CN111763684A - Ghd7基因在调节和筛选稻米中蛋白质含量的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及Ghd7基因在调节稻米中蛋白质含量(同时改良稻米外观品质、营养品质、蒸煮食味品质和氮素利用效率)的应用和在水稻育种中作为稻米蛋白质含量(还包括稻米外观品质、营养品质、蒸煮食味品质和氮素利用效率)的筛选标志的应用，本发明还涉及通过对Ghd7基因进行遗传操作来调节稻米中蛋白质含量(同时改良稻米外观品质、营养品质、蒸煮食味品质和氮素利用效率)的方法，以及以Ghd7基因或其突变体作为筛选标记的水稻杂交育种方法。

Description

Ghd7基因在调节和筛选稻米中蛋白质含量的应用
技术领域
本发明涉及水稻分子育种领域，更特别地，涉及Ghd7基因在调节和筛选稻米中蛋白质含量以及各储藏蛋白组分含量的应用，以及Ghd7基因(尤其是Hap2这种单倍型)在调节和筛选稻米品质上的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是世界一半以上人口的主食。精米(去除稻壳和糊粉层以及胚之后的稻米)是人们消费的主要形式，主要由淀粉(干重高达90％)和蛋白质(8-10％)两大组分组成，并且淀粉和蛋白质共同决定着稻米的营养品质、外观品质、蒸煮食用品质和加工品质。因此，研究淀粉和蛋白质的遗传基础及其对稻米品质的影响，对水稻育种具有重要意义。在这两种主要成分中，淀粉一直被认为是影响稻米品质的最重要因素。然而，蛋白质对稻米品质的影响尚未引起足够的重视。虽然已从突变体中鉴定出一些基因，但仅克隆到两个表现水稻品种自然变异的基因(OsAAP6和GluA2)，它们都是水稻籽粒蛋白质含量的正调控基因。
因此，有待于挖掘更多与籽粒蛋白质含量有关的基因，用于在稻米品质评价和育种。
发明内容
在本发明的发明人通过图位克隆以及全基因组关联分析发现了一个产量和抽穗期的主效基因Ghd7的新功能，该基因能够显著降低水稻籽粒中的蛋白质含量以及四种主要储藏蛋白(谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白)组成成分的含量，而且一些单倍型在具有上述效果的同时不影响该基因对产量的增益效果。该基因的表达或增强表达除了降低籽粒蛋白质含量，还增加直链淀粉和胶稠度，并且改变稻米中脂肪酸各组分的相对含量，此外还降低了稻米垩白，并显著提高了米饭的食味值，即Ghd7能够提高米饭的外观和蒸煮食味品质。并且本研究中还发现了Ghd7基因先前一种未知功能的单倍型Hap2(氨基酸序列：SEQ IDNO:2)属于强功能的单倍型，该单倍型能够在显著降低稻米蛋白质含量的同时不引起产量上的损失，即该单倍型能够同时提高水稻的产量和品质，对于育种而言具有极大的应用价值。另外本研究中还发现Ghd7能够通过促进水稻对外源氮素的吸收和转运从而提高水稻的氮素利用效率，进而提高了水稻的产量。
基于以上研究，本发明提供了Ghd7基因在调节稻米中物质组成的应用。
在一个具体实施方案中，所述物质组成为蛋白质含量(例如，总蛋白质含量、谷蛋白含量、醇溶蛋白含量、球蛋白含量、清蛋白含量中的一种或多种)、直链淀粉含量、脂肪含量和/或垩白。本发明通过使用Ghd7基因调节稻米中物质组成，既调节其营养品质，又调节其外观品质，还调节其蒸煮食味品质。
在一个具体实施方案中，所述Ghd7基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-7之一所示。在一个优选实施方案中，所述Ghd7基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明提供了一种调节稻米中蛋白质组分含量的方法，包括导入Ghd7基因、提高Ghd7基因表达水平、降低Ghd7基因表达水平或者突变Ghd7基因使Ghd7基因表达的蛋白功能提高、降低或消失的步骤，所述Ghd7基因的序列如SEQ ID NO:1-7之一所示。
例如，如果目标稻种其他性状优良，但是稻米中蛋白质含量太低，并且该稻种含具有功能的Ghd7基因，可通过敲除或突变目标稻种中的Ghd7基因，使Ghd7基因不表达，或者表达功能减弱或无功能的Ghd7基因，即可提高稻米中的蛋白质含量以及四种主要储藏蛋白的含量。
反之，如果目标稻种其他性状优良，但是稻米中蛋白质含量太高，并且该稻种不含Ghd7基因或含无功能的Ghd7基因，可通过敲入或者导入Ghd7基因，使其能够表达有功能的Ghd7基因，即可降低稻米中的蛋白质以及四种主要储藏蛋白的含量，同时提高直链淀粉含量、降低垩白，提高胶稠度和食味品质。
本发明还提供了Ghd7基因在水稻育种中作为稻米蛋白质含量的筛选标志的应用，所述Ghd7基因的序列如SEQ ID NO:8-14之一所示。
本发明还提供了一种水稻杂交育种方法，包括使用Ghd7基因或其突变体作为筛选标志来选择目标基因型的步骤。
在一个优选实施方案中，所述水稻杂交育种方法包括以下步骤：
S1：鉴定亲本中的Ghd7基因及其突变状态；
S2：选择Ghd7基因或其突变体作为筛选标志；
S3：将所述筛选标志与其他优势性状聚合到一起。
例如，已有稻种的其他性状优良，但稻米中蛋白质含量太低，并且含具有功能的Ghd7基因，要想通过杂交育种的方法提高稻米的蛋白质含量，可选择不含Ghd7基因或者含无功能的Ghd7基因的亲本与该稻种进行杂交，通过将无功能的Ghd7基因或不含Ghd7基因作为分子标志来使该突变基因与其他优势性状聚合到一起。
反之，已有稻种的其他性状优良，但稻米中蛋白质含量太高，并且不含Ghd7基因或含无功能的Ghd7基因，要想通过杂交育种的方法降低稻米的蛋白质含量，可先选择具有功能的Ghd7基因亲本与该稻种进行杂交，通过将该具有功能的Ghd7基因作为分子标志来使该基因与其他优势性状聚合到一起。
由于本研究中营养品质和蛋白质含量呈现正相关关系，而外观品质、蒸煮食味品质以及氮素利用效率与蛋白质含量呈现负相关关系，故上述调节蛋白质组分含量的方法也等同于调节稻米营养品质、外观品质、蒸煮食味品质以及氮素利用效率的方法。
附图说明
图1为Ghd7基因的图位克隆；
图2为通过对533个稻米品种蛋白质含量进行全基因组关联分析后得到的总群体(All)、籼稻(Xian)亚群、粳稻(Geng)亚群的蛋白质含量的曼哈顿图(Manhattan plot)；
图3为Ghd7在533份水稻微核心种质资源材料中的自然变异分析结果；
图4为Ghd7四种主要单倍型的蛋白质含量和四种储藏蛋白含量的表型图；
图5为Ghd7未知功能单倍型Hap2和已知强功能单倍型Hap1在三个不同环境下的产量比较；
图6为NYZ和ZS97构建的近等基因系以及转基因株的稻米蛋白质含量以及四种储藏蛋白含量的表型统计图；
图7为NYZ和ZS97构建的近等基因系以及转基因株的稻米胶稠度、食味评分和直链淀粉含量的统计图；
图8为Ghd7近等基因系和转基因材料为期一个月的苗期氮处理实验；
图9为Ghd7近等基因系材料大田氮处理试验的结果；
图10为1892S和RH003构建的近等基因系的稻米垩白率、垩白面积、胶稠度、食味评分和整精米率的统计图；
图11为1892S和RH003构建的近等基因系的稻米总蛋白含量、谷蛋白含量、球蛋白含量、清蛋白含量和醇溶蛋白含量的统计图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、样品来源
本发明使用的水稻包括533个栽培稻品种构成的获取群体。获取群体用于全基因组关联分析；
其中，533个栽培稻品种包括50个aus品种(aus)、305个籼稻品种(indica)和178个粳稻品种(japonica)。
NIL(NYZ)和NIL(ZS97)是一对以南洋占(在后续实验中经鉴定，Ghd7基因单倍型为Hap4)为供体、珍汕97(单倍型Hap9，即，缺失Ghd7基因)为受体通过多代连续回交构建的Ghd7位点的近等基因系(NIL)。
MpMc(+)和MpMc(-)是以珍汕97为受体采用农杆菌侵染法构建的Ghd7位点的阳性和阴性互补株，互补使用的Ghd7基因单倍型为Hap1。
OX-Ghd7、Ami-Ghd7是以中花11为受体采用农杆菌侵染法构建的Ghd7位点的过量表达株和抑制株。
珍汕97(ZS97)是由温州市农科所选育的籼型常规稻。南洋占(NYZ)是具有大粒、红米等特点的热带粳稻。中花11(ZH11)是由中国农业科学院作物科学研究所选育的粳型常规水稻。
所有材料均在武汉或者海南陵水的华中农业大学的试验田中栽植生长，成熟收获后的稻谷晾干后室温储藏至少三个月，然后用于实验。
2、样品处理
a)蛋白质含量的测定：
精米和植株的蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法，具体步骤如下：首先，在干燥的消化管中依次加入0.5±0.005g精米粉、8.5g催化剂(硫酸钾和五水硫酸铜质量比为9：1)和12ml浓硫酸；然后，将消化管置于通风橱中消化炉FOSS DT208上420℃消化1.5h，冷却至无浓烟冒出；最后，将消化管置于FOSS Kjeltec 8400上进行自动分析。每个单株样品重复测量3次，其平均值即为最终的蛋白质含量。
糙米蛋白质含量的测定采用FOSS XDS近红外快速含量分析仪。
b)直链淀粉含量的测定：
精米粉直链淀粉含量的测定参考国标NY/T2639-2014并做了简单的调整，具体步骤如下：首先，在干燥的15ml玻璃管中依次加入10±0.5mg的精米粉、0.1ml 95％的乙醇和0.9ml 1M的氢氧化钠，依次混匀后拧上盖子，沸水浴10min后冷却至室温，加入9ml单蒸水稀释；然后，将0.5ml稀释液加入一个新的15ml玻璃管，依次加入9.25ml单蒸水、0.2ml 1M乙酸和0.15ml0.2％碘-碘化钾溶液，拧上盖子，上下颠倒充分混匀后静置20min；最后，将0.2ml上述混合液和四个直链淀粉含量的标准样品(0.4％，10.6％，16.2％和26.5％)的相同处理混合液分别加入透明的ELISA平板，利用Tecan Infinite M200型多功能酶标仪在620nm波长处测定吸光度，根据标准样品的吸光度和直链淀粉含量的线性方程计算出每个样品的直链淀粉含量。每个单株样品重复测量3次，其平均值即为最终的直链淀粉含量。
c)垩白的测定：
垩白的评价分为垩白率和垩白度两个指标。使用万深SC-E型大米外观品质检测分析仪，对每个单株的200-300的精米粒扫描得到图像，并对图像分析得到垩白率和垩白度的数值。
d)脂肪酸含量的测定：
将稻谷去壳成糙米，然后在80℃下干燥24h，然后进行脂质提取。准确称取0.2±0.005g糙米加入10ml玻璃管中，加入4.5ml硫酸:甲醇溶液(5:100)和0.1ml内标，混匀。在85℃水浴中孵育2.5h。冷却至室温后，加入2ml超纯水，震荡后再加入2ml正己烷(色谱纯)，然后振荡器充分震荡后离心(2500rpm 10min)。最后取上清约1ml并通过GC-MS分析。每个样品设置三个生物学重复。
e)食味值的测定：
每种基因型的材料至少准备150g以上的精米，使用米粒食味计测定颗粒状态下的食味品质。每个样品设置10个生物学重复。
3、本研究实验结果分析
3.1、影响稻米蛋白质含量的基因的定位与鉴定
我们通过图位克隆技术将一个影响稻米蛋白质含量的主效QTL qPC7精细定位至96.6Kb的区间(图1)，该区间内含有16个基因，除了先前克隆的产量基因Ghd7和一个表达蛋白基因LOC_Os07g15820以外，其他都是转座子或者反转座子基因(表1)。通过测序确定，Ghd7基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
表1 96.6Kb候选区间内的16个基因
Figure BDA0002584632770000071
Figure BDA0002584632770000081
对533份水稻微核心种质资源蛋白质含量的数据进行全基因组关联分析，结果如图2和表2所示，在籼稻亚群7号染色体上检测到三个显著位点均位于Ghd7附近，这进一步佐证了Ghd7基因确实影响蛋白质含量。
表2籼稻亚群蛋白质含量全基因组关联分析中检测到的显著位点
Figure BDA0002584632770000082
3.2、Ghd7基因分型以及不同单倍型对稻米性质的影响
我们根据Ghd7基因外显子区域的变异对533份稻米品种进行单倍型分析，结果如图3所示，根据编码区序列，Ghd7基因总共分成8种单倍型，其中，Hap1、2、4、9是最为主要的四种单倍型，其中Hap1(SEQ ID NO:1和8)、2(SEQ ID NO:2和9)、3(SEQ ID NO:3和10)、4(SEQ ID NO:4和11)、7(SEQ ID NO:6和13)和8(SEQ ID NO:7和14)是有功能基因，Hap6(SEQID NO:5和12)为无功能基因，Hap9完全缺失Ghd7基因。
结合蛋白质含量和储藏蛋白含量数据对这四种主要单倍型进行分析，结果如图4所示，除清蛋白以外，单倍型Hap2在球蛋白含量、醇溶蛋白含量、谷蛋白含量以及总蛋白质含量四个性状上都呈现最低值。另外各种不同单倍型之间的蛋白质含量和储藏蛋白质含量均存在不同程度的差异，可见该位点的不同单倍型可影响稻米中的蛋白质含量，进而影响稻米的营养价值。在三个不同环境(2011年武汉、2012年陵水和2012年武汉)下对Hap1和Hap2两种单倍型产量进行比较，结果如图5所示，Hap2和Hap1在产量上没有统计学上的差异(Hap1在产量调控上是优势基因型)。
上述结果表明,相对于缺失Ghd7基因(Hap9)的水稻品种，含有Hap1、2和4的水稻品种中，储藏蛋白质含量和总蛋白质含量显著降低，该效果在Hap2中更为明显。此外，还能保证产量不受影响，这意味着该单倍型在育种上具有极大的应用价值。
3.3、南洋占与珍汕97构建的近等基因系的比较
对南洋占与珍汕97构成的近等基因系生产的稻米中的蛋白质含量和组成进行进一步研究。结果如图6所示，ZS97近等基因系(Hap9，完全缺失)的总蛋白含量、球蛋白含量、谷蛋白含量、清蛋白含量和醇溶蛋白含量均显著高于NYZ近等基因系(Hap4)，进一步说明，Ghd7是一个能够降低蛋白质含量的基因。我们还考察了南洋占与珍汕97构建的Ghd7近等基因系材料和转基因材料的品质性状，结果如图7所示，含有Hap4的NIL(NYZ)生产的稻米中直链淀粉含量升高，垩白减少，脂肪酸的相对组成也与NIL(ZS97)不同，胶稠度和食味值显著提高。这意味着Ghd7能够在降低蛋白质含量的同时提高稻米的外观和蒸煮食味品质。
对南洋占与珍汕97构建的Ghd7近等基因系材料进行水培和大田氮处理的实验均表明，Ghd7能够提高水稻的氮利用效率(图8-9)，进而提高水稻产量(图9)。
3.4、RH003与1892S构建的近等基因系的比较
使用RH003(Hap2)为供体，1892S(Hap9，缺失型)为受体，构建近等基因系NIL(1892S)和NIL(RH003)。对该对近等基因系生产的稻米理化性质进行比较，结果如图10和11所示，NIL(RH003)的总蛋白含量、清蛋白含量、醇溶蛋白含量、球蛋白含量和谷蛋白含量均显著低于NIL(1892S)，NIL(RH003)的垩白也显著低于NIL(1892S)，并且NIL(RH003)的整精米率、胶稠度和食味评分显著高于NIL(1892S)。
4、转基因分析
为了进一步确定Ghd7的功能，采用农杆菌侵染法将Ghd7基因(Hap1)转入ZS97中来获取Ghd7位点的互补材料，得到阳性互补株MpMc(+)和阴性互补株MpMc(-)，同时以ZH11为受体，采用农杆菌侵染法构建ZH11的Ghd7基因过表达株(OX-Ghd7)和Ghd7基因的抑制株(Ami-Ghd7)，对得到的材料进行表型鉴定。
结果如图6和7所示，与互补阴性株稻米相比，互补阳性株稻米的总蛋白质含量、垩白率、垩白面积显著降低，直链淀粉含量显著升高，胶稠度和食味值显著升高。同样地，与野生型ZH11相比，超表达株的稻米中的总蛋白质含量、三种储藏蛋白质含量、垩白率和垩白面积都显著降低，直链淀粉含量升高，并且胶稠度和食味值显著提高；而相比于野生型ZH11，抑制株的稻米中的总蛋白质含量、四种储藏蛋白质含量、垩白率以及垩白面积均显著升高，但在直链淀粉含量、胶稠度以及食味值上没有差异。
综合上面的实验可知，Ghd7是影响蛋白质含量的主效基因。该基因如果发生导致蛋白功能的增强、降低或消失的突变如果，会使稻米中的蛋白质含量降低或升高，同时引起稻米品质的变化。无论是单倍型1、2还是4型的Ghd7基因表达框，在转入(通过杂交或转基因的方法)到Ghd7基因缺失或失去功能的品系中，都能产生使受体株生产的稻米中的蛋白质含量和垩白降低，并且胶稠度和食味值升高，在Ghd7基因发生功能降低突变的品系中转入强功能Ghd7基因单倍型也能产生类似的效果。使用其他有功能的Ghd7基因也能产生类似效果。反之，将含有有功能的Ghd7基因的水稻品系中的Ghd7基因敲除或敲降，或者使用失能或低能的Ghd7基因替换该Ghd7基因，可使该品系所生产的稻米中的蛋白质含量升高。
此外，与互补阴性株相比，互补阳性株显著提升了氮素吸收和转运能力；与野生型ZH11相比，超表达株也显著提升了氮素吸收和转运能力，相反，抑制株却显著降低了氮素的吸收和转运能力。
由上述实验可知，Ghd7基因的突变如果导致蛋白功能的增强、降低或消失，会使水稻的氮素吸收能力提高和降低。所以对该基因位点的编辑也能够用于调节水稻的氮素吸收能力，进而调节氮利用效率。
以上的实例充分说明了，本领域技术人员在阅读本申请披露的内容后可知，只需要将该基因过表达、导入、敲除、敲降或突变成相关功能增强、降低或无相关功能，即可达到调节稻米蛋白质含量和稻米品质，甚至氮利用效率的目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> Ghd7基因在调节和筛选稻米中蛋白质含量的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<213> 水稻(Oryza sativa)
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Claims (10)

1.Ghd7基因在调节稻米中的物质组成的应用。。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物质组成为蛋白质含量、直链淀粉含量、脂肪含量和/或垩白。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白质含量包括总蛋白质含量、谷蛋白含量、醇溶蛋白含量、球蛋白含量、清蛋白含量中的一种或多种的混合。
4.一种调节稻米中物质组成的含量的方法，其特征在于，包括对生产所述稻米的稻种导入Ghd7基因、提高Ghd7基因表达水平、降低Ghd7基因表达水平或者突变Ghd7基因使Ghd7基因表达的蛋白功能提高、降低或消失的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，生产所述稻米的稻种含具有功能的Ghd7基因，敲除或敲降所述Ghd7基因，将所述具有功能的Ghd7基因替换成无功能的Ghd7基因，或者使所述具有功能的Ghd7基因突变成无功能或功能减弱。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，生产所述稻米的稻种不含Ghd7基因或者含无功能的Ghd7基因，转入具有功能的Ghd7基因，或使所述具有无功能的Ghd7基因突变成具有功能的Ghd7基因。
7.Ghd7基因在水稻育种中作为稻米蛋白质含量的筛选标志的应用。
8.一种水稻杂交育种方法，其特征在于，包括使用Ghd7基因或Ghd7基因突变体作为筛选标志来选择目标基因型的步骤。
9.根据权利要求8所述水稻杂交育种方法，其特征在于，已有稻种的不含Ghd7基因或含无功能的Ghd7基因，
S1：鉴定含具有功能的Ghd7基因的稻种作为亲本；
S2：使所述已有稻种与所述含具有功能的Ghd7基因的亲本杂交；
S3：以所述具有功能的Ghd7基因作为筛选标记，将所述具有功能的Ghd7基因与所述已有稻种的优势性状聚合到一起。
10.根据权利要求7所述水稻杂交育种方法，其特征在于，已有稻种含具有功能的Ghd7基因，
S1：鉴定含无功能的Ghd7基因或者不含Ghd7基因的稻种作为亲本；
S2：使所述已有稻种与所述含无功能的Ghd7基因或不含Ghd7基因的亲本杂交；
S3：以所述无功能的Ghd7基因或不含Ghd7基因作为筛选标记，将所述无功能的Ghd7基因或不含Ghd7基因与所述已有稻种的优势性状聚合到一起。
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