CN108623667B

CN108623667B - 一种水稻白斑叶控制基因wlml1及其编码的蛋白质与应用

Info

Publication number: CN108623667B
Application number: CN201810503221.9A
Authority: CN
Inventors: 任德勇; 郭龙彪; 钱前; 曾大力; 陈平; 张宇; 胡海涛; 胡江; 高振宇; 朱丽; 董国军
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2038-05-23
Also published as: CN108623667A

Abstract

本发明公开了一种水稻白斑叶控制基因WLML1编码的蛋白质，具有Seq ID No：2所示的氨基酸序列；本发明还公开了一种编码上述蛋白质的基因，具有Seq ID No：1所示的基因组核苷酸序列；本发明还公开了含有上述基因的植物表达载体、宿主细胞，以及上述蛋白质、基因、植物表达载体、宿主细胞在在调控植物叶色育种中应用，本发明还公开了与上述基因紧密连锁的分子标记在植物叶色育种中的应用。本发明利用图位克隆技术首次在水稻中克隆到了WLML1基因，通过对WLML1基因的功能分析，进一步阐明了植物特别是禾本科植物叶色调控遗传机制及其作用机理，为水稻高光效育种和叶色标记育种奠定基础。

Description

一种水稻白斑叶控制基因WLML1及其编码的蛋白质与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆一个引起水稻叶片形成白色斑块并伴有类病斑形成的白斑叶基因WLML1(White andLesion Mimic Leaf1)，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物之一，也是单子叶植物的理想模式植物。叶片是植物进行光合作用、积累有机物的主要部位，而色素在其中起到主要作用，所以叶色变异通常会影响水稻的光合效率，造成作物减产，严重时甚至导致水稻植株死亡。近年来，叶色突变体已成为研究植物光合作用、叶绿素合成代谢机制、叶绿体结构功能和发育调控机理、作物育种中性状标记以及抗病机制等系列生理代谢过程的理想材料。现已经有很多叶色相关基因被克隆，比如NYC1、OsCAO等，OsCAO与水稻叶绿素合成相关，而NYC1则在叶绿素降解中起作用。发掘水稻叶色突变体，对叶色控制基因的克隆，将成为水稻功能基因组学研究的一个重要研究方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能影响水稻叶色改变和病斑形成的蛋白质、基因以及其相关应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻白斑叶控制基因WLML1编码的蛋白质，所述蛋白质具有(A)或(B)所示的序列：(A)Seq ID No：2或图6所示的氨基酸序列；(B)在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个氨基酸且具有相同功能的由(A)衍生的蛋白质。本发明中的SEQ ID No：2或图6所示的蛋白质属于一类表达蛋白，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失可获得功能类似物。

本发明还提供了一种编码上述蛋白质的基因。所述基因具有(a)或(b)所示的序列：

(a)Seq ID No：1或图5所示的基因组核苷酸序列，该基因组核苷酸序列为从水稻突变体wlml1中克隆得到新基因WLML1。(b)在(a)所示的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的可编码具有影响水稻叶色改变和病斑形成的水稻白斑叶调控功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。其中包括与SEQ ID No：1所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。图5中，灰色阴影标注为编码221个氨基酸对应的核苷酸，即基因的外显子，其余部分为内含子，对内含子部分的添加、取代、缺失等一般不会影响蛋白质的功能。

本发明还提供了一种含有上述基因的植物表达载体。

作为本发明进一步地改进，所述植物表达载体为pCAMBIA1300质粒。该表达载体如图4所示，可以高效表达由上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。

本发明还提供了一种含有上述基因的宿主细胞。

作为本发明进一步地改进，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明中的突变植株，突变后引起叶色的变化，但对其他性状影响不是很大，可用于叶色标记育种。

本发明还提供了一种改良水稻叶色的方法，包括：将上述基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。

本发明还提供了一种上述蛋白质、基因、植物表达载体或宿主细胞在调控植物叶色育种中的应用。

本发明还提供了一种与上述基因紧密连锁的分子标记在植物叶色育种中的应用。

作为本发明进一步地改进，所述分子标记为采用P21引物对或P23引物对以植物单株全基因组DNA为模板扩增出来的核苷酸序列；所述P21引物对包括Seq ID No3和Seq IDNo4所示的引物；所述P23引物对包括Seq ID No5和Seq ID No6所示的引物。

上述植物禾本科植物，优选为水稻。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、突变体wlml1的分离和遗传分析：

本发明的水稻白斑叶突变体wlml1来自籼稻品种TN1(Taichung Native1)EMS诱变。通过与野生型的正反交实验，证明该突变体受隐性单基因控制，如图1所示为突变体wlml1与野生型材料的表型对比图。

二、图位克隆WLML1：

1)WLML1的初步定位：

为了分离WLML1基因，本发明首先组建了一个定位群体，由wlml1与粳稻品种武运粳7号杂交配组获得F₂定位群体，再通过图位克隆的方法，利用STS、SSR等分子标记对WLML1位点进行初步定位，将其初步定位在第4染色体上，并介于P1和P8两标记之间，见图2。

2)WLML1的精细定位：

通过对P1和P8两个标记之间的BAC序列分析，发展新的SSR、STS标记将WLML1精确定位于OSJNBa0084K20上的P23和OSJNBa0076N16上的P21标记之间41.4kb范围之内。(图3)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因。

3)WLML1基因的鉴定和功能分析：

转基因植株能恢复野生型表型，目标基因的功能已得到验证。

水稻叶色改变是水稻高光效育种的主要方向，通过提高水稻叶片的光合作用来提高生物合成量而实现水稻产量的提高，并且还可以作用一种表型标记用于育种。此外，WLML1基因不但能影响水稻叶色而且还能引起叶片类病斑的形成，因此该基因的克隆和应用，不但对水稻叶色研究有重要意义，可能还能成为研究抗病的理想材料。

综上所述，本发明利用水稻白斑叶突变体，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了WLML1基因，通过对WLML1基因的功能解读，进一步阐明了植物特别是禾本科植物叶色调控遗传机制及其作用机理，为水稻高光效育种和叶色标记育种奠定基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是突变体wlml1与野生型材料的表型对比图；其中，1a为突变体与野生型材料的全株表型对比图，1b和1c分别为突变体与野生型材料的叶片表型对比图；

图2是WLML1基因在水稻第4染色体上的初步定位图；

图3是WLML1基因的精细定位图；

图4是pCAMBIA1300-WLML1载体图谱；

图5是WLML1基因的DNA核苷酸序列，灰色阴影标注为编码221个氨基酸对应的核苷酸，即基因的外显子；

图6是WLML1基因编码的氨基酸序列。

具体实施方式

实施例1：

1、水稻材料：

水稻(Oryza sativa L.)叶色突变体wlml1(white and lesion mimic leaf1)的原始野生型为籼稻品种TN1(Taichung Native 1)。

水稻(Oryza sativa L.)叶色突变体wlml1的获得过程具体如下：

籼稻品种TN1的种子经过EMS诱变后，种植于大田，收取种子继续种植，从M₂代中分离出来的一个白叶兼病斑叶突变体，暂时将其命名为wlml1(white and lesion mimicleaf1)。将该突变体进行多代自交，获得能稳定遗传的突变体植株。

将突变体材料wlml1和野生型材料TN1进行正反交，即以突变体wlml1为母本，TN1为父本进行杂交；同时以TN1为母本，wlml1为父本进行杂交。获得的F₁带植株均变现为野生型性状，说明控制该性状的基因受隐性核基因控制。正反交获得的F₁代植株自交获得F₂群体，表现出野生型表型的单株与突变体表型的单株数的遗传分离比符合3:1，说明该表型是由一对隐性核基因控制的。

2、分析和定位群体：

纯合的wlml1突变体和粳稻品种武运粳7号进行杂交，F₁代自交，得到2878株F₂群体；并从2878株F₂群体中选出645株具有wlml1突变表型的个体(即表现为白斑叶)作为定位群体。在苗期每株收取全部突变体表型的幼苗，用来提取总DNA。

3、SSR和STS标记定位WLML1基因

采用CTAB法提取水稻提取用于基因定位的水稻叶片基因组DNA。取大约0.2g水稻叶片置于2ml EP管内，直接加入CTAB和钢珠，利用植物组织研磨器将组织破碎，氯仿抽提，乙醇沉淀，ddH₂O₂溶解，最后获得基因组DNA。每一个PCR反应用1μl DNA样品，体系为10ul。

WLML1基因的初步定位：从wlml1与武运粳7号杂交组合的F₂群体645株隐性单株中随机选取21株隐性单株，组成混池，利用已公布的234对近似均匀分布于各条染色体上B套引物，获得连锁位置，然后利用134株隐性单株，利用混池定位确定的连锁且具有多态性的引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，具体如下：

与目标基因连锁的STR引物为：

P1F：AAGTGCGGCTGTTTGATTT

P1R：CACCCACAGAGTTCTTCCA

PCR反应体系为：水稻基因组DNA 1ul,2×PCR Mix 5ul，10cM F/R引物各1ul，ddH₂O₂2ul，总体系10ul。

PCR扩增条件具体为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃补齐10分钟。

经4％琼脂糖凝胶电泳分离和Gel-Red染色，检测PCR产物的多态性，将WLML1初步定位在第4号染色体长臂上STS标记P1和P8之间。

WLML1基因的精细定位：利用wlml1与武运粳7号组合的F₂群体中共计511(645-134＝511)株隐性个体，在初定位的基础上继续设计STS标记，最终将WLML1精确定位于OSJNBa0084K20上的P23和OSJNBa0076N16上的P21标记之间41.4kb范围之内。

STS标记引物序列为：

P21F:5’-GGAGACAACTCTGGTCTTGACAGC-3’(Seq ID No：3)

P21R:5’-GGACCTCGCGTAGTTGAAGTCG-3’(Seq ID No：4)

P23F:5’-AACATCAGAGACCGACCTGG-3’(Seq ID No：5)

P23R:5’-AGCTGAATGCGTTGGATTTT-3’(Seq ID No：6)

PCR反应体系为：水稻基因组DNA 1ul，2×PCR Mix 5ul，10uM F/R引物各1ul，ddH₂O₂2ul，总体系10ul。

PCR扩增条件具体为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，40个循环；72℃补齐10分钟。

产物检测：在含有Gel-Red的4.0％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照记录结果。

4、基因预测和比较分析：

根据精细定位的结果，在41.4kb范围内根据RAP-DB

(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)的预测，发现在此区间内共有9个候选基因，根据网站中基因功能的预测，我们首先设计了一个基因的测序引物，采用PCR方法分别从wlml1和野生型品种基因组中扩增出这一个候选基因进行测序分析。具体如下：

目标基因测序引物的序列：

S1F:CGTGGGTTTCTTTTCACCTACA

S1R:ATGACATTTTGATGGCACAGGA

S2F:GATTGTCACCAACTTGCTACTGC

S2R:TTCAGAACTCATTATTTGGCACAC

S3F:GGAAGTCTGGAAAGTTTGATGC

S3R:CTTTCAAAATCCATTGCTTCTCA

S4F:TGTGATGACATGGACCAGGTAAT

S4R:GGGAGAGGGAAGGGACACAC

PCR扩增体系:水稻基因组DNA 5ul，2×KOD Buffer 25ul，2mM dNTP10ul，10uM F/R引物个3.0ul,KOD FX DNA聚合酶1ul，ddH2O 3ul，总体系50ul。

PCR扩增条件:94℃预变性4分钟；98℃变性1分钟，60℃退火30秒，68℃延伸1分钟，32个循环；68℃补齐10分钟。

发现其中该基因的基因组DNA片段中，突变体wlml1扩增的产物与野生型品种比较有1个碱基突变。在该位点前后各150bp左右设计前后引物，利用该对引物，继续扩增野生型和突变体DNA，进行测序比较，并重复三次，发现突变体wlml1与野生型比较在该位点均存在单碱基突变。根据RAP-DB的关于该基因的注释，该基因编码的是一个叶绿体前体蛋白。

检测引物为：

M-F：TAGCCCCGTCGTGGTCGC

M-R：ACGAATCAAATAGTTCCTCTGGGG

实施例2：

植物转化：

以野生型基因组DNA为模板，利用PCR克隆目的基因，该克隆覆盖了整个目的基因ORF的基因组区域，还包括ATG上游2.1kb序列和TAG下游1.1kb序列。电泳检测，并通过胶回收后，将目的基因通过同源重组法连接在已被EcoRI和XbalI酶切的pCAMBIA1300质粒上。通过电击的方法将质粒转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中，然后通过农杆菌介导转化水稻愈伤。我们利用突变体幼胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有40mg/LHygromycin的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上，在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。

以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。有必要指出，本发明不局限于以上实施例，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种水稻白斑叶控制基因WLML1及其编码的蛋白质与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3165

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggcggcgg ctgcccccgc gacgacgtca tccgcggccg cgaggccctc ctcctcctcc 60

tcctcctcgc ggcaatccga cgctcctctg cgcgccgcca ccgtctcctt cccttactcc 120

cgtacgcgcc cgccggacaa ccaaattttc tctccatctg agtcttttct tactcgtcct 180

gatttcattt ttcctcttct ctgtaatttg tctacttacg tgcagcacgg ccggccgcgt 240

tggctgcagg cgctcgggcc tcgcgggtta gccccgtcgt ggtcgccgcc ggcggcgggc 300

accagcggct tatggggtcg ttgactaaca cccaggggct caggtttgga gtggtgagtt 360

agtgtgtcct ccacttctcc cattgttgac ttgtgtatga ctgtagattg ggctaacttt 420

gagttgacgc ggctctacat ggacatgcga gatagcttcc tgcccaattt cttactgatt 480

cgtgaagttt gattgtgtgt tttctgtgct tcacatgaga cattgctcct ggccaatttc 540

tagctgatta ctagtaaagc ttccttcccc agaggaacta tttgattcgt ttgctttatt 600

gataatgctg aaaacacctg gttgtttggt ctaaaaaatg ttgctttact gaaacgccat 660

tgtttactga aaaatctcga caccttttct cctcaactgc ctaacgttgt tgttgttgtt 720

attgttgttg ttgttttttg tcctacaggt tgtggcacgg ttcaatgaga ttgtcaccaa 780

cttgctactg cagggagctc ttgagacatt tgagagatat tccgtcaaaa aagaaaatat 840

aacagtatgc atctttcttg ttctgagtga atttctgttt caaaaagatt ggagtaatcc 900

tgtgccatca aaatgtcata tcattgttcg agcatttttc ttaactagtc ttgaacatca 960

ttcatatcac cactattgta accgttattt ttttagataa tgaccactat tgtaaccgtt 1020

atgcatgcat acaaaattgt tttgttaccc ttgttcccga tgttaaggta aaaaatactt 1080

ttgtcatgaa gtattgacca tgcatagcac tcttgttgga tgacttacct actttgtagg 1140

gttaatatat gtttcatgcc catccacctg ttcctttctt atttcattgt tcagaaatac 1200

tgttctgaag taaaaaatgt aatgcagttt ctctaggccc attaactatt ttccttttgt 1260

tccatgcttg acaatgtatg aactacatat tatcagcatg tttcatggat ttgtaattgt 1320

gaataacctt tcgatgtatg agatgaactt cacacatgta gcattcataa gtagaggtta 1380

actaatgtta gcatggtacg cacttaagct gtgtacaacc tttgttgcat atcagacata 1440

taaagtgatc cacaaaacat atgaattcag acttcatcca tgattggtaa acagccttag 1500

tttgtttaag tttctaaata gtttcagaaa cttttggtgc acattgcctc actctaattc 1560

aaatgattgt ttaggttgta agtgttcctg gcagttttga aattcctgtt gcggcacaaa 1620

agcttgggaa gtctggaaag tttgatgcaa ttttgtgcat tggcgctgtg gtaagttgtt 1680

tgcctttttg ttcatattac catatatcat ggctccaaga ttgtgtctag gttattttcc 1740

agacacatca taattatctg attcagatac tatatagcct ggtgcagtgt gccaaataat 1800

gagttctgaa atgtttatgt aactcatatt ttacagggtg tcttttaaac aatgccaatc 1860

atatgtctaa tttacactgg acaaaattca actaggagct ttatcataac taacataagg 1920

gcctgtttgg cacagctcca gctctagctc cacccctcct ggagctggag ctcagccaaa 1980

cagttccagc tccaccaaaa atgggagtgg agcttggtgg agctctctca caaaatgaac 2040

tagagttgtg gagctgggtt taggtagctc cacaactcca ctccagaccc aactcctaaa 2100

gctaaattta ggagttggag ctttaccaaa caggcccgtc tagctaacaa tactaagtca 2160

caaagtattt tcccttaatc ccaccgctct tggcatgata atacctttat atctattttt 2220

tgcaagccct tagttatcag tagttggtgc gatttgatta cagaagtctt ccttatgcta 2280

atttgcagat tagaggtgac acaacccact acgatgctgt tgcaaactct gctgcttcag 2340

gtgtactgtc tgctggattg tctgctggta cgttgctttc acctctttgg gtgtagtgcc 2400

tgtaggaacc taattctgta agtttttgtt ttcagctggg gtaactctca gtggaactta 2460

tggcagatta tttattattt ttttattgtt gcacagagat cccatgcata tttggtgttc 2520

tgacatgtga tgacatggac caggtaattc atcattcatt aacatgtatc ttaccaaagt 2580

ttctattatt ccatatccaa tttataactc gtcgtttgtc aagtagttat tctgtacttt 2640

tgaaccatag taatttgaga agcaatggat tttgaaagtt tcttactcga aatgtagctg 2700

tcatgttccc aacccttatg tttaactcta atggaagatg caccaccact ttggcgtgct 2760

gtcatgtgac attgttggtg tgaatatttt agtaaaatga acctgaatca actcgacatg 2820

ggtggactaa tgatacaaga caatcataca tgctttctga taaaattgcc atgcgtactg 2880

tacagatctt tccttgattg tccaaccacc cttgagaagt cacggactat ttatctactt 2940

attaactaat tccctctact aataaaatac atgccacatc aaacctttac aggctctaaa 3000

tcgtgctggt ggtaaggctg gaaacaaggg agctgaagcc gctctaactg cagtgagtac 3060

catttcttga caagtcagat agaaacctgg attcattttc atctcaacaa actatctttc 3120

ctgtagatcg agatggcctc gctgttccag catcacctgg cctga 3165

<210> 2

<211> 221

<212> PRT

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Ala Ala Ala Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ala Ala Ala Arg Pro

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Gln Ser Asp Ala Pro Leu Arg Ala

20 25 30

Ala Thr Val Ser Phe Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Ala Ala Leu Ala Ala

35 40 45

Gly Ala Arg Ala Ser Arg Val Ser Pro Val Val Val Ala Ala Gly Gly

50 55 60

Gly His Gln Arg Leu Met Gly Ser Leu Thr Asn Thr Gln Gly Leu Arg

65 70 75 80

Phe Gly Val Val Val Ala Arg Phe Asn Glu Ile Val Thr Asn Leu Leu

85 90 95

Leu Gln Gly Ala Leu Glu Thr Phe Glu Arg Tyr Ser Val Lys Lys Glu

100 105 110

Asn Ile Thr Val Val Ser Val Pro Gly Ser Phe Glu Ile Pro Val Ala

115 120 125

Ala Gln Lys Leu Gly Lys Ser Gly Lys Phe Asp Ala Ile Leu Cys Ile

130 135 140

Gly Ala Val Ile Arg Gly Asp Thr Thr His Tyr Asp Ala Val Ala Asn

145 150 155 160

Ser Ala Ala Ser Gly Val Leu Ser Ala Gly Leu Ser Ala Glu Ile Pro

165 170 175

Cys Ile Phe Gly Val Leu Thr Cys Asp Asp Met Asp Gln Ala Leu Asn

180 185 190

Arg Ala Gly Gly Lys Ala Gly Asn Lys Gly Ala Glu Ala Ala Leu Thr

195 200 205

Ala Ile Glu Met Ala Ser Leu Phe Gln His His Leu Ala

210 215 220

<210> 3

<211> 24

<212> 人工序列（P21F）

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 3

ggagacaact ctggtcttga cagc 24

<210> 4

<211> 22

<212> 人工序列（P21R）

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 4

ggacctcgcg tagttgaagt cg 22

<210> 5

<211> 20

<212> 人工序列（P23F）

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 5

aacatcagag accgacctgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> 人工序列（P23R）

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 6

agctgaatgc gttggatttt 20

Claims

1.一种水稻白斑叶控制基因WLML1编码的蛋白质在改良水稻白斑叶中的应用，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如Seq ID No：2所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1中所述蛋白质的基因在改良水稻白斑叶中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如Seq ID No：1所示的核苷酸序列。