CN104593369A - miR319a2在调节白菜叶球形状中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了miR319a2在调节白菜叶球形状中的应用。具体地，本发明提供了一种叶球形成相关基因BrpTCP以及调控该基因的微小RNA-miR319a2。本发明人首次发现，miR319a2能调节白菜叶片的细胞分裂，从而调控白菜叶球形状。本发明不仅提供了miR319a2、或miR319a2的拮抗剂、或miR319a2的激动剂的用途，还提供了一种改良白菜品种的方法。本发明可针对性地调节叶球形状从而对白菜等作物进行品种改良，例如用于增大白菜叶片面积与叶球体积。

Description

miR319a2在调节白菜叶球形状中的应用

技术领域

本发明属于作物遗传学领域，具体地，本发明涉及miR319a2在调节白菜叶球形状中的应用。

背景技术

现今农业上的蔬菜品种从食用部位来看，可以分为叶类蔬菜，根茎类蔬菜和果实类蔬菜。其中在叶类蔬菜中，叶球类蔬菜是一个重要的组成部分，其中较为常见的有结球白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)，结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L)和结球生菜(Lactuca sativa var.capitata L.)。结球白菜(又称大白菜)，是亚洲地区传统的蔬菜作物

叶球作为该类蔬菜的储存器官，是其可食用部分，具有重要的农业价值和商品价值。从形态上看，叶球是一种变态器官，由轮生的叶片相互抱合而成，叶子向内弯曲是叶球发生的显著特征。

已经知道，许多因素会影响植物叶球的发生和发育过程。生长素在叶片内的不均衡分布、较低的温度和较大的昼夜温差、弱光、短日照以及充足的碳素营养都可以促进叶球的发生和发育。因此，叶球的发生是一个复杂的生物学过程，是在环境因子诱导下的形态学反应。在此过程中表达的基因是调控植物接受外界信号和展开发育活动的关键环节。

以大白菜为例，在栽培条件下，大白菜需要一个长时间的营养生长来形成叶球，通常这个时期可以分为4个部分：幼苗期，莲座期，包心期和结球期，通过叶形态的特点来划分。在幼苗期，幼态叶生长并分化为成熟叶；在莲座期，展开的叶片通过提供光合作用产物的方式辅助叶球形成。包心的叶片分化并向内弯曲为叶球形成提供架构和遮蔽，而叶球的叶片紧紧地围绕茎尖形成储存营养物质的叶球。

由于叶球是大白菜的主要食用器官，因此大白菜叶球发育的好坏决定了大白菜的品质和农业价值。我国育种家采用传统的育种方法广泛开展大白菜类蔬菜品种的选育工作，扩大资源来源途径，开展多种品种间的杂交组合，一定程度提高了白菜类蔬菜叶球性状，并选育了大量抗虫抗病，快速生长的品种，在生产上已经发挥了作用。然而，传统的育种学在原有的基础上进行品种的优选优育，但由于现有品种的局限性，传统的配置杂交组合的育种方法受到了一定的限制性，为了适应农业生产的需要，采用新的技术手段来开发更为早熟，结球品种更为多样化的的大白菜品种变得日益重要。此外，除了大白菜以外，对结球甘蓝，结球生菜等其他叶球类蔬菜的叶球农业性状的改良，也具有十分重要的意义。

microRNA(miR或miRNA，微小RNA)是一类在较高等的真核生物体内广泛存在的，长度约18-26个碱基的单链RNA分子。它可以通过碱基配对原则特异性地与一些mRNA上的靶位点相结合，引起靶mRNA降解或翻译抑制，进而在转录后水平对靶基因进行调控。

microRNA来源于长度约1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60-80nt的具有茎环结构的miRNA前体。前体miRNA转运至胞质后，被进一步切割成长约18-26nt的双链miRNA。双链miRNA解开后，成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其表达。尽管microRNA在细胞总RNA中所占的比重很小，但由于它可以高效地对所有具有靶位点的mRNA产生调控作用，microRNA在农作物品质改良中所起的作用不可小视。

迄今为止，本领域对于影响白菜叶片和叶球形状性状相关的基因或调控机理了解甚少，因此本领域迫切需要开发调节白菜叶球形状的物质及其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种可调节白菜叶球形状的物质、手段及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种微小RNA-miR319a2，所述的miR319a2具有如SEQ ID NO.:1所述的序列。

在本发明的第二方面，提供了一种用于产生本发明第一方面所述的微小RNA-miR319a2的多核苷酸，所述的多核苷酸是序列如SEQ ID NO.:3所示的编码序列。

在本发明的第三方面，提供了一种miR319a2、或miR319a2活性片段、或miR319a2的拮抗剂、或miR319a2的激动剂的用途，它们被用于调控白菜叶片的细胞分裂和/或调控白菜叶球形状。

在另一优选例中，所述的白菜包括大白菜、小白菜、甘蓝、生菜。

在另一优选例中，所述的大白菜选自下组：结球白菜(Bre)。

在另一优选例中，所述的调控白菜叶片的细胞分裂是指：调控白菜叶片的细胞分裂速度。

在另一优选例中，所述的调控白菜叶片的细胞分裂是增强白菜叶片的细胞分裂速度。

在另一优选例中，所述的调控白菜叶球形状是指：调控白菜叶球形状的叶球高度、叶球直径、以及叶球指数(即叶球高度直径比)。

在另一优选例中，所述的miR319a2具有如SEQ ID NO.:1所述的序列：

5'-UUGGACUGAAGGGAACUCCCU-3'(SEQ ID NO.:1)。

在另一优选例中，所述用途还选自下组：还包括调控白菜的叶边缘结构、调控白菜的叶面泡状结构、调控白菜的茎尖(顶端分生组织)的发育、或其组合。

在另一优选例中，所述miR319a2的拮抗剂包括与miR319a2结合的海绵体、反义寡聚核苷酸(如SEQ ID NO.:1的反义序列)、锁核酸、或抑制miR319a2表达的物质。

在另一优选例中，所述的拮抗剂是序列如SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列；或由SEQ ID NO.:2序列的串联形成的海绵体。

在另一优选例中，所述miR319a2的激动剂为：促进miR319a2高表达(或超表达)的物质。

在本发明的第四方面，提供了一种调控白菜叶球形状的方法，所述方法包括步骤：将表达miR319a2的表达载体导入所述白菜，从而在转基因的白菜中表达miR319a2。

在另一优选例中，所述方法还包括：对所述转基因的白菜，进行叶球形状测定，并与野生型白菜的叶球形状进行比较。

在另一优选例中，所述方法还包括：对所述转基因的白菜，测量BrpTCP基因的表达水平。

在另一优选例中，所述的叶球形状测定包括测量叶球高度、叶球直径、以及叶球高度直径比。

在另一优选例中，所述的叶球形状测定包括测量白菜的叶边缘结构、或调控白菜的叶面泡状结构。

在另一优选例中，所述方法还包括：对于选出的叶球形状发生变化(或预定变化)的白菜，测定其生长速度，从而挑选出改良的白菜品种。

在本发明的第五方面，提供了一种载体，所述的载体携带表达本发明第一方面所述的微小RNA-miR319a2的核酸序列。

在另一优选例中，所述的核酸序列是序列如SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的载体为表达载体。

在本发明的第六方面，提供了一种植物细胞，所述的植物细胞含有本发明第五方面所述的载体，或者其基因组中整合有表达本发明第一方面所述的微小RNA-miR319a2的核酸序列。

在另一优选例中，所述的植物细胞是叶球类植物细胞，较佳地是白菜的细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了拟南芥与大白菜的Brp-MIR319a和BrpTCP基因家族序列比对分析。其中包括At-miR319a、Brp-miR319a1和Brp-miR319a2等序列。

图2显示了结球白菜不同叶球的表型以及miR319a2基因对白菜叶球形态的影响。其中，图2A-2H为从结球白菜-不结球白菜重组自交系F6代植株中分离的四种大白菜叶球表型。(2A)圆形叶球白菜，及其叶球(2E),(2B)椭圆形叶球白菜，及其叶球(2F),(2C)圆柱形叶球白菜，及其叶球(2F),(2D)圆锥叶球白菜，及其叶球(2F),(2I)野生型大白菜品系Bre，及其叶球(2J)和顶端分生组织横切面(2K),(2L)Bre与319a2转基因大白菜球叶，(2M)Brp-MIR319a2转基因大白菜株系319a2-2，及其叶球(2N)和顶端分生组织横切面(2O),(2P)319a2转基因大白菜叶边缘融合现象，及其切片(2Q)。

图3显示了转基因大白菜319a2的表型。(3A)野生型和转基因大白菜319a2中miR319a的Northern杂交,(3B)野生型和转基因大白菜319a2中BrpTCP4基因表达分析，(3C)野生型和转基因大白菜319a2在子叶期，幼苗期和结球期的表型，(3D)野生型和转基因大白菜319a2球叶叶面积统计，(3E)野生型和转基因大白菜319a2中莲座叶的表型，(3F)野生型和转基因大白菜319a2中排水管和叶脉分布。

图4显示了转基因大白菜319a2的细胞学分析以及miR319a2通过影响细胞分裂影响叶球的形态。(4A)野生型和转基因大白菜319a2的叶表皮细胞形状，(4B)野生型和转基因大白菜319a2的叶表皮细胞大小统计结果，(4C)野生型和转基因大白菜319a2的莲座叶和球叶的表型。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一种作为miR319家族的新成员，该新成员是微小RNA-miR319a2。所述的微小RNA-miR319a2能有效调节白菜叶片的细胞分裂和/或调控白菜叶球形状。具体地，本发明的实验证明，miR319a2具有增强其功能的点突变，因而能够更强地抑制BrpTCP基因的的表达，从而影响大白菜叶球的形态，如导致叶球高度直径比增加等。基于该发现，本发明不仅提供了miR319a2、或miR319a2活性片段、或miR319a2的拮抗剂、或miR319a2的激动剂的用途，还提供了一种改良白菜品种的方法。

术语

如本文所用，术语“319a2转基因大白菜”、“转基因大白菜319a2”或“大白菜319a2”可互换使用，指Brp-MiR319a2过量表达的转基因大白菜。

miRNA及其前体

本发明提供了一类涉及与白菜叶球形状中相关的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA为miR319a2，其序列为：5'-UUGGACUGAAGGGAACUCCCU-3'(SEQ ID NO.:1)。本发明还包括miR319a2的变体和衍生物，本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miR319a2进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：烃基修饰、糖基化修饰、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰等。其中，糖基化的修饰基团包括：2-甲氧基-糖基、烃基-糖基、糖环基等。为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被宿主细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的miR319a2的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

用途

本发明还提供了miR319a2、或miR319a2活性片段、或miR319a2的拮抗剂、或miR319a2的激动剂的用途，它们被用于调控白菜叶片的细胞分裂和/或调控白菜叶球形状。

一种优选的调控白菜叶片的细胞分裂是调控白菜叶片的细胞分裂速度，尤其是通过使用miR319a2来增强白菜叶片的细胞分裂速度。

一种优选的调控白菜叶球形状是调控白菜叶球形状的叶球高度、叶球直径、以及叶球高度直径比。此外，本发明的用途还包括(但并不限于)：调控白菜的叶边缘结构、调控白菜的叶面泡状结构、调控白菜的茎尖(顶端分生组织)的分裂。

在本发明的优选例中，所述miR319a2的拮抗剂为可与miR319a2结合的海绵体(sponge)，例如序列如SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO.:2序列的串联形成的海绵体。

白菜改良

本发明还提供了一种改良白菜品种的方法，所述的改良包括：增加白菜叶片的细胞分裂、和/或调节或改变白菜叶球形状，包括步骤：将表达miR319a2的表达载体导入所述白菜，从而在转基因的白菜中表达miR319a2。一旦在白菜内表达miR319a2，则miR319a2会抑制BrpTCP的表达和功能，从而影响叶球的形状。

在一优选例中，所述方法还包括：对所述转基因的白菜，进行叶球形状测定，并与野生型白菜的叶球形状进行比较。

在另一优选例中，所述方法还包括：对所述转基因的白菜，测量BrpTCP基因的表达水平。

在另一优选例中，所述的叶球形状测定包括测量叶球高度、叶球直径、以及叶球高度直径比。

在另一优选例中，所述的叶球形状测定包括测量白菜的叶边缘结构、或叶面泡状结构。

在另一优选例中，所述方法还包括：对于选出的叶球形状发生变化(或预定变化)的白菜，测定其生长速度，从而挑选出改良的白菜品种。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明提供了与白菜叶球形状相关的微小RNA(microRNA)—miR319a2；

(2)本发明还提供了一种有针对性地调节白菜叶球形状从而对白菜作物进行品种改良的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

Brp-miR319a2改变大白菜叶球形状

在长期研究过程中，本发明人发现了一种特定的大白菜品种，其叶球为近似圆型。

通过对大白菜品种的基因组重测序和RNA测序，本发明人在结球白菜(Bre)的基因组序列中发现了一个带有点突变的miR319a家族成员，该新成员被命名为Brp-MIR319a2(简称为“miR319a2”)，其序列如SEQ ID NO.:1和图1所示。

与miR319a相比，该Brp-MIR319a2基因具有一个G→A的核苷酸点突变(图1)，该突变导致miR319a2与白菜靶基因(BrpTCPs)序列之间的互补性增强，从而造成BrpTCP基因表达水平的降低(与仅表达野生型miR319a的白菜相比)。

所述点突变是首次发现的，而在其他已经报道的大白菜(Chiifu品种)或其他植物基因组序列中没有发现。

对表达内源性miR319a2的大白菜形态进行观察，并与野生型白菜相比。所述表达内源性miR319a2的大白菜的叶球形状存在以下特点：野生型白菜叶球形状为圆形，转基因白菜叶球形形状为圆锥形，顶部较尖。在大小上，转基因白菜的长宽皆大于野生型白菜。

实施例2

靶基因BrpTCP的突变也导致叶球形状发生类似的变化

结球白菜的叶球可以分为四种类型：圆形，椭圆形，扁形和圆柱形(图2A-2H)。结球白菜(Bre)具有圆形的叶球(图2I，2J)。对结球白菜Bre(购自中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所)和不结球白菜(Wu-11)(购自中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所)进行杂交，从杂交一代开始自花授粉，连续6代，获得几乎纯合的F6代重组自交系。叶球形状的观察中发现，F6代的株系中，共有58个株系能够形成叶球，所形成的叶球在形态具有上述提到的四种类型(图1，A-H)，说明白菜叶球的形状可能是是一种数量性状。

利用Real time PCR，对这58个具有叶球的株系做了BrpTCP4基因表达水平的检测。结果发现，圆形的株系具有比其他株系更低的TCP4表达水平，同时也具有皱褶的叶边缘，说明BrpTCP4的表达水平和叶球的形态具有相关性。

实施例1和2的结果提示，可通过对BrpTCP基因的调控，针对性地对大白菜的叶球形状进行改良，例如，通过miR319a2进行调控，降低或增高BrpTCP4基因的表达量，可以改变大白菜的叶球形状。

实施例3

转入miR319a2可改变叶球形状

在本实施例中，834bp长度的Brp-MIR219a2的基因组片段(SEQ ID NO.:3)插入到pCAMBIA3301载体(购自CAMBIA，Australia公司)中，并通过CaMV35S启动子驱动。

方法如下：

利用Brp-MIR319a2基因特异引物，引物序列如下：

BrpMIR319a2-S:CCCAAGGAGTTTGCAACTACG(SEQ ID NO.:4),

BreMIR319a2-A:GGTGACACGCCAGCTTGAA(SEQ ID NO.:5)，

以用常规方法抽提的Bre白菜(购自中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所)的基因组DNA为模板，通过PCR扩增出长度为834bp的片段，通过限制性内切酶BamHI和SalI酶切，构建到市售的pCAMBIA3301载体中，并通过花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S驱动。

将上述制备的载体，对Bre品种的大白菜进行遗传转化，方法采用春化抽滤法(参见Bai J,Wu F,Mao Y,He Y2013.In planta transformation ofBrassica rapa and B.napus via vernalization-infiltration methods.Protocol Exchange,doi:10.1038/protex.2013.067)。将开花的Bre植株浸没在含有Brp-MIR319a2载体的农杆菌转化液中，通过真空抽滤法进行转基因。转化子的选择是将种子播种于含有30mg/L的除草剂草丁膦(ppt)上。对该除草剂具有抗性的阳性植株移栽至温室中继续生长，并自花授粉3代以获得纯合的转基因植株。

结果

通过农杆菌介导的真空抽滤法，本发明人获得了具有增强功能性点突变的Brp-MiR319a2过量表达的转基因大白菜(该转基因大白菜简称为319a2)(图2J,2N)。

得到的3个具有PPT抗性的转基因株系。这3个T1代株系通过自花授粉得到3个T2群体，在抗性培养基上，这3个群体均有3/4以上的植株具有抗性，说明至少有一个的p35S::Brp-miR319a2转入至Bre的基因组中。

Northern杂交实验表明，miR319a过量积累，即miR319a2的水平得到了明显的提高，而BrpTCP的表达水平则明显下降(图3A,3B)。

319a2的叶球的形态发生了改变。相对于野生型Bre中圆球形的叶球形态，319a2的叶球形态是圆锥形的。野生型白菜的叶球顶部是闭合的，而319a2具有一个开放的叶球顶部(图2I,2M)。在叶球大小上，319a2的叶球大于野生型白菜，其中直径比野生型长约为1.6cm，叶球高度比野生型高约4cm，叶球指数(高度比直径)是2.62，大于野生型。说明Brp-MiR319a2MIR319a2能促进白菜的叶球生长，并且对白菜叶球高度的促进要大于直径(图2K，2J，2O，2N)。因此改变了Bre大白菜叶球高度和叶球直径的比例，从而改变了叶球的形状(表1)。

表1野生型和Brp-MIR319a2转基因大白菜成熟叶球参数

叶球参数	野生型	319a2-1	319a2-2	319a2-3
					直径(cm)	16.10±1.4	16.92±1.5	17.70±1.6	17.98±1.8
高度(cm)	17.23±1.6	44.42±6.0	46.37±6.3	48.37±6.9
					重量(kg)	1.12±0.09	1.28±1.2	1.31±1.3	1.36±1.5
高度-直径比	1.07±0.12	2.53±0.25	2.62±0.29	2.82±0.28

注：319a2-1、319a2-2、319a2-3分别表示3个转基因大白菜319a2的株系。

此外，转基因植株的球叶的卷曲形态也发生了改变，其纵向的卷曲程度降低，这是由于转基因植株球叶在纵向上的生长被增强的结果(图2L)。显微切片发现，319a2的茎尖(顶端分生组织)比野生型要长的多(图2K,2O)。此外，还在球叶中发现319a转基因白菜具有叶边缘融合的现象(图2P,2Q)。

转基因白菜的叶发育也发生了改变，转基因白菜的子叶期叶片变大，叶边缘不平整，在莲座期，叶边缘的不平整变得更为严重，同时叶脉也增多了，在结球期，叶边缘变得非常皱褶，而此时野生型白菜则呈现略微皱褶的表型。在叶的大小上，转基因白菜各时期叶面积都要大于同时期的野生型(图3C,3D)。进一步的叶片显微观察则发现，319a2转基因白菜的叶面上的泡状程度加剧，叶脉和出水孔的数量都比野生型要多(图3E,3F)。这些结果说明，miR319a2通过改变影响叶发育从而影响叶球大小和形状。

实施例4

319a2转基因白菜的叶片细胞分裂得到增强

对实施例3中制备的319a2转基因白菜进行扫描电子显微镜观察。

结果发现，它的叶表皮细胞小于野生型白菜，细胞越小，说明细胞分裂越旺盛(图4A)。同时，319a2总的叶面积要大于野生型(图4B)，因此总的细胞数目，319a2要大于野生型白菜。这个结果说明在319a2过表达的白菜中，细胞分裂被增强了(图4B,4C)。

这种增强的细胞分裂改变了白菜球叶的大小和形状，从而改变了叶球的形态。说明Brp-MIR319a2是一个对白菜叶球形状具有重要作用的基因位点。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种微小RNA-miR319a2，其特征在于，所述的miR319a2具有如SEQ ID NO.:1所述的序列。

2.一种用于产生权利要求1所述的微小RNA-miR319a2的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是序列如SEQ ID NO.:3所示的编码序列。

3.一种miR319a2、或miR319a2活性片段、或miR319a2的拮抗剂、或miR319a2的激动剂的用途，其特征在于，它们被用于调控白菜叶片的细胞分裂和/或调控白菜叶球形状。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的调控白菜叶片的细胞分裂是指：调控白菜叶片的细胞分裂速度。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的miR319a2具有如SEQ IDNO.:1所述的序列:

5'-UUGGACUGAAGGGAACUCCCU-3'(SEQ ID NO.:1)。

6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述用途还选自下组：还包括调控白菜的叶边缘结构、调控白菜的叶面泡状结构、调控白菜的茎尖(顶端分生组织)的发育、或其组合。

7.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述miR319a2的拮抗剂包括与miR319a2结合的海绵体、反义寡聚核苷酸(如SEQ ID NO.:1的反义序列)、锁核酸、或抑制miR319a2表达的物质。

8.一种调控白菜叶球形状的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将表达miR319a2的表达载体导入所述白菜，从而在转基因的白菜中表达miR319a2。

9.一种载体，其特征在于，所述的载体携带表达权利要求1所述的微小RNA-miR319a2的核酸序列。

10.一种植物细胞，其特征在于，所述的植物细胞含有权利要求9所述的载体，或者其基因组中整合有表达权利要求1所述的微小RNA-miR319a2的核酸序列；

较佳地，所述的植物细胞是叶球类植物细胞，更佳地是白菜的细胞。