CN111334516A - 一种分离的生菜LsKN1基因及其在控制生菜结球性状中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种分离的生菜LsKN1基因及其在控制生菜结球性状中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及一个插入在结球基因LsKN1第一个外显子中的CACTA转座子。通过农杆菌介导转化不结球生菜的结果表明，LsKN1能够使不结球生菜叶片向内发生弯曲，产生结球表型。LsKN1是生菜中鉴定到的第一个控制结球性状的基因，为植物结球的机理研究开辟了新的方向，同时也为结球蔬菜的品种选育提供了基因资源和理论指导。

Description

一种分离的生菜LsKN1基因及其在控制生菜结球性状中的 应用

技术领域

本专利属于植物工程技术领域。具体涉及一种分离的生菜LsKN1基因及其在控制生菜结球性状中的应用。

背景技术

莴苣属于菊科莴苣属，原产于地中海地区，是重要的蔬菜作物。依据其不同的形态，莴苣可以进一步划分为不同的园艺类型，包括结球莴苣、散叶莴苣、奶油莴苣、罗马莴苣、油用莴苣及莴笋等。叶用莴苣也被统称为生菜。结球生菜是一类非常重要的叶用生菜，其特征表现为叶片向内卷曲、相互包裹，从而形成一个由叶片组成的球状结构。相对于其他生菜，结球生菜具有更好的口感体验，从而备受消费者的青睐。世界范围内，结球生菜的产量占所有生菜总量的一半，因而具有非常重要的经济价值。2017年，生菜基因组测序完成，为生菜不同农艺性状基因的克隆及其功能研究提供了便利。

申请人发现，生菜结球是一个由多基因控制且受多种环境因素影响的复杂性状。到目前为止，生菜结球性状的遗传规律以及控制结球性状的基因均未被报道过。因此，对控制生菜结球性状基因的克隆及对其作用机理的解析具有重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种分离的生菜LsKN1基因，所述基因为SEQ ID NO.1所示，其CDS序列为SEQ ID NO.3所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.4所示。

本发明的另一个目的在于提供了生菜LsKN1基因在制备结球生菜中的应用。

本发明的还有一个目的在于提供了一种增强生菜LsKN1基因表达的转座子，其序列为SEQ ID NO.2所示。该序列为一个长度3935bp的CACTA转座子，该转座子在结球基因LsKN1中的插入位置为基因起始密码子后第96个与第97个碱基之间，该转座子可以行使启动子功能，增强LsKN1基因的表达，从而导致结球表型。

本发明还有一个目的在于提供了上述转座子在制备结球生菜中的应用。

本发明的最后一个目的在于提供了N端截短的生菜LsKN1蛋白在制备结球生菜中的应用，所述的截短生菜LsKN1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

生菜结球性状相关基因LsKN1的获得：

本发明通过利用罗马生菜(Lactuca sativa var.longifolia，此类生菜表现为不结球)与结球生菜(Lactuca sativa var.capitata，此类生菜表现为结球)进行杂交获得F₁代后，进一步自交获得F₂代。利用F₂代群体，联合BSR-seq和传统遗传定位方法，对控制生菜结球性状基因进行定位。对定位区间进行基因注释及差异表达基因分析，确定了候选基因，成功克隆了控制生菜结球性状的关键基因LsKN1。该基因编码一个含有同源异域结构域的转录因子，属于KNOXI家族。在绝大数植物中，该基因只有一个拷贝，且只在植物的顶端分生组织中表达，对植物顶端分生组织的维持及防止干细胞的过早分化中起着关键的调控作用。进化分析发现，该基因在生菜基因组中发生了一次复制，并且在此基础上，一个长度为3935bp的CACTA转座子插入到该基因的第一个外显子上，从而使该基因的表达模式发生了重大改变并且能够在叶片中大量表达，引起叶片向内弯曲并包裹成叶球。LsKN1与其等位基因的区别就在于第一个外显子中有无CACTA转座子的插入。

LsKN1基因序列为SEQ ID NO.1所示，插入的转座子序列为SEQ ID NO.2所示，CDS序列为SEQ ID NO.3所示，编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO.4，编码380个氨基酸。

结球基因LsKN1在生菜结球中的应用，利用本领域的常规方式，将LsKN1(SEQ IDNO.1所示)在不结球生菜中表达，可以使转基因植株叶片向内弯曲、包裹，并完全恢复结球表型；或者将部分CDS序列(SEQ ID NO.5所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.6所示)在不结球生菜中超量表达，也可以恢复结球表型，该基因可以用于莴苣属生菜遗传改良及进行新品种培育的应用。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次提出了一个控制生菜结球性状的必需基因，该基因作为首个克隆的结球基因，对结球生菜乃至其它结球蔬菜叶球形成机制的解析具有重要的理论意义。此外，到目前为止，LsKN1基因也从未报道过参与任何植物的结球表型。该基因可以为菊科莴苣属叶用莴苣提供新的基因资源，有利于培育出新的生菜品种。

附图说明

图1：结球基因LsKN1可以互补生菜的结球表型。

其中：(a)不结球生菜NHG，LsKN1com#1及LsKN1com#2为LsKN1转基因互补植株，转基因受体材料为不结球生菜NHG。红色箭头代表叶球。标尺为5cm。

(b)转基因植株LsKN1com#1T1代单株基因型与表型分析。H代表结球表型；N代表不结球表型。扩增出条带的孔道代表含有LsKN1转基因插入的植株；无扩增条带的孔道代表无LsKN1转基因插入的植株。

图2：过表达LsKN1基因产生生菜结球表型。

其中：NHG为不结球生菜，用于LsKN1过表达的受体。LsKN1OE#1,LsKN1OE#2及LsKN1OE#3为LsKN1基因的过表达植株。红色箭头代表叶球，标尺为5cm。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

生菜结球基因LsKN1的获得：

1.生菜结球表型的遗传分析

为分析生菜结球性状的遗传规律，本发明采用结球生菜(表型为结球)与罗马生菜(表型为不结球)进行杂交获得F₁，进一步自交，获得F₂代群体。对F₂代个体进行结球表型评估、记录及统计分析，发现F₂群体中结球表型表现为连续分布的数量遗传性状，暗示生菜的结球表型为由多基因控制的复杂性状。

2.LsKN1基因的图位克隆

为克隆上述群体中控制生菜结球性状的关键基因，本研究采用了BSR-seq的分析方法。从F₂群体中选取结球单株20株和完全不结球单株20株，取相同生长部位及大小的叶片混合后磨样，提取两个混池的总RNA，并进一步采用Illumina对RNA进行测序。将RNA测序数据比对到生菜参考基因组上，采用SAMtools对两个混池进行SNP分析，并计算Δ(SNP-index)平均值，采用perl脚本对Δ(SNP-index)平均值进行图形展示。结果表明，在生菜七号染色体的前端有一个峰，即此位置存在一个对结球性状具有贡献的遗传位点。借助分子标记，我们筛选到一个由该位点控制且结球表型符合孟德尔单基因分离规律的F_2:3亚群体，并且将LsKN1基因初步定位于YHP003(5.87Mb)至YHP040(33.39Mb)之间。进一步扩大上述群体的种植和分子标记的开发，最终我们将LsKN1基因定位于YHP049(18.54Mb)至YHP053(18.99Mb)之间约500Kb的范围内。对该区间序列进行注释分析发现，该区间共编码11个基因，其中基因LG7600774在两个混池中存在显著的差异表达，因此，我们将该基因作为结球基因LsKN1的候选基因。通过Sanger测序分析发现，相对于不结球亲本lskn1基因(CDS序列SEQ ID NO.3，氨基酸序列SEQ ID NO.4)，结球生菜LsKN1基因(基因序列为SEQ ID NO.1)的第一个外显子中存在一个长度为3935bp的CACTA转座子(SEQ ID NO.2)的插入。由于该转座子的插入，增强了LsKN1基因的表达，从而导致生菜的结球表型。

实施例2：

结球基因LsKN1在生菜结球中的应用

从结球亲本中扩增LsKN1基因的全长序列，引物是：LsKN1com F:GACCTGCAGGCATGCaagcttTGTCTGTTTCTTCTACCCAA；LsKN1com R:GCTGGTCACCTGTAATTCAcacgtgGTGTTCTTTATTTTCTACTA，扩增出的目的片段包括SEQ ID NO.1所示序列，通过同源重组的方法将其插入到pCAMBIA1301植物表达载体中(载体经HindIII/PmlI线性化)，并在农杆菌介导下，转化不结球生菜(lskn1/lskn1)，共获得了4株转基因植株，并且每个株系均表现为结球表型(图1中a)。对其中一个转基因株系的T₁代结球表型及基因型分析发现(基因型鉴定引物：ValLsKN1COM F:CGGTTGTTTATTGGTGTATT；ValLsKN1COM R:CGAGGGTAATGAGGATGAGAC)，具有转基因插入的单株均表现为结球表型，而无转基因插入的单株表现为不结球(图1中b)，表明转基因植株的结球表型与转基因插入共分离，进一步验证了LsKN1具有调控生菜结球性状的功能。

从结球亲本中扩增LsKN1的部分CDS序列(该序列为一个缺少部分N端CDS片段，并非全长CDS，因为转座子插入到该基因的第一个外显子上，插入位置前面的CDS在结球材料中是不能表达，所以选用的是插入位点后第一个ATG至终止密码子的序列)，引物是；LsKN1OE F:ACGGGGGACTCTTGACCATGGTAATGATGCTTGAAAACAGC；LsKN1OER:AGAAATTTACCCTCAGATCTACCATGGCTATAGCAACGAAACGTCCATG，扩增的目的产物包括SEQ ID NO.5所示序列(该序列编码的蛋白质为SEQ ID NO.6所示)通过同源重组的方法，将该片段插入到pCAMBIA1301植物表达载体中(载体经NcoI线性化)的CaMV 35S强启动子后面，通过农杆菌介导稳定转化不结球生菜。转基因结果(引物为ValLsKN1OE F:ATGATGCTTGAAAACAGC；ValLsKN1OE R:GTAGAAATGGAGATTGCCTTG)表明，增强LsKN1基因的表达能够引起生菜的结球表型(图2)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种分离的生菜LsKN1基因及其在控制生菜结球性状中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10220

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtctgtttc ttctacccaa caaataaaac cattacgagg tccctaacaa aatcaattta 60

gaagttagaa gtgtagaatg caaagataaa aacaaataaa ttagggatac agtgtcctga 120

taaagaaagt caaacaaacc ttagtggggc aagcatagaa tggtcttcca gggtttgatg 180

gagtggaaga cattctgatt atggccaaac atccacatga gcatttcacc atttttgctt 240

cattgtttcc gagagctgct aacttcaaaa tgcaaacaag aacatgtaca aagaaatgag 300

atctattgcc gagtaaagga ggtaaagtac ttataaagag caaatgacga aaatatccca 360

gccgagtaag gaagtaagtt cttaaaaatt ataaattccg aaaatacccc ttgacgacat 420

taccccaatg tttgacctca ttaacatctg tcacagttgg tgtaccaaca acaattaatt 480

ttcattaatt aagccaacca agtgtccaaa tcgttagtct taatcaagaa cattaatccc 540

aacaaatcaa aacatattca aggtgtttac atttcatcaa gataatatca aaatgcttgt 600

tacatgttcc caggacttca aaaaacatcc gtaaacaacc accagtagat taccacaaac 660

atcatagacg attaccacaa acacaaacga acacacacaa tcctaataac atatattaca 720

ataaaaacct taaacataat aaacgattac gacgaacaca agattatcat accactgcta 780

ttcacctcct tcagaatcac ttgctgacta tcaagtgaat gatgaaaatc attagcagga 840

gcatcaccac gacaagaccc acaaccaaca acacaatagc tttaatctgc ttctcaacct 900

tctcgaacct ttgctgcatg ttcaggacat caaccctgga atgaaggtaa tcgcagaaaa 960

tcgtgtgcaa atcgttcaag tatagcccgt ctcttgagct agtcgagttg ttggagttta 1020

tactatctgg tgatggtggt ggggtaggct ccatggaaga cagtgaaagg gaacacgagt 1080

attctatttt cgtttgtcgg gttgtgtttg gccggaagtg gtaacaaagt gttagggttt 1140

tgtctaagag accatccatt tatatagtag gggaccactt aacccttagt gcccaagtaa 1200

gtgaactcgg tggtgagtcg atgatgtgta aaccgactcg tctgagttga ctcagtaggt 1260

tacttggatg atgacatgac aagcaaaccg gttgaattgg gtcaaaatcc caaattagcc 1320

ggttaaatgt tagtttatgc cattctaaag ccaaaaaata aaataaggga tcttttaaac 1380

caaaacatgt aagttagtgg ggctattttc ccataaatta aaaatactaa ttaatattca 1440

aaatatttat aatatacttt ttattataat atcttttggt catctttgtt catccatatt 1500

atcttcaagc attataatag aattttgcat ttcagtaaat aataaagtaa catcattttt 1560

ataaatataa actaattatt aatctatttc actgttcatt taattaatta tcggaaaatc 1620

aatgcttggc agttcatcaa tattattttc aagcattata atagaatttt tgcattgaat 1680

tttcagtaaa taataaagta acatcatttt tataaaaata aacaaattaa tctattatac 1740

tgttcattta attaattatt ggaaaatcaa tacttggcat tatgtttata tacgattttt 1800

cagtaaaagg ttagagaaac cccttttgta agcttaaaac tcgggtgaag cccctctcat 1860

gtaagtcgaa ggtaagtctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctcat 1920

gtacacacaa aagacacgta agtcctccat atccttctat acatatcttt acaaacagta 1980

agttgagtaa aaaagtttgc acagagagag agagagagag gagaaatgga gggtgatgct 2040

ggaggtggag ggggtacttc atcatgtttg atgagttttg gagacagcaa catcattaat 2100

actagcagta atagtaataa taacaaccac tactggaaaa ttggtaatag agtacacccc 2160

catctaatac ggttgtaaaa aaacccgtat tataaaggga taaataaata taatacacac 2220

aattgcagca tctaatacgg ttaattgcag catctaatac ggtcaatgag atgtactaga 2280

aacaaaatca aataactaaa aaaatacgcc cccattttga ttaagtacga ctaatacata 2340

aacatgatca acttcttctt tagttagaaa tccaacttta atgcctttat ccttgctgct 2400

acaactttga tcttgttttc aactattaaa gtatttatcc ctggaaaacc tcctgttgac 2460

taccaaggag ctagagaagc aaaaccaatc acagaatttg cactcaaaca aatgaagaca 2520

ctccctaaag acaaattaag tggaaaaact acaattactg aatcaagtgt acaggtttgg 2580

tagatgatat aaaaccatta ttcttaaagg aatggaattg ataggggaat ggaatgactg 2640

attccattct tgtcatagaa aagaaaagag aggtacataa cagaagcata tagagatgtg 2700

catcaaaaaa gtgtacaggt ttgtatgatg atataaaagt acaattttac ccttgggcta 2760

atatattttt aagttgacca ttttgcccct ttataggcca tgaaagcaca aatgggcgat 2820

cttggacaga gcttaggaat gacccaaggt ttgggcaact agttcaagca ataatcgaat 2880

tcccattttt ccctcatcct tcagaaagct gcagttttgt agactaacta tgccaaaagg 2940

tcaatattac ccctcaattt ttaataataa taattgtagt agttcttgtt cagttgattc 3000

agccacgtga ctattttctg tattttatcg tttttatttt ctgtattttc atcctttttt 3060

gtaagaagaa ttgtggggta acacaagtga ctttttttta tttttatttt ttattatttt 3120

aggtttgtta tcggtttatt ttaaaaaatt accaaacatc aaaaaccaat aaccagatga 3180

ggttcaagtt tcaatagatt acatgcaaag tttggaccat aaaaatggtc aaatggaatg 3240

aagaggttac attcaaatga tttttcttta aaattttttg ttttattttc tgtattaaac 3300

ataatgaaag cttgttataa ccaaaggtca taaacaaaat aacttttcca atttaattag 3360

aataagaaat tttagattat tattgtaaaa aggatgaatc ttttgtagtt tatattttac 3420

agtgtactct atagattatt tttaaataca attaatgaac ttttattcca tgtcgagtac 3480

aagggaagaa aataccatga ggcaattaaa ttcaatagga tatttttacc agtaaaaata 3540

cttgaaataa aaaattaaat aagtagcaga aaccttaaca aattcatcaa ctctttctcc 3600

ctttgagacg cttccggcat atgaccaaac aaattcatcg ccatttttgc tctattactt 3660

agagttgttt atacgaaacc ttagccttcg gtcgacgacg cctccgcctc tggccaacga 3720

cgcctccgcc tccggttgac gacgcctcca cctccggtct ccaatcgacg agactgatga 3780

agtctcctac tccggcctac agccgcttct gcctccttct ttcacgttgt ttacaggtac 3840

gctcggactt tgggtgtagt tgatctattc attgattaat gttgtgttta tgacaatgtc 3900

ttctctgtgt atgaaatatt tacttcatat ttctggttga taaccctaga aagcatcatc 3960

gactctgttt tgaacttcat ctgctgttgc tccaaaaaga aaaaattgtc ctctccaact 4020

tccttcctga tttcaacatt agccccatct aatgttccta taatcaggca tccattgagt 4080

gcagatttca tattaagaat atttcaaaac cactcaatga tcacacatcc tcctctataa 4140

ctattcgatt tcacattata attttgttaa agttcacatt tattgcttaa ttatatagaa 4200

accaatattt agaaaagcaa gatttttcat caaatgttga ccaagatata tgcttatagc 4260

tgtgagagct gcagtatcag catttcgtag ggaagaagaa tcacaagttc accattcatc 4320

taaaagaaga agagagagat cagatcaggt ttgtccattt ttctttatgg aactccatgt 4380

taaagaggta atttggtaat ttagttttag acataatagt agtaacatgt attgtatgga 4440

atcaggacag ggttaattat ggtgattcaa tgttcatgga gacaccacga ggcaaaggtc 4500

ttcaattccc attttctgtt gctgatcgtg ttattataaa gtccaatatc gctcattagc 4560

taaggtttct gatacttcat catcacagca aacttcaagt aagataacac ccaattggct 4620

ctaaacccat gtggcatctt taaatgtatc atgtttcaaa tgtatgtgtg tgtgttctaa 4680

agataattgt gtagcaagtt ttgcatatgt gactgattca atttcacttc aagtgccttt 4740

agctgtgggg tatcgattat tatttcatca tcttctcatt agttagatta agtcataatc 4800

tttaacatat ctttaccctc attattttct atgatcattt ttatgctcat tttcttatca 4860

acaggtctga ggttatacat tggaaattta ccatcacata tggatgaggt actagtgcaa 4920

acaaccaaga gcaggaggat ccgtatggta gaaagaaaaa ccagaaaaag aagtgttgat 4980

aaacccaaaa cgaaacatct tgaagcaagg tatacatatt aacaaacatt atttgagtta 5040

atatatgaat caagagtaca taaagcattg aatttgtttt gaaaagagca taaacttacc 5100

ttgggcatct ttaattttat ataaaattct ggtttttttt ttggtgttcg agactcttag 5160

aattaattat acgagtgttt atgcttttgt aggcatacaa tggacagtaa agaaaagaaa 5220

aagagaagtg tgacattgat cagagatcat tccaaagaat atctatcaaa tttaacagtt 5280

gagtttgatc aattcggtag agctattgga cctaaccgct ttaagttcac cagttatcgt 5340

ggagtgacta cgaggaagat gatttctatc cttatagata gttgggattt agtggatcaa 5400

tgtgacaagg atcaattgtg gttgaacata aaggtaaaac tcatttcaac acacttttga 5460

tatcatttaa tagtagcaat cacaatttcc tgccatgtta ttctcttcta tcatacaagt 5520

tgtatcatat catttaccta ataattgtta tcttcatttt ttatttaaaa aagcagaatt 5580

attggcatat atgatcattt tttattgaaa atgaaaacat gatcagtgat gtcccacttc 5640

ttatggttgg aatggaatca tatagtaggt ttgtattttg tagagattga tccatggtaa 5700

tcatatagta gctttgcaga aattgaaaag ttggaatggt gatccatgtg ttctagagca 5760

tccatggact ggaattgact gtttaataag gctggagtgg aattgtctgt ttaataaggc 5820

tctggaatgc aaaggggatg tgagacatca agtacggttg tttattggtg tattagatgt 5880

gtatatatgg cgtattagat gattgtatgt gtaaaataga taggataata taatacggtc 5940

aaatagccgt actctattat gcatgtaatc taatacaccc ctctactaat acgccctcta 6000

tgtacgtatt atattcacaa tttcaaccgt actctattaa cctttttcta gtagtgaacg 6060

ttggagcact atgtcttcct ccacctcctg tttcatataa caacaacaac aacaacctaa 6120

ttttcgccga tcaagatcac catcatcatc atcatcatca tcatcatagt acctgtggga 6180

cttcgacttc tgctatgatg cttgaaaaca gcgccattaa tatcaacgat ggaggagagt 6240

tagccttcat gagctcctcc tcgtgttctt cttctgctaa agcaaagatc atgtctcatc 6300

ctcattaccc tcgtctctta tcagcttatc ttaactgtca aaaggtatat ctagctactt 6360

cttaaccctc tctctctctc tctctctctc tctctctcgt gtgtttgttt gtgcgcgctc 6420

gcctatcagc aaacacggat ctatatagtt ctctatatat atagttcaca actgaaacaa 6480

gtggtggaat tttgtatctt caggtttcag catatctttt tatacgtgtt tactggtttc 6540

tgcatttggt acaatctaat aagaaatcct gagtaaaaat caagttgtgt tttttcaggg 6600

gtttgtgtgt ttgattcaat agctattgct tgatttagta gtgtaataga gacactctta 6660

aaagcaaaca acttgtaaga aggaacctag aagtgggttt tctagatttg tgtgtttctg 6720

tgtgcgtgac atcatttctt ttagttcttt cttcatttgg tagcataata tactttcttg 6780

aagagagaat aaaaaaaatg caaggcaaaa cccttattta gacgcagaaa gtttattctt 6840

tcactttcgt aacgtatatt tgatatatga agcatgtgtt tgtgtttaat taagagtaat 6900

atgaaagatt ttttctttaa ttaattaata caaaatacag ataggagcac cgcctgaagt 6960

agtggaaaga ctagaagatg cttgcagagc gtcggtggtg gctgcgatgt ccagtcgttc 7020

cggctccgca ggttgtgagg ctggtaccag tgatggcggt ggtggtggag gaatgaatat 7080

gatgatcatc ggacaagatc cagcacttga tcagttcatg gaagcttact gtgagatgct 7140

cattaaatac gagcaagaac tcgccaaacc cttcaaagaa gccatgcttt ttctctcaag 7200

agttgaatcc cagttcaagg caatctccat ttctacttca gattctggtg catcatctct 7260

ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctataa attttatgat cctggggaat 7320

tgtttaataa actacagatt actcttgatt tcatcataaa acttttaaaa gaagttctgt 7380

ttccagcaca aaagcgcttc tttgaatgtt cttcatgctt aggaactaga tgcgattctg 7440

ttttcttaga acagtttatt gtcttcatta atgctatctg gttcttaaat tattttttac 7500

aatagtaatc accaaaaagt actattaata tatatcatgt atagatctta aatttgtttt 7560

caaattttgt ccatagcaca atttccaaga cttgacaata gtttgcctac agtttcatat 7620

cacatgaatt cttgtgaaag ttcctttttc caaaagttta taattttcat gtatacaaac 7680

atgaaaaaat ctttgatata tgaggctcat ctatgatcta ttttatgaca ctatacggct 7740

atgtctgatc catttacgtg tataatgtaa aagatttgta ggggaggacc ctaaacgacg 7800

atgtatatgt gtggaggcct attgtgatga atctttcact ccatcctgga agctttgcac 7860

tgtttttcta gtaaaataac ctgtacaaat ttccagtttt tcaccccttg aatgtagaga 7920

tatatatata tacaagtaca attatatgtt ccttttattg gcagcatcct gtccaatatt 7980

acattgtttt ttaccctggg agattttttt gttgcaatta acataaggtt gattgtcggc 8040

atttccaccc aaagcaccca agggaaaaaa ataaccctat atctttggtt cggatgattg 8100

cattccaacc attttggtgg aaattaaagg tgcatctact gtcttgttcc attggcaatg 8160

tgatcaagat gcatgcattt tacgagttag ttgttaacag gttgaaattg gcgatcagaa 8220

taaaaaaaaa ataactcatg tgcatataat tgtgctttta tttattgtga tgtatataca 8280

acaaataagc tttagtttta aaatcggatt cttatagcag accatatgga agaaaacagt 8340

agtctatttg ttccatatga tctagataca tgtaccttat tgcatctaag aattgttcat 8400

aactgcattt tgtgcctaaa atctccttta aagttgcttt gtctttgata atttctgttt 8460

taatttgatg caaacttcag cgggtggcga agtaggtatg gataaaaatg gatcatccga 8520

ggaagaggtg gatgtaaata acaatctcat agatcctcaa gctgaagatc aggaactgaa 8580

gggtcagctg ttacgcaagt atagtggtta tttaggtagt ctcaagcaag agttcatgaa 8640

gaagagaaag aaaggaaagt tgcccaaaga agcacgtcaa caattactcg actggtggac 8700

taggcattac aaatggccat acccttcggt aactataata ctgttttctt gattaaaaca 8760

aaatctatct gccaaaaaag aaaaacttta catttctctt aacgtactct actgtctctt 8820

gtgaacagga ggctcagaag ttggcactgg ctgagtcaac aggactagac cagaagcaga 8880

taaacaactg gttcataaac caaaggaagc gacattggaa gccatctgag gatatgcagt 8940

ttgtggtaat ggatgctgct catcctcatc actatttcat ggagaacatc ctcgggaacc 9000

cttatcccat ggacgtttcg ttgctatagg ggctatatat atacatgccc aacgtggcat 9060

gaaatctcaa caaatgaccg tatctatgta tgattgacat tgaactcgat gagggttttg 9120

caagtttgtg tgaaccgtaa gggatgaaaa gaagctcgtt agcgttctca tgtatgctga 9180

cctattggtc ttaaaagttg gatgattata agacattgtt atttaagaca tgcacttaat 9240

gcaagtaaga tattcgtgtt tacttgttat tttttgatgt cgaacgccac cacgtaaatt 9300

aacttatatt ttaaagcgac atgaatacgc gtgtaaagtt taaaaaatcc cggtagctgt 9360

ataaaaaagt gcaagtattg taaatcaaaa tggtaaaaaa ataagtgggc aatacaacta 9420

gcgacaacat cattaagaaa caataaggca agcgataaca tcattaagaa acaataaggc 9480

atattagcgt taaacctcat tcagggacat tgattgtggt gaaggttcat tcacgtttag 9540

ctacctagag gtcctggtcg gagctagcat caacatatta gcaactggat gtcgcatatc 9600

aagaaatttc agatgcaatg tgaaccttaa gacctgttag acacattcac acacttgcac 9660

acaacagatt aagcaaagca aaaacacaga gaaagatttg gtcacacaca actgatgcgt 9720

attattctct aaagactaga tgcataaagg aaatatcaca cgccttatag acactacaag 9780

gaatgtggat caacaagcta ggaaaactaa aagcaactcc taaacagttt tgactaagaa 9840

aataactaaa tatctaccct aataaatgaa aatgactttg ccacatgtct tcttctcatt 9900

catttggaca cataagattt tctagaaatt ttaaaatttt ctattttcca cttgtcattt 9960

tattatattt ttgattttta ttaaattaaa atccacattt aatatataag gtaatatata 10020

tgtaaggtat ttattagaaa atggtttata tatgtaatgt atctaatgca ttaaactctc 10080

attaatttta ataattcaaa aaatttctta tttttcttat aaatttaaag ttttcaaatt 10140

gttaaaattt tatatttaat tttttttaaa tgaacccatg taatacatgg gtctcacacc 10200

tagtagaaaa taaagaacac 10220

<210> 2

<211> 3935

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaccactact ggaaaattgg taatagagta cacccccatc taatacggtt gtaaaaaaac 60

ccgtattata aagggataaa taaatataat acacacaatt gcagcatcta atacggttaa 120

ttgcagcatc taatacggtc aatgagatgt actagaaaca aaatcaaata actaaaaaaa 180

tacgccccca ttttgattaa gtacgactaa tacataaaca tgatcaactt cttctttagt 240

tagaaatcca actttaatgc ctttatcctt gctgctacaa ctttgatctt gttttcaact 300

attaaagtat ttatccctgg aaaacctcct gttgactacc aaggagctag agaagcaaaa 360

ccaatcacag aatttgcact caaacaaatg aagacactcc ctaaagacaa attaagtgga 420

aaaactacaa ttactgaatc aagtgtacag gtttggtaga tgatataaaa ccattattct 480

taaaggaatg gaattgatag gggaatggaa tgactgattc cattcttgtc atagaaaaga 540

aaagagaggt acataacaga agcatataga gatgtgcatc aaaaaagtgt acaggtttgt 600

atgatgatat aaaagtacaa ttttaccctt gggctaatat atttttaagt tgaccatttt 660

gcccctttat aggccatgaa agcacaaatg ggcgatcttg gacagagctt aggaatgacc 720

caaggtttgg gcaactagtt caagcaataa tcgaattccc atttttccct catccttcag 780

aaagctgcag ttttgtagac taactatgcc aaaaggtcaa tattacccct caatttttaa 840

taataataat tgtagtagtt cttgttcagt tgattcagcc acgtgactat tttctgtatt 900

ttatcgtttt tattttctgt attttcatcc ttttttgtaa gaagaattgt ggggtaacac 960

aagtgacttt tttttatttt tattttttat tattttaggt ttgttatcgg tttattttaa 1020

aaaattacca aacatcaaaa accaataacc agatgaggtt caagtttcaa tagattacat 1080

gcaaagtttg gaccataaaa atggtcaaat ggaatgaaga ggttacattc aaatgatttt 1140

tctttaaaat tttttgtttt attttctgta ttaaacataa tgaaagcttg ttataaccaa 1200

aggtcataaa caaaataact tttccaattt aattagaata agaaatttta gattattatt 1260

gtaaaaagga tgaatctttt gtagtttata ttttacagtg tactctatag attattttta 1320

aatacaatta atgaactttt attccatgtc gagtacaagg gaagaaaata ccatgaggca 1380

attaaattca ataggatatt tttaccagta aaaatacttg aaataaaaaa ttaaataagt 1440

agcagaaacc ttaacaaatt catcaactct ttctcccttt gagacgcttc cggcatatga 1500

ccaaacaaat tcatcgccat ttttgctcta ttacttagag ttgtttatac gaaaccttag 1560

ccttcggtcg acgacgcctc cgcctctggc caacgacgcc tccgcctccg gttgacgacg 1620

cctccacctc cggtctccaa tcgacgagac tgatgaagtc tcctactccg gcctacagcc 1680

gcttctgcct ccttctttca cgttgtttac aggtacgctc ggactttggg tgtagttgat 1740

ctattcattg attaatgttg tgtttatgac aatgtcttct ctgtgtatga aatatttact 1800

tcatatttct ggttgataac cctagaaagc atcatcgact ctgttttgaa cttcatctgc 1860

tgttgctcca aaaagaaaaa attgtcctct ccaacttcct tcctgatttc aacattagcc 1920

ccatctaatg ttcctataat caggcatcca ttgagtgcag atttcatatt aagaatattt 1980

caaaaccact caatgatcac acatcctcct ctataactat tcgatttcac attataattt 2040

tgttaaagtt cacatttatt gcttaattat atagaaacca atatttagaa aagcaagatt 2100

tttcatcaaa tgttgaccaa gatatatgct tatagctgtg agagctgcag tatcagcatt 2160

tcgtagggaa gaagaatcac aagttcacca ttcatctaaa agaagaagag agagatcaga 2220

tcaggtttgt ccatttttct ttatggaact ccatgttaaa gaggtaattt ggtaatttag 2280

ttttagacat aatagtagta acatgtattg tatggaatca ggacagggtt aattatggtg 2340

attcaatgtt catggagaca ccacgaggca aaggtcttca attcccattt tctgttgctg 2400

atcgtgttat tataaagtcc aatatcgctc attagctaag gtttctgata cttcatcatc 2460

acagcaaact tcaagtaaga taacacccaa ttggctctaa acccatgtgg catctttaaa 2520

tgtatcatgt ttcaaatgta tgtgtgtgtg ttctaaagat aattgtgtag caagttttgc 2580

atatgtgact gattcaattt cacttcaagt gcctttagct gtggggtatc gattattatt 2640

tcatcatctt ctcattagtt agattaagtc ataatcttta acatatcttt accctcatta 2700

ttttctatga tcatttttat gctcattttc ttatcaacag gtctgaggtt atacattgga 2760

aatttaccat cacatatgga tgaggtacta gtgcaaacaa ccaagagcag gaggatccgt 2820

atggtagaaa gaaaaaccag aaaaagaagt gttgataaac ccaaaacgaa acatcttgaa 2880

gcaaggtata catattaaca aacattattt gagttaatat atgaatcaag agtacataaa 2940

gcattgaatt tgttttgaaa agagcataaa cttaccttgg gcatctttaa ttttatataa 3000

aattctggtt ttttttttgg tgttcgagac tcttagaatt aattatacga gtgtttatgc 3060

ttttgtaggc atacaatgga cagtaaagaa aagaaaaaga gaagtgtgac attgatcaga 3120

gatcattcca aagaatatct atcaaattta acagttgagt ttgatcaatt cggtagagct 3180

attggaccta accgctttaa gttcaccagt tatcgtggag tgactacgag gaagatgatt 3240

tctatcctta tagatagttg ggatttagtg gatcaatgtg acaaggatca attgtggttg 3300

aacataaagg taaaactcat ttcaacacac ttttgatatc atttaatagt agcaatcaca 3360

atttcctgcc atgttattct cttctatcat acaagttgta tcatatcatt tacctaataa 3420

ttgttatctt cattttttat ttaaaaaagc agaattattg gcatatatga tcatttttta 3480

ttgaaaatga aaacatgatc agtgatgtcc cacttcttat ggttggaatg gaatcatata 3540

gtaggtttgt attttgtaga gattgatcca tggtaatcat atagtagctt tgcagaaatt 3600

gaaaagttgg aatggtgatc catgtgttct agagcatcca tggactggaa ttgactgttt 3660

aataaggctg gagtggaatt gtctgtttaa taaggctctg gaatgcaaag gggatgtgag 3720

acatcaagta cggttgttta ttggtgtatt agatgtgtat atatggcgta ttagatgatt 3780

gtatgtgtaa aatagatagg ataatataat acggtcaaat agccgtactc tattatgcat 3840

gtaatctaat acacccctct actaatacgc cctctatgta cgtattatat tcacaatttc 3900

aaccgtactc tattaacctt tttctagtag tgaac 3935

<210> 3

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagggtg atgctggagg tggagggggt acttcatcat gtttgatgag ttttggagac 60

agcaacatca ttaatactag cagtaatagt aataataaca acgttggagc actatgtctt 120

cctccacctc ctgtttcata taacaacaac aacaacaacc taattttcgc cgatcaagat 180

caccatcatc atcatcatca tcatcatcat agtacctgtg ggacttcgac ttctgctatg 240

atgcttgaaa acagcgccat taatatcaac gatggaggag agttagcctt catgagctcc 300

tcctcgtgtt cttcttctgc taaagcaaag atcatgtctc atcctcatta ccctcgtctc 360

ttatcagctt atcttaactg tcaaaagata ggagcaccgc ctgaagtagt ggaaagacta 420

gaagatgctt gcagagcgtc ggtggtggct gcgatgtcca gtcgttccgg ctccgcaggt 480

tgtgaggctg gtaccagtga tggcggtggt ggtggaggaa tgaatatgat gatcatcgga 540

caagatccag cacttgatca gttcatggaa gcttactgtg agatgctcat taaatacgag 600

caagaactcg ccaaaccctt caaagaagcc atgctttttc tctcaagagt tgaatcccag 660

ttcaaggcaa tctccatttc tacttcagat tctgcgggtg gcgaagtagg tatggataaa 720

aatggatcat ccgaggaaga ggtggatgta aataacaatc tcatagatcc tcaagctgaa 780

gatcaggaac tgaagggtca gctgttacgc aagtatagtg gttatttagg tagtctcaag 840

caagagttca tgaagaagag aaagaaagga aagttgccca aagaagcacg tcaacaatta 900

ctcgactggt ggactaggca ttacaaatgg ccataccctt cggaggctca gaagttggca 960

ctggctgagt caacaggact agaccagaag cagataaaca actggttcat aaaccaaagg 1020

aagcgacatt ggaagccatc tgaggatatg cagtttgtgg taatggatgc tgctcatcct 1080

catcactatt tcatggagaa catcctcggg aacccttatc ccatggacgt ttcgttgcta 1140

tag 1143

<210> 4

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Glu Gly Asp Ala Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ser Ser Cys Leu Met

1 5 10 15

Ser Phe Gly Asp Ser Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ser Asn Ser Asn Asn

20 25 30

Asn Asn Val Gly Ala Leu Cys Leu Pro Pro Pro Pro Val Ser Tyr Asn

35 40 45

Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gln Asp His His His His

50 55 60

His His His His His His Ser Thr Cys Gly Thr Ser Thr Ser Ala Met

65 70 75 80

Met Leu Glu Asn Ser Ala Ile Asn Ile Asn Asp Gly Gly Glu Leu Ala

85 90 95

Phe Met Ser Ser Ser Ser Cys Ser Ser Ser Ala Lys Ala Lys Ile Met

100 105 110

Ser His Pro His Tyr Pro Arg Leu Leu Ser Ala Tyr Leu Asn Cys Gln

115 120 125

Lys Ile Gly Ala Pro Pro Glu Val Val Glu Arg Leu Glu Asp Ala Cys

130 135 140

Arg Ala Ser Val Val Ala Ala Met Ser Ser Arg Ser Gly Ser Ala Gly

145 150 155 160

Cys Glu Ala Gly Thr Ser Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Met Asn Met

165 170 175

Met Ile Ile Gly Gln Asp Pro Ala Leu Asp Gln Phe Met Glu Ala Tyr

180 185 190

Cys Glu Met Leu Ile Lys Tyr Glu Gln Glu Leu Ala Lys Pro Phe Lys

195 200 205

Glu Ala Met Leu Phe Leu Ser Arg Val Glu Ser Gln Phe Lys Ala Ile

210 215 220

Ser Ile Ser Thr Ser Asp Ser Ala Gly Gly Glu Val Gly Met Asp Lys

225 230 235 240

Asn Gly Ser Ser Glu Glu Glu Val Asp Val Asn Asn Asn Leu Ile Asp

245 250 255

Pro Gln Ala Glu Asp Gln Glu Leu Lys Gly Gln Leu Leu Arg Lys Tyr

260 265 270

Ser Gly Tyr Leu Gly Ser Leu Lys Gln Glu Phe Met Lys Lys Arg Lys

275 280 285

Lys Gly Lys Leu Pro Lys Glu Ala Arg Gln Gln Leu Leu Asp Trp Trp

290 295 300

Thr Arg His Tyr Lys Trp Pro Tyr Pro Ser Glu Ala Gln Lys Leu Ala

305 310 315 320

Leu Ala Glu Ser Thr Gly Leu Asp Gln Lys Gln Ile Asn Asn Trp Phe

325 330 335

Ile Asn Gln Arg Lys Arg His Trp Lys Pro Ser Glu Asp Met Gln Phe

340 345 350

Val Val Met Asp Ala Ala His Pro His His Tyr Phe Met Glu Asn Ile

355 360 365

Leu Gly Asn Pro Tyr Pro Met Asp Val Ser Leu Leu

370 375 380

<210> 5

<211> 906

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgatgcttg aaaacagcgc cattaatatc aacgatggag gagagttagc cttcatgagc 60

tcctcctcgt gttcttcttc tgctaaagca aagatcatgt ctcatcctca ttaccctcgt 120

ctcttatcag cttatcttaa ctgtcaaaag ataggagcac cgcctgaagt agtggaaaga 180

ctagaagatg cttgcagagc gtcggtggtg gctgcgatgt ccagtcgttc cggctccgca 240

ggttgtgagg ctggtaccag tgatggcggt ggtggtggag gaatgaatat gatgatcatc 300

ggacaagatc cagcacttga tcagttcatg gaagcttact gtgagatgct cattaaatac 360

gagcaagaac tcgccaaacc cttcaaagaa gccatgcttt ttctctcaag agttgaatcc 420

cagttcaagg caatctccat ttctacttca gattctgcgg gtggcgaagt aggtatggat 480

aaaaatggat catccgagga agaggtggat gtaaataaca atctcataga tcctcaagct 540

gaagatcagg aactgaaggg tcagctgtta cgcaagtata gtggttattt aggtagtctc 600

aagcaagagt tcatgaagaa gagaaagaaa ggaaagttgc ccaaagaagc acgtcaacaa 660

ttactcgact ggtggactag gcattacaaa tggccatacc cttcggaggc tcagaagttg 720

gcactggctg agtcaacagg actagaccag aagcagataa acaactggtt cataaaccaa 780

aggaagcgac attggaagcc atctgaggat atgcagtttg tggtaatgga tgctgctcat 840

cctcatcact atttcatgga gaacatcctc gggaaccctt atcccatgga cgtttcgttg 900

ctatag 906

<210> 6

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Met Leu Glu Asn Ser Ala Ile Asn Ile Asn Asp Gly Gly Glu Leu

1 5 10 15

Ala Phe Met Ser Ser Ser Ser Cys Ser Ser Ser Ala Lys Ala Lys Ile

20 25 30

Met Ser His Pro His Tyr Pro Arg Leu Leu Ser Ala Tyr Leu Asn Cys

35 40 45

Gln Lys Ile Gly Ala Pro Pro Glu Val Val Glu Arg Leu Glu Asp Ala

50 55 60

Cys Arg Ala Ser Val Val Ala Ala Met Ser Ser Arg Ser Gly Ser Ala

65 70 75 80

Gly Cys Glu Ala Gly Thr Ser Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Met Asn

85 90 95

Met Met Ile Ile Gly Gln Asp Pro Ala Leu Asp Gln Phe Met Glu Ala

100 105 110

Tyr Cys Glu Met Leu Ile Lys Tyr Glu Gln Glu Leu Ala Lys Pro Phe

115 120 125

Lys Glu Ala Met Leu Phe Leu Ser Arg Val Glu Ser Gln Phe Lys Ala

130 135 140

Ile Ser Ile Ser Thr Ser Asp Ser Ala Gly Gly Glu Val Gly Met Asp

145 150 155 160

Lys Asn Gly Ser Ser Glu Glu Glu Val Asp Val Asn Asn Asn Leu Ile

165 170 175

Asp Pro Gln Ala Glu Asp Gln Glu Leu Lys Gly Gln Leu Leu Arg Lys

180 185 190

Tyr Ser Gly Tyr Leu Gly Ser Leu Lys Gln Glu Phe Met Lys Lys Arg

195 200 205

Lys Lys Gly Lys Leu Pro Lys Glu Ala Arg Gln Gln Leu Leu Asp Trp

210 215 220

Trp Thr Arg His Tyr Lys Trp Pro Tyr Pro Ser Glu Ala Gln Lys Leu

225 230 235 240

Ala Leu Ala Glu Ser Thr Gly Leu Asp Gln Lys Gln Ile Asn Asn Trp

245 250 255

Phe Ile Asn Gln Arg Lys Arg His Trp Lys Pro Ser Glu Asp Met Gln

260 265 270

Phe Val Val Met Asp Ala Ala His Pro His His Tyr Phe Met Glu Asn

275 280 285

Ile Leu Gly Asn Pro Tyr Pro Met Asp Val Ser Leu Leu

290 295 300

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacctgcagg catgcaagct ttgtctgttt cttctaccca a 41

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctggtcacc tgtaattcac acgtggtgtt ctttattttc tacta 45

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggttgttta ttggtgtatt 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgagggtaat gaggatgaga c 21

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgggggact cttgaccatg gtaatgatgc ttgaaaacag c 41

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agaaatttac cctcagatct accatggcta tagcaacgaa acgtccatg 49

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgatgcttg aaaacagc 18

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtagaaatgg agattgcctt g 21

Claims (5)

1.一种分离的结球生菜的基因，所述基因为SEQ ID NO.1所示

权利要求1所述的基因在制备结球生菜中的应用。

2.一种分离的结球生菜的转座子序列，其序列为SEQ IDNO.2所示。

3.其CDS序列为SEQ ID NO.3所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.4所示。

4.权利要求3所述的转座子序列在制备结球生菜中的应用。

5.SEQ ID NO.6所示氨基酸序列或编码SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的核苷酸序列在制备结球生菜中的应用。

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