CN104164449A - OsDSK2a蛋白在调控水稻株高方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种OsDSK2a蛋白在调控水稻株高方面的应用，属于水稻遗传育种技术领域。本发明所提供的OsDSK2a及其编码基因在失去功能的条件下可引起水稻株高降低，因此，通过基因工程方法可以将该基因有效地应用到水稻遗传改良中，用以获得农作物的理想株型，提高水稻产量。

Description

OsDSK2a蛋白在调控水稻株高方面的应用

技术领域

本发明属于水稻遗传育种技术领域，涉及一种OsDSK2a蛋白及其编码基因在调控水稻株高方面的应用。

背景技术

水稻是世界上主要粮食作物之一，水稻的穗数、穗粒数和粒重是决定水稻产量的三个重要因素，株型也是水稻高产的一个重要影响因素，其中株高一直是育种家们关注的重点。20世纪的“绿色革命”，育种学家培育出植株矮化的品种来增加作物的产量，同时又提高植物的耐风沙、抗倒伏能力。水稻半矮秆基因sd1的应用，使水稻产量翻了近一番。特别是我国选育成的第一个水稻矮秆品种“矮脚南特”，具有耐肥抗倒、耐密植、经济系数高等优点，大幅提高了作物的产量，且品质及耐逆性也得到改善。通过鉴定株高相关突变体，已有大量株高相关基因被克隆，如D1、D2、D11、OsBRI1、D10、HTD1、D3、D14、D53、OsTB1等。研究表明，控制水稻株高的基因大多是由植物激素的生物合成途径或激素信号传导路径受阻造成的。

目前已鉴定的调控水稻株高的基因中有一些是泛素-蛋白酶体系统的组份， Nature（Liang Jiang et al., 2013; Feng Zhou et al., 2013）最近报道了李家洋院士团队和万建民教授团队分别研究的D53在水稻株高分蘖方面的调控作用，他们是利用一个矮化多分蘖突变体d53鉴定到独角金内酯信号途径的一个负调控因子D53，在独脚金内酯存在的条件下D53蛋白可与两个已知的独脚金内酯信号分子D14、D3互作，形成D53–D14–SCFD3蛋白复合体，D53蛋白被泛素化，进而特异地被蛋白酶体系统降解，从而诱导下游目标基因的表达以及独脚金内酯信号的响应。此外，赤霉素信号途径的GID2是SCF型E3连接酶的F-box蛋白，参与降解DELLA蛋白SLR1；BR信号途径的TUD1编码一个U-box家族的E3泛素连接酶，TUD1与异三聚体G蛋白α亚基D1互作调控BR介导的水稻生长；OsDSG1 是RING类E3 泛素连接酶，OsDSG1功能缺失后表现萌发延迟和植株较矮。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：通过挖掘调控水稻株高的功能基因，获得降低植物株高的转基因植物。

本发明提供的技术方案是：一种能调控水稻株高的OsDSK2a蛋白。

    本发明提供的蛋白质（OsDSK2a蛋白），来自粳稻品种DJ（Japonica rice Oryza sativa cv. Dongjin），是可以分离的、合成的或重组的多肽，其包括：

a)        SEQ ID NO:1所示序列；b) SEQ ID NO:1的序列由534个氨基酸残基组成；c) SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且与水稻株高性状相关的由SEQ ID NO:1序列衍生的多肽。

本发明提供所述蛋白的基因（OsDSK2a基因）可以是分离的、合成的或重组的DNA分子，其包括：

a)        SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的序列；b) SEQ ID NO:2所示的DNA分子由1605个核苷酸组成，其编码的多肽与SEQ ID NO:1所示序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽；c)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其蛋白活性片段的序列；d)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列互补的序列；e)止于遗传密码的简并性而衍生自所示序列的序列之一。

     SEQ ID NO:3所示的DNA分子由4765个核苷酸组成，自5’端1-153位为5’UTR，154-376为第一外显子，377-1966为第一内含子，1967-2707为第二外显子，2708-2815为第二内含子，2816-3024为第三外显子，3025-3124为第三内含子，3125-3238为第四外显子，3239-3306为第四内含子，3307-3365为第五外显子，3366-3536为第五内含子，3537-3565为第六外显子，3566-4114为第六内含子，4115-4199为第七外显子，4200-4326为第七内含子，4327-4472为第八外显子，4473-4765为3’UTR。

    为了使上述蛋白质便于纯化，可在上述多肽的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的一个或几个标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag Ⅱ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

    上述多肽可以是人工合成的，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述多肽也可通过将SEQ ID NO:2所示序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端或3’端连上表1所示的标签的编码序列得到。

    本发明还提供了含有上述DNA分子或上述多肽的表达载体，所述表达载体具体可为将所述基因插入载体pET-30a(+)的多克隆位点而获得的。本发明还提供了扩增上述DNA分子的引物对；含有上述DNA分子或上述多肽的转基因重组菌。

    含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

    本发明提供的OsDSK2a含有典型的类泛素（UBL, Ubiquitin like）结构域和泛素结合（UBA, Ubiquitin associate）结构域，UBL结构域为第16到87氨基酸残基，UBA结构域为第493到531氨基酸残基。且OsDSK2a可在体外与K48或K63形式连接的多聚泛素链结合。

本发明还同时提供了改良水稻株高的方法：包括用上述DNA分子或上述多肽转化水稻细胞或者沉默目的水稻中所含有的上述DNA分子或上述多肽，再将转化后的水稻细胞培育成植株，得到株高改变的转基因水稻，其中株高可以是提高或降低的。。

本发明具有以下有益效果：。

1、本发明提供了一种水稻株高调控蛋白OsDSK2a的应用，本发明人发现在水稻中OsDSK2a功能缺失后，水稻株高降低。

2、本发明首次鉴定了水稻OsDSK2a基因，OsDSK2a基因在失去功能或表达量下降的条件下可引起水稻株高降低，因此，通过基因工程的方法能利用该基因有效地调节、控制和改良水稻的株型，对进一步提高水稻产量具有重要的潜在作用。本发明公开的基因及其编码的多肽对培育植物新品种、改良株型具有重要意义。

3、本发明中应用的基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物抗倒伏研究提供支持。

 

附图说明

图1所示为OsDSK2a 相关T-DNA插入突变体植株PCR鉴定，osdsk2a-1突变体植株1和4为野生型，2和3为杂合体，5为纯合体；osdsk2a-2突变体植株1、3和4为野生型，2为杂合体，5为纯合体。

图2所示为OsDSK2a 相关T-DNA插入突变体插入位点示意图。

图3所示为OsDSK2a 相关T-DNA插入突变体转录本水平检测。

图4所示为野生型DJ与突变体osdsk2a-1植株株高比较，其中A为水培2周龄DJ和 osdsk2a-1幼苗，B为土培4周龄DJ和 osdsk2a-1幼苗，C为成熟期DJ和 osdsk2a-1第一、二、三节间长度比较，D为DJ和 osdsk2a-1第一节间长度统计结果。

图5所示为OsDSK2a蛋白的体外泛素结合特性检测。

 

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：OsDSK2a 相关T-DNA插入突变体鉴定

从韩国水稻突变体库订购到编号为PFG_3A-00810.L和PFG_3A-03346.L的T-DNA激活标签插入突变体，其背景均为DJ（Japonica rice Oryza sativa cv. Dongjin），两个突变体标注的T-DNA插入位点均是位于3号染色体的LOC_Os03g03920，其编码泛素家族蛋白，们命名为OsDSK2a，并将两个突变体分别命名为osdsk2a-1和osdsk2a-2。

首先CTAB法提取野生型DJ和突变体各个单株的基因组DNA，通过三引物法来鉴定突变体有无纯合体，针对osdsk2a-1突变体，以特异引物对甲和中间引物15LB1同时进行PCR反应；针对osdsk2a-2突变体，以特异引物对乙和中间引物15LB1同时进行PCR反应。然后琼脂糖凝胶电泳检测，野生型应该只有一条1000 bp 大小左右的条带，纯合体应该只有一条500 bp大小左右的条带，杂合体应该两条带都有。结果显示两个突变体均有纯合体单株，电泳检测结果如图1所示。同时对突变体纯合体扩增出来的PCR产物经切胶回收后进行测序来鉴定T-DNA插入位点，结果显示osdsk2a-1突变体的T-DNA插入在OsDSK2a基因编码区ATG上游397碱基处，osdsk2a-2突变体的T-DNA插入在OsDSK2a基因编码区ATG上游319碱基处，如图2所示。

特异引物对甲：

5’-CATCACCCTCACACCATTTG-3’

5’-GCACAGAAGAGGGTAGGCAC-3’

特异引物对乙：

5’-CATCACCCTCACACCATTTG-3’

5’-TAACCCTAGCTCTCGATCCG-3’

15LB1：

5’-CTAGAGTCGAGAATTCAGTACA-3’

实施例2：检测OsDSK2a 相关T-DNA插入突变体纯合体中OsDSK2a基因的转录本水平

为了检测osdsk2a-1突变体和osdsk2a-2突变体纯合体中OsDSK2a基因的转录本水平，首先用TRIzol法提取野生型DJ和两个突变体的总RNA，取2 μg总RNA用M-MLV反转录酶进行反转录，合成cDNA第一链，然后以cDNA为模板，通过荧光定量PCR分析OsDSK2a基因的表达。将OsDSK2a基因（引物5’-CAGTGGGCTCGGTGCTGGTG-3’和5’-GTCGCTCCACCGCAGCATGA-3’）的荧光信号（以Ct值表示）与Actin基因（内参基因，引物5’-TCCAAGCAGCATGAAGATCA-3’和5’-CACATAAGAGAGTGACGTACA-3’）的荧光信号（以Ct值表示）根据公式（相对表达量=2^-△Ct，其中△Ct=Ct_目的基因-Ct_内参基因）计算出的值作为OsDSK2a基因的相对表达量，结果见图3。结果表明，OsDSK2a基因在osdsk2a-1突变体纯合体中基本上检测不到，而OsDSK2a基因在osdsk2a-2突变体纯合体中的表达较野生型DJ升高。

 

实施例3：OsDSK2a功能缺失突变体和野生型在营养生长期和成熟期的株高比较

    本实施例分析了OsDSK2a功能缺失突变体osdsk2a-1和野生型DJ水稻植株苗期以及成熟期的株高。第一个发育阶段：将突变体和野生型的种子浸种一天后放37度培养箱进行催芽，选取萌发一致的种子种于剪掉底部的96孔平板上，然后将平板放于水中，12小时光照28℃/12小时黑暗23℃生长三天后，将水换成营养液，营养液包括MS培养基中的大量、微量和铁盐，对2周大小的幼苗进行拍照。第二个发育阶段：将萌发的种子转移至土中，在温室中培养（自然条件）至4周，照相。成熟期阶段：将育好的幼苗移栽至大田中培养至成熟期，测定突变体和野生型第一节间、第二节间和第三节间的长度并拍照。结果均表明OsDSK2a功能缺失突变体osdsk2a-1较野生型DJ在整个生长期和成熟期中植株株高降低，如图4所示。

 

实施例4：OsDSK2a蛋白体外泛素结合特性分析

一、            pET-30a(+)-OsDSK2a表达载体的构建

1、  按实施例2中得到野生型DJ的cDNA后，以特异引物对丙进行PCR反应，PCR产物经电泳分离回收后，克隆到pEASY-Blunt（北京全式金生物技术有限公司），命名为pEASY-Blunt-OsDSK2a，进行测序。

特异引物对丙如下：

上游引物：5’-ATGAGCGGCGGGGACGGGGA-3’

下游引物：5’-GCCAATATTCCCAAGAAGTCGC-3’

测序结果表明，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质。

2、  用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切重组质粒pEASY-Blunt-OsDSK2a，回收包含OsDSK2a序列的片段。

3、  用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切pET-30a(+)，回收骨架，与步骤2得到的片段连接，得到pET-30a(+)-OsDSK2a。

二、            OsDSK2a-HIS融合蛋白的原核诱导表达

将pET-30a(+)-OsDSK2a电转化大肠杆菌BL21，将获得的阳性克隆接种于LB培养基，当其生长至OD600为0.4时，加入终浓度为0.5 μM的IPTG诱导OsDSK2a蛋白的表达，16℃，150 rpm培养6小时，收集菌体，超声破碎细胞后，得到蛋白粗提液。

三、            OsDSK2a-HIS与多聚泛素链的体外结合

1. 通过HIS 亲和层析柱填料用Bio-Rad蛋白低压层析系统纯化OsDSK2a-HIS 体外重组蛋白；

2. 取纯化的OsDSK2a-HIS重组蛋白6 μg 分别与5 μg K48 或K63 连接的Ub2-7（BOSTONBIOCHEM）混匀；

3. 用Buffer A 洗涤50 μL HIS 亲和层析柱填料，然后与上一步的蛋白混液混匀，用Buffer A 补足到500 μL 体系，室温孵育2 h；

4. 用Buffer A 洗涤三次，最后用40 μL Buffer A 重悬，加10 μL 5×loading buffer；

5. 沸水浴煮10 min，然后离心取上清进行SDS-PAGE 电泳；

6. 用anti-ubiquitin 抗体进行western blot 检测。

Buffer A:

Tris-HCl（pH7.5） 50 mM

NaCl 100 mM

Na₂EDTA 1 mM

NP40 0.1%

检测结果如图5所示，OsDSK2a在体外可以与K48和K63形式连接的多聚泛素结合。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120>OsDSK2a蛋白在调控水稻株高方面的应用

<160> 3

<210> 1

<211>534

<212> 氨基酸

<400> 1

 

MetSerGlyGlyAspGlyGluGluAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaThrLeuHisIle

ArgCysThrAsnGlySerLysLeuAlaValArgAlaAspLeuGlyLeuSerValGlyAla

PheLysAlaIleValAlaGluSerCysAspValProAlaProGlnGlnArgLeuIleTyr

LysGlyArgIleLeuLysAspGluGlnThrLeuAlaSerTyrGlyValGluThrAspHis

ThrIleHisMetValArgGlyAlaAlaProProProAlaSerThrAlaProProAlaAla

AsnAsnValThrProAlaIleAsnAlaThrThrAlaSerAsnSerProAlaValGlyPhe

GlyGlyLeuLeuHisGlyLeuGlyGlySerGlySerAlaAsnSerGlyGlyLeuGlySer

PheGlySerGlyLeuProGluLeuSerGlnMetGlnGlnGlnLeuSerGluAsnProThr

LeuMetArgGluIleMetAsnMetProLeuMetGlnAsnIleLeuAsnSerProAspLeu

IleArgAsnIleIleMetAsnAsnProGlnMetArgGluIleValAspArgAsnProAsp

LeuAlaHisValLeuAsnAspProSerIleLeuArgGlnThrValGluAlaAlaArgAsn

ProGluLeuMetArgGluMetMetArgAsnThrAspArgAlaMetSerAsnIleGluSer

SerProGluGlyPheAsnMetLeuArgArgMetTyrGluThrValGlnGluProPheLeu

AsnAlaThrThrMetAlaGlyGluGlyAspArgSerSerAsnProPheSerAlaLeuLeu

GlyAsnHisGlySerAsnGlnAlaArgAspProAlaAlaAsnSerProThrThrThrSer

GluSerThrThrGlySerProAlaProAsnThrAsnProLeuProAsnProTrpSerThr

ThrAlaGlyAlaAlaGlnGlyAlaThrArgProSerProValThrAsnAlaArgSerAla

ThrAlaGlyGlyLeuGlyGlyLeuSerSerThrAspLeuGlyGlyMetLeuGlyGlyGly

SerAspThrSerPheLeuSerGlnValLeuGlnAsnProThrMetMetGlnMetMetGln

AsnIleMetSerAsnProGlnSerMetAsnGlnLeuLeuAsnIleAsnProAsnValArg

AsnMetMetGluSerAsnThrGlnLeuArgGluMetPheGlnAsnProGluPheValArg

GlnLeuThrSerProGluThrLeuGlnGlnLeuIleSerPheGlnGlnSerLeuMetSer

GlnLeuGlyGlnGlnGlnAlaGlyProGluArgThrGlnSerGlyAlaGlyAlaGlyAsn

ThrAsnLeuAsnAsnLeuMetSerMetPheSerGlyLeuGlyAlaGlyGlyGlyLeuGly

ValProSerAlaProAsnValProProGluGluLeuTyrAlaThrGlnLeuAlaGlnLeu

GlnGluMetGlyPhePheAspThrGlnGluAsnIleArgAlaLeuIleAlaThrAlaGly

AsnValHisAlaAlaValGluArgLeuLeuGlyAsnIleGly

 

<210> 2

<211>1605

<212> DNA

<400> 2

ATGAGCGGCGGGGACGGGGAAGAGGCAGCCGCCGCGGCGGCGGCCGCGACGCTGCACATCCGGTGCACCAACGGCTCCAAGCTCGCGGTGCGGGCCGACCTGGGGCTCAGCGTCGGGGCGTTCAAGGCGATCGTCGCCGAGAGCTGCGACGTGCCGGCGCCGCAGCAGCGGCTGATCTACAAGGGCCGGATCTTGAAGGACGAGCAAACCCTAGCCAGCTACGGTGTTGAGACGGATCACACCATTCACATGGTCCGTGGTGCTGCACCACCACCAGCGTCAACCGCACCTCCTGCAGCCAACAATGTAACTCCTGCCATTAATGCTACCACTGCTTCCAATTCACCAGCAGTTGGTTTTGGAGGTTTGTTGCATGGTCTTGGGGGTTCAGGTTCTGCTAACAGTGGAGGGTTGGGCTCATTTGGTTCTGGCCTTCCAGAACTATCCCAGATGCAACAACAGCTATCCGAGAACCCTACGTTGATGAGAGAAATAATGAATATGCCACTCATGCAGAATATATTGAATAGCCCTGATCTAATTCGCAATATAATTATGAACAACCCCCAAATGCGTGAAATTGTTGATCGTAATCCAGATCTTGCTCATGTCCTCAATGATCCAAGCATTCTCCGCCAGACTGTTGAAGCAGCTAGGAATCCTGAACTTATGCGAGAGATGATGCGGAACACAGACAGAGCCATGAGCAACATTGAATCTTCTCCAGAAGGGTTCAATATGCTCCGCCGCATGTATGAAACTGTTCAAGAGCCATTTCTGAATGCAACAACGATGGCTGGGGAGGGTGATAGAAGTTCAAACCCATTTTCTGCTCTCCTAGGAAATCATGGATCAAACCAAGCCAGAGATCCAGCTGCAAATTCACCAACGACCACCTCAGAATCCACAACAGGTTCTCCTGCTCCAAACACTAATCCACTTCCAAATCCCTGGAGCACAACTGCTGGAGCTGCACAGGGAGCAACAAGGCCCTCTCCAGTTACCAATGCAAGGAGTGCCACAGCTGGTGGCCTAGGAGGGTTAAGTTCTACAGATTTGGGAGGTATGCTGGGTGGTGGCTCGGATACTTCCTTCTTGAGTCAGGTGTTGCAAAATCCTACAATGATGCAAATGATGCAGAACATTATGTCAAATCCTCAGTCCATGAATCAGCTGCTTAATATCAACCCAAATGTACGTAATATGATGGAATCTAACACTCAGTTGAGGGAGATGTTCCAGAACCCAGAATTTGTTCGCCAGTTGACATCTCCTGAAACTTTGCAGCAATTAATCTCATTCCAGCAGTCCTTGATGTCACAACTTGGTCAACAACAAGCTGGCCCAGAGCGAACCCAATCAGGTGCTGGTGCAGGCAATACTAACCTCAACAATCTGATGAGCATGTTCAGTGGGCTCGGTGCTGGTGGTGGCCTAGGTGTTCCTAGTGCACCCAATGTTCCACCAGAAGAGCTATATGCAACACAACTAGCTCAGCTCCAAGAAATGGGTTTCTTTGACACACAGGAGAACATTCGAGCTTTGATTGCTACAGCGGGAAATGTTCATGCTGCGGTGGAGCGACTTCTTGGGAATATTGGCTGA

 

<210> 3

<211>4765

<212> DNA

<400> 3

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Claims (9)

1.一种改变植物株高的方法，将受体植物中OsDSK2a蛋白的编码基因表达降低或使其不表达，得到株高降低的转基因植物或突变体；或将受体植物中OsDSK2a蛋白的编码基因表达升高，得到株高升高的转基因植物或突变体；所述OsDSK2a蛋白由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出载体pET-30a(+)的多克隆位点得到。

3.如权利要求1至2所述的方法，其特征在于：所述受体植物为禾谷类植物，优选为水稻。

4.一种植物表达载体，该载体包含SEQ ID No.2所示的DNA片段。

5.如权利要求3所述的载体，其特征在于，其出发载体pET-30a(+)载体。

6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，将SEQ ID No.2所示的DNA片段通过BamHI和XhoI酶切位点连接，得到的pET-30a(+)-OsDSK2a载体。

7.如下任一物质在改变植物株高中的应用：

（1）SEQ ID No.1所示的蛋白；

（2）SEQ ID No.1所示蛋白的编码基因；

（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述改变植物株高是降低植物株高。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述植物为禾谷类植物，优选为水稻。