições, e/ou inserções de aminoácido na sequência de aminoácido de qualquer uma
27/81 de SEQ ID NOs: 3, 13, e 15, e tem uma atividade de conferir um fenótipo de enraizamento profundo a uma planta.
Em seguida, ocasionalmente, os DNAs acima descritos são também referidos como DNA da presente invenção ou Gene Dro1. Por enquanto, uma proteína codificada por um DNA da presente invenção é, aà vezes, referida como proteína da presente invenção ou proteína Dro1.
Aqui, compreende também se refere a ambos compreende e consiste de.
Por enquanto, o DNA de (e) acima pode também ser referido como:
(e) uma DNA que codifica uma proteína tendo pelo menos uma mutação selecionado de uma ou mais substituições, anulações, adições, e inserções de aminoácido no aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3, 13, e 15, e tendo a atividade de conferir um traço de enraizamento profundo a uma planta.
Além disso, um DNA da presente invenção pode ser referido como DNA isolado.
A sequência de nucleotídeo de DNAgenômico para o Gene Dro1 de cultivar de arroz Kinandang Patong é mostrada em SEQ ID NO: 1; a sequência de nucleotídeo do cDNAé mostrada em SEQ ID NO: 2; e a sequência de aminoácido da proteína codificada pelas regiões de codificação das sequências de nucleotídeo (proteína Dro1) é mostrada em SEQ ID NO: 3.
A região de codificação de proteína na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 consiste dos nucleotídeos nas posições 264 a 2,685.
Por enquanto, a região de codificação de proteína na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 consiste nos nucleotídeos nas posições 264 a 1019.
Além disso, a sequência de nucleotídeo do Gene Dro1 e sua a montante incluindo a região promotora de Kinandang Patong é mostrada em SEQ ID NO: 17. Quando comparada à sequência da região equivalente em Nipponbare (SEQ ID NO: 18), uma sequência em Kinandang Patong (SEQ ID NO: 17) contém uma substituição de nucleotídeo simples e uma anulação de
28/81 nucleotídeos cerca de 1.2 kb a montante do Gene Dro1. Especificamente, T do motivo GATA (o nucleotídeo na posição 6 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 18) em Nipponbare é substituída com G em Kinandang Patong (o nucleotídeo na posição 6 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17). Em adição, os 30 nucleotídeos nas posições 7 a 36 in SEQ ID NO: 18 são anulados na região correspondente de Kinandang Patong.
A sequência de nucleotídeo da sequência de codificação (CDS) no Gene Dro1 derivado de sorgo é mostrada em SEQ ID NO: 12, enquanto que a sequência de aminoácido da proteína codificada pela região de codificação da sequência de nucleotídeo é mostrada em SEQ ID NO: 13.
A região de codificação de proteína da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 12 (sequência CDS) consiste nos nucleotídeos nas posições 1 a 789.
A sequência de nucleotídeo de CDS no Gene Dro1 derivada do milho é mostrada em SEQ ID NO: 14, enquanto que a sequência de aminoácido da proteína codificada pela região de codificação da sequência de nucleotídeo é mostrada em SEQ ID NO: 15.
A região de codificação de proteína da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 14 (sequência CDS) consiste nos nucleotídeos nas posições 1 a 768.
O Gene Dro1 da presente invenção tem a atividade de conferir um traço de enraizamento profundo a uma planta. Aqui, o traço de enraizamento profundo se refere à natureza que a raiz, um órgão subterrâneo da planta, se prolonga no solo com um ângulo profundo relativo à superfície do solo. Aqui, um ângulo profundo significa que o ângulo de uma raiz com relação à superfície do solo é pelo menos 50°, preferivelmente 60°, mais preferivelmente 70°, e ainda mais preferivelmente 80°, ou mais.
Se um DNA tem a atividade de conferir um traço de enraizamento profundo a uma planta pode ser confirmado pela preparação de uma planta transformada com o Gene Dro1 e determinando o ângulo da planta relativo à superfície do solo. As plantas podem ser avaliadas para o ângulo relativo á superfície do solo, por exemplo, pelo método de cesta e um método de cesta
29/81 aperfeiçoado descritos nos Exemplos aqui, bem como pelo método de abrir trincheiras, método de monolito, e método de amostragem de núcleo; contudo, tais métodos não são limitados a estes.
Os DNAs que codificam uma proteína Dro1 da presente invenção incluem DNAs genômicos, cDNAs, e DNAs quimicamente sintetizados. Tais DNAs genômicos e cDNAs podem ser preparados por métodos convencionais conhecidos àqueles técnicos na área. Os DNAs genômicos podem ser preparados, por exemplo, conforme segue. O DNA genômico é extraído de plantas de um cultivar de arroz (por exemplo, Kinandang Patong), sorgo, ou milho, tendo um enraizamento profundo para preparar uma biblioteca genômica (vetores tais como plasmídeos, fagos, cosmídeos, BACs, e cromossomos artificiais P1 (PACs) podem ser usados, mas não são limitados a estes); e a biblioteca é amplificada, e classificada pela colônia ou placa de hibridização usando uma sonda preparada de um DNA que codifica proteína Dro1 (por exemplo, DNA tendo a sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 12, 14, 16, e 17). Alternativamente, tais DNAs genômicos podem ser preparados por PCR usando iniciadores preparados para serem específicos a um DNA que codifica proteína Dro1 (por exemplo, DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 12, 14, 16, e 17). Por enquanto, os cDNAs podem ser preparos, por exemplo, conforme segue. O cDNA é sintetizado usando mRNA extraído de plantas de um cultivar de arroz (por exemplo, Kinandang Patong) tendo um enraizamento profundo, e inserido em um vetor tal como DZAP para construir uma biblioteca de cDNA; e a biblioteca é amplificada e classificada pela colônia ou placa de hibridização. Alternativa mente, os cDNAs podem ser preparados por PCR na mesma maneira descrita acima.
Por outro lado, os DNAs quimicamente sintetizados podem ser preparados, por exemplo, pelo uso de sintetizadores de oligonucleotídeo disponíveis no mercado.
Alternativamente, os DNAs que codificam uma proteína Dro1 da presente invenção podem ser preparados por extração do DNA genômico ou mRNA do sorgo (por exemplo, lâmina de folha e invólucro) ou milho (por
30/81 exemplo, lâmina de folha e invólucro) tendo um enraizamento profundo.
A presente invenção compreende DNAs que codificam uma proteína funcionalmente equivalente à proteína Dro1 de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3, 13, e 15. Aqui, funcionalmente equivalente à proteína Dro1 significa que a proteína de interesse tem uma função de conferir um traço de enraizamento profundo a uma planta. Os DNAs preferidos são aqueles derivados de monocotiledôneas, mais preferivelmente aqueles derivados da família Gramineae, família Liliaceae, família Bromeliaceae, família Palmae, família Araceae, família Zingiberaceae, e família Orchidaceae, ainda mais preferivelmente aqueles derivados de arroz, variedades de trigo (trigo, cevada, centeio, aveia, e lágrimas de Job (hatomugi)), milho, milho miúdo, milho miúdo de rabo-de-raposa, milho miúdo japonês, sorgo, milho miúdo de dedo, milho miúdo de pérola, cereal africano, cana de açúcar, capim-rabo-de-gato, capim-do-campo do Kentucky, grama de pomar, grama de centeio italiano, grama de centeio perenial, festuca alta, e grama da Bahia, e, particularmente preferivelmente, aqueles derivados de arroz, sorgo, e milho.
Tais DNAs incluem, por exemplo, mutantes, derivados, alelos, variantes, e homólogos que codificam uma proteína tendo a função de conferir um traço de enraizamento profundo a uma planta, e compreendendo uma sequência de aminoácido com uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 resíduos) substituições, anulações, adições, e/ou inserções de aminoácido na sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3, 13, e 15.
Exemplos de métodos bem conhecidos na técnica para preparação de DNAs que codificam uma proteína com sequência de aminoácido alterada incluem métodos de mutagênese direcionada de local (Kramer, W. and Fritz, H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA. Methods in Enzymology, 154: 350-367). Na natureza, mutações nas sequências de nucleotídeo podem também conduzir a mutações na sequências de aminoácido de proteínas codificadas desse modo. Conforme descrito acima, os DNAs que codificam uma proteína tendo uma sequência de aminoácido com uma ou mais substituições, anulações ou a31/81 dições de aminoácido na sequência de aminoácido que codifica a proteína Dro1 que ocorre naturalmente são incluídos nos DNAs da presente invenção, considerando-se que eles codificam uma proteína tendo a função equivalente à proteína Dro1 que ocorre naturalmente (sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3, 13, e 15). Tais DNAs incluem, por exemplo, DNAs compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 16. Os DNAs compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 16 têm uma sequência de nucleotídeo com uma adição 1-pb em cada uma das extremidades 5' e 3' em um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2. Os DNAs também têm uma substituição de G por A na posição pb 373 da extremidade 5' (na posição pb 372 da extremidade 5' em SEQ ID NO: 2). Devido a esta substituição de nucleotídeo, a sequência de aminoácido codificada por tal DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 16 tem uma substituição de aminoácido não-sinônima de ácido glutâmico para lisina na posição 37 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3. A presente invenção também proporciona tais proteínas compreendendo uma sequência de aminoácido com uma substituição de ácido glutâmico por lisina na posição 37 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3. A presente invenção também proporciona DNAs que codificam tal proteína (por exemplo, DNAs compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQIDNO: 16).
Mesmo se a sequência de nucleotídeo tem uma mutação, em alguns casos, a mutação não pode resultar em quaisquer mutações na sequência de aminoácido da proteína (degeneração de mutação). Tais mutantes (mutantes degenerados) são também incluídos nos DNAs da presente invenção.
Outros métodos bem conhecidos àqueles técnicos no assunto para preparação de um DNA que codifica uma proteína funcionalmente equivalente à proteína Dro1 de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3, 13, e 15 incluem métodos usando técnicas de hibridização (Southern, Ε. M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503) ou técnicas de PCR (Saiki, R. K. et al., (1985) Science, 230, 1350-1354; Saiki, R. K. et al., (1988) Science, 239,
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487-491). Especificamente, àqueles técnicos no assunto podem prontamente isolar DNAs com alta homologia ao Gene Dro1 de arroz ou outras plantas usando como uma sonda a sequência de nucleotídeo do Gene Dro1 (a sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 12, 14, 16, e 17), ou uma porção desta, ou usando como oligonucleotídeos de iniciadores que especificamente hibridizam ao Gene Dro1 (a sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1,2, 12, 14, 16, e 17). Os DNAs da presente invenção também compreendem tais DNAs que codificam uma proteína que é funcionalmente equivalente à proteína Dro1, que pode ser isolada pelo uso de técnicas de hibridização ou PCR.
Para isolar tais DNAs, uma reação de hibridização é preferivelmente efetuada sob condições estringentes. Àqueles técnicos no assunto podem apropriadamente selecionar condições de hibridização estringentes. Por exemplo, pré-hibridízação é efetuada em uma solução de hibridização contendo 25% de formamida, ou 50% de formamida, sob condições mais estringentes, e 4x SSC, 50 mM de Hepes (pH 7,0), 10x solução de Denhardt, e 20 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturada a 42°C durante a noite; em seguida, sondas etiquetadas são adicionadas, e hibridização é efetuada por incubação a 42°C durante a noite. Lavagem de pós- hibridização pode ser efetuada com as seguintes condições para a solução de lavagem e temperatura: por exemplo, 2x de SSC, 0,1% de SDS, 50°C, 2x SSC, 0,1% de SDS, 42°C, 1x SSC, 0,1% de SDS, 37°C, ou assim; 2x SSC, 0,1% de SDS, 65°C, 0,5x de SSC, 0,1% de SDS, 42°C, ou assim para uma condição mais estringente; e 0,2x SSC, 0,1% de SDS, 65°C, ou assim para uma condição ainda mais estringente. À medida que a estringência da hibridização aumenta, o isolamento de DNAs com alta homologia à sequência de sonda é esperado. Contudo, as combinações acima descritas de SSC, SDS, e condições de temperatura são meros exemplos, e aqueles técnicos no assunto podem alcançar estringências similares conforme aquelas descritas acima por combinação apropriadamente dos elementos acima ou outros (tal como concentração de sonda, comprimento de sonda, ou tempo de reação de hibridização) que determinam a estringência de hibridização.
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Desse modo, a proteína codificada por tal DNA isolado é esperada ter alta homologia à sequência de aminoácido de proteína Dro1 (SEQ ID NO: 3, 13, ou 15) no nível de aminoácido. Além disso, o
O DNA é esperado ter alta homologia á sequência de nucleotídeo de um DNA que codifica proteína Dro1 (SEQ ID NO: 1, 2, 12, 14, 16, ou 17) no nível de sequência de nucleotídeo. A alta homologia se refere a uma identidade de sequência de pelo menos 50% ou mais, preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais) sobre o aminoácido total ou sequência de nucleotídeo. Tal sequência de aminoácido ou identidade de sequência de nucleotídeo pode ser determinada usando o algoritmo BLAST por Karin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sei USA 90: 5873, 1993). Programas denominados BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos baseados no algoritmo BLAST (Altschul SF, et aí, J Mol Biol 215: 403, 1990). Quando sequências de nucleotídeo são analisadas usando BLASTN, os parâmetros podem ser ajustados em: classificação = 100 e comprimento de palavra =12, por exemplo. Alternativamente, quando as sequências de aminoácido são analisadas usando BLASTX, os parâmetros podem ser ajustados em: classificação = 50 e comprimento de palavra = 3, por exemplo. Quando os programas BLAST e Gapped BLAST são usados, é possível usar parâmetros de falta para cada programa. Procedimentos específicos são conhecidos para estes métodos analíticos.
Os DNAs da presente invenção podem ser usados, por exemplo, na preparação de proteínas recombinantes e produção de transformantes de planta tendo um traço de enraizamento profundo.
As proteínas recombinantes são tipicamente preparadas por inserção de DNAs que codificam proteínas da presente invenção em vetores de expressão apropriados, introdução de vetores em células apropriadas, cultura das células transformadas, e purificação das proteínas expressas. As proteínas recombinantes podem ser expressas como proteínas de fusão com outras proteínas para produzir purificação mais fácil, por exemplo, como proteínas de fusão com proteína de ligação de maltose usando Escheríchia
34/81 cofi como um hospedeiro (New England Biolabs, USA, vector pMAL series), como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST) (Amersham Pharmacia Biotech, vector pGEX series), ou etiquetadas com histidina (Novagen, pET series). As células hospedeiras não são particularmente limitadas, considerando-se que a célula é adequada para expressão das proteínas recombinantes. É possível usar, por exemplo, levedura, várias plantas ou células de animal, células de inseto, ou tais, em adição ao descrito acima E. coli. Os vetores podem ser introduzidos em células hospedeiras por uma variedade de métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto. Por exemplo, os métodos de introdução usando íons cálcio podem ser usados para introdução em E. coli (Mandei, M. & Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162; Hanahan, D. (1983) Journal of Molecular Bíology, 166, 557-580). As proteínas recombinantes expressas nas células hospedeiras podem ser purificadas e recuperadas das células hospedeiras, ou um sobrenadante de cultura destas, por métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto. As proteínas recombinantes podem ser mais fáceis por afinidade quando expressas como proteínas de fusão com a proteína de ligação de maltose acima descrita, ou tais. Alternativamente, os transformantes de planta introduzidos com um DNA da presente invenção podem ser produzidos pelas técnicas descritas aqui abaixo. As proteínas da presente invenção podem ser preparadas de tais plantas. Consequentemente, os transformantes de planta da presente invenção incluem plantas introduzidas com um DNA da presente invenção para preparar uma proteína da presente invenção, bem como as plantas introduzidas com um DNA da presente invenção para conferir um traço de enraizamento profundo às plantas, que são descritas aqui abaixo.
A proteína recombinante resultante pode ser usada para preparar anticorpos que se ligam à proteína. Os anticorpos policlonais podem ser preparados, por exemplo, conforme segue. Os animais para imunização, tal como coelhos, são imunizados com uma proteína purificada da presente invenção, ou um peptídeo parcial desta; e após um certo período, seu sangue é coletado, e o sangue coagulado é removido. Por enquanto, os anticorpos
35/81 monoclonais podem ser preparados como segue. As células de mieloma são fundidas com células de produção de anticorpo de animais imunizados com uma proteína ou peptídeo acima descritos; células de clone simples (hibridomas) que produzem o anticorpo de interesse são isoladas; e o anticorpo é obtido das células. O anticorpo resultante pode ser usado para purificar ou detectar as proteínas da presente invenção. A presente invenção compreende anticorpos que se ligam a uma proteína da presente invenção. Tais anticorpos podem ser usados para detectar locais de expressão da proteína Dro1 em plantas, ou para avaliar se uma espécie de planta expressa a proteína Dro1. Por exemplo, a sequência de aminoácido das posições 227 a 251 da proteína Dro1 tipo Kinandang Patong é uma característica de sequência de cultivares tendo um traço de enraizamento profundo. Desse modo, os anticorpos que especificamente reconhecem as sequências de aminoácido totais, ou uma porção desta, podem ser usados para avaliar se uma espécie de planta expressa a proteína Dro1 tipo Kinandang Patong (se ela tem um traço de enraizamento profundo).
A presente invenção também proporciona vetores e células transformadas compreendendo o Gene Dro1.
Com relação aos vetores da presente invenção, por exemplo, quando o hospedeiro é E. coli, considerando-se que o vetor tem uma ori para amplificação em E. coli, tal que os vetores são amplificados e preparados em grandes quantidades em E. coli (por exemplo, JM109, DH5D, HB101, e XLIBlue) ou tais, e, adicionalmente, tem um gene de seleção para E. coli transformado (por exemplo, um gene de resistência à droga que permite discriminação usando uma droga (ampicilina, tetraciclina, canamicina, cloranfenicol, ou tais)), os vetores não são limitados. Tais vetores incluem, por exemplo, vetores M13, vetores pUC, pBR322, pBluescript, e pCR-Script Em adição aos vetores acima, por exemplo, pGEM-T, pDIRECT, e pT7 podem também serem usados para a subclonagem e excisão de cDNAs. Quando se usa vetores para produzir a proteína Dro1, os vetores de expressão são particularmente úteis. Quando um vetor de expressão é expresso em E. coli, por exemplo, ele deve ter as características acima de modo a ser amplificado em
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E. coli. Adicionalmente, quando E. coli tal como JM109, DH5D, HB101, ou XL1-B!ue são usados como o hospedeiro, o vetor deve ter um promotor que permite expressão eficiente em E. coli, por exemplo, um promotor lacZ (Ward et al. Nature 341: 544-546, 1989; FASEB J. 6: 2422-2427, 1992), promotor araB (Better et al. Science 240:1041-1043, 1988), ou promotor T7. Outros exemplos dos vetores incluem pGEX-5X-1 (Pharmacia), QIAexpress system (QIAGEN), pEGFP, e pET.
Além disso, o vetor pode compreender uma sequência de sinal para secreção de polipeptídeo. Quando se produz polipeptídeos no periplasm de E. coli, a sequência de sinal pelB (Lei, S. P et al. J. Bacteriol. 169: 4379 (1987)) pode ser usada como a sequência de sinal para secreção de polipeptídeo. Por exemplo, métodos de cloreto de cálcio ou métodos de eletroporação podem ser usados para introduzir o vetor em uma célula hospedeira. Vetores para expressar no corpo da planta incluem pMH1, pMH2, pCAMBIA, e tais.
Em adição a E. coli, vetores de expressão derivados de mamíferos (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids Res. 18(17): 5322 (1990)), pEF, e pCDM8), células de inseto (por exemplo, Bac-to-BAC baculovirus expression system (GIBCO-BRL) e pBacPAK8), plantas (por exemplo,, pMH1 e pMH2), vírus de animal (por exemplo, pHSV, pMV, e pAdexLcw), retrovírus (por exemplo, pZIPneo), leveduras (por exemplo, Pichia Expression Kit (Invitrogen), pNV11 e SP-Q01), e Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608 e pKTH50), podem também serem usados como vetores para produção da proteína Dro1.
Para expressão em células de animal tais como células de CHO, COS, e NIH3T3, o vetor deve ter um promotor necessário para expressão em tais células, por exemplo, um promotor SV40 (Mulligan et al. Nature 277: 108 (1979)), promotor MMLV-LTR, promotor EF1 L(Mizushíma etal. Nucleic Acids Res. 18: 5322 (1990)), ou promotor CMV. É ainda mais preferível que o vetor compreenda um gene para seleção de transformantes (por exemplo, um gene resistente à droga que capacita discriminação por uma droga (tal como neomicina e G418)). Exemplos de vetores com tais características incluem
37/81 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, e pOP13.
As células transformadas da presente invenção podem ser usadas, por exemplo, como um sistema de produção para expressão ou produção de proteínas da presente invenção. Tais sistemas de produção de proteína incluem sistemas in vitro e in vivo.
Quando células eucarióticas são usadas, por exemplo, células de animal, células de planta, ou células de fungo, são usadas como células hospedeiras. Células de animal conhecidas incluem células de mamífero (por exemplo, células tais como 3T3, células de mieloma, BHK (rim de hamster recém-nato), HeLa, e Vero, em adição à células CHO, células COS, e células NIH3T3 descritas acima), células de anfíbio (por exemplo, Xenopus laevis oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340)), e células de inseto (por exemplo, células tais como sf9, sf21, e Tn5). Entre as células de CHO, dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1980) 77, 4216-4220), que é células de CHO deficientes de gene DHFR, e CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1968) 60, 1275), podem ser preferivelmente usadas na presente invenção. As células de CHO são particularmente preferidas para uso em expressão de grande escala.
As células de planta incluem, por exemplo, as células derivadas de planta descritas abaixo, bem como células derivadas de Nicotiana tabacum bem conhecidas como sistemas de produção de proteína. É possível cultivar calos de células.
Por enquanto, células de fungo incluem células de levedura, por exemplo, células do gênero Saccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae-, células de fungo filamentoso, por exemplo, o gênero Aspergillus, por exemplo, Aspergillus niger, mas não são limitados a estas.
A presente invenção também proporciona as células acima descritas introduzidas com um DNA ou vetor da presente invenção.
Além disso, a presente invenção se relaciona a plantas transformadas com o Gene Dro1, que tem um traço de enraizamento profundo.
Se uma planta tem um enraizamento profundo, o traço pode também ser avaliado por comparação do mesmo com um controle. Aqui,
38/81 considerando-se que a raiz de transformante de planta se prolonga no solo a um ângulo mais profundo com relação à superfície do solo quando comparado a um controle, mesmo se a diferença de ângulo é muito pequena, o transformante é julgado ter um traço de enraizamento profundo. Se uma raiz de um transformante de planta se prolonga no solo com um ângulo mais profundo com relação à superfície do solo, ela pode ser avaliada pelos métodos descritos acima.
Aqui, controle se refere a uma planta que é do mesmo tipo como um transformante de planta da presente invenção, mas sem introdução artificial de um DNA da presente invenção, ou que não tem qualquer DNA da presente invenção. Aqui, o controle não é particularmente limitado, considerando-se que ele é uma planta que é do mesmo tipo como um transformante de planta da presente invenção, mas sem introdução artificial de um DNA da presente invenção, ou que não tem qualquer DNA da presente invenção. Consequentemente, o controle da presente invenção também compreende plantas artificialmente introduzidas com DNAs outros do que os DNAs da presente invenção. Tais plantas incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, plantas do mesmo tipo como um transformante de planta da presente invenção, que são transformados com um DNA outro do que os DNAs da presente invenção, um DNA da presente invenção introduzido com uma mutação que causa perda de função no DNA, um DNA da presente invenção convertido em um tipo que suprime a função, ou um fragmento de DNA contendo somente uma porção de um DNA da presente invenção que é insuficiente para exercer a função do DNA.
As plantas transformadas com um DNA da presente invenção não são particularmente limitadas, considerando-se que elas têm um traço de enraizamento profundo, e podem conter modificações em quaisquer outras partes. Tais modificações em quaisquer outras partes incluem, por exemplo, mudanças morfológicas de panículas, mas não são limitadas a estas.
O transformante de planta pode ser preparado usando um DNA da presente invenção pelo seguinte procedimento. O DNA ou um vetor inserido com o DNA é introduzido nas Células de planta. Em seguida, as plantas
39/81 são regeneradas a partir das células de planta transformadas resultantes.
Na presente invenção, vetores preferidos são aqueles capazes de expressarem genes inseridos em células de planta, e incluem os vetores descritos acima (por exemplo, vetores tais como vetores pMH1, pMH2, e vetor pCAMBIA); contudo, os vetores não são particularmente limitados. Os vetores da presente invenção podem compreender, por exemplo, um promotor (por exemplo, promotor Vírus do mosaico da couve-flor 35S) para expressão de gene constitutiva em células de planta. Quando tal promotor é usado, um DNA é designado de modo que um DNA da presente invenção é operavelmente ligado a jusante do promotor. Em seguida, um vetor designado compreendendo o DNA é introduzido nas células de planta. Transformantes de planta expressando o DNA da presente invenção podem ser obtidos pela regeneração das células de planta transformadas resultantes. Desse modo, a presente invenção também proporciona DNAs aos quais um DNA da presente invenção é operavelmente ligado a jusante de um promotor. Aqui, operavelmente ligado significa que uma sequência promotora é ligada a um DNA da presente invenção de modo que a expressão do DNA é induzida após ligação de fatores transcricionais à sequência promotora.
É possível usar, em adição ao acima, vetores com um promotor que é ativado sob estimulação extrínseca em uma maneira induzível.
As espécies de planta em que os DNAs antes mencionados ou vetores são introduzidos não são particularmente limitadas e incluem, por exemplo, monocotiledôneas. As monocotiledôneas incluem, mas não são limitadas a, plantas pertencentes à família Gramineae, família Liliaceae, família Bromeliaceae, família Palmae, família Araceae, família Zingiberaceae, e família Orchidaceae. As plantas pertencentes a família Gramineae incluem, mas não são limitadas a, arroz, variedades de trigo (trigo, cevada, centeio, aveia, e lágrimas de Job (hatomugi)), milho, milho miúdo, milho miúdo de rabo-de-raposa, milho miúdo japonês, sorgo, milho miúdo de dedo, milho miúdo de pérola, cereal africano, cana de açúcar, capim-rabo-de-gato, Capim-do-campo do Kentucky, grama de pomar, grama de centeio italiano, grama de centeio perenial, festuca alta, e grama da Bahia.
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Células de planta em que os DNAs antes mencionados ou vetores são introduzidos não são particularmente limitados e podem estar em qualquer forma considerando-se que eles podem ser usados para regenerar plantas. Por exemplo, células cultivadas em suspensão, protoplastos, seções de folha, calo, e sementes germinadas, podem ser usados.
A introdução dos DNAs antes mencionados ou vetores nas células de planta pode ser realizada usando métodos conhecidos a um técnico no assunto, tais como métodos de polietileno glicol, de eletroporação, métodos mediados por Agrobacterium, e métodos de canhão de partícula. No método mediado por Agrobacterium, por exemplo, de acordo com o método por Nagel etal. (Nagel, R. et aL FEMS Microbiol. Lett. 67, 1990, 325-328), um DNA pode ser introduzido nas células de planta pela introdução em Agrobacteria de um vetor de expressão ao qual o DNA é inserido, e infecção das células de planta com infecção direta, via Agrobactéria, ou pelo método de disco de folha. O vetor acima mencionado compreende um promotor de expressão de modo que, por exemplo, o DNA da presente invenção é expresso em uma planta após introdução na planta. Geralmente, o DNA da presente invenção está localizado a jusante do promotor, e um terminador está localizado adicionalmente a jusante de tal DNA. O vetor recombinante usado para esta proposta é adequadamente selecionado por um técnico no assunto, dependendo do tipo de planta ou método de introdução.
Os promotores acima mencionados incluem, por exemplo, o CaMV35S derivado do vírus do mosaico da couve-flor e o promotor de ubiquitin do milho (JP-A (Kokai) H02-79983).
Exemplos do terminador acima mencionado pode ser um terminador derivado do vírus do mosaico da couve-flor e o terminador do gene nopalina sintase; contudo, o promotor e terminador não são limitados a estes, considerando-se que eles funcionam em uma planta.
A regeneração de uma planta de uma célula de planta pode ser efetuada de acordo com o tipo de planta por métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto. Exemplos incluem os seguintes métodos, mas não são limitados a estes:
41/81 para arroz, o método de Fujimura et al. (Fujimura. et al. Tissue Culture Lett. 2, 1995, 74);
para trigo, o método de Harris et al. (Harris, R. et al. Plant cell Reports. 7, 1988, 337-340) and the method of Ozgen et al. (Ozgen, M. et al. Plant cell Reports. 18, 1998, 331-335);
para cevada, o método de Kihara and Funatsuki (Kihara, M. and Funatsuki, H. Breeding Sei. 44, 1994, 157-160) and the method of Lurs and Lorz (Lurs, R. e Lorz, H. Theor. Appl. Genet. 75, 1987, 16-25);
para milho, o método de Shillito et al. (Shillito, R.D., et al. Bio/Technology, 7, 1989, 581-587) e the method of Gordon-Kamm et al. (Gordon-Kamm, W.J. et al. Plant cell. 2(7), 1990, 603-618);
para sorgo, o método de Wen et al. (Wen, F.S., et al. Euphytica. 52, 1991, 177-181) e the method of Hagio (Hagio, T. Breeding Sei. 44, 1994, 121-126);
para centeio, o método de Castillo et al. (Castillo A. M., Vasil V., Vasil I. K. (1994) Nature Biotechnology 12: 1366-1371.);
para aveia, o método de Cho et al. (Cho M. J., WEN J., LEMAUX P. G., (1999) Plant science 148: 9-17.);
para milho miúdo de pérola, o método de OJKennedy et al. (0’Kennedy Μ. M., Burger J. T, Botha F. C. (2004) Plant cell Reports 22: 684-690.);
para capim-do-campo do Kentucky, o método de Ha et al. (Ha C. D., Lemaux P. G., Cho M. J. (2001) In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 37: 6-11.);
para grama de pomar, o método de CHO et al. (CHO M.J., CHOI H. W., LEMAUX P. G. (2001) Plant cell reports 20: 318-324.);
para grama de centeio italiano, o método de Ye et al. (Ye X., Wang Z. Y, Wu X., Potrykus I., Spangenberg G. (1997) Plant cell Reports 16: 379-384.);
para grama de centeio pereníal, o método de Spangenberg et al. (Spangenberg G., Wang Z. Y, Wu X., Nagel J., Potrykus I. (1995) Plant science 108: 209-217);
42/81 para festuca alta, o método de Wang et al. (Wang Z. Y, Takamizo T, Iglesias V. A., Osusky M., Nagel J., Potrykus I., Spangenberg G. (1992) Nature Biotechnology 10: 691-696.); e para grama da Bahia, o método de Smith et al. (Smith R. L., Grando Μ. E, Li Y. Y, Seib J. C., Shatters R. G. (2002) Plant cell Reports 20: 1017-1021).
As plantas em que o DNA da presente invenção é introduzido podem ser explantes, ou o DNA pode ser introduzido nas células cultivadas preparadas destas plantas. Células de planta na presente invenção incluem, por exemplo, Células de planta de uma folha, raiz, caule, flor, escutelo em uma semente, e embrião imaturo; calos; células cultivadas em suspensão; e semente germinada, mas não são limitados a estes.
De modo a selecionar eficientemente as células transformadas pela introdução do DNA da presente invenção, o vetor recombinante é introduzido nas células de planta, preferivelmente juntas com um gene marcador de seleção adequado, ou um vetor de plasmídeo compreendendo um gene marcador de seleção. Os genes marcadores de seleção usados para esta proposta incluem, por exemplo, o gene hígromicin fosfotransferase resistente ao antibiótico higromicin, o gene neomicin fosfotransferase resistente a kanamicin ou gentamicin, e o gene acetiltransferase resistente ao herbicida fosfinotricin.
As células em que o vetor recombinante foi introduzido são colocadas em um meio de seleção conhecido contendo um agente de seleção adequado dependendo do tipo do gene marcador de seleção introduzido, e, em seguida, cultivadas. Desse modo, as células cultivadas de planta transformada podem ser obtidas.
Em seguida, corpos de planta regenerados das células transformadas são cultivados em um meio de aclimatação. As plantas aclimatadas regeneradas são, em seguida, crescidas sob condições de cultura usuais para obter plantas tendo traço de enraizamento profundo, do qual sementes podem ser obtidas uma vez que elas maturam e suportam fruto. Especificamente, a presente invenção proporciona métodos para produção de plantas
43/81 transformadas, que compreende as etapas (a) e (b) abaixo. A presente invenção também proporciona métodos para conferir um traço de enraizamento profundo às plantas, que compreende etapas (a) e (b) abaixo:
(a) introdução de uma célula de planta com um DNA da presente invenção (Gene Dro1) ou um vetor conduzindo o DNA (Gene Dro1); e (b) regeneração de uma planta da célula de planta introduzida com o DNA ou vetor na etapa (a).
Os métodos acima descritos para produção de plantas transformadas podem adicionalmente compreender a etapa de:
(c) seleção de uma planta a qual o traço de enraizamento profundo é conferido.
A presença dos DNAs estranhos introduzidos nas plantas transformadas que são regeneradas e crescidas dessa maneira pode ser confirmada pelo método de PCR conhecido, ou método de hibridização de Southern, ou pela análise das sequências de nucleotídeo dos DNAs em corpos de planta. Neste caso, a extração dos DNAs das plantas transformadas pode ser efetuada de acordo com o método conhecido por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, the 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Quando da análise dos genes estranhos que estão presentes nos corpos de planta regenerados e incluem os DNAs da presente invenção, usando o método de PCR, uma reação de amplificação é efetuada usando como um gabarito os DNAs extraídos dos corpos de planta regenerados conforme mencionado acima. Uma reação de amplificação pode também ser realizada em uma mistura de reação contendo como iniciadores sintetizados oligonucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeo adequadamente selecionadas de acordo com as sequências de nucleotídeo dos DNAs da presente invenção. Na reação de amplificação, reações de desnaturação, recozimento e extensão de DNAs podem ser repetidas várias dezenas de vezes para obter produtos amplificados de fragmentos de DNA compreendendo as sequências de DNA da presente invenção. Submetendo-se a mistura de reação compreendendo os produtos amplificados, por exemplo, a eletroforese de agarose, os vários tipos de fragmentos de DNA
44/81 amplificados são fracionados, desse modo, capacitando a confirmação de se um certo fragmento de DNA corresponde a um DNA da presente invenção.
A presente invenção também se relaciona à plantas transformadas, que são produzidas pela introdução do Gene Dro1 ou um vetor que conduz o Gene Dro1 em Células de planta, e que têm um traço de enraizamento profundo. A presente invenção também se relaciona a métodos para produção de plantas transformadas, que compreendem a etapa de introduzir o Gene Dro1 ou um vetor que conduz o Gene Dro1 em uma célula de planta.
Além disso, em uma concretização preferida da presente invenção, as plantas transformadas incluem aquelas que são produzidas pelas etapas (a) a (d) abaixo, e que têm um traço de enraizamento profundo. Em outra concretização preferida da presente invenção, os métodos para produção de plantas transformadas incluem aqueles compreendendo as etapas de:
(a) introdução do Gene Dro1 ou um vetor que conduz o Gene Dro1 em uma célula de planta;
(b) determinação do número de cópia do Gene Dro1 artificialmente introduzido ou vetor que conduz o Gene Dro1 na célula de planta da etapa (a);
(c) seleção de uma célula de planta transformada cujo número de cópia do Gene Dro1 artificialmente introduzido ou vetor que conduz o Gene Dro1 é um (que contém em uma cópia simples do gene ou vetor); e (d) regeneração de uma planta a partir da célula de planta transformada selecionada na etapa (c).
Nos métodos descritos acima, o número de cópias do Gene Dro1 artificialmente introduzido, ou vetor que conduz o Gene Dro1 nas plantas, pode ser determinado para selecionar plantas em que o número de cópia é 1 após uma planta ser regenerada a partir da célula de planta transformada compreendendo o Gene Dro1. Desse modo, a presente invenção se relaciona a plantas transformadas que são produzidas pelas etapas (a) a (c) abaixo, e que têm um traço de enraizamento profundo. A presente invenção também se relaciona a métodos para produção de plantas transformadas,
45/81 que compreendem as etapas de:
(a) introdução do Gene Dro1, ou um vetor que conduz o Gene Dro1 em uma célula de planta, e regeneração de uma planta a partir da célula de planta;
(b) determinação do número de cópia do Gene Dro1 artificialmente introduzido, ou vetor que conduz o Gene Dro1 na planta da etapa (a); e (c) seleção de uma planta transformada cujo número de cópia do Gene Dro1 artificialmente introduzido, ou vetor que conduz o Gene Dro1, é um.
A introdução do Gene Dro1, ou um vetor que conduz o Gene Dro1 nas Células de planta e regeneração de planta a partir das células de planta transformadas podem ser alcançadas pelos métodos acima descritos. Por enquanto, o número de cópia do Gene Dro1, ou vetor que conduz o Gene Dro1 nas células de planta transformadas, ou plantas transformadas, pode ser determinado, por exemplo, por análise de mancha Southern, método de PCR de tempo real, análise de sequência de nucleotídeo, ou similares. Contudo, tais métodos não são limitados a estes.
Aqui, número de cópia se refere ao número de Genes Dro1 ou vetores que conduzem o gene introduzido nas plantas por transformação. Especificamente, aqui, número de cópia não inclui o número de Genes Dro1 endógenos nas plantas (genes endógenos).
Conforme descrito nos Exemplos aqui, os presentes inventores produziram plantas de geração T1 de plantas transformadas (geração TO) em que o número de cópia do Gene Dro1 artificialmente introduzido é 1, e verificaram a relação entre a proporção de enraizamento profundo e o número de cópia estimado do Gene Dro1 na geração T1. O resultado demonstrou que na geração T1, a proporção de enraizamento profundo das plantas homozigóticas (número de cópia do Gene Dro1 artificialmente introduzido: 2) foi maior do que aquele das plantas tipo nula (número de cópia do Gene Dro1 artificialmente introduzido: 0) e plantas heterozigóticas (número de cópia do Gene Dro1 artificialmente introduzido: 1). Desse modo, plantas particular
46/81 mente preferidas da presente invenção incluem plantas transformadas da geração T1 onde o número de cópia do Gene Dro1 artificialmente introduzido é 2 (homozigotos), que são produzidos de plantas transformadas da geração TO onde o número de cópia do Gene Dro1 artificialmente introduzido é 1.
Especificamente, em uma concretização particularmente preferida, a presente invenção inclui plantas transformadas produzidas pelos métodos compreendendo as etapas descritas abaixo, em adição às etapas descritas acima (a) a (d), ou (a) a (c). Em outra concretização particularmente preferida, a presente invenção inclui métodos para produção de plantas transformadas, que compreendem, em adição às etapas acima descritas (a) a (d), ou (a) a (c), as etapas de:
- produção de uma planta por cruzamento dos transformantes de planta obtidos na etapa (d) ou (c); e
- seleção de uma planta homozigótica para o Gene Dro1 das plantas obtidas na etapa acima.
Métodos para produção de plantas da geração T1 daquelas da geração TO por cruzamento são conhecidos àqueles técnicos no assunto. O número de cópia do Gene Dro1 (tipo nulo, heterozigoto, e homozigoto) em uma planta produzida pelo cruzamento pode ser determinado por métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto, tais como análise de mancha Southern e método de PCR de tempo real.
Uma vez que a planta transformada tendo um DNA da presente invenção introduzido em seu cromossomo é gerada, sua progenia pode ser obtida por reprodução sexuada ou assexuada a partir da planta. Alternativamente, a planta pode ser produzida em uma grande escala de células, órgãos, ou materiais de propagação (por exemplo, sementes, frutos, panículas cortadas, tubérculos, raízes tuberosas, estoques, calos, e protoplastos) isolados das plantas, suas progenias, ou clones. A presente invenção inclui Células de planta artificialmente introduzidas com um DNA da presente invenção; plantas compreendendo as células; órgãos (por exemplo, flor, folha, raiz, caule, etc.) das plantas; progenias e clones das plantas; e materiais de propagação das plantas e suas progenias e clones. Tais Células de planta,
47/81 plantas compreendendo as células, órgãos das plantas, progenias e clones das plantas, e materiais de propagação das plantas e suas progenias e clones, podem ser usados para conferir um traço de enraizamento profundo às plantas.
Por enquanto, as plantas transformadas da presente invenção incluem, por exemplo, monocotiledôneas. Monocotiledôneas incluem, mas não são limitadas a, plantas pertencentes à família Gramineae, família Liliaceae, família Bromeliaceae, família Paímae, família Araceae, família Zingiberaceae, e família Orchidaceae. Plantas pertencentes à família Gramineae include, mas não são limitadas a, arroz e variedades de trigo (trigo, cevada, centeio, aveia, e lágrimas de Job (hatomugi)), milho, milho miúdo, milho miúdo de rabo-de-raposa, milho miúdo japonês, sorgo, milho miúdo de dedo, milho miúdo de pérola, cereal africano, cana de açúcar, capim-rabo-de-gato, capim-do-campo do Kentucky, grama de pomar, grama de centeio italiano, grama de centeio perenial, festuca alta, e grama da Bahia.
Além disso, a presente invenção se relaciona a alimentos processados obtidos de pelo menos qualquer um de: células, materiais de propagação, e órgãos da presente invenção. Aqui, alimento processado se refere a um produto na forma comestível para humanos, que é produzido por processamento artificialmente de plantas, tais como arroz, variedades de trigo (trigo, cevada, centeio, aveia, e lágrimas de Job (hatomugi)), milho, milho miúdo, milho miúdo de rabo-de-raposa, milho miúdo japonês, sorgo, milho miúdo de dedo, milho miúdo de pérola, cereal africano, cana de açúcar, e capim-rabo-de-gato, ou porções destes (células, materiais de propagação, órgãos, etc.). Na presente invenção, processamento inclui tratamentos, tais como ebulição, fervura, agitação-fritura, vaporização, fritura, e pulverização, mas não é limitado a estes. Pulverização inclui debulhar e polir o arroz. Os alimentos processados da presente invenção incluem aqueles resultantes de pelo menos um dos tratamentos descritos acima. Um exemplo de alimentos processados preferidos da presente invenção é: alimentos processados resultantes de debulhamento e polimento de sementes de arroz, seguido por aquecimento. Especificamente, alimentos processados da presente invenção
48/81 include, mas não são limitados a, produtos de arroz cozidos obtidos por ebulição do arroz (incluindo arroz cozido congelado e arroz cozido esterilizado), pó de arroz, bolo de arroz, macarrão de arroz, refeições rápidas de arroz cúbico, refeição rápida de arroz japonês, biscoito, miso (pasta de soja fermentada), tempero de soja, tofu (coalho de feijão fermentado), pão, soba (macarrão de trigo-sarraceno), macarrão de trigo, pasta, macarrão tal como macarrão chinês (macarrão bruto, macarrão rehidratável, macarrão fervido, etc.), cereal, e flocos de milho.
A configuração de alimentos processados da presente invenção como um produto comercial não é particularmente limitada. Exemplos incluem a configuração onde o produto é vendido e distribuído em um ambiente ou baixa temperatura, e no momento de comer/beber aquecido à temperatura ambiente ou alta temperatura usando um aquecedor, tal como forno de microondas. Especificamente, tal configuração como um produto comercial inclui, mas não é limitada a, lanches em caixa, esferas de arroz, e macarrões cozidos, que são vendidos em lojas de conveniência, supermercados, delicatesses, e tais.
Os alimentos processados da presente invenção podem estar em uma forma acondicionada em um recipiente. Por exemplo, os alimentos podem estar acondicionados em um recipiente plástico moldado, ou acondicionados em bolsa de retorta ou similar, e esterilizados após vedação.
Alimento processado obtido de pelo menos um de células, materiais de propagação, ou órgãos, da presente invenção, pode também ser referido como alimento processado produzido de pelo menos um de células, materiais de propagação, ou órgãos, alimento processado compreendendo pelo menos um de células, materiais de propagação, ou órgãos, ou alimento processado obtido por processamento de pelo menos um de células, materiais de propagação, ou órgãos.
Além disso, a presente invenção proporciona métodos para avaliar se uma planta tem um traço de enraizamento profundo, que compreende etapas (a) a (c) descritas abaixo, no qual uma planta de teste é julgada ter um traço de enraizamento profundo, ou ter potencialmente um traço de enrai
49/81 zamento profundo quando um peso molecular ou sequência de nucleotídeo é idêntico:
(a) preparar uma amostra de DNA a partir da planta de teste;
(b) amplificar a partir da amostra de DNA uma região compreendendo o todo ou uma porção de um DNA da presente invenção (Gene Dro1); e (c) comparar o peso molecular ou sequência de nucleotídeo do fragmento de DNA amplificado com aquele do DNA da presente invenção (Gene Dro1).
Tal porção preferida do Gene Dro1 inclui éxon 4 do Gene Dro1, mais preferivelmente regiões que compreendem uma sequência compreendendo o nucleotídeo na posição pb 116 a partir da extremidade 5' de éxon 4 do Gene Dro1 (o nucleotídeo na posição 943 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2) (por exemplo, regiões consistindo em pelo menos 100, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 nucleotídeo, que compreende o nucleotídeo na posição 943 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2), mas não é limitada esta. Os presentes inventores revelaram que em Kinandang Patong, o nucleotídeo na posição pb 116 a partir da extremidade 5' de éxon 4 do Gene Dro1 (o nucleotídeo na posição 943 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2) é adenina, enquanto que o nucleotídeo é anulado em IR64. Desse modo, se uma planta de teste tem um traço de enraizamento profundo, pode ser avaliado pelo exame da presença ou ausência deste nucleotídeo. Especificamente, a presente invenção proporciona métodos para avaliar se uma planta tem um traço de enraizamento profundo, que compreende a etapa de detectar a presença ou ausência do nucleotídeo na posição 943 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, no qual uma planta de teste é julgada não ter um traço de enraizamento profundo quando anulação do nucleotídeo é detectada. A anulação do nucleotídeo simples pode ser detectada por comparação da sequência de nucleotídeo ou peso molecular de uma região compreendendo um todo ou uma porção do Gene Dro1.
Além disso, a presente invenção se relaciona a métodos pata avaliar se uma planta tem um traço de enraizamento profundo, que compre
50/81 ende a etapa de realizar PCR com iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 8 e 9, usando como um gabarito um DNA genômico preparado de uma planta de teste. Nestes métodos, uma planta de teste é julgada ter um traço de enraizamento profundo quando o produto amplificado é obtido.
Além disso, a presente invenção se relaciona a métodos para avaliar se uma planta tem um traço de enraizamento profundo, que compreende a etapa de realizar PCR com iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 10 e 11, usando como um gabarito um DNA genômico preparado de uma planta teste. Nestes métodos, uma planta de teste é julgada não ter um traço de enraizamento profundo quando o produto amplificado é obtido.
Além disso, a presente invenção proporciona iniciadores para uso em avaliar se uma planta tem um traço de enraizamento profundo. Tais iniciadores incluem, mas não são limitados a, DNAs compreendendo as sequências de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 8 a 11.
Aqui, avaliar se uma planta tem um traço de enraizamento profundo não somente significa avaliar se um cultivar que foi cultivado tem um traço de enraizamento profundo, mas também significa avaliar se um cultivar recentemente desenvolvido por cruzamento, ou usando técnicas de engenharia genérica, tem um traço de enraizamento profundo.
Nos métodos da presente invenção para avaliar se uma planta tem um traço de enraizamento profundo, as plantas são avaliadas pelo teste de se elas têm DNA que codifica uma proteína Dro1 tipo Kinandang Patong funcional. Se uma planta tem um DNA que codifica uma proteína Drola funcional (tipo Kinandang Patong), pode ser avaliado pelo exame de DNAs genômicos em termos da diferença no peso molecular ou sequência de nucleotídeo da região correspondente a Dro1.
Nos métodos de avaliação da presente invenção, primeiro, uma amostra de DNAé preparada (extraída), e, em seguida, uma região de DNA correspondente ao gene Dro1 é amplificada a partir da amostra de DNA. Em seguida, o peso molecular do fragmento de DNA amplificado de uma região
51/81 de DNA para o Gene Dro1 em um cultivar tendo um traço de enraizamento profundo é comparado àquele do fragmento de DNA amplificado de uma amostra de DNA de uma planta de teste. A planta de teste é julgada ter um traço de enraizamento profundo quando os pesos moleculares são os mesmos. Alternativamente, a sequência de nucleotídeo do fragmento de DNA amplificado de uma região de DNA para o gene Dro1 em um cultivar tendo um traço de enraizamento profundo é comparada àquela do fragmento de DNA amplificado de uma amostra de DNA de uma planta de teste. A planta de teste é julgada ter um traço de enraizamento profundo quando as sequências de nucleotídeo são idênticas.
Amostras de DNA podem ser preparadas (extraídas) pelos métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto. Tais métodos de preparação preferidos incluem, por exemplo, métodos para extrair DNA por um método de CTAB.
Amostras de DNA a serem avaliadas pelos métodos de avaliação da presente invenção não são particularmente limitadas. Em geral, os DNAs genômicos extraídos de plantas de teste são usados como amostras de DNA. Além disso, fontes de DNAs genômicos a serem coletadas não são particularmente limitadas, e elas podem ser extraídas de quaisquer tecidos de planta, por exemplo, panículas, folhas, raízes, caules, sementes, endosperma, farelo, ou germes. Contudo, as fontes não são limitadas a estes exemplos.
Nos métodos de avaliação da presente invenção, uma região de DNAdo gene Dro1 da presente invenção é, em seguida, amplificada por PCR, ou tal. A região de DNA do gene DroT' da presente invenção se refere a uma porção correspondente à região de DNA genômico para o gene Dro1 (por exemplo, a região de DNA de SEQ ID NO: 1). A região a ser amplificada pode ser o todo do DNA genômico ou uma porção do DNA genômico (por exemplo, uma região ORF que codifica a proteína ou uma porção desta). Àqueles técnicos no assunto podem efetuar PCR por seleção apropriadamente das condições de reação, e tais. Os produtos de DNA amplificado podem ser etiquetados usando iniciadores etiquetados com isótopos tais como 32P, co
52/81 rantes fluorescentes, biotin, ou tais, quando PCR é efetuado. Alternativamente, os fragmentos de DNA amplificado podem ser etiquetados pela adição de substratos de nucleotídeo etiquetados com isótopos tais como 32P, corantes fluorescentes, biotin, ou tais, para misturas de PCR, e efetuando PCR. Além disso, os fragmentos de DNA amplificado podem também serem etiquetados após PCR por fixação de substratos de nucleotídeo etiquetados com isótopos tais como 32P, corantes fluorescentes, biotin, ou tais, usando uma enzima de Klenow, ou similares.
Os fragmentos de DNA etiquetados obtidos desse modo são desnaturados por aquecimento ou tal, e eletroforesados em um gel de poliacrilamida contendo um desnaturante, tal como uréia ou SDS. SDS-PAGE, que usa SDS como um desnaturante, é uma técnica de fracionamento vantajosa na presente invenção. SDS-PAGE pode ser efetuada de acordo com o método de Laemmli (Laemmli (1970) Nature 227, 680-685). Após eletroforese, a mobilidade dos fragmentos de DNAs é detectada e analisada por autorradiografia usando filmes de raios X, varredores de detecção de fluorescência, ou tais. Quando DNAs etiquetados não são usados, os fragmentos de DNA podem ser detectados por manchamento de gel após eletroforese com brometo de etídio, manchamento com prata, ou tais. Por exemplo, os fragmentos de DNA são amplificados de um cultivar tendo um traço de enraizamento profundo (por exemplo, Kinandang Patong) e uma planta de teste usando iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 8 e 9. Se a planta de teste tem um traço de enraizamento profundo pode ser avaliado por comparação de seus pesos moleculares. A planta de teste é julgada ter um traço de enraizamento profundo quando os pesos moleculares são idênticos.
Alternativamente, se a planta tem um traço de enraizamento profundo pode ser avaliado por determinação diretamente da sequência de nucleotídeo da região de DNA de uma planta de teste correspondente ao DNA da presente invenção, e comparando a sequência com aquela de um cultivar tendo um traço de enraizamento profundo. A planta de teste é julgada ter um traço de enraizamento profundo quando as sequências de nucleotídeo
53/81 são idênticas.
Aqui, idêntico significa que ambos alelos, o peso molecular do gene, ou sua sequência de nucleotídeo, ou sequência de aminoácido, são idênticos àqueles em uma planta tendo um traço de enraizamento profundo. Consequentemente, idêntico não inclui o caso onde o peso molecular, sequência de nucleotídeo, ou sequência de aminoácido para um dos alelos, são os mesmos conforme àqueles de uma planta tendo um traço de enraizamento profundo, mas o outro é diferente daquele da planta tendo um traço de enraizamento profundo.
A análise de eletroforese acima mencionada pode ser conduzida de acordo com um método convencional. Por exemplo, eletroforese é efetuada pela aplicação de voltagem em uma agarose ou gel de poliacrilamida, e o padrão de DNA separado é analisado.
Por enquanto, as sequências de nucleotídeo podem ser determinadas, por exemplo, usando sequências de DNA disponíveis no mercado.
Além disso, as plantas a serem identificadas têm um traço de enraizamento profundo que pode ser selecionado em um estágio precoce pelo uso dos métodos de avaliação da presente invenção.
Especificamente, a presente invenção proporciona métodos para seleção de uma planta tendo um traço de enraizamento profundo, que compreende as etapas de (a) e (b) descritas abaixo:
(a) produção de um cultivar por cruzamento de uma planta arbitrária com uma planta tendo um traço de enraizamento profundo; e (b) avaliação se uma planta produzida na etapa (a) tem um traço de enraizamento profundo por um método aqui descrito para avaliar se uma planta de teste tem um traço de enraizamento profundo.
Os métodos de seleção da presente invenção podem adicionalmente compreender a etapa de:
(c) selecionar uma planta que é julgada ter um traço de enraizamento profundo na etapa (b).
Uma planta tendo um traço de enraizamento profundo pode ser cruzada com uma planta arbitrária por métodos conhecidos àqueles técnicos
54/81 no assunto.
As plantas julgadas terem um traço de enraizamento profundo podem ser selecionadas em um estágio precoce pelo uso dos métodos de seleção da presente invenção. A presente invenção também proporciona tais métodos para selecionar uma planta julgada ter um traço de enraizamento profundo em um estágio precoce. Aqui, estágio precoce se refere a, por exemplo, o estado antes de encabeçamento, preferivelmente o estado imediatamente após germinação. Pelo uso dos métodos de seleção da presente invenção, geração de variedades de planta tendo um traço de enraizamento profundo pode ser alcançada em um período de tempo mais curto do que sempre antes.
As plantas a serem usadas nos métodos de avaliação ou seleção da presente invenção incluem, por exemplo, monocotiledôneas, mas não são limitados a estas. Monocotiledôneas incluem, mas não são limitadas a, plantas pertencentes a família Gramineae, família Liliaceae, família Bromeliaceae, família Palmae, família Araceae, família Zingiberaceae, e família Orchidaceae. As plantas pertencentes a família Gramineae incluem, mas não são limitadas a, arroz, variedades de trigo (trigo, cevada, centeio, aveia, e lágrimas de Job (hatomugi)), milho, milho miúdo, milho miúdo de rabo-de-raposa, milho miúdo japonês, sorgo, milho miúdo de dedo, milho miúdo de pérola, cereal africano, cana de açúcar, capim-rabo-de-gato, capim-do-campo do Kentucky, grama de pomar, grama de centeio italiano, grama de centeio perenial, festuca alta, e grama da Bahia.
A presente invenção também proporciona DNAs (oligonucleotídeos) compreendendo pelo menos 15 (por exemplo, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25) nucleotídeos consecutivos complementares à sequência de nucleotídeo do gene Dro1 da presente invenção, ou uma sequência complementar destes. Aqui, sequência complementar se refere à sequência de um trançado oposto com relação à sequência de uma um trançado de um DNAde trançado duplo consistindo em pares bases [A:T] e [G:C]. Além disso, complementar significa não somente uma sequência de nucleotídeo completamente complementar a uma sequência de nucleotídeo contínua com
55/81 pelo menos 15 nucleotídeos, mas também uma identidade de pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente 90%, e ainda mais preferivelmente 95% ou mais (95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%) no nível de sequência de nucleotídeo. Tais DNAs podem ser usados como uma sonda para detectar ou isolar um DNA da presente invenção, ou como um iniciador para amplificação do DNA.
Tais iniciadores incluem, mas não são limitados a, os conjuntos de iniciador descritos abaixo:
um conjunto de iniciador consistindo em iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 4 e 5, que são usados para amplificar Dro1-INDEL09, um marcador de InDel para polimorfismo entre IR64 e Kinandang Patong;
um conjunto de iniciador consistindo em iniciadores compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 6 e 7, que são usados para amplificar Dro1-CAPS05, um marcador de CAPS para polimorfismo entre IR64 e Kinandang Patong;
um conjunto de iniciador consistindo em iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 8 e 9, que são usados para amplificar SNP02-KP, um marcador específico de DNA genômico Kinandang Patong; e um conjunto de iniciador consistindo em iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 10 e 11, que são usados para amplificar SNP02-IR64, um marcador específico de DNA genômico Kinandang Patong derivado de 1R64.
Além disso, a presente invenção se relaciona a 20 a 100 nucleotídeos consecutivos a partir do gene Dro1, que compreende o todo ou uma porção de um fragmento de DNA amplificado com um conjunto de iniciador acima descrito usando como um gabarito um DNA genômico derivado de uma planta (por exemplo, planta de arroz). Tais DNAs podem ser usados para avaliar se uma planta de teste tem o enraizamento raso ou profundo.
Quando os oligonucleotídeos da presente invenção são usados como sondas, eles são preferivelmente usados após etiquetação apropriada.
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Métodos de etiquetação incluem, por exemplo, aqueles em que a extremidade 5’ de um oligonucleotídeo é fosforilatada com 32P usando um T4 polinucleotídeo cinase, e métodos em que nucleotídeos substratos etiquetados com isótopos tais como 32P, corantes fluorescentes, biotin, ou similares, são incorporados no oligonucleotídeo por um DNA polimerase tal como enzima Klenow, usando como iniciadores oligonucleotídeos de hexâmero aleatório (métodos de escorvamento aleatório, e similares).
Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser produzidos, por exemplo, com um sintetizador de oligonucleotídeo comercialmente disponível. As sondas podem também serem produzidas como fragmentos de DNA de trançado duplo obtidos por tratamento de enzima de restrição, ou similares.
Além disso, a presente invenção se relaciona a agentes farmacêuticos que conferem um traço de enraizamento profundo às plantas compreendendo o gene Dro1, ou um vetor que conduz o gene em uma maneira expressível. O tipo de DNAs usado nos agentes farmacêuticos da presente invenção não é particularmente limitado, e os DNAs podem ser cDNAs ou DNAs genômicos. Em adição, é possível usar não somente DNAs que codificam uma proteína Dro1 derivada de planta de arroz, mas também DNAs que codificam uma proteína estruturalmente similar à proteína (por exemplo, mutantes, derivados, alelos, variantes, e homólogos), considerando-se que eles podem conferir um traço de enraizamento profundo a uma planta quando introduzidos na planta.
Os DNAs incluídos nos agentes farmacêuticos da presente invenção podem ser inseridos em vetores. Os vetores não são particularmente limitados, considerando-se que eles podem permitir que os genes introduzidos sejam expressos em células de planta. Por exemplo, é possível usar vetores contendo promotores para expressões de gene homeostáticas em células de planta (por exemplo, o promotor do gene SK2 chitinase da batata, o vírus do mosaico da couve-flor 35S promotor, etc.), ou vetores contendo promotores que são induzívelmente ativados por estimulação externa.
Os agentes farmacêuticos da presente invenção podem ser
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DNAs descritos acima ou vetores inseridos com um DNA descrito acima, e eles podem ser misturados com outros ingredientes para introdução em células de planta. Por exemplo, o DNA descrito acima, vetores inseridos com um DNA acima descrito, Agrobactéria introduzida com um DNA acima descrito, e reagentes bioquímicos e soluções compreendendo is mesmos são também incluídos nos agentes farmacêuticos da presente invenção.
Além disso, a presente invenção se relaciona a plantas que são transformadas com um DNA da presente invenção, e que são resistentes à estiagem.
A presente invenção também se relaciona a células, materiais de propagação, e órgãos isolados a partir das plantas acima descritas.
Em adição, a presente invenção se relaciona a alimentos processados obtidos de pelo menos um de células, materiais de propagação, e órgãos descritos acima.
Além disso, a presente invenção se relaciona a métodos para produção de plantas transformadas resistentes à estiagem, que compreendem as etapas de introduzir um DNA ou vetor da presente invenção em células de planta e regeneração das plantas das células de planta.
A presente invenção também se relaciona a métodos para avaliar se a planta é resistente à estiagem, que compreende etapas (a) a (c) descritas abaixo, onde uma planta de teste é julgada ser resistente à estiagem quando um peso molecular ou sequência de nucleotídeo é idêntico.
(a) preparar uma amostra de DNA de uma planta teste;
(b) amplificar uma região compreendendo um DNA da presente invenção da amostra de DNA; e (c) comparar o peso molecular ou sequência de nucleotídeo do DNA da presente invenção com aquele do fragmento de DNA amplificado.
A presente invenção também se relaciona a métodos para avaliar se uma planta é resistente à estiagem, que compreende a etapa de efetuar PCR com iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 8 e 9 usando como um gabarito um DNA genômico preparado de uma planta de teste, no qual a planta de teste é julgada ser resistente à es58/81 tiagem quando PCR produz um produto de amplificação.
Além disso, a presente invenção se relaciona a métodos para avaliar se uma planta é resistente à estiagem, que compreende a etapa de efetuar PCR com iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 10 e 11 usando como um gabarito um DNA genômico preparado de uma planta de teste, no qual a planta de teste é julgada não ser resistente à estiagem quando PCR produza um produto de amplificação.
Em adição, a presente invenção se relaciona a métodos para selecionar plantas resistentes à estiagem, que compreende as etapas de:
(a) produzir um cultivar por cruzamento de uma planta arbitrária com uma planta resistente à estiagem; e (b) avaliar se a planta produzida na etapa (a) é resistente à estiagem pelo método acima descrito para avaliar se a planta é resistente à estiagem.
A produção de plantas transformadas que são resistentes à estiagem, avaliação das plantas para resistência à estiagem e seleção das plantas resistentes às estiagens podem ser alcançadas de acordo com a descrição aqui.
Se uma planta é resistente à estiagem pode ser avaliada por medição da temperatura da folha.
Aqui, considerando-se que a temperatura da folha de um transformante de planta é diminuída sob uma condição artificial de estresse de estiagem (sob um ambiente seco), conforme comparado a um controle, mesmo se a queda de temperatura é muito pequena, a planta é julgada ser resistente à estiagem.
Aqui, a temperatura da folha se refere a temperatura da superfície da folha de uma planta. As plantas absorvem dióxido de carbono através do estômato para fotossíntese. Ao mesmo tempo, a água intracelular evapora através do estômato na atmosfera. Isto resulta em uma perda de água. O fenômeno é denominado transpiração. Com relação a estes particulares, Takai et aí, reportaram que a temperatura da folha tem uma correlação negativa para a taxa de fotossíntese e grau de dilatação de estorna (condutân
59/81 cia estomatal) (Takai et ai, Field Crops Research doi:10.1016/j.fcr.2009.10.019. 2009). Quanto maior a abertura do estômato, mais ativa a transpiração se torna. A transpiração retira calor da superfície da folha, resultando em uma redução da temperatura da folha. Quando uma planta está atívamente efetuando fotossíntese, ela abre o estômato, e a transpiração se torna ativa. Isto resulta em uma temperatura diminuída na superfície da folha. Por enquanto, sob estresse de estiagem, a planta suprime a transpiração, fechando o estômato para manter o potencial celular de água. Isto prejudica a fotossíntese e eleva a temperatura da superfície da folha. As plantas resistentes à estiagem, que podem abrir o estômato e efetuar fotossíntese mesmo sob condições de estiagem, têm uma temperatura da folha mais baixa conforme comparada a plantas sensíveis à estiagem. Hirayama et al. reportaram que a seleção de linhas de planta de arroz resistente à estiagem usando a temperatura da folha como um indicador é efetiva no desenvolvimento de cultivares de arroz resistentes à estiagem (Hirayama et al., Breeding Science 56: 47-54. 2006). Conforme descrito nos Exemplos aqui, se uma planta tem uma baixa temperatura da folha pode ser avaliada simplesmente pelo teste da mesma sob estresse de estiagem usando um dispositivo, tal como termografia de infravermelho. Por enquanto, a fotossíntese e grau de dilatação de estorna podem ser avaliadas por testes simples sob estresse de estiagem usando um dispositivo, tal como o sistema de fotossíntese/transpiração, conforme descrito nos Exemplos aqui.
Além disso, é sabido que, em geral, as plantas exibem enrolamento de folha quando expostas a estresse por estiagem. Em particular, as folhas da planta de arroz são conhecidas por se enrolarem em uma forma similar a agulha. Contudo, as plantas transformadas da presente invenção mostram duramente a folha se enrolando mesmo sob estresse por estiagem.
Especificamente, a presente invenção se relaciona a plantas que são transformadas com um DNA da presente invenção, e que são resistentes a enrolamento da folha sob estresse por estiagem.
A presente invenção também se relaciona a células, materiais de propagação, e órgãos isolados a partir das plantas, conforme descrito acima.
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A presente invenção também se relaciona a alimentos processados obtidos de pelo menos um das células, materiais de propagação, e órgãos, descritos acima.
Além disso, a presente invenção se relaciona a métodos para produção de plantas transformadas resistentes a enrolamento da folha sob estresse por estiagem, que compreende as etapas de introduzir um DNA ou vetor da presente invenção em células de planta e regenerar as plantas a partir das células de planta.
A presente invenção também se relaciona a métodos para avaliar se uma planta é resistente a enrolamento da folha sob estresse por estiagem, que compreende etapas (a) a (c) descritas abaixo, onde uma planta de teste é julgada ser resistente a enrolamento da folha sob estresse por estiagem quando um peso molecular ou sequência de nucleotídeo são idênticos:
(a) preparação de uma amostra de DNA de uma planta de teste;
(b) amplificação de uma região compreendendo um DNA da presente invenção a partir da amostra de DNA; e (c) comparação do peso molecular ou sequência de nucleotídeo de um DNA da presente invenção com aqueles do fragmento de DNA amplificado.
A presente invenção também se relaciona a métodos para avaliar se uma planta é resistentes à enrolamento da folha sob estresse por estiagem, que compreende a etapa de efetuar PCR com iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 8 e 9 usando como um gabarito um DNA genômico preparado de uma planta teste, no qual a planta de teste é julgada ser resistentes a enrolamento da folha sob estresse por estiagem quando PCR produz um produto de amplificação.
Além disso, a presente invenção se relaciona a métodos para avaliar se uma planta é resistente a enrolamento da folha sob estresse por estiagem, que compreende a etapa de efetuar PCR com iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 10 e 11 usando como um gabarito um DNA genômico preparado de uma planta teste, no qual a planta de teste é julgada não ser resistentes a enrolamento da folha sob
61/81 estresse por estiagem quando PCR produz um produto de amplificação.
Em adição, a presente invenção se relaciona a métodos para selecionar plantas que são resistentes a enrolamento da folha sob estresse por estiagem, que compreende as etapas de:
(a) produção de um cultivar por cruzamento de uma planta arbitrária com uma planta que é resistente a enrolamento da folha sob estresse por estiagem; e (b) avaliar se uma planta produzida na etapa (a) é resistentes à enrolamento da folha sob estresse por estiagem pelo método acima descrito para avaliar se uma planta é resistente a enrolamento da folha sob estresse por estiagem.
A produção de plantas transformadas que são resistentes a enrolamento da folha sob estresse por estiagem, avaliação de se uma planta é resistente a enrolamento da folha sob estresse por estiagem, e seleção de plantas que são resistentes à enrolamento da folha sob estresse por estiagem, podem ser alcançadas de acordo com a descrição aqui.
Aqui, a resistência a enrolamento de folha se refere a resistência ao enrolamento de folha causado por estresse por estiagem. Quando as folhas da planta de arroz se tornam desidratadas, a pressão de turgidez de células motoras epicuticulares é reduzida dentro das folhas, e com um resultado que elas se enrolam, de modo que o lado epicuticular se torna côncavo. Se uma planta é resistente a enrolamento da folha pode ser avaliado simplesmente pelo teste de se suas folhas enrolam sob estresse por estiagem.
Aqui, considerando-se que o grau de enrolamento de folha em um transformante de planta é menor quando comparado a um controle, mesmo se a diferença no grau for muito leve, a planta é julgada ser resistente a enrolamento da folha.
Além disso, sob condições de estresse de estiagem, as plantas de colheita são, em geral, frequentemente severamente inférteis, resultando em uma diminuição no número de grãos amadurecidos e peso de grão amadurecido. Isto conduz a uma redução no rendimento da última colheita.
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Contudo, mesmo sob estresse por estiagem, as plantas transformadas da presente invenção produzem um maior número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados (redução no número de grãos amadurecidos ou peso de grão amadurecido foram suprimidos), conforme comparado a plantas sem ter um DNA da presente invenção (controle).
Especificamente, a presente invenção se relaciona a plantas transformadas com um DNA da presente invenção, que produz um maior número de grãos amadurecidos ou mais pesado grãos amadurecidos, conforme comparado a um controle sob estresse por estiagem. Tal planta pode também ser referida como uma planta que foi aperfeiçoada para reduzir uma perda no número de grãos amadurecidos, ou peso de grão amadurecido sob estresse por estiagem. Alternativamente, a planta pode ser referida como uma planta que foi aperfeiçoada para ter um número aumentado de grãos amadurecidos, ou peso de grão amadurecido aumentado sob estresse por estiagem, conforme comparado a um controle.
Além disso, a presente invenção se relaciona a células, materiais de propagação, e órgãos isolados a partir das plantas descritos acima.
A presente invenção também se relaciona a alimentos processados produzidos de pelo menos um das células, materiais de propagação, e órgãos, descritos acima.
Além disso, a presente invenção se relaciona a métodos para produção de uma planta transformada que produz um maior número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem conforme comparado a um controle, que compreende as etapas de introduzir um DNA ou vetor da presente invenção em células de planta, e regeneração de plantas a partir das células de planta.
Em adição, a presente invenção se relaciona a métodos para avaliar se uma planta produz um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem conforme comparado a um controle, que compreende etapas (a) a (c) abaixo, no qual uma planta de teste é julgada produzir um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem,
63/81 conforme comparado a um controle, quando um peso molecular ou sequência de nucleotídeo são idênticos:
(a) preparar uma amostra de DNA de uma planta de teste;
(b) amplificar uma região compreendendo um DNA da presente invenção a partir da amostra de DNA; e (c) comparar o peso molecular ou sequência de nucleotídeo de um DNA da presente invenção com aqueles do fragmento de DNA amplificado.
A presente invenção também se relaciona a métodos para avaliar se uma planta produz um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem, conforme comparado a um controle, que compreende a etapa de efetuar PCR com iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 8 e 9 usando como um gabarito um DNA genômico preparado de uma planta de teste, no qual a planta de teste é julgada produzir um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem, conforme comparado a um controle, quando PCR produz um produto de amplificação.
Além disso, a presente invenção se relaciona a métodos para avaliar se uma planta produz um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem, conforme comparado a um controle, que compreende a etapa de efetuar PCR com iniciadores compreendendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 10 e 11 usando como um gabarito um DNA genômico preparado de uma planta de teste, no qual a planta de teste é julgada não produzir um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem, conforme comparado a um controle, quando PCR produz um produto de amplificação.
Em adição, a presente invenção se relaciona a métodos para selecionar plantas que produzem um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem, conforme comparado a um controle, que compreende as etapas de:
64/81 (a) produzir um cultivar por cruzamento de uma planta arbitrária com uma planta que produz um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem, conforme comparado a um controle; e (b) avaliar se uma planta criada na etapa (a) produz um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem, conforme comparado a um controle pelo método acima descrito para avaliar se uma planta produz um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados sob estresse por estiagem, conforme comparado a um controle.
A produção, avaliação e seleção das plantas descritas acima podem ser alcançadas de acordo com a descrição aqui.
Aqui, produz um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados significa que o número de grãos amadurecidos sob estresse por estiagem é maior ou o peso de grão amadurecido sob estresse por estiagem é mais pesado quando comparado a um controle sem ter um DNA da presente invenção. Aqui, considerando-se que o número de grãos amadurecidos é maior ou o peso de grão amadurecido é mais pesado quando comparado ao controle, mesmo se a diferença é muito pequena, a planta é julgada produzi um grande número de grãos amadurecidos ou grãos amadurecidos mais pesados.
O número de grãos amadurecidos de uma planta pode ser prontamente determinado, por exemplo, por contagem de grãos amadurecidos em panículas coletadas excluindo panículas inférteis. Contudo, o método de determinação não é limitado a este exemplo. Por enquanto, o peso de grão amadurecido de uma planta pode ser prontamente determinado, por exemplo, pelo peso de grãos amadurecidos em panículas coletadas excluindo panículas inférteis. Contudo, o método de determinação não é limitado a este exemplo.
SEQ ID NOs correspondente a respectivas sequências são listadas abaixo:
SEQ ID NO: 1, a sequência de nucleotídeo de DNA genômico
65/81 para o gene Dro1 of Kinandang Patong;
SEQ ID NO: 2, a sequência de nucleotídeo de cDNApara o gene Dro1 de Kinandang Patong;
SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácido da proteína Dro1 de Kinandang Patong;
SEQ ID NOs: 4 e 5, um conjunto de iniciador usado para amplificar Dro1-INDEL09, um marcador de InDel para polimorfismo entre IR64 e Kinandang Patong;
SEQ ID NOs: 6 e 7, um conjunto de iniciador usado para amplificar Dro1-CAPS05, um marcador de CAPS para polimorfismo entre IR64 e Kinandang Patong;
SEQ ID NOs: 8 e 9, um conjunto de iniciador usado para amplificar SNP02-KP, um marcador específico de DNA genômico Kinandang Patong;
SEQ ID NOs: 10 e 11, um conjunto de iniciador usado para amplificar um marcador específico de DNA genômico IR64 de SNP02-IR64;
SEQ ID NO: 12, a sequência de nucleotídeo de CDS do sorgo de gene Dro1;
SEQ ID NO: 13, a sequência de aminoácido do sorgo de proteína Dro1;
SEQ ID NO: 14, a sequência de nucleotídeo de CDS do milho de gene Dro1;
SEQ ID NO: 15, a sequência de aminoácido do milho de proteína Dro1;
SEQ ID NO: 16, a sequência de nucleotídeo de cDNA de Nipponbare usado no sistema de busca FOX [Esta sequência tem uma adição 1-pb em cada uma das extremidades 5' e 3' quando comparada à sequência de cDNA (a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2) determinada baseado na sequência de nucleotídeo de DNA genômico. Além disso, este cDNA tem uma substituição de nucleotídeo de G para A na posição pb posição a partir da extremidade 5' em sua sequência de nucleotídeo (na posição pb 372 a partir da extremidade 5' em SEQ ID NO: 2).];
66/81
SEQ ID NO: 17, a sequência de nucleotídeo do gene Dro1 de Kinandang Patong e sua sequência a montante incluindo a região promotora; e
SEQ ID NO: 18, a sequência de nucleotídeo de uma região em Nipponbare que corresponde a o SEQ ID NO: 17.
Todos os documentos da técnica anterior aqui citados são incorporados aqui por referência.
Exemplos
Na presente invenção, um método de cesta foi aperfeiçoado para capacitar avaliação reprodutível simples de enraizamento profundo em um modo de economizar espaço. Além disso, um método de transformação de Agrobacterium à base de calo foi aperfeiçoado para introduzir sequências de nucleotídeo candidatas em IR64, e o gene foi introduzido em IR64. A sequência de nucleotídeo de Dro1, que é o gene de enraizamento profundo, foi isolada e identificada por um método de clonagem à base de mapa. Desse modo, os presentes inventores desenvolveram técnicas para conferir capacidade de se evitar estiagem às plantas de arroz por modificação facilmente do enraizamento profundo usando o gene.
Aqui abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos Exemplos, mas não é para ser construída como sendo limitadas a estes.
Exemplo 1 Identificação de local de gene Dro1
Dois cultivares de arroz: Kinandang Patong (uma variedade de arroz de terreno elevado) e IR64 (um cultivar de arroz de campo de arrozal desenvolvido por International Rice Research Institute) foram distribuídos pelo International Rice Research Institute. Os dois cultivares foram cruzados entre si para obter materiais para isolamento de gene. Entre a população de BC2F2 que resulta de cruzamento dos dois cultivares, uma população segregada no cromossomo 9, mas fixada ao homozigoto IR64 o mais possível nas outras regiões cromossomais segregadas nas plantas com raiz rasa e plantas de enraizamento profundo. IR64 e Kinandang Patong mostram o tipo de enraizamento raso e tipo enraizamento profundo, respectivamente. Por
67/81 tanto, o gene responsável pelo enraizamento profundo de Kinandang Patong foi assumido ser envolvido na segregação. A partir da perspectiva descrita acima, os inventores avaliaram completamente a população e dividiram as plantas em tipos enraizamento raso e enraizamento profundo para investigar os genótipos. O resultado mostrou que o local de traço quantitativo (QTL) relacionado ao enraizamento profundo foi localizado no cromossomo 9 (Uga et aí, The 2nd International Conference on Plant Molecular Breeding. 2007). Uma análise genética detalhada foi efetuada pelo uso do método de cesta que capacita avaliação quantitativa do enraizamento profundo. Especificamente, cestas plásticas com um diâmetro de 15 cm foram preenchidas com solo e enterradas em potes. Após semeadura, as plantas de arroz foram cultivadas até que elas alcançaram folhas de cerca de 8 de idade. O enraizamento profundo foi avaliado baseado na proporção de enraizamento profundo, que foi definido como a percentagem de raízes que penetram o fundo da cesta com relação ao número total de raízes que penetram cada cesta. As cestas têm fundos planos. Quando se prolongam para baixo mais do que 53° com relação à superfície do solo, a raiz penetra o fundo da cesta. A proporção media de enraizamento profundo foi 1,6% para IR64, onde a proporção média de Kinandang Patong foi 72,6%. Para mapear o QTL relacionado ao enraizamento profundo como um local simples, oito plantas tendo recombinações em uma região perto do QTL foram selecionadas da população BC2F2. Em seguida, linhas fixas inatas (BC2F4) foram selecionadas das próprias progenias (BC2F3). De cada linha fixa, 20 a 23 plantas foram cultivadas em um pote. Os genótipos foram deduzidos a partir da proporção de enraizamento profundo determinada pelo método de cesta. A partir da linha BC2F4, as cepas cuja região ao redor de QTL foi fixada no tipo IR64 mostraram uma proporção média de enraizamento profundo de 2,6%, que foi quase comparável àquela de IR64. Por enquanto, as cepas cujas regiões ao redor de QTL foram fixadas no tipo Kinandang Patong exibiram uma proporção média de enraizamento profundo de 40,4%. Seus genótipos de QTL foram claramente determinados a partir destes resultados. O QTL foi mapeado como um local simples localizado entre marcador de InDels: ID07_14 e ID07_17. Desse
68/81 modo, o QTL foi denominado enraizamento profundo relacionado a local Dro1 (Enraizamento Mais Profundo 1) (Uga et aí, Nihon Ikusyu Gakkai Dai 112 Kai Kouenkai Youshisyu (112nd Meeting of The Japanese Society of Breeding, Program e Abstracts) PP. 188, 2007; Uga et aí, Dai 27 Kai Ne Kenkyu Syukai (27th Research Meeting of The Japanese Society for Raiz Research), 2007; Uga et aí, The 5th International Crop Science Congress Abstracts 243p. 2008). Além disso, todos os marcadores de SSR localizados na região entre os dois marcadores de InDe! foram avaliados pela análise do polimorfismo baseada na informação pública nos marcadores de repetição de sequência simples (SSR) (International Rice Genome Sequencing Project 2005). A região candidata para Dro1 foi estreitada para 608 kpb localizada entre marcadores SSR: RM24393 e RM7424.
Exemplo 2 Análise de articulação de alta resolução
Para isolar o gene Dro1 por um método de clonagem à base de mapa, 359 plantas tendo recombinações dentro da região candidata foram selecionadas de população BC3F2 consistindo em 4.560 plantas. Um grande número de plantas tem que ser avaliado em um tempo para sua proporção de enraizamento profundo para estreitar a região candidata usando progenias das plantas selecionadas. Em seguida, os presentes inventores desenvolveram um método de avaliação que capacita o cultivo hidropônico sem enterrar cestas nos potes. No método de cesta aperfeiçoado desenvolvido pelos presentes inventores, cestas de aço inoxidável feitas por encomenda com um diâmetro de 7,5 cm preenchidas com solo foram colocadas em um meio hidropônico, ao invés de serem enterradas em potes. Desse modo, o método capacita avaliar plantas de arroz para a proporção de enraizamento profundo em um quarto do espaço requerido no método original. No método de cesta aperfeiçoado, a raiz profunda foi definida como se prolongando para baixo mais do que 50° com relação à superfície do solo (figura 1). Usando-se o método de cesta aperfeiçoado, a proporção de enraizamento profundo foi determinada pela avaliação sobre 40 plantas por linha. O genótipo de gene Dro1 em cada linha foi previsto baseado na distribuição de freqüência da proporção de enraizamento profundo. Para estreitar a região de gene, mar
69/81 cadores de DNA foram selecionados por classificação. A informação sobre SNPs localizados perto de Dro1 em Azucena, um cultivar mais próximo relacionado a IR64 e Kinandang Patong, foi extraída da homepage of OryzaSNP Consortium (http://irfqc.irri.orq/index.php?option=com content&taskview&id=14&ltemid= 106) para a designação de marcadores de CAPS. Os marcadores de CAPS foram testados para polimorfismos. Com um resultado, seis marcadores detectam polimorfismos entre IR64 e Kinandang Patong, e os seis marcadores de polimorfismo foram usados no mapeamento. Além disso, bibliotecas de BAC de 1R64 e Kinandang Patong foram construídas, e classificadas para clones compreendendo a região candidata. Os clones selecionados foram analisados por sequenciamento de nucleotídeo. A informação de sequência resultante foi usada para preparar 11 tipos de marcadores de InDel e marcadores de CAPS para polimorfismo entre IR64 e Kinandang Patong. As linhas recombinantes foram selecionadas de 359 linhas usando estes marcadores. Pela análise de ligação, a região de gene Dro1 foi estreitada para uma região de 6.0-kpb entre um marcador Dei Dro1-INDEL09 (iniciadores: 5'GCAGACGCTCGTAACACGTA -3’ (SEQ ID NO: 4) e 5'- GTGGCAGCTCCATCAACTCT -3' (SEQ ID NO: 5)) e um marcador de CAPS Dro1-CAPS05 (iniciadores: 5'- GCACAAGATGGGAGGAGAGT -3' (SEQ ID NO: 6) e 5'CATGGGTGAGAATCGTGTTG -3' (SEQ ID NO: 7); o DNA amplificado é digerido com enzima de restrição Hinf\). Uma análise de RAP-DB da sequência de nucleotídeo genômica compreendendo a região candidata revelou a presença de um gene previsto. O gene previsto foi verificado ter anulação 1-pb em éxon 4 da sequência IR64 que causa uma alteração de estrutura, resultando em um códon de parada.
Exemplo 3 Teste de complementação para identificação do Gene Dro1 e avaliação da proporção de enraizamento profundo em plantas que sobre expressam Gene Dro1
3.1 Teste de complementação para identificação do gene Dro1
O gene previsto por RAP-DB foi presumido ser Dro1. Um fragmento 8.7-kpb Kpnl-Notl derivado de Kinandang Patong que cobre 6.0-kpb
70/81 região candidata para Dro1 e suas regiões a montante e a jusante foi inserido em pPZP2H-lac (Fuse et al,t Planta Biotechnology 18: 219-222, 2001), e introduzido nos calos de IR64 através de Agrobacterium EHA101. Especificamente, a transformação de 1R64 foi efetuada conforme segue.
(Indução de calos para infecção de Agrobacterium)
Sementes esterilizadas IR64 foram colocadas em um meio de indução de calo contendo 2,4-D, e cultivadas a 30 a 33°C por uma semana sob luz contínua. Em seguida, os calos foram divididos e transferidos em um meio de indução de calo. Este procedimento foi repetido três vezes para formação de calo. O meio de indução de calo usado foi modificado de NBPRCH40 (Hiei and Komari Nature Protocols 3: 824-834. 2008), que tinha sido usado em Hiei and Komari para pré-cultura de calo para rediferenciação de transformantes de planta após seleção de calos transformados pelo método de embrião imaturo. O meio de indução de calo tem a seguinte composição:
100 mL de 10x N6 de sais maiores, 10 mL de 100x Fe-EDTA, 1 mL de 1.000x B5 de sais menores, 1 mL de 1.000x vitaminas B5, 30 g/L de maitose, 0,5 g/L de ácidos casamino, 0,5 g/L de prolina, 2 mg/L de 2,4-D, e 5 g/L de Gelrite (pH 5,8).
(Infecção de Agrobacterium)
Antes da infecção, is calos são transferidos em um meio fresco. Após três dias de pré-cultura, os calos foram imersos em uma suspensão de Agrobacterium. Em seguida, os calos foram transferidos em meio 2N6-AS (Hiei and Komari, Nature Protocols 3: 824-834. 2008) e co-cultivados a 23°C no escuro.
(Remoção de bactéria e seleção de calos transformados)
Agrobacterium foi removida após cocultura. Em seguida, de modo a selecionar células transformadas, os calos transformados foram colocados em um meio de indução de calo (seleção) contendo drogas (25 mg/L de Higromicin e 400 mg/L de carbenicilin). Após uma semana de cultura a 30 a 33°C sob luz contínua, os calos foram divididos e transferidos em um meio de seleção fresco. Este procedimento foi repetido três vezes para selecionar as células transformadas.
71/81 (Rediferenciação de transformantes)
Os calos que cresceram no meio de seleção foram transferidos em um meio de rediferenciação. Após uma semana a 10 dias de cultura a 28°C sob luz contínua, calos desenvolvidos foram transferidos em um meio de rediferenciação fresco. Este procedimento foi repetido duas vezes para selecionar plantas transformadas. A composição do meio de rediferenciação é como segue: 100 mL de 10x N6 de sais maiores, 10 mL de 100x de Fe-EDTA, 1 mL de 1.000x B5 de saia menores, 1 mL de 1.000x de vitaminas B5, 30 g/L de maltose, 30 g/L de sorbitol, 2g/L de ácidos casamino, 0,5 g/L de prolina, 0,02 mg/L de NAA, 5 g/L, 2 mg/L de kinetin, e 5 g/L de Gelrite (pH 5.8). Higromicin e carbenicilin foram adicionados a 25 mg/L e 300 mg/L ao meio preparado, respectivamente.
(Naturalização)
Os transformantes rediferenciados foram transferidos e cultivados em um meio de enraizamento (meio MS (4 g/L de Gelrite (pH 5.8) suplementado com 25 mg/L de Higromicin e 200 mg/L de carbenicilin)) a 28°C sob luz contínua. As plantas transformadas foram naturalizadas após confirmação de crescimento de raiz.
Os clones transformantes derivados de calo 17 independente obtidos através de seleção de Higromicin foram testados para sua proporção de enraizamento profundo na primeira geração (T0) pelo método de cesta aperfeiçoado. Entre linhas introduzidas com o 8.7-kpb fragmento derivado de Kinandang Patong, um número de linhas mostrou uma alta proporção de enraizamento profundo, onde a proporção de enraizamento profundo no controle de vetor foi a mesma conforme aquela de IR64 (figuras 1 e 2). O número de cópia do vetor de transformação introduzida em cada planta da geração T0 foi determinado pelo uso combinado de análise de Southern e um sistema de PCR de tempo real que permite detecção da sequência do gene resistente à Higromicin no vetor de transformação. As plantas que conduz o gene em uma cópia simples foram selecionadas e sementes T1 foram produzidas. O tipo nulo (0 cópia), heterozigoto (1 cópia), e homozigoto (2 cópias) de plantas T1 de quatro linhas com cópia simples T0 foram inferidos basea
72/81 dos nas intensidades de sinal obtidas pelo sistema de PCR de tempo real, e a correlação com a proporção de enraizamento profundo foi avaliada. Em todas as quatro linhas, as plantas com zero intensidade de sinal mostraram a mesma proporção de enraizamento profundo como plantas com o vetor de controle (figura 3). Por enquanto, linhas com uma forte intensidade exibem uma alta proporção de enraizamento profundo. Por exemplo, duas linhas de D27-c foram especulados serem um tipo nulo, porque suas intensidades de sinal foram zero e suas proporções de enraizamento profundo foram baixas. Por enquanto, quatro linhas com uma intensidade de sinal de cerca de 10 a 20 mostraram uma proporção de enraizamento profundo média e, desse modo, foram assumidos serem o tipo heterozigoto; e todas as quatro linhas com uma intensidade de sinal de cerca de 40 a 70 exibiram uma alta proporção de enraizamento profundo, e, portanto, foram julgadas serem o tipo homozigoto. Conforme descrito acima, nas linhas T1 com uma cópia simples de Dro1, uma correlação positiva foi encontrada entre a proporção de enraizamento profundo e a segregação de genótipo para o Gene Dro1 introduzido.
3.2 Avaliação de plantas que sobre-expressam gene Dro1 para sua proporção de enraizamento profundo
Um cDNA de comprimento total (AK068870) para o gene putativo foi registrado em RAP-DB. Duas linhas Nipponbare para cada uma das gerações T1 e T2 são disponíveis no sistema de busca FOX (CDNA de comprimento total que Sobre-expressa sistema de busca de gene). A sequência de cDNA de comprimento total (SEQ ID NO: 16) usada para as linhas FOX tem uma adição 1-pb em cada uma das extremidades 5' e 3' quando comparada à sequência de cDNA (SEQ ID NO: 2) determinada a partir da sequência genômica de nucleotídeo. Além disso, este cDNA tem uma substituição de nucleotídeo de G para A na posição pb 373 a partir da extremidade 5' em sua sequência de nucleotídeo (na posição pb 372 a partir da extremidade 5' em SEQ ID NO: 2). A substituição de nucleotídeo resultou em uma substituição de aminoácido não-sinônima de ácido glutâmico para lisina na posição 37 em SEQ ID NO: 3. Cinco plantas de cada uma das quatro linhas foram avaliadas por sua proporção de enraizamento profundo pelo método de cesta
73/81 aperfeiçoado. O resultado mostrou que nas linhas FOX, a proporção de enraizamento profundo variou de 8,1 a 50,0%, enquanto que a proporção foi entre 12,2 e 23,5% para dez Nipponbare tipo selvagem (controle). Desse modo, as plantas das linhas FOX incluem aquelas que exibem uma proporção de enraizamento profundo significantemente mais alta do que Nipponbare (figura 4).
O resultado demonstrou que o gene previsto na região candidata 6.0-kpb foi o verdadeiro Dro1. Por enquanto, o resultado de teste de complementação sugeriu que o Kinandang Patong tipo Dro1 foi a forma funcional responsável pelo enraizamento profundo, enquanto que o IR64 tipo Dro1 perdeu a função ou sua função foi prejudicada, resultando em enraizamento raso.
Duas linhas (T1) tendo Dro1 em multicópias foram avaliadas para a relação entre intensidade de sinal e proporção de enraizamento profundo. Em D130-C, uma correlação positiva foi encontrada entre intensidade de sinal e proporção de enraizamento profundo (figura 3). Por enquanto, com relação a D91-e, uma correlação positiva foi observada entre intensidade de sinal e proporção de enraizamento profundo em quatro plantas que dão uma intensidade de sinal comparável àquela do homozigoto com uma cópia simples do gene (10 to 350); contudo, seis linhas com uma alta intensidade de sinal (500 a 2,000) tem o mesmo enraizamento raso conforme aquelas do controle de vetor. A introdução de Dro1 em multicópias foi assumida por causar silenciamento de gene nas plantas. Isto sugere que é necessário ajustar o nível de expressão do gene Dro1, por exemplo, pela seleção de plantas tendo uma cópia simples do gene no tempo de introdução.
Exemplo 4 Homologia de sequência de aminoácido entre arroz, sorgo e milho Dro1
Usando-se a sequência de aminoácido de Dro1 como uma indagação, genes homólogos a Dro1 foram pesquisados por blastn na NCBI homepage (http://blastncbi.nlm.nih.gov/Blastcgi). A pesquisa identificou genes altamente homólogos; um gene foi um gene de sorgo, e o outro foi um gene de milho. Em ambos sorgo e milho, o ORF com a homologia mais alta
74/81 para Dro1 não tem nome de gene. Desse modo, os presentes inventores denominaram os genes de sorgo e milho SbDro1L1 e ZmDrolLT', respectivamente. A sequência de aminoácido para o gene de sorgo está disponível na NCBI homepage. Por enquanto, a sequência de aminoácido para o gene de milho foi obtido de MaizeGDB (http://www.maizegdb.org/), via pesquisa baseada na sequência extraído de mRNA em NCBI. A sequência de nucleotídeo de SbDro1L1 CDS é mostrada em SEQ ID NO: 12, e a sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 13. Por outro lado, a sequência de nucleotídeo de ZmDro1L1 CDS é mostrada em SEQ ID NO: 14, e a sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 15. SbDro1L1 e ZmDro1L1 mostraram 64% e 62% de homologia para Dro1, respectivamente (figura 5).
Exemplo 5 Efeito de Dro1 no enraizamento profundo sob condição de campo
Os presentes inventores avaliaram Dro1 foi responsável pelo enraizamento profundo sob condições de campo. As linhas quase isogênicas (Dro1-NIL) usadas como um material experimental no teste de campo foram desenvolvidas pelo seguinte método. IR64/Kinandang Patong Fj foi retrocruzado com IR64 quatro vezes, seguido por um interesse. A partir das linhas resultantes BC4F2, as plantas homozigóticas somente para 16.6- a 19.5-Mpb de região no cromossomo 9 foram selecionadas, e as sementes de interesse a partir das linhas foram usadas como as linhas quase isogênicas. As sementes de IR64, Kinandang Patong, e Dro1-NIL foram plantadas em um campo de terreno elevado e crescidas sob controle de fertilização comumente usado para plantas de arroz de terreno elevado. As plantas foram crescidas por 105 dias sob condições chuvosas. O solo perto da planta foi removido a uma profundidade de cerca de 1 m com uma pazada de carregamento. Em seguida, a superfície exposta foi lavada completamente com água pulverizada a cerca de 5 cm a partir da planta de modo a observar profundidade máxima de raiz. O resultado mostrou que a profundidade de raiz de IR64, Kinandang Patong, e Dro1-NlLno solo foi cerca de 20, 80, e 40 cm, respectivamente (figura 6). O comprimento de raiz de Dro1-NIL foi o mesmo conforme aquele de IR64. Contudo, a profundidade de crescimento
75/81 de raiz de Dro1-NILfoi cerca de duas vezes conforme aquela de IR64. Desse modo, o ângulo de crescimento de raiz foi aumentado devido ao efeito de Dro1, e, como um resultado, as raízes de Dro1-NIL se prolongam mais profundas até a mesma profundidade (cerca de 40 cm) como o comprimento de raiz de IR64.
Exemplo 6 Efeito de Dro1 na resistência à estiagem no campo experimental para testar resistência à estiagem
Os presentes inventores testaram se o enraizamento profundo devido a Dro1 aperfeiçoou resistência à estiagem. IR64 e Dro1-N1L foram usados como material experimental no teste de resistência à estiagem. A mesma facilidade de teste de resistência à estiagem usada no Plant Biotechnology Institute, Ibaraki Agricultural Center (Hirayama and Suga, Nougyo Kenkyu Senta Kenkyu Shiryo Dai 30 Gou, Ine Ikusyu Manyuaru (Agricultural Research Center Research Data NO. 30; Rice plant breeding manual) 152-155. 1995) foi disposta em uma estufa plástica no Instituto do inventor para efetuar o teste de resistência à estiagem. A facilidade inclui uma área de irrigação e uma área de estresse de estiagem. Na área de irrigação, 30 cm de solo de topo adicional dentro de uma estrutura de madeira foi colocado no solo. Na área de irrigação, as plantas de arroz foram aguadas intermitentemente para evitar estresse por estiagem durante o período entre semeadura e coleta. Durante o período de cultivo, o potencial de água do solo foi monitorado por um tensiômetro colocado no solo a uma profundidade de 25 cm, e irrigação foi aplicada quando o potencial foi abaixo de cerca de -0,015 MPa (figura 7). Em geral, as plantas não sofrem de estresse por estiagem neste nível. Por enquanto, na área de estresse de estiagem, 10-mm de cascalho (5 cm de espessura) foi colocado em camadas no leito do solo do campo experimental e 25 cm de solo de topo adicional foi colocado no mesmo para bloquear água capilar a partir do solo. Sob este arranjo, o teor de água do solo na camada de solo de tipo adicional é gradualmente reduzido, e as plantas são expostas a estresse por estiagem quando a irrigação é terminada. Na área de estresse de estiagem, a irrigação foi terminada cerca de dois meses após semeadura, e as plantas não foram aguadas até o primeiro aparecí
76/81 mento de panícula. O potencial de água de solo a uma profundidade de 25 cm foi reduzido para -0,07 MPa 10 dias após irrigação ser terminada. Como um resultado, a condição de estresse de estiagem foi alcançada na área de estresse de estiagem (figura 7). Por outro lado, a 40 cm de profundidade do solo, o potencial de água era estável a cerca de -0,03 MPa através de todo o período de tratamento de estresse. Desse modo, a condição de estresse de estiagem não foi alcançada nesta profundidade. Na área de estresse de estiagem, enrolamento de folha foi observado em IR64 no dia 35 após a terminação de irrigação, sugerindo o efeito de estresse por estiagem. Em contraste, enrolamento de folha não foi detectado em IR64 tendo Kinandang Patong tipo Dro1 (Dro1-NIL) (figura 8). Em seguida, o grau de enrolamento de folha em IR64 foi aumentado na área de estresse, e no dia 49, o crescimento das plantas foi revelado ser severamente suprimido. Por enquanto, em Dro1-NIL, o grau de enrolamento de folha permaneceu baixo mesmo no dia 49, e o crescimento da planta foi vigoroso quando comparado a IR64. A temperatura média da folha de Dro1-NIL foi 0,7°C mais baixa do que aquela de IR64 no dia 35 após a terminação de irrigação na área de estresse de estiagem (figura 9). A temperatura da folha de Dro1-NIL foi revelada ser mais baixa do que aquela de IR64 em todo dia de medição. Além disso, duas vezes nos dias 34 e 41, IR64 e Dro1-NIL foram também medidos para a condutância estomatal e taxa de fotossíntese. O resultado mostrou que ambos valores de Dro1-NIL foram significantemente maiores do que aqueles de IR64 (figura 9). Após o primeiro aparecimento de panícula na área de estresse de estiagem, as plantas foram aguadas novamente para amadurecimento do grão de arroz. Cada planta foi separadamente coletada e avaliada para seu comprimento de colmo, comprimento de panícula, número de panícula, peso de panícula, número de grãos preenchidos, e o peso de matéria seca de sua parte aérea. Nenhuma diferença significante foi observada no colmo e comprimentos de panícula entre IR64 e Dro1-NIL. Por enquanto, o peso de matéria seca de sua parte aérea, número de panícula, peso de panícula, e número de grãos preenchidos foram significantemente diferentes entre IR64 e Dro1-NIL (figura 10). Em particular, o número de grãos preen
77/81 chidos em Dro1-NIL foi cerca de 3,8 vezes maior do que aquele de IR64. Para determinar se o enraizamento profundo de Dro1-NlLfoi responsável por este resultado, o campo experimental foi dessecado para observar se as raízes penetraram a camada de cascalho. O resultado revelou que as raízes de Dro1-NIL penetraram através da camada de cascalho na camada de solo mais profunda onde as raízes de IR64 não podem penetrar através da camada de cascalho (figura 11). As descobertas descritas acima demonstram que as plantas de arroz adquirem resistência à estiagem a partir do enraizamento profundo conferido por Dro1, resultando em diminuições na capacidade de fotossíntese e rendimento.
Por enquanto, a temperatura da folha foi medida usando-se um dispositivo para revelação das imagens de distribuição de temperatura por detecção da energia de infravermelho emitida a partir do indivíduo e convertendo a mesma em uma temperatura aparente (termografia de infravermelho). Especificamente, a temperatura da superfície da folha das plantas de arroz sob uma condição de estresse de estiagem foi medida por termografia de infravermelho de uma distância fixa. Em seguida, as imagens foram exportadas com software exclusivo para determinar a temperatura média das folhas de plantas nas imagens. A taxa de fotossíntese foi estimada pela colocação das folhas em uma câmara aerada com ar contendo uma concentração constante de dióxido de carbono e medição da diminuição da concentração de dióxido de carbono no ar de descarga da câmara. Por enquanto, a condutância estomatal foi estimada pela medição do aumento de teor de vapor de água no ar de descarga a partir da câmara contendo a folha. Especificamente, os valores foram determinados conforme segue. As folhas totalmente expandidas das plantas de arroz sob uma condição de estresse de estiagem foram cada mantidas presas por um período fixo de tempo na câmara do sistema de medição de transpiração de fotossíntese. As mesmas folhas expandidas foram medidas em triplicata para determinar o valor médio.
Exemplo 7 Efeito de resistência à estiagem de Dro1 em um campo de terreno elevado sob estiagem severa
No Exemplo 6, Dro1 foi demonstrado ser responsável pela re
78/81 sistência à estiagem no campo experimental para teste da resistência à estiagem. Em seguida, os presentes inventores avaliaram se Dro1 resulta em resistência à estiagem mesmo sob maior estresse por estiagem no ambiente natural de um campo de colheita. O experimento foi efetuado usando IR64 e Dro1-NIL em um campo de terreno elevado em triplicata para áreas com (N:P:K = 12:12:9 kg/10 a) e sem fertilizador. Em cada área (3 m x 3 m), 200 plantas foram plantadas com um espaçamento de 30 cm entre séries e 15 cm entre plantas. As 200 plantas consistiam de 100 plantas cada de IR64 e Dro1-N1L. As plantas não foram aguadas durante cultivo. Desse modo, a condição de estresse de estiagem foi severa, e o potencial de água no solo médio foi -0,08 MPa abaixo a 40 cm de profundidade do solo (figura 12), porque não existe precipitação atmosférica por um mês de 90 dias após semeadura. Sob a condição de estresse de estiagem, enrolamento de folha foi severamente detectável em Dro1-NIL, enquanto que enrolamento de folha severo foi observado para IR64 em ambas as áreas (figura 13). Particularmente, na área sem fertilizador, enrolamento de folha foi severamente detectado em Dro1-NIL, onde IR64 mostrou enrolamento de folha e a taxa de encabeçamento foi significantemente retardada conforme comparado àquela de Dro1-NIL. Estes rendimentos foram estimados pelo método do quadrado na estação de coleta. Dos cinco parâmetros investigados, quatro parâmetros a saber, número de panícula, peso de matéria seca da parte aérea, peso de grão total, e peso de grão preenchido, têm valores maiores em Dro1-N1L do que em IR64 (Tabela 1).
79/81
Rendimento de Traços de Plantas de Arroz Crescidos em um Campo de Terreno Elevado sob Estiagem Severa Tratamento Linha Número de Peso de matéria Peso de matéria Peso de grão Peso de grão
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Média: valor médio para um total de 24 plantas por área em triplicata, s.d: desvio padrão
As letras alfabéticas diferentes indicam diferença de 5% em uma comparação par a par por teste-t student
80/81
Em particular, o peso de grão preenchido, que é o fator maior para o rendimento, foi grandemente aumentado para 4,9 vezes na área sem fertilizador e para 7,8 vezes na área com fertilizador. Esta descoberta demonstra que Dro1 resultou em resistência à estiagem no meio de cultivo natural de um campo de colheita mesmo sob condições de estiagem.
Exemplo 8 Marcadores para exame da presença de anulação do nucleotídeo simples no Gene Dro1
Desde que a sequência de gene Dro1 de IR64 tem uma 1 anulação de base em seu éxon 4, os marcadores de PCR foram designados para testar a presença da anulação. Os dois tipos de marcadores designados foram: SNP02-KP (iniciadores: 5'- GTCTAGATCACGCAGTGAAT -3' (SEQ ID NO: 8) e 5'- TCGCATGATGATGACCAAGT -3' (SEQ ID NO: 9)), que é amplificado somente na presença do DNA tipo Kinandang Patong, e SNP02-IR64 (iniciadores: 5'-ATCGTCTAGATCACGCAGTGAAC -3' (SEQ ID NO: 10) e 5’AGGGTGGCTTTACCTCCGTA-3' (SEQ ID NO: 11)), que é amplificado somente na presença do DNA tipo IR64.
A mistura de PCR continha 0,2 μΜ iniciadores, 0,6 U de Tag, 0,2 mM de dNTPs, 2 mM de MgCI2, e 20 ng de DNA por reação (15 pl_). As condições de reação de PCR foram conforme segue: (1) 95°C por 2 minutos; (2) 94°C por 30 segundos; (3) temperatura de recozimento variando de 51,8 a 62,2°C por 30 segundos; (4) 72°C por 1 minuto; e (5) por 7 minutos; 25 ciclos de reações (2) a (4) para SNP02-KP; 30 ciclos de reações (2) a (4) para SNP02-IR64. Os produtos de PCR foram colocados em eletroforese. O resultado mostrou que SNP02-KP foi amplificado somente quando usando DNA Kinandang Patong, enquanto que SNP02-IR64 foi amplificado somente quando usando DNA IR64 (figura 9).
Aplicabilidade Industrial
A presente invenção proporciona o gene Dro1, que controla o enraizamento profundo de plantas tais como plantas de arroz, e plantas transformadas com o gene. É esperado que plantas com capacidade aperfeiçoada de se evitar estiagem são produzidas por manipulação do gene Dro1 para converter uma planta de enraizamento raso em uma planta de
81/81 enraizamento profundo. Alternativamente, a resistência à umidade pode ser conferida à plantas por manipulação do gene Dro1, de modo que uma planta de enraizamento profundo é convertida em uma planta de enraizamento raso.
As estiagens têm causado uma séria redução no rendimento das colheitas no mundo. Por enquanto, no Japão, desde que campos de arrozal têm pobre eficiência de drenagem, dano de umidade tem sido problemático para soja e milho sem resistência à umidade. Apresente invenção é útil para solucionar tais problemas domésticos e internacionais.

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para conferir um traço de enraizamento profundo a uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas (i) e (ii) abaixo:
    (i) introdução, em uma célula de planta, de um DNA de (a) ou (b) abaixo:
    (a) um DNA consistindo em uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1; ou (b) um DNA consistindo em uma região de codificação da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1,2, 16, e 17;
    ou um vetor carreando o DNA de (a) ou (b); e (ii) regeneração de uma planta a partir da célula de planta introduzida com o DNA ou vetor na etapa (i).
  2. 2. Método para produção de uma planta transformada, em que a planta é transformada com o DNA de (a) ou (b) abaixo, e tem um fenótipo de enraizamento profundo, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas (i) e (ii) abaixo:
    (i) introdução, em uma célula de planta, de um DNA de (a) ou (b) abaixo:
    (a) um DNA consistindo em uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1; ou (b) um DNA consistindo em uma região de codificação da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1,2, 16, e 17;
    ou um vetor carreando o DNA de (a) ou (b); e (ii) regeneração de uma planta a partir da célula de planta.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de selecionar uma célula de planta transformada ou planta transformada, que tem o DNA em uma cópia simples.
  4. 4. Método para produção de uma planta transformada tendo fenótipo de enraizamento profundo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (i) a (iv) abaixo:
    (i) introdução, em uma célula de planta, de um DNA de (a) ou (b) abaixo:
    Petição 870180161977, de 12/12/2018, pág. 7/21
    2/4 (a) um DNA consistindo em uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1; ou (b) um DNA consistindo em uma região de codificação da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1,2, 16, e 17;
    ou um vetor carreando o DNA de (a) ou (b);
    (ii) determinação do número de cópias do gene Dro1 artificialmente introduzido ou do vetor que carreia o gene Dro1 na célula de planta da etapa (i);
    (iii) seleção de uma célula de planta transformada contendo o DNA introduzido ou o vetor em uma cópia simples; e (iv) regeneração de uma planta a partir da célula de planta selecionada na etapa (iii).
  5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a monocotiledônea é uma planta gramínea.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a planta gramínea é selecionada a partir do grupo consistindo em arroz, variedade de trigo (trigo, cevada, centeio, aveia, lágrimas de Job (hatomugi)), milho, milho miúdo, milho miúdo de rabo-de-raposa, milho miúdo japonês, sorgo, milho miúdo de dedo, milho miúdo de pérola, cereal africano, cana de açúcar, capim-rabo-de-gato, capim-do-campo do Kentucky, grama de pomar, grama de centeio italiano, grama de centeio perenial, festuca alta, e grama da Bahia.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a planta gramínea é selecionada a partir do grupo consistindo em arroz, sorgo, e milho.
  9. 9. Método para avaliar se uma planta tem um fenótipo de enraizamento profundo, no qual uma planta de teste é julgada ter um fenótipo de enraizamento profundo quando um peso molecular ou sequência de nucleotídeo é idêntica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) a (c) abaixo:
    Petição 870180161977, de 12/12/2018, pág. 8/21
    3/4 (a) preparar uma amostra de DNA de uma planta de teste;
    (b) amplificar a partir da amostra de DNA uma região compreendendo um DNA de (A) ou (B) abaixo:
    (A) um DNA consistindo em uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1; ou (B) um DNA consistindo em uma região de codificação da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1,2, 16, e 17; e (c) detectar o fragmento de DNA amplificado e comparar o peso molecular ou sequência de nucleotídeo do fragmento de DNA amplificado com aquela do DNA de (A) ou (B) descritos acima.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que uma planta de teste é julgada ter um fenótipo de enraizamento profundo quando um produto amplificado é obtido por PCR com um iniciador consistindo na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8, e um iniciador consistindo na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 9 usando um DNA genômico preparado a partir da planta de teste como um molde.
  11. 11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que uma planta de teste é julgada não ter um fenótipo de enraizamento profundo quando um produto amplificado é obtido por PCR com um iniciador consistindo na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 10, e um iniciador consistindo na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 11 usando um DNA genômico preparado a partir da planta de teste como um molde.
  12. 12. Método para selecionar uma planta tendo um fenótipo de enraizamento profundo, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de avaliar pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11 se uma planta que foi obtida pela produção de um cultivar por cruzamento de uma planta arbitrária com uma planta tendo um fenótipo de enraizamento profundo tem um fenótipo de enraizamento profundo.
  13. 13. Uso de um DNA de (a) ou (b) abaixo:
    (a) um DNA consistindo em uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1;
    Petição 870180161977, de 12/12/2018, pág. 9/21
    4/4 (b) um DNA consistindo em uma região de codificação da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1,2, 16, e 17;
    ou um vetor carreando o DNA de (a) ou (b), o referido uso caracterizado pelo fato de que é na produção de uma planta tendo um fenótipo de enraizamento profundo.
  14. 14. Uso de um DNA de (a) ou (b) abaixo:
    (a) um DNA consistindo em uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1;
    (b) um DNA consistindo em uma região de codificação da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1,2, 16, e 17;
    ou um vetor carreando o DNA de (a) ou (b), o referido uso caracterizado pelo fato de que é para conferir um traço de enraizamento profundo a uma planta.
  15. 15. DNA, caracterizado pelo fato de que consiste de uma região de codificação da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 ou 16.
  16. 16. Célula transformada, caracterizada pelo fato de que abriga o DNA, como definido na reivindicação 15, em uma maneira expressível, em que a célula é Agrobactéria, Escherichia coli, ou fungo.
  17. 17. Uso de um DNA que consiste da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 4 a 11, o referido uso caracterizado pelo fato de que é para detecção, isolamento e amplificação de um DNA de (a) ou (b) abaixo:
    (a) um DNA consistindo em uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1; ou (b) um DNA consistindo em uma região de codificação da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1,2, 16, e 17.
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