WO2004081210A1

WO2004081210A1 - 植物の開花を制御する遺伝子Lhd4とその利用

Info

Publication number: WO2004081210A1
Application number: PCT/JP2004/003122
Authority: WO
Inventors: Yuzo Minobe; Lisa Monna; Noriyuki Kitazawa; Yumiko Maehara; Haruka Masuda; Masahiro Yano
Original assignee: Plant Genome Center Co., Ltd.; Plant Functional Genomics Co., Ltd.
Priority date: 2003-03-10
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2004-09-23

Abstract

　本発明者らは、大規模分離集団により、イネ品種ほしのゆめとKasalathの間で検出された出穂期を調節する晩生遺伝子座（Lhd4遺伝子座）の高精度連鎖解析を行った。その結果、イネの出穂期を調節するLhd4遺伝子を単離することに成功した。また、該遺伝子の導入によりイネの出穂期が改変することを見い出した。以上のことから、新たに単離されたLhd4遺伝子は、植物の出穂期の調節に利用でき、効率的な優良新品種開発と育成に利用できるものと考えられる。

Description

明細書植物の開花を制御する遺伝子 Lhd4とその利用技術分野

本発明は、植物の開花を制御する遺伝子 Lhd4およびその利用に関する。背景技術

現在、世界的に来るべき食糧不足に対応すべく、主要穀物の優良品種の開発が積極的に進められている。一般的に品種改良は、優良な特性を持った品種とその特性を付加したい品種とを交雑し、得られた雑種後代の中からその優良な特性を受け継いでいる系統を選抜することが必要となる。その際、付加したくない特性をも両親から受け継ぐため、選抜の作業を繰り返すことで、目的とする特性のみが付加された系統を取得する。このように、従来の育種の技術では新品種育成に多くの労力と時間を要することから、新しレ、技術による迅速な品種改良の技術開発が望まれてきた。

近年、イネをはじめ、 1、ゥモロコシ、大麦、小麦、大豆など主要穀物のゲノム解析の進歩に伴い、ポジショナルクローニングゃタギングなどの手法を用いて有用遺伝子が多数特定されてきている（例えば、非特許文献 1及び非特許文献 2 ) 。これらの遺伝子を利用して、効率良く優良品種を開発することも技術的に可能となっている。特に重要な食料資源であるイネでは、既に外来有用遺伝子の導入やアンチセンスなどの遺伝子組換え技術を用いて有用形質を付加した栽培品種の開発が実験的に成功している。例えば、アンチセンス技術により草丈を制御したり (非特許文献 3 )、アミロース含量を低下させる（非特許文献 4 ) といった、栽培特性の改変が可能となっている。また、従来の育種法を用いた品種改良においても、有用形質に関連した遺伝子の特定により、導入したい形質にリンクした遺伝子あるいは連鎖する DNAマーカーの存在を選抜の指標にすることで効率的な個体選抜が可能となることが予想される。

ところで、イネにおいて品種改良の際の重要な育種目標の一つに出穂期が挙げられる。品種ごとの出穂期の違いは、栽培可能な地域、時期を限定する。特に、日本国においては地理的に南北で広がりがみられるため、それぞれの地域に適した品種の育成が不可欠となっている。従来、出穂期の改変は、交雑により得られる雑種後代における早生 ·晩生系統の選抜や、放射線を使った人為的突然変異誘発により得られる変異体系統からの選抜などによつて行われてきた。しかしながら、出穂期を制御している遺伝子座は多数存在していることもあり（量的形質）、多大な労力と時間をかけながらも期待にそぐう品種が得られることは稀であった。そのようなことから、近年では、出穂期を制御している分子メ力二ズムを解明する研究が進められている。矢野らのグループは QTL解析によって、出穂期を制御する 15個の遗伝子座を検出している (非特許文献 5 ) 。さらに、それらのうち、いくつかの QTLの原因遣伝子をマップべ一スクローニングの手法で特定したことを報告している。そのうち、 Hdlはシロイヌナズナ CONSTANS (CO)のイネホモログであり、短日条件下で出穂を促進する機能を持つ（非特許文献 6 ) 。また、 Hd3a はシロイヌナズナ FLOWERING LOCUS T (FT)のホモ口グであり、短日条件下で出穂を促進、長日条件下で出穂を抑制する機能を持つ (非特許文献 7 ) 。さらに、これらの遺伝子を利用することで、ィネにおレ、て効率的な出穂期の改変が可能であることが証明されている (特許文献 1 ) 。

このように、出穂期関連遺伝子が特定されることで出穂の制御機構が明らかとなれば、その遺伝子を利用して出穂期をコントロールすることが可能である。しかしながら、現在のところ、複雑な制御機構の一端が解明されたに過ぎない状況である。

尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。

〔特許文献 1〕特開 2002- 153283 〔非特許文献 1〕 Ashikari, M.， Wu, J.， Yano, M.， Sasaki, T.， and Yosh imura, A. (1999) Rice gibberell in-insensitive dwarf mutant gene Dwarf 1 encodes the α -subunit of GTP - binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 : 10284-10289.

〔非特許文献 2〕 Monna L. , Kitazawa N. , Yoshino R. , Suzuki J. , Masuda

H, Maehara Y. , Tanj i M. , Sato M.， Nasu S. , and Minobe Y. (2002) Positio nal cloning of rice semi dwarf ing gene, sd- 1 : rice "green revolution gene encodes a mutant enzyme involved in gibberell in synthesis. DNA Res. 2 8 : 9 (1) : 11 - 17.

〔非特許文献 3〕 Itoh, H.， Ueguchi-Tanaka, M.， Sakamoto, T.， Kayano,

T.， Tanaka, H. , Ashikari, M.， and Matsuoka, M. (2002) Modification of Ri ce Plant Height by Suppressiing the Height-Controll ing Gene, D18， in Ric e. Breeding Science 52 : 215 - 218.

〔非特許文献 4〕 Terada, R.， Nakaj ima, M. , Isshiki, M. , Okagaki, R. J.， Wessl er, S. R.， and Shimamoto, K. (2000) Antisense Waxy genes with h ighly active promoters effectively suppress Waxy gene express ion in tran sgenic rice. Plant Cell Physiol. 41 : 88ト 888.

〔非特許文献 5〕 Yano, M. , Koj ima, S.， Takahashi, Y.， Lin, H. , and Sa saki, T. (2001) . Genetic control of flowering time in rice, a short-day plant. Plant Physiol. 127 : 1425—1429.

〔非特許文献 6〕 Yano, . , Katayose, Y.， Ashikari, M. , Yamanouchi, U.： Monna, L.， Fuse, T.， Baba, T.， Yamamoto, K.， Umehara, Y.， Nagaraura, Y.， and Sasaki, T. (2000) Hdl, a major photoperiod sensitivity QTL in rice, is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS. Pla nt Cel l 12 : 2473-2483.

〔非特許文献 7〕 Kojima, S.， Takahashi, Y. , Kobayashi, Y.， Monna L. , Sasaki, T.， Araki, T. , and Yano, M. (2002) Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes transition to flowering downstream of Hdl under short-day conditions. Plant and Cell Physiology 43 (10) : 1096-1105. 発明の開示

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、植物の開花を制御する遺伝子およびその利用法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の課題を解決するために、イネにおける重要な栽培特性の 1つとされている出穂期を制御している遺伝子の特定を行つた。

北海道のイネ栽培品種「ほしのゆめ」とインド型品種「Kasalath」の交雑後代を材料に出穂期に関連する QTL解析を行った結果、第 7染色体短腕のセントロメァ近傍に出穂期に作用力を持つ量的形質遺伝子座（QTL) が存在することが明らかとなっていた。この QTLは出穂の抑制に関与し、ほしのゆめの極早生性はそのァレルの機能が低下あるいは消失していることが原因であると推察されていた (野々上ら、日本育種学会第 97回講演会要旨集、育種学研究第 2卷、別冊 1号、 pp. 13) 。本発明者らは、ほしのゆめと Kasalathの間で検出されたこの出穂抑制遺伝子座を、 Late heading_4 (Lhd4)と命名し、その原因遺伝子を単離するために、以下の方法に従って実験を行った。

本発明者らは、 Lhd4遗伝子座が分離する集団を 2回に分けてファィトトロンで育成し、高精度連鎖解析を行った。まず、播種後 2週間目の幼苗 5000個体からゲノム DNAを抽出し、 Lhd4候補領域を挟み込む 2つの CAPSマーカー RA3113および C39 を用、て CAPS解析を行い、両マーカー間で組換えが起きている 563個体を選抜した。さらに、 dCAPSマーカー E3844および Y1055L間の組換え個体を 38個体再選抜し、幼苗をポットに移植し、温室内で栽培を続けた。 Lhd4における遺伝子型は、播種してから出穂するまでにかかった到穂日数によって判定した。しかしながら、選抜された組換え個体の当代では、はっきりした判定が困難なものが存在したため、自殖種子を回収して後代検定を行った。

一方で、 E3844および Y1055Lの間の RFLPマーカー G1068および S21350と、新たに作成した CAPSマーカーを用いて、組換え個体のジエノタイピングを進めた。後代検定とジヱノタイビングの結果から、候補領域は G1068— S7010間であると判定した。この時点で、候補領域は依然として 100 kb以上であることが予想され、選抜された組換え個体の染色体組換え位置はこの領域内で偏りが見られたことから、候補領域をさらに絞り込むには不十分であると判断した。そこで、新たに 2500個体の分離集団を育成し、 2回目の連鎖解析に用いた。その結果、 E3844— C39間での組換え個体は 41個体選抜され、そのうち、 S7005— S7010間での組換え個体は 8 個体であった。これらの個体の出穂調查を行い、遺伝子型との相関を解析したが当代個体でははつきりとした判定が困難であったため、自殖種子 F₃を回収して後代検定を行った。 F₃系統は分離するため、 CAPS解析によつて各個体の候補領域における遺伝子型を決定し、 Lhd4における遺伝子型と到穂日数の間の相関を確認した。また、新たに多数の DNAマーカーを候補領域内に設定して、各個体の遺伝子型を詳細に決定していった。 DNAマーカーは、 RGPの日本晴公開ゲノムシーケンスの情報をもとに PCRプライマーを設計し、ほしのゆめおよび Kasalathのゲノム DNA を用いて PCRを行い、その PCR産物のシーケンスの結果得られた両品種間での塩基多型情報を検索することで作成した。その結果、候補領域は S7012— S7017間の約 34 kbとなった。

RGPにおいて公開されている候補領域に相当する日本晴ゲノムシーケンスの Ri c eGMSによるァノテーシヨン結果から、 7つの蛋白質の存在が予測された。 Putati ve TNP-l ike transposable element 2つ、 hypothetical protein力、 2つ、 no hit のもの力 1つ、 putative polyprotein力 1つ、 CONSTANS- l ike protein力 1つの計 7 個である。その内唯一保存領域を持った蛋白質として、 CONSTANS - l ike蛋白質が予測された。 CONSTANSは開花を制御している遺伝子としてシロイヌナズナにおいて初めて単離 '解析され、近年、イネにおいてもそのホモログである Hdl遺伝子が単離 ·解析されている。イネでは出穂期と開花期は、ほぼ同時であると考えてよいことから、この予測蛋白質（遺伝子）も出穂に関与していることが予想された。従って、この蛋白質をコードする遺伝子を Lhd4の有力な候補遺伝子であると判断し、この遺伝子をクローニングした。

クローニングした遺伝子の構造は、候補領域におけるァノテーシヨンの結果から得られた遺伝子予測の結果とは異なっていた。得られた全長 cDNA配列は、公開されている候補領域に相当する日本晴ゲノムシーケンスと比較したところ、 444 bpおよび 327 bpからなる 2つのェクソンの間に、 1645 bpのィントロンが揷入した構造をとっていることが明らかとなった。また、ァノテーシヨンプログラムで予測された「no hit」の蛋白質は、実はこの遺伝子の一部分を含んでいることが明らかとなつた。さらに、 rhypothetical proteinj の 1つは、この遺伝子の 5' 上流のプロモーター領域であると推測される領域に予測されており、よって、この 2つの予測遺伝子は候補から除外できるものと思われた。得られた全長 cDNAから推定されるァミノ酸配列を配列情報解析ソフトゥェァ DNASIS Proによって検索した結果、 257アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードしていることが予測された。このポリペプチドは BLASTによるホモロジ一検索の結果、 3，末端近くに複数の植物種で単離されてレヽる C0NSTANS、 CONSTANS- like蛋白質および T0C1 (timing of cab 1)にコードされた配列と相同性の高い領域が存在することが明らかとなつたが、その他の領域に関しては相同性の高いものはなかった。

ほしのゆめのアレルと比較するため、予想されたコード領域を含む cDNAをほしのゆめから RT-PCRによって取得し、塩基配列を決定した。さらに、ほしのゆめおよび Kasalathでこの遺伝子の転写領域に相当するゲノムシーケンスをウォーキング法によって決定した。 cDNAおよびゲノムの両方の塩基配列を解析した結果、ほしのゆめと Kasalathの間では、転写領域内に 16個の SNPが存在することが明らかとなった。 Kasalathの cDNA配列をもとに推定したコード領域中には SNP力つ存在するが、ほしのゆめの cDNAをアミノ酸に翻訳すると、この内の最初に出現する SN Pによって停止コドンが生まれ、推定されるポリペプチドは Kasalathのものと比ベて非常に小さなものになった。

また、野生型の遺伝子であると考えられる Kasalath型のゲノム DNA断片を、ァグロパクテリゥム法により突然変異型の遺伝子を持つと推測されるほしのゆめに導入した形質転換体を作成し、表現型が回復するかどうかを確認した。形質転換体の表現型を解析した結果、導入遺伝子を保持するほとんどの個体で到穂日数が遅延し、ベクターのみを導入した個体においては大きな変化の見られた個体は現れなかった。さらに、本発明者らは、イネ植物体におけるセンス RNAの過剰発現による影響を調べた結果、過剰発現が確認された形質転換体では、短日条件下においてもほとんど出穂すらしなかった。以上の結果から、候補遺伝子として単離した遺伝子が Lhd4遺伝子であることが証明された。また、 Lhd4遺伝子には到穂日数を調節する機能を有することが明らかとなった。さらに、該遺伝子を用いて植物の出穂期の調節が可能であることが判明した。

イネの栽培では、ある地域で非常に優良な品種が育成されても、他の地域で同じょうに栽培することは困難となっている。従って、地域における日長や温度などの自然環境の違いから、その地域に適した品種の選択が不可欠である。つまり、出穂期がその栽培地域に適さない場合は、新たに出穂期の早晩性を指標に、品種改良を行う必要がある。本発明によって同定された Lhd4遺伝子は、植物の開花時期の調節に利用でき、効率的な優良新品種開発と育成に利用できるものと考えられる。

即ち、本発明は、植物の開花を制御する Lhd4遺伝子およびその利用に関し、' 以下の〔1〕〜〔1 7〕を提供するものである。

〔1〕以下の（a ) 〜（d ) のいずれかに記載の植物の開花を遅延する機能を有する蛋白質をコードする DNA。

( a ) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA。

( b ) 配列番号： 1または 2に記載の塩基配列のコ一ド領域を含む DNA。 (c) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、揷入、および/または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA。 '

(d) 配列番号： 1または 2に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA。

〔2〕イネ由来である、〔1〕に記載の DNA。

〔3〕以下の（a) 〜（d) のいずれかに記載の DNA。

(a) 〔1〕または〔2〕に記載の DNAの転写産物と相補的なアンチセンス R NAをコードする DNA。

(b) 〔1〕または〔2〕に記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNAをコードする DNA。

(c) 植物細胞における発現時に、 RNAi効果により、〔1〕または〔2〕に記載の DNAの発現を抑制する RNAをコードする DNA。

(d) 植物細胞における発現時に、共抑制効果により、〔1〕または〔2〕に記載の DNAの発現を抑制する RNAをコ一ドする DNA。

〔4〕以下の（a) または (b) に記載の DNA。

(a) 配列番号： 9に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA。

( b ) 配列番号： 7または 8に記載の塩基配列のコ一ド領域を含む DNA。

〔5〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の DNAを含むベクター。

〔6〕〔 1〕もしくは〔 2〕に記載の DNA、または該 DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物の開花遅延剤。

〔7〕〔3〕もしくは〔4〕に記載の DNA、または該 DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物の開花促進剤。

〔8〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の DNA、または〔5〕に記載のベクタ一を保持する形質転換植物細胞。

〔9〕〔8〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。〔1 0〕〔9〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。

〔1 1〕〔 9〕または〔 1 0〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。

〔1 2〕〔9〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の DNAまたは〔5〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。

〔1 3〕〔1〕または〔2〕に記載の DNAを植物体の細胞内で発現させること

. を特徴とする、植物の開花を遅延する方法。

〔1 4〕植物体の細胞内における、内因性の〔1〕または〔2〕に記載の DNA の発現を抑制することを特徴とする、植物の開花を促進する方法。

〔1 5〕〔3〕に記載の DNAを植物に導入することを特徴とする、〔1 4〕に記載の方法。

〔1 6〕〔4〕に記載の DNAを植物に導入することを特徴とする、植物の開花を促進する方法。

〔1 7〕植物がイネである、〔1 2〕〜〔1 6〕のいずれかに記載の方法。本発明者らは、大規模分離集団により、イネ品種ほしのゆめと Kasalathの間で検出された出穂期を調節する晩生遺伝子座（Lhd4遺伝子座）の高精度連鎖解析を行った。その結果、 Kasalath からイネの出穂期を遅延させる機能を有する Lhd4 遺伝子を単離することに成功した。さらに、 Kasalath の Lhd4遺伝子配列と日本晴および極早生品種であるほしのゆめの Lhd4遺伝子配列との間では、多数の SNP が存在することが明らかとなった。本発明で単離された Kasalath, 日本晴およびほしのゆめの Lhd4のゲノム DNA配列をそれぞれ配列番号： 1、 4および 7に、 cDN A配列をそれぞれ配列番号： 2、 5および 8に、これら DNAがコードする蛋白質のァミノ酸配列をそれぞれ配列番号： 3、 6および 9に示す。

本発明は、これらの知見に基づき、植物の開花を遅延する機能を有する Lhd4蛋白質をコードする DNA、 Lhd4蛋白質をコードする DNAの発現を抑制する DNAであつ - 1 o - て、植物の開花を促進する機能を有する DNA、植物の開花を促進する機能を有する変異型 Lhd4蛋白質をコードする DNA、および、それらの利用法を提供する。

本発明において開花の遅延とは、開花時期を遅らせることを指す。一方、開花の促進とは、開花時期を早めることを指す。開花とは通常、花が咲くことを指す、イネを含むイネ科植物等においては出穂を意味する。

本発明において、 Lhd4蛋白質をコードする DNAが由来する生物種としては、特に制限はないが、好ましくは植物である。 Lhd4蛋白質をコードする DNAが由来する植物としては、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、才ォムギ、ダイズなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。

また、本発明の DNAが導入されることで開花が制御される植物としては、特に制限はなく、例えば、有用農作物、鑑賞用植物等を挙げることができる。具体的には、有用農作物としては、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、ォォムギ、ダィズ、トマト、ヮタ、タバコ、ナタネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、ヒマヮリが挙げられる。また、観賞用植物としては、例えばキク、カーネーション、バラ、シクラメン、トレユア、ペチュニア、チューリクプ、ガ一ペラが挙げられる。

また、本発明において、 Lhd4蛋白質をコードする DNAとしては、例えば配列番号： 1または 2に記載の塩基配列のコード領域を含む DNAや配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNAが挙げられる。

また、本発明は、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなる Lhd4蛋白質と構造的に類似しており、植物の開花を遅延する機能を有する蛋白質をコードする DN Aを包含する。このような DNAの配列は、配列番号： 1または 2に記載の塩基配列と、配列全体で少なくとも 50%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90% 以上、さらに好ましくは 95%以上、さらにより好ましくは 97%以上、最も好ましくは 98%以上の相同性を示す。また、このような DNAからコードされる蛋白質のァミノ酸配列は、配列番号： 3に記載のァミノ酸配列と、配列全体で少なくとも 60%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 9 5%以上、さらにより好ましくは 97%以上、最も好ましくは 98%以上の相同性を示す。

また、 Lhd4蛋白質は、カルボキシル末端側に CCTモチーフを持つという構造的特徴を有する（実施例参照）。このモチーフは、核移行シグナルを含んでいることが確認されている。また、核移行シグナル以外にも蛋白質-蛋白質の相互作用に関与していることが推測されており、機能的にも重要な領域であるとされている。さらに、このモチーフを有するほとんどの蛋白質は、花芽形成に関連した機能を持つことが知られている。

例えば、 CCTドメインを持つシロイヌナズナ COは、長日条件下で開花を促進する機能を持つことが知られている。従って、機能を喪失した co突然変異体では、野生型に比べて著しい開花の遅延がみられる。このような co変異体はいくつか知られており、近年、そのうちの 2つは CCTドメイン内の一アミノ酸置換に起因していることが確認された。また、そのうちの 1つ co-7は開花を促進するという機能は喪失しているが、核移行シグナルの機能は保持していることが確認された。よって、 CCTドメインは COにおいては開花を促進するという機能を規定している重要な領域でもあると推測されている（Robson et al. (2001) Plant J. , 28 (6) , 619-631)。さらに、 T0C1においても、その tocl変異は概日リズムの周期が短くなり開花時期が変化する表現型を示すが、 2つの tocl変異（tocl-1および tocl - 2) のうちの 1つ tocl-1の表現型は同様に CCTドメイン内の一アミノ酸置換に起因していることが確認されている（Strayer et al. (2000) Science, 289, 768-77 1) 。

CCTモチーフ配列は 43アミノ酸残基からなり、そのコンセンサス配列（配列番号： 1 0 ) は「REAR (A) VL (M) RYR (K) E KR (K) KXRKF (Y) E (D) KT IRYA (E) SRKAY (R) A E (D) XRPRI (V) KGRF AKR」と示すことが可能である（鍵括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を示す。また、 0 内のアミノ酸残基はその前の残基と入れ替わつている場合が多いことを示し、「X」は保存されていない残基を示す）。

ある DNAが植物の開花を遅延する機能を有する蛋白質をコードするか否かは、例えば、該 DNAが導入された植物の開花が遅延するか否か、または、該 DNAの発現を抑制する DNAが導入された植物の開花が促進するか否かを観察することで検証することができる。

植物の開花を遅延する機能を有する蛋白質をコードする DNAには、例えば、配列番号： 3に記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸が置換、欠失、付加および Zまたは挿入されたァミノ酸配列からなる蛋白質をコードする変異体、誘導体、ァリル、バリアントおよびホモログが含まれる。このようなアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。変異するアミノ酸数は、アミノ酸が付カロ、欠失もしくは置換されるアミノ酸残基の部位などによってことなるが、好ましくは 30個以内、より好ましくは 2〜20個、さらに好ましくは 2〜15個程度を指す。また、変異するアミノ酸残基においては、ァミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、親水性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、 A、 V、 L、 I、 P) 、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、 Τ、 Υ) 、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、 M) 、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、 N、 E、 Q) 、塩基含有側鎖を有するァミノ離 (R、 K、 Η) 、芳香族含有側鎖を有するァミノ酸 (H、 F、 Y、 ) を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。

あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及ぴ又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81， 5662 - 5666 、 Zoller, M. J. & Smith, M. N ucleic Acids Research (1982) 10， 6487 - 6500 、 Wang, A. et al.， Science 22 4, 1431-1433, Dalbadie - McFarland, G. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79， 6409 - 6413、 Bowie et al. , Science (1990) 247， 1306-1310) 。

また、ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、蛋白質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 27 1-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468—500、 Kr amer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12， 944ト 9456、 Kramer W, and F ritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、 Kunkel, TA (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82， 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85， 2763-27 66) などを使用できる。

配列番号： 3に記載のァミノ酸配列からなる Lhd4蛋白質のァミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された蛋白質には、これら蛋白質を含む融合蛋白質が含まれる。融合蛋白質は、これら蛋白質と他の蛋白質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合蛋白質を作製するには、例えば、配列番号： 3に記載のァミノ酸配列からなる Lhd4蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする DNAと他の蛋白質をコードする DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現べクタ一に導入し、宿主で発現させればよい。本発明の蛋白質との融合に付される他の蛋白質としては、特に限定されない。

本発明の蛋白質との融合に付される他のぺプチドとしては、例えば、 FLAG (Ho pp, T. P. et al. , BioTechnology (1988) 6， 1204-1210 ) 、 6個の His (ヒスチジン）残基からなる 6 X His、 10 X His、ィンフルェンザ凝集素 (HA) 、ヒト c- myc の断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7- tag、 HSV-tag 、 E- tag 、 SV40T 抗原の断片、 lck tag 、 a - tubulinの断片、 B- tag 、 Protein C の断片等の公知のぺプチドを使用することができる。また、本発明の蛋白質との融合に付される他の蛋白質としては、例えば、 GST (ダルタチオン一 S—トランスフェラーゼ) 、 HA

(ィンフルェンザ凝集素) 、ィムノグロプリン定常領域、 β—ガラクトシダーゼ、 MBP (マルトース結合蛋白質）等が挙げられる。市販されているこれら蛋白質をコードする DNAを本発明の蛋白質をコードする DNAと融合させ、これにより調製された融合 DNAを発現させることにより、融合蛋白質を調製することができる。

配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなる Lhd4蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする DNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術（Southern EM: J. Mol. Biol. 98 : 503， 1975) やポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 技術 (Saiki RK, et al : Science 230 : 1350， 198 5、 Saiki RK, et al : Science 239： 487, 1988) を利用する方法が挙げられる。すなわち、 Lhd4領域のゲノム塩基配列（配列番号： 1 ) 、 Lhd4 cDNAの塩基配列 (配列番号： 2 ) 、または、その一部をプローブとして、また、 Lhd4領域のゲノム塩基配列、 Lhd4 cDNAの塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレォチドをプライマーとして、イネや他の植物から Lhd4蛋白質をコードする DNAと高い相同性を有する DNAを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダィゼーシヨン技術や PCR技術によって単離し得る L hd4蛋白質と同等の機能を有する蛋白質をコードする DNAもまた、本宪明の Lhd4蛋白質をコードする DNAに含まれる。

このような DNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダィゼーション反応を行う。本発明のハイブリダィゼーション反応においては、さまざまな程度のストリンジェントな条件を用いることができる。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。好ましくは、標準的方法（Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloni ng : A Laboratory Manual)」、三片反、 Cold Spring Harbor^ ニューヨーク (200 1) ) において説明されているような当技術分野において周知の技術によって、ストリンジェントな条件の下でハイブリダィゼーションを行う。

本発明の目的に適した「低ストリンジェントな条件」は、例えば、 5xSSC、 5x デンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムアミド、 32°C条件でのハイブリダィゼーシヨン、それに続く 2xSSC、 0. 1%SDS, 室温での洗浄である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、 5xSSC、 5xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムァミド、 42°C条件でのハイプリダイゼーション、それに続く 0. 2xSSC、 0. 1% SDS、 37°Cでの洗浄、「高ストリンジェントな条件」は、例えば、 5xSSC、 5xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムアミド、 42°C条件でのハイブリダイゼーション、それに続く 0. lxSSC、 0. 1%SDS、 65°Cでの洗浄である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有する DNAが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイプリダイゼーシヨンのストリンジエンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。ここで、「高い相同性」とは、 DN A配列全体で少なくとも 50%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、さらにより好ましくは 97%以上、最も好ましくは 98 %以上の配列の同一性を指す。

また、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなる Lhd4蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする DNAは、本発明の DNAを有する植物や植物細胞に変異処理を行い、該植物や細胞から、例えば配列番号： 3に記載のァミノ酸配列からなる Lh d⁴蛋白質をコ一ドする DNAとストリンジェントな条^でハイブリダイズする DNAを選択することによつても得ることができる。

また、たとえ塩基配列が変異していても、その変異が蛋白質中のアミノ酸の変異を伴わないこと（縮重変異）があるが、このような縮重変異 DNAも本発明の Lhd 4蛋白質をコードする DNAに含まれる。

アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチユールによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2264- 2268， 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90： 5873， 1993) を用いて決定できる。 BLASTのアルゴリズムに基づいた BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul S F， et al : J Mol. Biol. 215 : 403， 1990) 。 BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば score = 50、 wordlength==3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http : //丽. ncbi. nlm. nih. gov/) 。

本発明の DNAには、ゲノム DNA、 cDNAおよび化学合成 DNAが含まれる。ゲノム DNA および cDNAの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノム DNAは、例えば、 Lhd4蛋白質をコードする DNAを有するイネ品種からゲノム DN Aを抽出し、ゲノミックライブラリ一 (ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、 BAC、 PACなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明の Lhd4蛋白質をコードする DNA (例えば、配列番号： 1または 2 ) を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダィゼーションあるいはプラークノ、イブリダィゼーシヨンを行うことで調製できる。また、本発明の Lhd4蛋白質をコ ―ドする DNA (例えば、配列番号： 1または 2 ) に特異的なプライマーを作製し、これを利用した PCRを行って調製することも可能である。 cDNAは、例えば、 Lhd4 蛋白質をコードする DNAを有するイネ品種から抽出した mRNAを基に cDNAを合成し、これを； I ZAPなどのベクターに挿入して cDNAライブラリ一を作製し、これを展開して、上記と同様にコ口ニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーシヨンを行うことで、また PCRを行うことにより調製できる。

本発明の Lhd4蛋白質をコードする DNAは、植物の開花遅延剤としての用途を有する。例えば、該 DNAを発現または発現誘導可能なベクターに連結して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによって、開花が遅延した形質転換植物体を作製できる。本発明においては、このような方法で植物の開花を遅延できる。

また、本発明は、 Lhd4蛋白質をコードする DNAの発現を抑制する DNAを提供する。ここで「Lhd4蛋白質をコードする DNAの発現の抑制」には、 Lhd4蛋白質をコードする DNAの転写の抑制おょぴ蛋白質への翻訳の抑制が含まれる。また、該 DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。また、翻訳された蛋白質が植物細胞内で本来の機能を発揮しないことも含まれる。また、本発明は、ほしのゆめ由来の変異型 Lhd4蛋白質をコードする DNA (配列番号： 9に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA、または配列番号： 7もしくは 8に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA) を提供する。 Lhd4蛋白質をコードする DNAの発現を抑制する DNA、および、ほしのゆめ由来の変異型 Lhd4蛋白質をコードする DNAは、植物の開花を促進する機能を有する。よって、これら DNAは、植物の開花促進剤として使用することができる。

例えば、 Lhd4蛋白質をコ一ドする DNAの発現を抑制する DNAを発現または発現誘導可能なベクターに連結して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによって、開花が促進した形質転換植物体を作製できる。また、ほしのゆめ由来の変異型 Lhd4蛋白質をコードする DNAを利用することにより、植物の開花を促進することが可能である。例えば、従来の育種で用いられている交雑による導入、または相同組換えなどの遺伝子組換え技術を利用した方法により、ほしのゆめ由来の変異型 Lhd4遺伝子と内在性の正常型遺伝子とを置換することにより、開花が促進した形質転換植物体を作製できる。本発明においては、このような方法で植物の開花を促進できる。

従来の育種で用いられている戻し交雑育種法によれば、以下のようにして開花が促進した植物を得ることが可能である。まず、変異型 Lhd4遺伝子を持つほしのゆめと正常型 Lhd4遺伝子を持つ品種 (例えば、インド型イネ品種 Kasalath) を交配し、を得る。このに、 Kasalathを戻し交配してを得る。は、理論上染色体全領域の 2分の 1が Kasalathのホモ型であり、 2分の 1がほしのゆめと Kasalathのへテロ型となっている。この BC i個体群の中から、 DNAマーカーを用いて Lhd4遺伝子領域がヘテロ型になっている個体を選抜し、さらに Kasalathとの戻し交配により BCAを得る。なお、ここで言う DNAマーカーとしては、本発明において作製した CAPS、 dCAPS、および SNPマーカーなどを利用することが可能である（実施例に記載）。同様にして Lhd4遺伝子領域がヘテロ型になっている個体を選抜し、 Kasalathとの戻し交配を重ねる。い BC₂Fい BC₃Fい BC^と選抜 '戻し交配を繰り返すごとに、導入遺伝子を含む染色体領域がヘテロに維持されたまま、他の染色体領域が Kasalathのホモ型に徐々に置換されて行く。 BC^世代では、ほしのゆめの染色体をへテロで有する領域は理論上全体の 32分の 1となり、遺伝的背景はほとんど Kasalathと同一で、目的とする染色体領域のみにほしのゆめの染色体が導入された準同質遺伝子系統が得られてくる。開花に関連するほしのゆめ由来の遺伝子座 (遺伝子）の影響が全くないようであれば、選抜した種子の自殖種子 BC₅F₂を展開 ·栽培し、ほしのゆめ由来の変異型 Lhd4遺伝子をホモで保有する個体を選抜することで目的とする植物体を得ることができる。

近年、飯田らのグループにより従来と比べて超高率の相同組換えによるイネ形質転換法が開発された（Terada et al. (2002) Nature Biotechnology, 20, 103 0-1034) 。この技術によれば、遺伝子ターゲティングをイネにおいても再現性よく行うことが可能であるとしている。従って、本発明によるほしのゆめ由来の変異型 Lhd4遺伝子を染色体上の正常型 Lhd4遺伝子領域と相同組換えにより置換することで、開花が促進した形質転換植物を得ることが可能である。

植物における特定の内在性遗伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるァンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンス RNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ec ker JR & Davis 冊： Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83： 5372， 1986) 。その後、タバコゃペチュニアにおいても了ンチセンス RNAの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（van der Krol AR, et al : Nature 333： 866， 1 988) 、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。

アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイプリッド形成による転写阻害、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとェクソンとの接合点におけるハイブリツド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシンク" 阻害、 mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キヤツビング部位やポリ（A)付加部位とのハイプリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイプリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリポソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイプリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸と蛋白質との相互作用部位とのハイプリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上：新生化学実験講座 2 核酸 IV 遺伝子の複製と発現（日本生化学会編，東京化学同人） pp. 319- 347， 1993) 。

本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域に相捕的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む DNAも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。使用されるアンチセンス DNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された DNAは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。ァンチセンス DNAの配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス DNAの長さは少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さらに好ましくは 500塩基以上である。通常用いられるアンチセンス DNAの長さは 5kbよりも短く、好ましくは 2. 5kbよりも短い。本発明のアンチセンス DNAとしては、例えば、配列番号： 6 8または 6 9に記載の塩基配列からなる DNAを挙げることができる。

内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザィムをコ一ドする DNAを利用して行うことも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことを指す。リボザィムには種々の活性を有するものが存在するが、中でも RNAを切断する酵素としてのリボザィムに焦点を当てた研究により、 RNAを部位特異的に切断するリボザィムの設計が可能となった。リボザィムには、グループ Iィントロン型ゃ R Nase Pに含まれる Ml RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーへッド型ゃヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子：蛋白質核酸酵素， 35 : 2191， 1990) 。例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15という配列の C15の 3'側を切断するが、その活性には U14と A9との塩基対形成が重要とされ、 C15の代わりに A15または U15でも切断され得ることが示されている（Koizu mi M, et al : FEBS Lett. 228： 228, 1988) 。基質結合部位が標的部位近傍の RN A配列と相補的なリボザィムを設計すれば、標的 RNA中の UC、 UUまたは UAという配列を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することができる（Koizumi M, et al : FEBS Lett. 239： 285， 1988、小泉誠および大塚栄子：蛋白質核酸酵素 35 : 2191， 1990、 Koizumi , et al： Nucl. Acids. Res. 17： 7059， 1989) 。例えば、 Lhd4蛋白質をコードする DNA (配列番号： 2 ) 中には、標的となり得る部位が複数存在する。

また、ヘアピン型リボザィムも本発明の目的に有用である。このリボザィムは. 例えばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan JM : Nature 323： 349, 1986) 。ヘアピン型リボザィムからも、標的特異的な RNA切断リボザィムを作出できることが示されている（Kikuchi Y & S asaki N: Nucl. Acids. Res. 19 : 6751, 1991、菊池洋：化学と生物 30： 112， 1 992) 。

標的を切断できるように設計されたリボザィムは、植物細胞中で転写されるように、力リフラヮーモザィクウィルスの 35Sプロモーターなどのプロモーターおよぴ転写終結配列に連結される。このとき、転写された RNAの 5'端や 3'端に余分な配列が付加されていると、リボザィムの活性が失われることがあるが、こういつた場合は、転写されたリボザィムを含む RNAからリボザィム部分だけを正確に切り出すために、リボザィム部分の 5'側や 3，側にシスに働く別のトリミングリボザィムを配置させることも可能である (Taira K, et al： Protein Eng 3： 733, 1990、 Dzianott AM & Bujarski JJ : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86： 4823, 19 89、 Grosshans CA & Cech TR : Nucl. Acids Res. 19 : 3875, 1991、 Tail- a K, et al : Nucl. Acids Res. 19 : 5125, 1991) 。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる (Yuyama N, et al : Biochera Biophys Res Commun 186： 1 271， 1992) 。このように、リボザィムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖 RNAを用いた RNA interferance (RNAi) によっても行うことができる。 RNAiとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖 RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。 RNAiの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖 RNAが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。 RNAiは植物においても効果を奏することが知られている（Chuang CF & Meyerowitz EM: Pro c. Natl. Acad. Sci. USA 97： 4985, 2000) 。例えば、植物体における Lhd4蛋白質をコードする DNAの発現を RNAiにより抑制するためには、 Lhd4蛋白質をコードする DNA (配列番号： 2 ) またはこれと類似した配列を有する二本鎖 RNAを目的の植物へ導入し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が促進した植物を選択すればよい。

RNAi効果により、 Lhd4蛋白質をコードする DNAの発現を抑制する DNAは、標的配列のィンバ一テッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい) を揷入し、ヘアピン構造を持つダブルストランド RNA (self-complementary ^ehairp in' RNA (hpRNA) )を作るようなコンストラクト (Smith, N. A. et al. Nature, 4 07 : 319， 2000、 Wesley, S. V. et al. Plant J. 27 : 581， 2001、 Piccin, A. et a 1. Nucleic Acids Res. 29 : E55， 2001) として使用することもできる。

RNAiに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95 %以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。

内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する DNAの形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部は RNAiの機構と重複していると考えられている。共抑制は植物においても観察される（Smyth DR: Curr. Biol. 7： R793, 1997、 Marti enssen R: Curr. Biol. 6 : 810， 1996) 。例えば、 Lhd4蛋白質をコードする DNA が共抑制された植物体を得るためには、 Lhd4蛋白質をコードする DNAまたはこれと類似した配列を有する DNAを発現できるように作製したべクタ一 DNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が促進した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、最も好ましくは 95%以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。

本発明は、本発明の DNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む形質転換植物体の製造方法を提供する。

本発明において、植物細胞が由来する植物としては、特に制限はない。また、植物細胞の形質転換に用いられるベクタ一は、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はないが、挿入遺伝子を過剰発現させることが可能なベクターであることが好ましい。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラヮ一モザイクウィルスの 35Sプロモーター) を有するベクタ一や、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。例えば、実施例に記載のバイナリーベクター pPZP2Ha3 (+)バ-）（Fuse et al. (2001) Plant Biotechnolog y， 18， 219- 222)を使用することができる。また、上記「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。

植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法 (エレクトロポレーシヨン法) 、ァグロパクテリゥムを介する方法、パーテイクルガン法、マイクロインジェクション法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。

形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド'型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta S K : In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and bpangenberg, Eds) pp. 66- 74, 1995、 Hayashimoto et al. (1990) Plant Physiol.， 93， 857 - 863、 Datta et al. (1990) Bio/technology, 8， 736-740) 、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Sh imamoto et al. (1989) Nature, 338, 274-276、 Toriyama et al. (1988) Bio/t echnology, 6， 1072-1074) 、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9， 957-962、 Li et al. (1993) Plant Cel l Rep.， 12, 250-255) 、およびァグロノくクテリゥムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hi ei Y， et al : Plant J 6 : 271, 1994) など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。また、ァグロパクテリゥム法によるイネへの遺伝子の導入、形質転換体の選抜および再分化は、公知とされているイネの形質転換法 ( 「Hiei et al . (1994) Plant J. 6： 271-282. J および「Toki et al. (1 997) Plant Molecular Biology Reporter, 15 (1)， 16-21」）を参考に実施できる, 本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。

ゲノム内に本発明の DNAが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。図面の簡単な説明

図 1は、 Lhd4領域の低密度連鎖地図を示した図である。左の垂直の棒は、日本晴 · Kasalathの F₂植物を利用して Harushimaらにより作成された RFLP連鎖地図である（Harushima et al. (1998) Genetics, 148, 479-494) 。右の垂直の棒は、ほしのゆめ ' Kasalath交雑後代集団（BC F₂)を利用して作成した低密度連鎖地図である。その棒の左側の数字は両マーカーの間で組換えの起きた個体数を、右側の斜線の範囲はマッビングによって限定された Lhd4候補領域を示す。

図 2は、 Lhd4候補領域の詳細な連鎖地図および物理地図を示した図である。 A は、ほしのゆめ · Kasalath交雑後代集団 5000個体を用いた連鎖解析の結果により作成した連鎖地図である。マーカー間の数字は、そのマーカーの間で組換えの起きた個体数を示す。 Bは、ほしのゆめ · Kasalath交雑後代集団をさらに 2500個体用いて行った連鎖解析の結果を、 Aの図に追加してまとめた連鎖地図である。 Aの図における候補領域 G1068-S7010間をより詳細に示した。マーカ一間の数字は、そのマーカーの間で組換えの起きた個体数を示す。 Cは、候補領域およびその周辺領域をカバーする日本晴 PACと BACによるコンテイダの図を示したものである。水平線上の数字は、 RGPホームページ (http : //rgp. dna. affrc. go. jp/index. htm 1) で公開されているクローン名を示す。 Dは、候捕領域およびその周辺領域を力バーする Kasalath由来の BACコンテイダの図を示したものである。 Eは、限定された候補領域約 34 kb内での組換え位置とその個体数 (上段) 、およびァノテ一シヨンプログラムによって予測された 7つの 0RF (下段）を示したものである。 F は、候補として単離した遺伝子の構造を Eの物理地図に対応させて表した図である。

図 3は、候捕遺伝子全長 cDNAァライメントを示した図である。塩基の下の二重下線は、 Kasalath、日本晴、ほしのゆめの間で見られる SNPの位置を示す。

図 4は、候補遺伝子全長 cDNAァライメントを示した図である。図 3の続きを示す。矢印は、イントロンの挿入位置を示す。塩基の下の二重下線は、 Kasalath、日本晴、ほしのゆめの間で見られる SNPの位置を示す。

図 5は、転写領域における 3品種間 SNPsを示した図である。水平線は、各品種のゲノム配列を表し、その線上の縦線は Kasalathのゲノム配列との比較により検出された SNPsの位置を示す。アスタリスク（*) は、 Kasalath、日本晴では一致し、ほしのゆめでのみ異なっていた SNPの位置を示す。

図 6は、推定された蛋白質のァライメントを示した図である。 Kasalathと日本晴の間で異なるアミノ酸を二重下線で示す。矢じりは、対応する DNA配列におけるイントロンの挿入位置を示す。ボックスは、 CCTドメインを示す。

図 7は、候補遺伝子の RT- PCR解析を示した写真である。

図 8は、相補性試験に用いたバイナリーベクターを示した図である。

図 9は、過剰発現に用いたバイナリ一ベクターを示した図である。

図 1 0は、センス RNA過剰発現形質転換体における到穂日数の変化を示した図及び写真である。棒グラフの一番左はべクタ一のみを導入した対照 (N=45) における平均到穂日数を、その右はセンス RNA過剰発現形質転換体の各個体ごとの到穂日数を示す。到穂日数が 100日の個体は、この棒グラフにおいては 100日目でなお未出穂であったことを示す。下の図は、ノーザンハイブリダ一ゼーシヨンのブ口ッ卜結果を示す。棒グラフにおける個体番号とプロット結果における個体番号は対応している。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[実施例 1] 出穂期関連遺伝子座 Lhd4の検出

北海道のイネ栽培品種「ほしのゆめ」とインド型品種「Kasalath」の交雑後代を材料に出穂期に関連する QTL解析を行った結果、第 7染色体短腕のセントロメァ近傍に出穂期に作用力を持つ量的形質遺伝子座（QTL) が存在することが明らかとなっていた。この QTLは出穂の抑制に関与し、ほしのゆめの極早生性はそのァレルの機能が低下あるいは消失していることが原因であると推察されていた . (野々上ら、日本育種学会第 97回講演会要旨集、育種学研究第 2卷、別冊 1号、 pp. 13) 。実際に、ほしのゆめと Kasalathの交雑後代 BCA集団を用いて RFLPマー力一 R46〜C39間での組換え個体に対する連鎖解析を行つた結果、出穂期を調節する作用を持つ遺伝子座が RFLPマーカー E3844〜Y1055Lの間に存在することが確認された（図 1 ) 。なお、連鎖解析に用いた RFLPマーカー R46および C39とその間に存在する計 9個の RFLPマーカーおよび ESTクローン Y²⁷0⁷L、 C383、 E50426, E3844、 G1068、 S21350、 Y2707R、 Y1055L、 R610は独立行政法人農業生物資源研究所（ht tp : //rgp. dna. affrc. go. jp/し loneaccess. htm丄) より入牛ロ]" でめる。

ところで、ほしのゆめと Ksalathの品種の組み合わせによって検出されたこの Q TLとほぼ同座に、これまでにも同様な作用を持つとされる遺伝子座の存在が報告されていた。矢野らのグループでは、日本型品種「日本晴」とインド型品種「Ka salathj の交雑後代を用いて出穂期に関連する QTL解析を行った結果、作用力は小さいが出穂期関連 QTLを検出している。この QTLは、現在解析されている 15の出穂期関連遺伝子座の 4番目に見出されたことから Hd4 (Heading date 4) と命名されている（Yano et al . (1997) Theor. Appl. Genet.， 95, 1025-1032)。そして、 Hd4遺伝子座とその近傍領域のみが Kasalath型の染色体に置換されている日本晴準同質遺伝子系統 NIL_Hd4 (Hd4の nearly i sogenic l ine：準同質遺伝子系統）を用いた解析によって、 Kasalath型の Hd4は日本晴型に対して出穂を遅延（抑制）する作用があり、その作用は単一の遺伝子座によるものであることが証明されている（林ら、日本育種学会第 96回講演会要旨集、育種学研究第 2卷、別冊 2号、 pp. 44) 。また、吉村らのグループでは、日本型品種「台中 65」に野生種「ダルメパテユラ（IRGC Ac No. 105668) 」の染色体断片を導入した系統（glumIL s) を用いた出穂期関連遺伝子座の連鎖分析によって、晩生遺伝子座 Lhd2 (t) (La te heading-2 (t) ) を同定している (Sanchez et al. (2000) Rice Genetics New sletter, 17, 46-48) 。さらに、出穂を制御している感光性遺伝子座の一つとされている E1遺伝子座が Hd4と同座であると推測されている（Ichitani et al. (19 98) Breed. Sci. , 48, 51-57) 。しかしながら、これらの報告は低密度の連鎖解析によるものであり、出穂抑制遺伝子座の検出に用いられた品種材料が異なることから、その原因遺伝子が同一であるのか否かは未解決の問題とされている。本発明者らは、上記ほしのゆめと Kasalathの間で検出された出穂抑制遺伝子座を、 Late heading- 4 (Lhd4)と命名し、その原因遺伝子を単離するために、以下の方法に従つて実験を行つた。

1 ) 植物体の育成

Lhd4遺伝子座が分離する集団には、ほしのゆめと Kasalathの戻し交雑後代である BC₂F₂世代を用いた。この分離集団を 2回に分けてフアイトトロンで育成し、連鎖解析を行った。

2 ) 高精度連鎖解析

まず、播種後 2週間目の幼苗 5000個体から簡易抽出法（Monna et al. (2002) DN A Research, 9, 11-17) に従ってゲノム DNAを抽出し、 Lhd4候補領域を挟み込む 2 つの CAPSマーカー RA3113および C39 (表 1 ) を用いて CAPS解析を行レ、、両マーカ一間で組換えが起きている 563個体を選抜した。さらに、 dCAPS (derived - CAPS) マ一カー E3844および n055L (表 1 ) 間の組換え個体を 38個体再選抜し、幼苗をポットに移植し、温室内で栽培を続けた。 Lhd4における遺伝子型は、播種してから出穂するまでにかかった日数によって判定した。しかしながら、選抜された組換え個体の当代では、はっきりした判定が困難なものが存在したため、自殖種子を回収して後代検定を行つた。一方で、 E3844および Y1055Lの間の RFLPマーカ一 G 1068および S21350と、新たに作成したマーカー S7004、 S7005および S7010 (表 1 ) を用いて、組換え個体のジヱノタイピングを進めた。後代検定とジエノタイビングの結果から、候補領域は G1068— S7010間であると判定した（図 2 A) 。この時点で、候補領域は依然として 100 kb以上であることが予想され、選抜された組換え個体の染色体組換え位置はこの領域内で偏りが見られたことから、候補領域をさらに絞り込むには不十分であると判断した。そこで、新たに 2500個体の分離集団を育成し、 2回目の連鎖解析に用いた。その結果、 E3844—C39間での組換え個体は 41個体選抜され、そのうち、 S7005— S7010間での組換え個体は 8個体であった。これらの個体の出穂調査を行い、遺伝子型との相関を解析したが当代個体でははつきりとした判定が困難であったため、自殖種子 F₃を回収して後代検定を行った。 1回目（δΟΟΟ個体）、 2回目（2500個体）の大規模連鎖解析によって得られた種子を用いて、平成 13年度、ファイトトロン内で、組換え個体の F₃種子およびその組換え固定系統の種子 F₄を用いて後代検定を行った。ファイトトロン内での栽培条件は、以下の通りである。温度：昼温 28°C/夜温 25°C、日長： 12時間明 /12時間暗、湿度： 70%。 F₃系統は分離するため、 CAPS解析によって各個体の遺伝子型を決定し、 Lhd4における遺伝子型と到穂日数の相関を確認した。また、新たに多数の DNAマーカ一を候補領域内に設定して、各個体の遺伝子型を決定していった。 DNAマーカーは、 RGPの日本晴公開ゲノムシーケンス（DDBJ Acc. No.： AP005307および AP003701) の情報をもとに PCRプライマーを設計し、ほしのゆめおよび Kasalathのゲノム DNAを铸型に用いて PCRを行い、その PCR産物のシーケンスの結果得られた両品種間での塩基多型情報を検索することで作成した。ただし、遺伝子型を調べる個体数が多くないことから、一部は塩基多型の探索に用いたプライマーを用いて PCRを行い、直接塩基多型を含む領域をシーケンスにより確認することで、その領域での遺伝子型を判定した（表 2 ) 。

表 1

*1 は、このマーカー力 cycloPrime- FP SNP detection kit (Perkin Elmer社）を用いて、キットに添付の業者推奨のプロトコールに従って遺伝子型を判定したことを示す。

qeencue s πθ

CO

し、多型を検出したことを示す。

*2は、図 2 Cにおける PACクローン P0046D03 (DDBJ Acc. No. AP005307, 150554 bp) 上の遺伝子型判定に利用した SNPの位置を示す。

なお、この PACのシーケンスデータは平成 15年 1月 10日現在、公開されていたものを参照した。その結果、候捕領域は S7012— S7017間の約 34 kbとなった。以上の連鎖解析により作成された遺伝地図を図 2 Bに示す。さらに、候補領域を絞り込むためにこの候補領域内にマーカー S7028、 S7015および S7016を作成して、 5つの組換え個体の遺伝子型を決定したところ 2個体が S7012 - S7028間で、 3個体が S7017- S7016間で組換えが起きていたことが明らかとなった。従って、候捕鎮域両端のマーカーの近傍で組換えが起きている個体のみが残された状況となるため、これ以上の候捕領域の絞込みは困難であると判断した (図 2 Eの上段) 。なお、地図上に示した、作成 ·使用した DNAマーカーの一覧を表 1および表 2に示す。 RGPにおいて公開されている候捕領域に相当する日本晴ゲノムシーケンス（DDBJ Ac No. : AP005307) の RiceGAAS (http V/ricegaas. dna. affix, go. jp/) によるァノテーション結果から、約 34 kbの領域内に 7つの蛋白質の存在が予測された（図 2 Eの下段）。 Puta tive TNP-l ike transposable element;^ 2つ、 hypothetical protein力 ^¾2つ、 no h itのものが 1つ、 putative polyprotein力 1つ、 C0NSTANS - l ike protein力 1つの計 7個である。このうち、 Putative TNP - l ike transposable elementおよび putat iv e polyproteinはイネゲノム中に多数存在するトランスポゾンであり、 hypotheti cal proteinは 2つとも非常に小さな蛋白質であるため、候補として可能性が低いと判断した。また、 No hitの蛋白質も非常に低分子量であるため、優先的に解析すべきでないと判断した。一方、唯一保存領域を持った蛋白質として、 C0NSTAN S - l ike蛋白質が予測された。この予測蛋白質はモチーフ様の領域を有しており、この領域の BLASTによる相同性検索の結果、植物で高度に保存されているモチーフであることが明らかとなった。モチーフは、 43個のアミノ酸残基からなり、 C0、 C0_like蛋白質おょぴ T0C1に共通に見られることから CCTモチーフと呼ばれている

(Strayer et al. (2000) Science, 289, 768-771) 。現在、多くの植物種で C0、 CO- like蛋白質のホモ口グぉよびオルソ口グが解析されており、この CCTドメインは核移行シグナルを含んでいることが確認されている（Robson et al. (2001) P lant J. , 28 (6)， 619—631、 Sun et al. (2001) Plant Cell, 13 (9)， 2053 - 206 1) 。また、核移行シグナル以外にも蛋白質 -蛋白質の相互作用に関与していることが推測されており (Kurup et al. (2000) Plant J.， 21 (2) , 143-155) 、機能的にも重要な領域であるとされている (Robson et al. (2001) Plant J. , 28 (6)， 619-631) 。さらに、これまで単離 .解析されている C0、 CO-like蛋白質、 T0C1 およびそのホモログは、ほとんどが花芽形成に関連した機能を持つことが知られている (Robert et al. (1998) Plant Mol. Biol. , 37 (5)， 763—772、 Liu et al.

(2001) Plant Physiol. , 125 (4) , 1821-1830) 。従って、 CCTドメインを持つこの予測された蛋白質が、花芽形成、イネにおいては出穂 ·開花を調節する機能を持つことが予想された。よって、この予測蛋白質をコードする遺伝子を Lhd4の有力な候補遺伝子であると判断し、この遺伝子の解析を行うことにした。

3 ) 候補遺伝子のクローニング

まず、予測された遗伝子が発現していることを確認するため、予測された 0RF 上でプライマ一を設計し、 RT - PCRを行った。 Kasalathの生育段階の異なる複数のサンプルから全 RNAを抽出した後、混合し、 mRNA Selective PCR Kit Ver. 1. 1 (TaKaRa社）のプロトコールに従い、 50°Cで 30分間の逆転写反応の後、 85°Cで 1 分、 50°Cで 1分、 72°Cで 1分のサイクルを 30回繰り返す PCRを行った。なお、使用したプライマーの塩基配列は、センスプライマー U1が 5' -GAT GAT GGG GAG AGC TTG AA_3，（配列番号： 4 8 ) 、アンチセンスプライマー L1が 5 ' - TCA TCT CGG CAT AGG CTT TT- 3' (配列番号： 4 9 ) である。 PCR産物をァガロース電気泳動した後、増幅されたバンドを切り出して GENECLEAN SPIN Kit (BI0 101社）で精製し、 pCR2. 1- T0P0ベクター（Invitrogen社）にサブクローニングした。 PCRで挿入断片の DNAを増幅し、 ExoSAP- IT (Amersham Biosciences社）で処理後、 DYEnamic ET Terminator reagent (Amersham Biosciences社)の £$ J心.プロトコ一ノレ ίこ従つ飞サイクルシーケンス反応を行い、 MegaBACElOOO DNA Sequencing System (Amersh am Biosciences社）で塩基配列を決定した。シーケンスを確認した結果、候補領域から転写された産物由来であることが確認された。次に、全長 cDNAを単離するために、 3， RACEおよび 5 ' RACEを行った。まず、 Kasalathから抽出した全 RNAを出発材料として、 ReverTraAce- a - (T0Y0B0社）のプロトコールに従い、逆転写反応には 01 i go (dT) ₂₀-P7アンカープライマー (5' - CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT-3' (配列番号： 5 0 ) ) を用いて、 cDNAを合成した。この cDNAを鍀型にして、 Taqボリメラーゼに Ampl iTaq Gold (Appl ied Biosy stems社）を、遺伝子特異的プライマーに U2 (5， - CAA GGA GAA GAG GAA GAA GAG G T - 3' (配列番号： 5 1 ) )、アンカー配列特異的プライマ一に Ρ7 (5' -CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC- 3 ' (配列番号： 5 2 ) )を使用し、 95°Cで 10分間の後、 9 4°Cで 30秒、 66°Cで 1分、 72°Cで 1分のサイクルを 40回繰り返し、最後に 72°Cで 7分間の 3， RACE - PCRを行った。さらに、この PCR産物の一部を鍀型にして、遺伝子特異的 nestedプライマーに U3 (5， - AGA AGA GGT GCT ACG AGA AGC AA- 3' (配列番号： 5 3 ) )をアンカー配列特異的プライマーに P7を用いて、前記の PCR条件で nes ted PCRを行った。増幅された cDNA断片の塩基配列を決定した結果、 3' UTR およびポリ A配列を含む目的とする cDNAの一部であることが確認された。 5 ' RACEは、同様に Kasalath全 RNAの複数のサンプルを混合したものを出発材料として、 GeneR acer kit with SSII RT, T0P0 TA Cloning (Invitrogen社）を用いて行った。具体的には、製造業者のプロトコールに従って全 RNA 5 gより cDNAを合成し、遺伝子特異的アンチセンスプライマーとして L3 (5， -TTT GGC GAA GCG ACC TCT CAC T-3' (配列番号： 5 4 ) ) センスプライマーとしてキットに付属の GeneRacer 5， Primerを用いて PCRを行った。 PCRには HotStarTaq (QIAGEN社）を用いて、 95°Cで 15 分間の活性化ステップの後、 94°Cで 30秒、 59°Cで 1分、 72°Cで 1分のサイクルを 40 回繰り返し、最後に 72°Cで 10分間の伸長反応を加える条件で行った。続いて、この PCR産物の一部を铸型として nested PCRを行った。遺伝子特異的アンチセンスプライマーとして L1 (5， -TCA TCT CGG CAT AGG CTT TT- 3' (配列番号： 4 9 ) ) および L4 (5， -TTT CTG GAC GCG TAC CGG ATT TG- 3' (配列番号： 5 5 ) ) を、センスプライマーとしてキットに付属の GeneRacer 5' Nested Primerを用いて、 Fi rst PCRと同様な条件で PCRを行った。 PCR産物をァガロース電気泳動した後、 EtB r染色を行い、メィンバンドを切り出して GENECLEAN SPIN Kit (BIO 101社）で精製し、 pCR2. 1- T0P0べクター (Invitrogen社）にサブクローニングした。このプラスミドを使用して、前記の方法に従い、挿入 DNA断片の塩基配列を決定した。以上、 3 ' RACEおよび 5 ' RACEにより、候補遺伝子の Kasalath由来 cDNA全長の塩基配列が決定された。なお、塩基配列の決定の際には PCRによる複製の誤りを避けるために、複数のクローンをシーケンスした。

4 ) シーケンス解析

决定した遺伝子の構造は、候補領域におけるァノテーションの結果から得られた遺伝子予測の結果とは大きく異なっていた。得られた全長 cDNA配列は、公開されている候補領域に相当する日本晴ゲノムシーケンス (DDBJ Ac No.： AP005307) と比較したところ、 2つのエタソン（444 bpおよび 327 bp) の間に、 1645 bpのィントロンが挿入した構造をとっていることが明らかとなった。また、ァノテーシヨンプログラムで予測された「no hit」の蛋白質は、実はこの遺伝子の 5 ' 末端側の一部を含んでいることが明らかとなった。さらに、 hypothetical protei n」の 1つは、この遺伝子の 5 ' 上流のプロモーター領域であると推測される領域に予測されており、よって、この 2つの予測遺伝子は候補から削除できるものと思われた。得られた全長 cDNAから推定されるァミノ酸配列を配列情報解析ソフトウェア DNASIS Pro (日立ソフトウェアエンジニアリング社）によって検索した結果、 257アミノ酸残基からなるポリぺプチドをコ一ドしていることが予測された , このポリぺプチドは BLASTによるホモロジ一検索の結果、カルボキシル末端近くに複数の植物種で単離されてレ、る C0NSTANSおよぴ C0NSTANS - like遺伝子にコードされた配列と相同性の高い領域が存在することが明らかとなったが、その他の領域に関しては相同性の高いものはなかった。ほしのゆめのアレルと比較するため. 予想されたコード領域を含む cDNAをほしのゆめから RT - PCRによって取得し、塩基配列を決定した。決定した日本晴、 Kasalathおよびほしのゆめの全長 cDNAのァラィメントを図 3および図 4に示した。さらに、ほしのゆめおよび Kasalathでこの遺伝子の転写領域に相当するゲノムシーケンスをウォーキング法によって決定した。 cDNAおよびゲノムの両方の塩基配列を比較 ·解析した結果、日本晴と Kasala thの間では 15個、ほしのゆめと Kasalathの間では 16個の SNP (single nucleotide polymorphism)が存在することが明らかとなつた。ほしのゆめと日本晴間では 1個であり、言い換えると、両品種が Kasalathとの間で検出された 15個の SNPは日本晴とほしのゆめとでは一致していた。明らかとなった SNPの位置を図 5に示す。 K asalathの cDNA配列をもとに推定したコード領域中には SNPが、日本晴と Kasalath の間では 5つ、ほしのゆめと Kasalathの間では 6つ存在するが、ほしのゆめの cDNA をアミノ酸に翻訳すると、この内の最初に出現する SNPによって第一ェクソン内で停止コドンが生まれ、推定されるポリペプチドは Kasalathのものと比べて非常に小さなものになった。推定された蛋白質のァライメントを図 6に示した。ほしのゆめの近縁種である日本晴では、この SNPはカサラス型に一致しており、このことから、ほしのゆめの予測蛋白質は Kasalathのものに比べて機能が低下あるいは消失したものになっていることが推察された。ところで、この遺伝子は候補領域内の S7012- S7028の間に位置していたが、この領域内での組換え個体が 2個体存在していた。そこで、この 2個体（個体番号： 36- 21および 52- 3) における組換え位置を確認するため、各組換え固定系統のゲノム DNAを铸型とし、 S7012- S7028間に設定した S7027、 S7023 (表 2 ) を用いて direct sequenceを行った。その結果 36 - 21は S7027c - S7023a間で、 52 - 3は S7023a- S7023b間で組み換わっていたことが明らかとなった。この 3つのマーカー（S7027c、 S7023aおよび S7023b) はイントロン内に位置していることから、これらの個体の発現遺伝子はェクソン 1とェクソン 2とで異なる親由来のキメラ遺伝子となっていることが予想された。実際に、組換え固定系統の全 RNAを出発材料にして RT- PCRにより cDNAを単離し、塩基配列を確認したところ、予想した通りのキメラとなっていることが確認された。このことが、連鎖解析の結果と矛盾しないことは容易に説明が可能であった。つまり、 Lhd4における遺伝子型は後代検定の判定結果ではニクソン 1の遺伝子型に一致しており、従って、この候補遺伝子が依然として候補となりうることが理解できた。よって、前記した連鎖解析の結果と推定された蛋白質の解析結果とを考え合わせると、この候補遺伝子が Lhd4の有力な候補であると判断した。

本発明で単離された Kasalath、日本晴およびほしのゆめの Lhd4のゲノム DNA配列をそれぞれ配列番号： 1、 4および 7に、 cDNA配列をそれぞれ配列番号： 2、 5および 8に、これら DNAがコードする蛋白質のァミノ酸配列をそれぞれ配列番号： 3、 6および 9に示す。

5 ) 発現解析

Lhd4候補遺伝子の発現を調べるために RT- PCRを行った。日本晴、ほしのゆめ、 Kasalath, NIL_Hd4、 Italica Livornoの各品種から播種後 10日目の幼苗、吸水 72 時間後の種子、成熟葉、開花期の穂、根をサンプリングし、公知の方法（Chomcz ynski et al. (1987)， Anal. Biochem. , 162, 156 - 159) により抽出した全 RNAから R everTraAce- α - (T0Y0B0社）を用いて cDNAを合成した。 Italica Livornoは、極早生タイプの熱帯ジャポニカに属する品種であり、 Lhd4遺伝子の機能が低下していることが予測され、遺伝子の発現量が他品種と異なる可能性が期待された。この cDNAを铸型として、プライマーにはイントロン領域を挟み込むように設計した U7 (センスプライマー「5， - CCT TCG TCT TCC CGC CGA GT- 3，（配列番号： 5 6 )」）および L7 (アンチセンスプライマー「5， - TCG CTG CGT CAG TGA ACG TG- 3' (配列番号： 5 7 )」 ) を用い、 HotStarTaq (QIAGEN社）で PCRを行った。 PCRは、 95。Cを 15分間の後、 94°Cで 30秒、 62°Cで 30秒、 72°Cで 30秒のサイクルを 40回繰り返し、最後に 72°Cを 10分間の条件を用いた。なお、 Lhd4の半定量的 PCRの前に、イネのァクチン遺伝子（DDBJ Acc. No. : X15865) を増幅するプライマー OsActinU 3 (5' -CTG GGT TCG CCG GAG GAT GAT- 3' (配列番号： 5 8 ) )および 0sActinL3 (5' - TGA GAT CAC GCC CAG CAA GG- 3，（配列番号： 5 9 ) ) を用いて RT-PCRを行レ、、各 cDNAサンプル量を平均化した。その際の PCRは、 AmpliTaq Gold (Applied B iosystems社）を用い、 95°Cで 10分間の後、 94°Cで 30秒、 58°Cで 30秒、 72°Cで 1分のサイクルを 28回繰り返し、最後に 72°Cを 7分間の条件を用いた。 PCR産物は、 3. 5% Nusieve GTG Agarose (BioWhittaker Molecular Applications社）で電気泳動し、 EtBrで染色することで増幅断片を検出した。その EtBr染色像を図 7に示す。その結果、 Italica Li vornoでは増幅断片自体が見られなかつたが、その他の各品種間では発現量に大きな違いは見られなかった。従って、 Italica Livorno以外は、この候補遺伝子のアレルの作用による品種間の形質の違いは、 mRNAの発現レベルで調節されたものというよりは蛋白質の機能の違いによるものであることが推察された。つまり、コード領域における塩基配列多型によって品種間で蛋白質の機能に変化を生じた結果であることが、その原因の一つとして考えられた。このことは、シーケンス解析の結果を支持するものである。また、 Ital ica Livo rnoは、遺伝子自体の発現が検出されなかったことから、この候補遺伝子の機能を完全に欠いた変異体である可能性が示唆された。それを裏付けるために、候補遺伝子 cDNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ほしのゆめ、日本晴および Kasalathではハイブリダイズしたバンドが検出されたが Italica Livornoではシグナルが得られなかった。従って、 Italica Livornoではこの遺伝子を含む染色体領域が欠損しているために、遺伝子の発現がなされていない可能性がある。

6 ) 形質転換体を用いた候補遺伝子の機能解析

(I) ベクターの構築上記のようにして絞り込んだ候補遺伝子が、実際に出穂に関して機能していることを確認、するために相補性試験を行った。すなわち、野生型の遺伝子であると考えられる Kasalath型のゲノム DNA断片を突然変異型の遺伝子を持つと推測されるほしのゆめに導入した形質転換体を作成し、表現型が野生型に回復するかどうかを確認した。まず、 Kasalathのゲノム DNA をもとに作成された BACライブラリ一から、候補領域をカバーする BACクローン 115 - B08を PCRによって選抜した（図 2 D) 。次に、この候補領域に相当する日本晴のシーケンスデータ力 ¾GPのホームページ (DDBJ Acc. No.： AP005307) 上で公開されていたので、そのデータを用いて DNASIS Pro (日立ソフトウエアエンジニアリング社）で制限酵素地図を作成した。制限酵素地図により候補遺伝子の転写領域を含み、かつ転写開始点より上流約 4 kbpを含むゲノム DNA断片約 8 kbpを制限酵素 Sea Iでべクタ一から切り出すことが可能であることが予想された。クローン 115-B08の大腸菌をクロラムフエ二コールが終濃度 12. 5 g/ml含む 500mlの LB培地に植菌し、 37°Cで一晚振とう培養し、遠心分離後に大腸菌のぺレットを得た。そのペレツトから、 Large-Construe t Kit (QIAGEN社) を用いてプラスミド DNAを回収し、制限酵素 Sea Iで処理し、パルスフィーノレド電気泳動で DNA断片を分画した。分画した DNAは、 Nylon - Membra nes, positively charged (Boehringer Mannheim社) ίこ製造業者のフロトコ一ノレこ従い、アルカリトランスファ一法で変性 '転写した。転写したメンブレンに対して、候補遺伝子 Lhd4のコード領域全長を含む cDNAをプローブとして ECL direct n uc eic acid labeling and detection system (Amersham Biosciences社) でサザンハイブリダイゼーションを行つた結果、約 8 kbpに位置する DNA断片に強くイブリダィズしたことから、このゲノム DNA断片内に確かに候補遺伝子が含まれていることが明らかとなった。そこで、このゲノム DNA断片を含むァガロースゲルを回収し、 GENECLEAN SPIN Kit (BIO 101社）を用いて DNAを精製 ·回収した。精製したゲノム DNAを、 pUC118 (TaKaRa社）の Hinc IIサイトに挿入し、大腸菌株 DH5 aを形質転換した。この大腸菌を培養し、 Large - Construct Kit (QIAGEN ）を用いてプラスミド DNAを大量調整した後、マルチクローニングサイトの Hinc II サイトの両側にある Kpn Iおよび Hind IIIで二重切断することでゲノム DNA断片を切り出した。 Kpn I、 Hind IIIサイトは揷入ゲノム DNA断片中に存在しないため、この過程を経ることにより両末端が Kpn I、 Hind IIIサイトに変換されたゲノム D NA断片が得られたことになる。なお、制限酵素処理の条件は、 10 _M gのプラスミド DNAに対して、 Kpn I (TaKaRa社）を ²0U、 Hind III (TaKaRa社）を 22. 5U使用し、 ΙχΜバッファーからなる 75 μ 1の反応溶液中で 37°C、 2時間の反応で行った。反応溶液を 1 XTAE緩衝液で調整したラージサイズの 0. 8% (W/V)ァガロースゲルで 30V、一昼夜泳動して DNAを分画した。このァガロースゲルからの DNAの回収は、分子量が大きレ、 DNAになるだけダメージを与えないために、以下の方法を用いた。まず、マーカー； L /Hind IIIを泳動したレーンと反応溶液をアプライしたスロットの端を含むゲルを切り落として EtBr染色し、脱色後に UV照射下においてパスッ一ルピぺッ卜で約 8 kbのバンドの位置にマークした。そして元のゲルと組み合わせてマークに対応する位置のゲルを剃刀で切り出し、透析膜 SnakeSkin, MWC0 3500 (PIERCE Biotechnology社）のチューブに回収した。少量の 1 XTAE緩衝液を加え、空気を抜いた後にチューブの端を閉じ、電気泳動装置にセットした。 80V、 5時間の条件で泳動した後、電極を逆にして 80Vで 30秒間泳動して DNAを透析膜から分離した。先の広いチップで溶液を回収し、 0. 5xTEを入れた 9 cmの丸シャーレに二トロセルロースフィルター， 0. 025 / . m (Millipore社）を浮かべ、そこにこの溶液を静かにスポットした。シャーレを氷上で 2時間静置し、 DNA溶液の緩衝液を置換した。さらに、 30% (W/V) PEG8000, 0. 5xTEを入れた 9cmの丸シャーレにフィルターを移動させ、氷上で 2時間 30分程度静置して DNA溶液を濃縮した。このフィルター上に濃縮された DNAを 1. 5mlチューブに回収し、バイナリーベクターとのライゲーシヨンに使用するまで ⁴°Cで保存した。一方、バイナリーベクター pPZP2H - la c (Fuse et al. (2001) Plant Biotechnology, 18， 219—222) の DNAも Kpn I、 Hin d IIIで二重切断し、上記と同様な精製方法で調整した。 pPZP2H_lacは選択マーカーとしてストレプトマイシンおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を有しており. ハイグロマイシン耐性遺伝子は LB (Left T-DNA border) -RB (Right T-DNA borde r)の間に配置されているため、それを用いて形質転換体を選抜できる。さらに、マルチクローニングサイトが pBluescript II (Stratagene社）由来の lacZ内にあるため、青白判定が可能となっている。以上の操作により得られたインサートおよびベクターのライゲーション反応は、 DNA Ligaton Kit Ver. 2 (TaKaRa社) の S olution Iを用いた。具体的には、 1. 1 μ 1のインサート DNA (150ng相当）、 0. 5 1のベクター DNA (45ng相当）に Solut ion Iを 2· 25 μ 1加え、滅菌ミリ Q水で全量が 4. 5 μ 1になるように調整した。この溶液を 16°Cで 2時間、 Water bath中で保温した後、 2 μ 1を使用して 100 1のコンビテントセル DH5 a (T0Y0B0社) を業者推奨のプロトコールに従って形質転換した。大腸菌の懸濁液を 50mg/lストレブトマイシン、 0. ImM IPTGおよび 0. 004% (W/V) X_galを含む LBプレートに播き、 37°C で一昼夜培養することで得られた白コロニーから、 PCRによってポジティブク口ーンを選抜した。 PCRは、 Taqポリメラーゼには Ampl iTaq Gold (Appl i ed Biosyst ems社）、 2つのプライマーセット C0L_end (5， - CTT CCA TGC ATA CAT CAC AC- 3 ' (配列番号 : 6 0 ) )と T7プロモーター (5， - GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C_ 3 ' (配列番号： 6 1 ) ) 、 COL-top (5， -TTT GAG AAC CCA CAA AAG AT- 3 ' (配列番号 : 6 2 ) ) と T3プロモーター (5， - ΑΑΤ ΤΑΑ CCC TCA CTA AAG GG- 3，（配列番号： 6 3 ) ) を用いて、 95°Cで 10分間の後、 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72。Cで 1分のサイクルを 35回繰り返し、最後に 72°Cで 7分間の条件で行つた。また、数クローン由来の PCR増幅産物を直接シーケンスし、正しい配列がクローン化されたことを確認した。さらに、ポジティブクローンからプラスミド DNAを精製し、 K pn I、 Hind I IIの二重切断によって、約 8 kbの断片が切り出されることを確認した。この Lhd4候補遺伝子のプロモーター及び構造遺伝子を含むと推測される約 8 kbpのゲノム DNA断片を含むプラスミドを PPZP2H- lac - 8kと命名し、以下に使用した（図 8 ) 。また、イネにおける候補遺伝子の過剰発現のためのベクターを構築した。バイナリーベクター pPZP2Ha3 (+) / (-）（Fuse et al. (2001) Plant Biotechnology, 18, 219-222)は、力リフラワーモザィクウィルス（CaMV) 35Sプロモータ一の下流に発現させたい遺伝子を挿入することが可能なマルチクローニングサイトがある。従つて、候補遺伝子を任意の方向に挿入することにより、アンチセンス RNA発現用あるいはセンス RNA発現用のベクター構築が可能である。 Lhd4候補遺伝子特異的プライマーに U5 (センスプライマー「5， -GAG CTC AAG TGA CCT CAC CTG CTA- 3 ' (配列番号： 6 4 ) J ) および L5 (アンチセンスプライマ一「5， - GTC AGT GGT ATA TAC GCA CTG TAA- 3 ' (配列番号： 6 5 )」 ) 、 Kasalath由来の全 RNAからの c DNAの合成には ReverTraAce- α - (T0Y0B0社）、 PCRには HotStarTaq (QIAGEN社）を用いて RT- PCRを行い、 Lhd4候補遺伝子由来の 894 bpの cDNA断片を得た。 PCRは、 95°Cで 15分間の後、 94°Cで 30秒、 59°Cで 30秒、 72°Cで 1分 30秒のサイクルを 40回繰り返し、最後に 72°Cで 10分間の条件で行った。この cDNA断片を pCR2. 1- T0P0 (In vitrogen社）へ TAクローニングし、ベクターの BamHIサイト側に U5プライマー配列がきている pCR2. 1-1を作成した。挿入した cDNA断片の配列が正しいものであることは、シーケンスによって確認した。 CR2. 1 - 1から BamHI-Xho Iの二重切断により切り出した断片を pPZP2Ha3 (+)の同様な部位へクローニングし、 _PPZP2Ha3 (+) - S - fullを構築した（図 9 ) 。

なお、 pPZP2H- lac- 8kに導入した Kasalathのゲノム配列は、日本晴のゲノム配列では PACクローン P0046 D03 (DDBJ Ac No. ： AP005307, 150554 bp)のゲノムシーケンス 66198-74131に相当する部分である。 _PPZP2Ha3 (+) -S-ful 1に導入した配列は、配列表の配列番号： 2において、塩基番号 124-1017に相当する。

(II) イネのァグロバタテリゥムによる形質転換

ベクターコンストラクトは、一端大腸菌 DH5ひ株に導入し、得られたコロニーから目的とする断片の揷入されているベクターを保持するクローンを PCRによつて選抜した。陽性クローンから QIAGEN Plasmid Mini Kit (QIAGEN社）を用いてプラスミド DNAを抽出 ·精製し、この DNAを用いてァグロパクテリゥム EHA101株に凍結融解法で導入した。すなわち、 100mlの YEP培地（l% (w/v) Bacto- Peptone、 l% (w /v) Bacto- Yeast extract, 5% (w/v) NaCl) を入れたバッフル付の三角フラスコに E HA101株を植菌し、 28°C、 205rpmの条件で振とう培養した。 0D₆。。が 0. 6近くになつたところで培養を止め、 50mlのチューブに移し、氷中で 10分間静置した。 4°C、 6 000rpm、 5分間の条件で遠心後、上清を捨て、 4°Cの 10mM Tris- HC1 (pH7. 5)を 12ml 加え、ペレットを懸濁した。再び、 4°C、 6000rpm、 5分間の条件で遠心後、上清を捨て、 1mlの YEP培地で懸濁し、 50 μ 1ずつ 1. 5mlチューブに分注して、液体窒素にて凍結させ、コンピテントセルのストツクとして- 80°Cで保存した。上記プラスミド DNA溶液の 2 μ g分と YEP培地で 25 μ 1に調整し、前記のコンビテントセル 50 1に加えて軽く混合し、氷中で 30分間静置した。 -80°Cの冷凍庫に 10分間入れて凍結させた後、 37°Cのインキュベータ一中に 25分間静置した。この凍結 ·融解の操作を合計 4回繰り返した後、 3. 75mlの YEP培地を入れた 50mlチューブに移し、 3 0°C、 120rpmで 2時間振とう培養した。室温、 6000rpm、 5分間の遠心後、上清を捨て、得られた菌体を 0. 5mlの YEP培地で懸濁した。この菌懸濁液 100 z 1を、 50mg/l のストレプトマイシン、 50mg/lのハイグロマイシンを含む ABプレートに播き、 2 8。C、喑所で 3日間培養した。形成されたコロニーを突付き、コロニ一ダイレクト PCRによってプラスミドが導入されていることを確認後、 50mg/lのストレプトマィシン、 50mg/lのハイグロマイシン含有の YEP培地に植菌して、 28°Cでー晚振とう培養することで菌を増幅し、終濃度で 15% (v/v)になるようにグリセ口ールを加えてストツクとして _80°Cで保存した。

ァグロバタテリゥム法によるイネへの遺伝子の導入、形質転換体の選抜および再分化は、公知とされているイネの形質転換法（参考「寺田および飯田：モデル植物ラボマニュアル (岩測雅樹 '岡田清孝 '島本功編，シュプリンガー ' フエ了ラーク東京） pp. 110- 121， 2000」、「Hiei et al. (1994) Plant J. 6： 271-28 2. J および「Toki et al. (1997) Plant Molecular Biology Reporter, 15 (1)， 1 6 - 21」 ) に従った。感染の対象としてほしのゆめを使用した。具体的には以下の手順に従った。完熟種子から小型籾摺り器で籾殻を除き、少量の Tween- 20を含む有効塩素濃度 2. 5%の次亜塩素酸ナトリゥム溶液中で 20分間、 lOOrpmで攪拌して殺菌した。滅菌水で 4回洗浄した後、カルス誘導（2N6)培地に播種し、 28°C、明所で 3週間培養してカルスを誘導した。一方で、コンストラクトを導入し、フリーズストツクしておいたァグロバタテリゥム EHA101を、終濃度 50mg/lのハイグロマイシンおよびストレプトマイシンを含むァグロ培養 (AB) 培地プレート上で 28°C、喑所で 3日間培養し、この菌体を 10m_g/lのァセトシリンゴンを含むァグロ感染（A AI) 培地に 0D₆。。が 0. 04になるように懸濁し、感染用のァグロパクテリゥム懸濁液を準備した。誘導したカルスは新鮮なカルス誘導（2N6) 培地上に移殖し、 3日間前培養した。カルスを茶漉しに集め、シャーレに入れたァグロパクテリゥム懸濁液に 3分間浸漬し、その後、余分な懸濁液を滅菌済みキムタオル上で除いた。ァグロバクテリゥムを感染させたカルスは、共存培養（N6C0)培地上に置き、 28°C、暗所で 3日間、共存培養した。ァグロパクテリゥムの除菌は、カルスを茶漉しに集め、シャーレに入れた滅菌水で数回洗浄した後、 500mg/lのカル'ベニシリンを含む滅菌水で 1回洗浄することにより行った。余分な洗浄水を滅菌済みのキムタオル上で除き、 500mg/lのカルべニシリンと 50mg/lのハイグロマイシンを含む選- 抜 (N6SE)培地上に置き、 28°C、照明下で 3週間培養した。その後、 500mg/lのカルベニシリンと 50mg/lのハイグロマイシンを含む再分化（MSRE)培地に移殖し、 28°C、照明下で 2週間培養し、これを 2回繰り返した。この間に、カルスからシュートおよび根が適度に分化してきた時点で、 50mg/lのハイグロマイシンを含む発根（MSR T)培地を入れた管ビンに移殖し、 28°C、照明下で培養を続けた。さらに、ハイグロマイシンに耐性を示して発根を続けた個体は、角型のポットに移殖して 1週間程度馴化させた後鉢上げした。この再生植物体を形質転換体実験用の隔離温室で栽培を続けて出穂させ、種子を回収した。

(III) 形質転換体イネによる機能解析 ( i) 相補性試験

イネ染色体への外来遺伝子の導入は、再分化植物体 (T。世代）から葉を一部サンプリングしてゲノム DNAを抽出し、それを鍀型とした PCRによって確認した。相補性試験用キメラ遺伝子の導入の確認には、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Hpt) 上で設計した HPT- p5 (5' -GAT CAG CAA TCG CGC ATA TG-3' (配列番号： 6 6 ) ) と CaMV35プロモーター上で設計した 35S_pl (5， -ACT ATC CTT CGC AAG ACC els' (配列番号： 6 7 ) ) のプライマーペア、ベクターコンストラタの際に使用した前記 COL-end (配列番号： 6 0 ) と T7 (配列番号 : 6 1 )、および COL- top (配列番号： 6 2 )と13 (配列番号： 6 3 ) の 3つのプライマーペアを使用した。センス RNA過剰発現用キメラ遺伝子の導入の確認には、 35S- piプライマー（配列番号： 6 7 ) と候補遺伝子特異的なプライマー L5 (配列番号： 6 5 ) の組み合わせを使用した。また、導入の確認とともに、コピー数を調べるためにサザンハイブリダィゼーシヨンを行った。各個体から CTAB法により抽出したゲノム DNA 2 μ _§を、相補性試験用キメラ遺伝子の導入の確認では制限酵素 Kpnlで、過剰発現用キメラ遺伝子の導入の確認では Hind IIIあるいは Dra Iで切断後、 0. 7% (W/V) ァガロースケゾレで分离佳し、 Nylon— Membranes, positively charged (Boehringer Mannheim社) に製造業者のプロトコールに従い、アルカリトランスファ一法で変性 ·転写した。ノヽィプリグイセーションは、 ECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Biosciences社) のプロトコ一ノレに従った。プローブには、 p PZP2Ha3 (- )のプラスミド DNAを錶型とし、 35S-pl (配列番号： 6 7 ) および HPT- p 5 (配列番号： 6 6 ) のプライマーペアを用いた PCRによって増幅される約 500 bp の DNA断片を使用した。その結果、再生 T。植物体における導入遺伝子のコピー数は、ほとんど力 ¾から 4コピーであり、 5から 6コピー検出された個体もあった。再分化 T。個体では、導入遺伝子は染色体にヘテロで組み込まれているため、その後代では分離する。従って、後代での解析を効率よく行うには、再分化当代で 1コピーのものを選抜しておき、次世代においてそのホモ系統を選抜して、導入遺伝子の分離しない固定系統を得ることが重要である。ゆえに、再分化してきたすベての個体を対象にサザンハイブリダィゼーシヨンを行い、 1コピーの個体を以下の解析に優先的に用いた。

相補性試験用に作成した形質転換体は、合計で 327個体得られた。これら遺伝子の導入された再分化当代における到穂日数を調査した。しかしながら、各種ストレスの影響が大きいためか、同調的 ·健全に生育した個体が少なく、正確な評価は行なえなかった。そこで、形質転換体の自殖種子を用いて再度、表現型の確認を行つた結果、コント口ールに比べて到穂日数が長くなつた個体とそうでない個体が分離したが、長くなつた個体では導入した遺伝子を保持していた（表 3 ) 。これは、 T。植物がへテロ体となつており、その後代である Ί\植物がメンデルの法則に従って、分離したためであると考えられる。以上の結果から、 Lhd4候補遺伝子として単離した遺伝子には到穂日数を調節する機能を有することが明らかとなつた。さらに、該遺伝子を用いて植物の出穂期を調節することが可能であることが確認された。

¾鰌 () ίίΒΒι

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ベクタ #46一一

栽培条件：ファイトトロン 1³.5時間明（28°C)/10.5時間暗（25°C) (-) / (+) ：外来遺伝子（Kasalathゲノム）断片が遺伝されたか（+) 、否か（-) を示す。

(i i) 35S :： S- full組換え植物を用いた機能解析

イネ植物体におけるセンス RNAの過剰発現による影響を調べた。まず、ほしのゆめの 35S : : S-full形質転換体 45個体から、全 RNAを抽出し、ノーザンハイブリダィゼーシヨンを行った。プローブには、導入した Lhd4遺伝子の cDNA断片を用いた。具体的には、緑葉から公知の方法 (Chomczynski et al. (1987) Anal. Bioche ra.， 162， 156-159) により全 RNAを抽出し、そのうちの 20 μ gをホルムアルデヒドを含む変性ァガロースゲル- (1. 2% (w/v) Agarose, 2. 2M ホルムアミド， lxMOPS (pH 7. 0) ) で泳動、分画した。 25分間の EtBr染色、 15分間の DEPC処理水での脱色後、 rRNAの染色像を写真撮影した。ナイロンメンブレン Hybond- N+ (Amersham Bi osciences社）への RNAのトランスファ一は、 10 x SSCを用いて一昼夜行った。メンプレンを 6 x SSC中で 1分間振とうした後、余分な SSCを濾紙で除き、 80°Cで 2時間の条件でベーキングすることで RNAを固定した。ハイブリダィゼーシヨンは、 A lkPhos Direct Label l ing and Detection System with CDP-Star (Amersham Bios ciences-社)を用いて、キット添付のプロトコ一ノレに'従って亍つた。

その結果、再分化当代 Τ。において、約 2分の 1の個体で導入遺伝子の強い過剰発現が確認された。なお、元々内在する Lhd4遺伝子の発現量は非常に少ないらしく、上記の条件のノーザンハイブリダイゼーションでは検出が不可能であった。当初、 T。の自殖後代である 1\世代を用いて検定を行う予定でいたが、驚いたことに強い過剰発現の見られた個体は、ベクターのみを導入した対照が出穂し、登熟する生育段階においても一向に出穂する兆候を示さなかった。これは、導入遺伝子による開花の抑制が、過剰発現でより強く作用している結果であると考えられた。従つて、出穂せず Ί世代の種子を回収できないまま枯死することが予想されたため、 Τ_η世代で検定を行うことにした。再分化してきたシユートを土に移植してから出穂するまでの日数を到穂日数として調査した。その結果、調査したすべての個体において到穂日数とノーザンハイブリダィゼーシヨンの結果とに強い相関があることが明らかとなった。つまり、ノーザンハイブリダイゼーションでシグナルの得られなかつた個体では対照と同程度の到穂日数で出穂したのに対し、強いシグナルの得られた個体では 100日を越えても出穂しなかった。（図 1 0 ) 。

以上、形質転換イネを用いた候補遺伝子の機能解析の結果から、限定した候補遺伝子は出穂期を制御する機能を有しており、また、この遺伝子を利用することで植物体の出穂期を人為的に調節することが可能であることが明らかとなった。よって、この遺伝子が本発明の目標としていた Lhd4遺伝子座の原因遺伝子であると結論した。産業上の利用の可能性

本発明により植物の開花を制御する遺伝子が提供された。本発明によれば、ィネにおいては出穂期を調節することができ、イネの品種育成に大きく貢献し得る。ィネの出穂期の調節は、栽培地域や栽培時期に適応したィネ品種育成に有用である。また、本発明の遺伝子を用いるイネの品種育成は、短期間で高い確実性をもつて目的の植物体を得ることができる点で、従来の方法より有利である。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（a) 〜（d) のいずれかに記載の植物の開花を遅延する機能を有する蛋白質をコードする DNA。

(a) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA。

( b ) 配列番号： 1または 2に記載の塩基配列のコ一ド領域を含む DNA。

( c ) 配列番号： 3に記载のァミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、揷入、および/または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA。

(d) 配列番号： 1または 2に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする DNA。

2. イネ由来である、請求項 1に記載の DNA。

3. 以下の（a) 〜（d) のいずれかに記載の DNA。

( a ) 請求項 1または 2に記載の DNAの転写産物と相補的なアンチセンス RNAをコードする DNA。

(b) 請求項 1または 2に記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNAをコードする DNA。

(c) 植物細胞における発現時に、 RNAi効果により、請求項 1または 2に記載の DN Aの発現を抑制する RNAをコードする DNA。

(d) 植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項 1または 2に記載の DNAの発現を抑制する RNAをコードする DNA。

4. 以下の（a) または（b) に記載の DNA。

5. 請求項 1〜4のいずれかに記載の DNAを含むベクター。

6. 請求項 1もしくは 2に記載の DNA、または該 DNAを含むべクターを有効成分 - 5

として含有する、植物の開花遅延剤。

7 . 請求項 3もしくは 4に記載の DNA、または該 DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物の開花促進剤。

8 . 請求項 1〜4のいずれかに記載の DNA、または請求項 5に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。

9 . 請求項 8に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。

1 0 . 請求項 9に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。

1 1 . 請求項 9または 1 0に記載の形質転換植物体の繁殖材料。

1 2 . 請求項 9に記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項 1〜4のいずれかに記載の DNAまたは請求項 5に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。

1 3 . 請求項 1または 2に記載の DNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の開花を遅延する方法。

1 4。植物体の細胞内における、内因性の請求項 1または 2に記載の DNAの発現を抑制することを特徴とする、植物の開花を促進する方法。

1 5 . 請求項 3に記載の DNAを植物に導入することを特徴とする、請求項 1 4 に記載の方法。

1 6 . 請求項 4に記載の DNAを植物に導入することを特徴とする、植物の開花を促進する方法。

1 7 . 植物がイネである、請求項 1 2〜1 6のいずれかに記載の方法。