CN101492682A

CN101492682A - 水稻杂种花粉育性基因及其应用

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Publication number: CN101492682A
Application number: CNA2008101323419A
Authority: CN
Inventors: 刘耀光; 龙云铭; 赵利锋; 牛白晓; 庄楚雄
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2008-07-11
Publication date: 2009-07-29
Anticipated expiration: 2028-07-11
Also published as: CN101492682B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及水稻杂种花粉育性基因座Sa的2个命名为SaM和SaF的基因的分离克隆和应用。细菌双杂交实验证明籼稻和粳稻的SaM和SaF的特定等位基因编码的蛋白发生特异的相互作用。遗传分析和转基因功能互补实验表明，在杂种中杂合的SaM和来源于籼稻的SaF即3个等位基因的相互作用产生杂种花粉不育，缺少它们中的任何一个或抑制其表达时产生杂种亲和性即花粉可育。本发明还涉及利用所述基因培育水稻杂种育性亲和系的方法和应用，以及鉴定水稻杂种育性基因型的分子标记及其应用。

Description

水稻杂种花粉育性基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及水稻杂种花粉育性基因的分离克隆及其功能验证，以及在水稻杂交育种中的应用。

背景技术

植物通过不同品种间的杂交产生杂种。杂种在生长势、适应性、产量等方面具有优势，称为杂种优势。利用杂种优势可以提高农作物的产量、品质和抗性。亚洲栽培稻的籼稻(Oryza sativa ssp.indica)和粳稻(O.sativa ssp.japonica)亚种间的杂种有强大的杂种优势，增产潜力很大。另一方面，通过栽培稻与野生稻杂交和回交等育种方法，可以将存在于野生稻的一些有用性状如抗病、抗虫、高产等导入栽培稻，培育出优良新品种。但是，籼粳亚种间杂交以及栽培稻与野生稻杂交产生的杂种存在育性低或不育的问题，称为杂种不育(hybridsterility)。所述的杂种不育是稻属物种分化过程中产生的生殖隔离的机制之一，属于合子后生殖隔离(postzygotic isolation)。杂种不育现象严重阻碍了水稻杂种优势和野生稻有用基因的利用。

在水稻中，有多个基因座(locus)与水稻杂种育性有关。所述的基因座是细胞遗传学水平的概念，是指染色体的一个特定区域，可能包含1个或1个以上的相关基因控制同一性状。这些杂种育性基因座中，有些是导致雌配子不育，如S5，S7，S8，S9，S15，S17，有些是导致雄配子(花粉)不育，如Sa，Sb，Sc，Sd，Se，Sf(Kinoshita 1995，Rice Genet.Newsl.，12：9-15；Ikehashi等1988，Japan J.Breed.38：283-291；Ikehashi等1996，Rice Genet III，pp404-408；Wang等1996，Theor Appl Genet92：183-190；Wang等1998，Rice Genet Newsl 15：151-154；张桂权等1989，中国水稻科学3：97-101；张桂权等1993，遗传学报20：222-228；张桂权等1993，遗传学报20：541-551；张桂权等1994，遗传学报21：34-41)。这些基因座在不同品种或品系或野生稻材料中可以有不同程度的变异分化，产生多种复等位基因座。根据携带这些复等位基因座的水稻亚种类型以及对杂种育性的效应，它们被划分为籼型(Sⁱ)、粳型(S^j)、亲和型(Sⁿ)、或其它过渡类型。所述的基因符号S代表杂种育性基因座，S5，Sa等指特定的杂种不育基因座，ⁱ，^j，ⁿ分别代表籼型(indica)、粳型(japonica)、和中性型(neutral)的复等位基因座，如Saⁱ、Sa^j、或Saⁿ。中性型也称为亲和型(compatibility)或广亲和型(wide compatibility)。

在水稻杂种中，分化程度较大的杂种育性基因座在杂合状态下往往发生不亲和互作，导致携带某一等位基因座的雄配子(或雌配子)发育不正常。这种现象也称为杂种的等位基因特异杀配子(allele-specific gamete elimination)效应。但是，这些基因座在纯合状态下(如纯合的亲本)不影响配子的正常发育。大部分杂种不育基因座的遗传行为符合“单座位孢子体-配子体互作”的模式(Oka，1974，Genetics 77，521-534)。例如，用分别携带Sa^j/Sa^j和Saⁱ/Saⁱ基因型的水稻粳稻和近等基因系杂交，产生的杂种一代(F₁)的基因型为Saⁱ/Sa^j。其产生的雄配子中，携带Saⁱ等位基因座的正常可育，而携带Sa^j等位基因的雄配子发育异常(不育)。因此表现为约50％的花粉不育即半不育。但雌配子的育性不受Saⁱ/Sa^j杂合基因座的影响。结果导致杂种二代(F₂)代群体中携带Sa^j/Sa^j基因型的植株的比例严重偏少，即严重偏离Saⁱ/Saⁱ∶Saⁱ/Sa^j∶Sa^j/Sa^j＝1∶2∶1的孟德尔分离规律。但是，用携带亲和型等位基因座Saⁿ/Saⁿ的亲本与携带SaⁱSaⁱ或Sa^jSa^j等位基因的水稻亲本杂交(F₁的基因型为Saⁿ/Saⁱ或Saⁿ/Sa^j)，F₂代群体中3种基因型的分离符合1∶2∶1的分离规律，即该杂合的等位基因不产生等位基因特异杀配子效应，Saⁿ对籼型和粳型等位基因座都是亲和的。因此，用携带亲和等位基因座的亲本与粳稻或籼稻杂交，可以提高杂种的育性。

目前已报道了一些水稻杂种育性基因的染色体定位，但杂种花粉不育或亲和(可育)的分子基础还不清楚。Sa是控制水稻杂种花粉育性的基因座之一，它已被初步定位于第1染色体(庄楚雄等1994，遗传学报21：34-37)。为了在杂交水稻育种中有效地克服杂种不育性问题，本发明通过图位克隆(map-based cloning)技术在Sa座获得了的2个相邻的杂种育性相关基因，包括它们的籼型和粳型等位基因，以及产生亲和性的等位基因组合。通过转基因实验验证了这些基因的功能，并提出通过基因工程技术或杂交-回交育种培育杂种育性亲和系的方法。

发明内容

(一)所要解决的技术问题

本发明的第一个目的是分离克隆水稻杂种花粉育性基因的DNA片段。

本发明的第二个目的是提供上述杂种花粉育性基因所编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供上述杂种育性基因在培育杂种育性亲和系中的应用。

本发明的再一个目的是提供上述杂种育性基因产生的分子标记或其紧密连锁标记及其在水稻杂交育种中的应用。

(二)技术方案

本发明涉及分离和应用包含杂种育性基因座Sa有关的基因，该基因控制水稻品种(系)间或水稻与野生稻间杂交产生的杂种的花粉育性。

本发明利用图位克隆法克隆了Sa基因座有关基因并验证了其功能，其技术方案如下：

1、Sa基因座的精细定位和目标基因的发现

Sa基因座已被定位于水稻第1染色体上的大致区域(庄楚雄等1994，遗传学报21：34-37)。根据公开的水稻基因组序列数据库的资料(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，在该区域发展了多个分子标记。用粳稻台中65(代号T65，携带Sa^j/Sa^j基因型)和它的近等基因系E4(携带籼型基因型Saⁱ/Saⁱ)杂交，产生F₁和F₂群体，经过连锁分析，把Sa精细定位在一个10.6kb的区间。

根据水稻基因组序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的资料，在定位的10.6kb区间内有2个相邻的基因，本发明将它们分别命名为SaM和SaF。遗传分析表明，在F2重组体中，只有含有杂合的SaM以及同时有来源于E4的SaF等位基因，即同时含有这3种等位基因的个体才能产生杂种花粉半不育。表明Sa座位由SaM和SaF组成，这2个基因的遗传互作是Sa座位产生杂种不育的原因。进一步用细菌双杂交系统证实这2个基因的特定等位基因编码的蛋白之间发生相互作用。

2、SaM和SaF等位基因的序列测定比较分析

用聚合酶链式反应(PCR)技术从多个籼型、粳型、和亲和型水稻品种(系)扩增出SaM和SaF等位基因片段并测定其序列。籼型SaM和SaF等位基因被命名为SaM⁺和SaF⁺，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5所示，它们分别编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7所示的氨基酸多肽序列。粳型的SaM和SaF等位基因被命名为SaM^-和SaF^-，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：7所示，它们分别编码具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示的氨基酸多肽序列。SaM⁺和SaM^-编码新的蛋白SaM⁺和SaM^-，其C端与酵母的Mms21蛋白即类泛素E3连接酶(small ubiquitin-likemodifier E3 ligase)有部分同源。与SaM⁺相比，SaM^-的C端截断了40个氨基酸。SaF⁺和SaF^-编码功能未知的F-box蛋白，它们之间存在1个氨基酸差异，即在287位处SaF⁺是苯丙氨酸氨，SaF^-变为丝氨酸。亲和型品种含有SaM⁺/SaM⁺//SaF^-/SaF^-基因型。这些不同的基因型品种间的杂种含有不同组合的杂合基因型，产生雄配子不亲和效应即花粉半不育，或亲和效应即花粉全可育。

3、SaM和SaF等位基因的功能验证

用PCR技术从E4扩增SaM⁺和SaF⁺，以及从T65扩增SaM^-，它们包括启动子区、编码区、以及下游序列，构建植物转化表达载体。将SaM^-转化含有基因型为SaM⁺/SaM⁺//SaF⁺/SaF⁺的E4，获得的T₀代转化体表现为花粉半不育；将SaM⁺转化含有基因型为SaM^-/SaM^-//SaF⁺/SaF^-的花粉全可育重组体，获得的T₀代转化体表现为花粉全不育；将SaF⁺转化含有基因型为SaM⁺/SaM^-//SaF^-/SaF^-的花粉全可育重组体，获得的T₀代转化体表现为花粉半不育。另外，在粳稻中导入产生RNA干扰(RNA interference，RNAi)反应的SaM或SaF的序列结构，再与E4杂交。产生的杂种F₁的SaM或SaF的表达受到抑制，结果其花粉育性得到恢复。这些结果证明了各个等位基因的生物学功能，说明只有当SaM⁺、SaM^-以及SaF⁺这3个等位基因都具备时才使含有SaM^-的花粉产生不育；植株中缺少其中的任何一个等位基因，或抑制任何一个基因的表达，可以恢复杂种的花粉育性。

应当理解，在不影响SaM以及SaF蛋白活性的前提下，本领域技术人员可对SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6以及SEQID NO：8所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。

此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响SaM或SaF表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。

(三)有益效果

本发明提供的杂种育性基因具有重要的应用价值。应用之一是培育杂种育性亲和系。本发明提供通过基因工程技术如使用RNA干扰技术或反义RNA技术或其它有效技术，控制SaM或SaF或它们二者的表达，获得能抑制所述基因表达的杂种育性亲和系。还可以用获得的转化植株为亲本与其它水稻品种或品系杂交，培育出新的杂种育性亲和系。本发明所述的基因构建到转化载体中，可以对所述基因或其调控序列作适当修饰，也可以用其它启动子取代所述基因原有的启动子，使之达到同等的或强化的表达效果。

本发明提供的杂种育性基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、Indel(插入缺失多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)。用这些标记可鉴定栽培稻或野生稻或它们的杂交后代群体植株的基因型，培育水稻杂种育性亲和系。例如，可以用携带亲和型Sa基因座如其基因型为SaM⁺/SaM⁺//SaF^-/SaF^-的栽培稻或野生稻材料为供体亲本，其它粳稻或籼稻品种(系)为轮回亲本，进行杂交和回交，利用根据本发明产生的特异分子标记进行筛选，培育出新的杂种育性亲和系。用本发明的方法获得杂种育性亲和系与其它粳稻或籼稻或野生稻亲本杂交，可产生育性正常的杂种，有利于新的品种选育或生产杂交种。

附图说明

图1、显示水稻Sa基因的遗传模式及其基因型对花粉育性的效应。(A)粳稻T65(Sa^jSa^j)产生的正常可育花粉；(B)近等基因系E4(SaⁱSaⁱ)产生的正常可育花粉；(C)T65与E4杂交的杂种F₁(SaⁱSa^j)产生半不育花粉，即约50％的花粉不育；(D-F)T65x E4杂种的F₂植株中，不同基因型植株的频率及其花粉育性。各种基因型频率是用Sa共分离标记M76.3(图2，表1)检测666株F₂植株所得。

图2、显示水稻Sa基因座在第1染色体的精细定位及SaM与SaF基因的发现。各标记的数字同时表示在一个公开的细菌人工染色体P0013G02上的位置(kb)。ATG和TAG/TGA分别表示起始密码和终止密码。

图3、显示籼型(E4)和粳型(T65)的SaM和SaF蛋白结构及其差异。

图4、显示功能互补实验，转基因导入tSaM^-(A)、tSaM⁺(B)、和tSaF⁺(C)使受体水稻产生花粉半不育或全不育。转化受体水稻的基因型如图所示。

图5、显示用细菌双杂交检测SaM⁺(M⁺)、SaM^-(M^-)、SaF⁺(F⁺)、和SaF^-(F^-)的互作。细菌生长表示有互作。pBT和pTRG为诱饵载体和捕获载体，分别用于表达SaM和SaF。

图6、显示用反转录PCR检测SaM和SaF在亲本幼穗的表达以及它们在杂种F₁幼穗的表达受RNA干扰(RNAi)的抑制。SaM⁺(E4)和SaM^-(T65)的全长cDNA分别为1101bp和1021bp。

图7、显示RNA干扰抑制SaM和SaF在杂种F₁的表达产生育性恢复。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容。若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：多态性分子标记的筛选和Sa的精细定位

已知Sa定位在水稻第1染色体上的大致区域(庄楚雄等1994，遗传学报21：34-37)。本发明用如图2所示的图位克隆方法进一步克隆Sa基因。首先用粳稻品种台中65(简称T65，具有基因型Sa^jSa^j)与其近等基因系E4(SaⁱSaⁱ)杂交，建立了一个F₂代分离群体。本发明所用的近等基因系E4，是除了Saⁱ等位基因座及其附近区域是来源于籼稻外，其核基因组背景与T65相同的品系(庄楚雄等1994，遗传学报21：34-37)。因此它们的杂种的雄性不育性的遗传分离只受SaⁱSa^j杂合基因互作效应的影响。用1％I₂-KI溶液染色鉴定花粉的形态，确定F₂植株的花粉育性表型，即全可育或半不育(图1)。

根据公开的水稻基因组序列数据库的资料(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，在该区域发展了多个多态性分子标记，如表1所示。

表1.与Sa紧密连锁或共分离的多态性分子标记

表1中的SSR为微卫星标记；Indel为插入/缺失标记；SNP为单核苷酸多态性标记。基于PCR的一种SNP检测方法为：在20μl PCR反应液中加入1μl水稻DNA(约50ng)，用表1所示的引物“A”和“B”扩增33个循环(94℃ 30s，63℃ 1min，72℃ 1min)。然后取0.5μl PCR产物为第2次PCR的模板，每个样品配制2个PCR反应(20μl)，即用引物“A”和“B-i”为E4基因型的特异反应，用引物“A”和“B-j”为T65基因型的特异反应，扩增8-10个循环(94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 1min)。用1％琼脂糖凝胶检测PCR产物。

利用遗传作图的方法和上述10000多株F₂植株构建了一个Sa基因座的遗传连锁图(图2)。图中所示的重组体将Sa基因座确定在2个标记即M69和M79.6之间的10.6kb区域内。所述的定位区域位于已公开的水稻细菌人工染色体P0013G02(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的约69-79.6kb处。

实施例2：Sa座位相关基因的序列分析

根据GenBank公开的水稻(粳稻)基因组DNA序列和RiceGAAS软件(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)分析，在所述的定位区域内只存在2个预测的基因，分别命名为SaM和SaF。遗传分析表明，在不同的F₂重组体中，只有含有杂合的SaM以及同时有1个或2个来源于E4的SaF等位基因即杂合SaF或纯合的E4SaF的个体才能产生杂种花粉半不育(图2)。表明Sa座位由SaF和SaM组成，这2个基因的3个等位基因的遗传互作产生杂种不育。

使用引物5’TCTAAGGGATCCAGGCGCGGGTGAAGCAAACTAGAC-3’(下划线为BamHI)和5’ATTTAAGAATTCGCCGTCTTAACACACATTGGAAAA-3’(下划线为EcoRI)用PCR技术从T65、E4、和多个籼型(广路矮4、93-11、明恢63等等)和粳型(日本晴、中花11等等)水稻DNA扩增出SaF基因片段。本PCR反应使用高保真LA-Taq酶(宝生物工程公司)，扩增30个循环(94℃ 30s，62℃1min，72℃ 5min)。使用引物5’-TGGATAAGCTTAGTACTATACTTGATGGGGTGCAAGTAA-3’(下划线为Hind III)和5’TGTTGAGCTCGGGCGTTGTTTCATCTTATTAAAAATAATG-3’(下划线为SacI)，用PCR技术从T65、E4、和多个籼型(广路矮4、93-11、明恢63等等)和粳型(日本晴、中花11等等)水稻DNA扩增出SaM基因片段。将获得的基因片段连接克隆到质粒载体pUC18，并测定其序列。

E4及其它籼稻品种如广路矮4、93-11、明恢63的SaM和SaF等位基因被命名为SaM⁺和SaF⁺，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5所示，它们分别编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7所示的氨基酸多肽序列。T65及其它粳稻品种如日本晴、中花11的SaF和SaM等位基因被命名为SaM^-和SaF^-，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7所示，它们分别编码具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8所示的氨基酸多肽序列。这些籼稻和粳稻品种可以从中国的育种机构(如中国水稻研究所种质资源库)或种子商品市场获得。SaM编码1个新的蛋白，其C端与酵母的Mms21蛋白即类泛素E3连接酶有部分同源。与SaM⁺的基因组序列相比，SaM^-在第5内含子的3’剪切位点即分子标记M74.6的位置存在1个单核苷酸的变异即“G”改变为“T”。此变异导致SaM^-丢失了第6个外显子(80bp)以及移码产生新的终止密码，使其编码的蛋白的C端截断了40个氨基酸(图2、图3)。SaF编码1个功能未知的F-box蛋白，SaF⁺和SaF^-之间存在由编码区的860位即分子标记M68.9的1个单核苷酸多态产生的1个氨基酸差异，即在蛋白序列287位处SaF⁺是苯丙氨酸氨，SaF^-变为丝氨酸(图2、图3)。

实施例3：遗传转化鉴定目标基因的功能

将实施例2所述的SaM⁺、SaM^-、以及SaF⁺，它们包括启动子区、编码区、以及下游序列，克隆到双元转化载体pCAMBIA1300(澳大利亚CAMBIA公司)。获得的载体转基因分别命名为tSaM⁺、tSaM^-、和tSaF⁺。用电激法将这些载体导入土壤根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105，以根癌农杆菌介导法(Hiei等，Plant J.6：271-282)转化适合基因型的水稻。将tSaM^-转化含有基因型为SaM⁺/SaM⁺//SaF⁺/SaF⁺的E4，获得的4株T₀代转化体表现为花粉半不育(图4A)。将tSaM⁺转化由65与E4杂交产生的杂种后代中分离出的含有基因型为SaM^-/SaM^-//SaF⁺/SaF^-的花粉全可育重组体，获得的8株T₀代转化体表现为花粉全不育即不育花粉率达到或接近100％(图4B)。这是因为这种转化体有纯合的SaM^-/SaM^-，其产生的全部携带SaM^-的花粉不育。将SaF⁺转化由65与E4杂交产生的杂种后代中分离出的含有基因型为SaM⁺/SaM^-//SaF^-/SaF^-的花粉全可育重组体，获得的4株T₀代转化体表现为花粉半不育(图4C)。

本实施例验证了各个等位基因的生物学功能，并证明SaM⁺、SaM^-、以及SaF⁺这3个等位基因具备时使含有SaM^-的花粉产生不育；缺少其中的任何一个等位基因时不产生杂种不育。

实施例4：SaM和SaF的表达蛋白的互作

用引物对5’-TCAGAATTCGAACTCCCGACTCCTTCCTC-3’/5’-TGACTCGAGTCAGTGGCAGTACTTTATGTC-3’，和5’-TCAGAATTCGAACTCCCGACTCCTTCCTC-3’/5’-TGACTCGAGCAAATACCAGGTCGTTTGACAC-3’，将SaM⁺和SaM^-的编码区序列PCR扩增；用引物对5’-CCACCGGGATCCCATGGAGGAGG TCATCG-3’/5’-AGAACACTCGAGAGG GAATAATCTAAAGGATCATC-3’将SaF⁺和SaF^-的编码区序列PCR扩增，克隆到细菌双杂交系统BacterioMatchtwo-hybrid system试剂盒(美国Stratagene公司)的载体，按照试剂盒说明的实验条件和步骤进行了蛋白互作实验。结果表明，SaF⁺和SaF^-蛋白能够与SaM^-互作，但不能与SaM⁺互作(图5)，表明SaM⁺的C端存在抑制该蛋白与SaF互作的氨基酸序列。

实施例5：抑制SaM和SaF的表达产生杂种亲和性

用引物对5’-CCCTGCAAGCTTCGCCCGCCCCGGCCGTCC-3’/5’-TTGGAACGGATCCATTCCATGTACAGAATA-3’和5’-CCACCGGGATCCCATGGAGGAGGTCATCG-3’/5’-CCGAAGCTTGGGAATAATCTAAAGGATCATC-3’分别扩增SaM和SaF的cDNA片段，按公开的方法克隆到RNA干扰载体(胡旭霞、刘耀光2006，分子植物育种4：621-626)。用电激法将这些载体导入土壤根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，以根癌农杆菌介导法(Hiei等，Plant J.6：271-282)转化粳稻品种T65，获得转化体。将转化体与E4杂交，获得杂种F₁。利用引物对5’-GTCCCTGCCCATTTCGCCCT-3’/5’-GCCCAACGCTGACAGTGCTCA-3’和5’-CCGCTGTGTTCTCCTGCTCA-3’/5’-GGGGATAAGTGTCTTGAAGCTTA-3’，按照反转录酶试剂盒SuperScript III kit(美国Invitrogen公司)说明的条件分别对这些杂种的SaM和SaF进行反转录PCR检测。PCR反应利用Ex TaqDNAPolymerase Kit(大连Takara公司)进行28个循环(94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 2min)。结果证实，SaM和SaF的表达受到抑制(图6)。观察这些杂种的花粉育性，表现为全可育(图7)。因此，利用本发明的方法，可以创建SaM或SaF的表达受抑制的水稻杂种亲和系，用于产生可育的杂种。

实施例6：利用SaF和SaM的分子标记鉴定水稻的基因型

利用本发明提供的序列信息可以产生SaM和SaF等位基因特异的分子标记，用于鉴定水稻和野生稻Sa座位的基因型，可在分子标记辅助选择育种过程中加以应用。例如，本实施例利用表1所示的标记M68.9和M74.6，鉴定了多个粳稻和籼稻的基因型。结果发现，所有检测的粳稻品种具有SaM^-/SaM^-//SaF^-/SaF^-基因型，大部分籼稻品种有SaM⁺/SaM⁺//SaF⁺/SaF⁺基因型，约10％的籼稻品种有SaM⁺/SaM⁺//SaF^-/SaF^-基因型(表2)，这些品种均表现为花粉全可育。由于SaM⁺/SaM⁺//SaF^-/SaF^-基因型的籼稻品种与粳稻品种杂交的杂种在该座位缺少等位基因SaF⁺，因此不产生花粉不育性。它与SaM⁺/SaM⁺//SaF⁺/SaF⁺基因型的籼稻品种的杂种在该座位缺少等位基因SaM^-，因此也不产生花粉不育性。因此该基因型为亲和型等位基因座，即Saⁿ。含有此等位基因的品种为Sa亲和品种。用这些品种为亲和基因供体，与其品种杂交和回交，可培育新的杂种亲和品种。

表2.用分子标记M68.9和M74.6鉴定籼稻和粳稻品种的基因型

序列表

<110>华南农业大学

<120>水稻杂种花粉育性基因及其应用

<130>

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5700

<212>DNA

<213>稻属水稻品系E4

<220>

<221>CDS

<222>(1292)..(1556)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1641)..(1712)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2625)..(2720)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2814)..(2888)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2971)..(3084)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3411)..(3490)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(4639)..(4715)

<400>1

gtggaggaag tcccaacaaa atttagagac agcataaaac agctgtaatt ccattcgagc 60

caatatatct tttttccttc ttcttccaga tgttaactgg ttactataga atttgttcaa 120

ttagatggaa aagacaatct gatttagcga acaataatgt tgtggtcgta attaagcaca 180

tcagttttgg gctaccagaa ctggtgtcac ttggtaaggc ctttcgaata taagttattt 240

ttctcttttt tttaatcaac tattaagttg ttctggcaaa aatctttgta aattctaaac 300

aaggcttggt tacccaacat tttgatatgt gcttggtcca tctccaatgc agcttgtaca 360

tgttcgtgtg cgctaacata attgttagaa acatatgtac ggtgtgattg tggtgttatc 420

taccaagatt taaatagact taaatgttgg tgtccataaa tgttaaggtt agtgattttc 480

ggttagttcc gtctttttcc aatgtgtgtt aagacggcga acctttaaat acttatttaa 540

tagagttcaa atttcatcgc agtaatagta atactatcgt ttatcacaaa ttatccatac 600

tatcttttga tttgattata atttcaattt agatgggacc tataccccca cacatttcaa 660

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ggtgtcattt taaatcattc tattttttaa aatgaataaa catgtggatg gtgtcatttt 780

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<212>PRT

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Ser Asp Thr Val Ala Pro Ser Pro Pro Ser Pro Cys Glu Ser Gln Glu

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Gln Pro His His Leu Gly Lys Arg Leu Glu Asp Val Leu Ile Ser Leu

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Arg Asp Val Ala Phe Gln Phe Ile Lys Ile Gly Arg Gln Asp Glu Val

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Cys Gly His Ile Phe Asp Arg Gln His Ile Met Asn Tyr Met Gly Ser

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His

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<212>DNA

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<220>

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<223>

<220>

<221>CDS

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<223>

<220>

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<223>

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<223>

<220>

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<223>

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<223>

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<213>稻属水稻品系T65

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<223>

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<223>

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aataaggagg gcctctcagt cgcccacaac ctcagaccaa aaggcttgtg cactcgtctc 1080

tcatctcgtc ctcctcgtgc tcctccgcca aaaccccgac gccgccaaaa ccccaatcca 1140

atcgggctcc gactccgact ccgaccaccg cgccggcatg gaggcggtca tcgcggagtg 1200

ccgccccaag cctctcttca ccaccgggcc cttcctctcc gccgtcggcg gcggcggcgg 1260

cggcgtcgac cgcatctccg ggctccccga cgacctcctc tttgtcatcc tctccaagct 1320

ccccgtcagg gatgccgtgg cgacgtccgc cctctccccc cgctggaaga gcctctggtc 1380

cagcgtcccg ctccgcctcg acgacgccgg cctcctccac cgccgcgacg gcacgcgcct 1440

cggccgggaa ggcgtcgccg ccaccgtctc cgccgtcctc gccgcccacc caggccccgt 1500

gcccgcggcc tccgttgggt gctgcctctc ctccgacgac cagggctacc agctgggagg 1560

ctggctccga gccctcgccg ccaagggcgt tcggcaactg tgcctgatgg gcgcgccatg 1620

gtcgccgcgc gctgctctcc cctccgctgt gttctcctgc tcatccctgc ggcgcctctt 1680

ccttggttcc gtgcaatgca actgggacct cataccagac catgcctgct tccctgagct 1740

acgagagatc cagatatgca acgccctaat gaagagccag gatctgtccc ttgttttggc 1800

tgtctgccca gcgcttgaga cagtggagat tcttgcgagc cgtaacaaaa tccccaccgt 1860

gcgaatgagt agccatacta tccgcaatac tttgctatgg aagtcggtgg ccaaggaagt 1920

gaacgttttg gacacccctt gcctcagcag ggttgttttg tggcaggatc ttctgctgcc 1980

ccactcaaga tataattcta aggtcacaat cagccgtgcc accaaaatgc gcattttcgg 2040

ttacctggac accggcatca acactttggt gatcaacgaa accacagtta aggtatttgt 2100

ccctttgttg gatactatat atctctaatc atatcgaatc tgtgaaactg tgttaacgcg 2160

ttttaatcgt tgaatttgaa ggtaaacaca aatataagct tcaagacact tatccccagc 2220

gtgaaggttt tgggtctctc tgttcatttc ggagtacgaa aggaggcttt gatgtccatc 2280

agcttcctta ggtgttttcc agaggttgag acactacata taactgtgag atttctttcc 2340

ttctttcatt cccgacatat atatacataa atgtgagatt gcgagatagc tgtctttctt 2400

ctttcattcc tgacatatgc atcattttac acactcactg cagccattct ttcattcccg 2460

acatatgcat cattttacac actcactgca gccatatgtt cctttgatag ctggaggtga 2520

tcaatttttc ttcttgtgca gagcaaaacg gacaaggctt cagaagccga acaattcagt 2580

ttctggggaa aggttgatcc tgttgagtgt gtgacctctc atctcaagaa gttagtgttc 2640

catgggatgc catggtgtcc tggaaacctt gagtttctca aattcatcgt ggaaggggca 2700

tacttgctag agaaggtgtt gattgttctt cctaaaggaa cttacactag catgcatagc 2760

gttatcacca aactcaagtt agcacctttg acctctgcaa gttgggctag tcacatctgt 2820

aaaatggagg ttgtccaatc cagtcaagga actttgagct accaaagggc atctgatcat 2880

tccgtcgatg atcctttaga ttattccctg taggctgttc tatctgtttg ttgtgattat 2940

aacatattgt cgatatggtt atcctttagg tccttcatgt ctgtatgcca ttttcatgtg 3000

ttttggcttg ttatctagag aaaaatgtat ggtttgttgg atatgcttag tactatactt 3060

gatggggtgc aagtaataga atgcagagca tctgatgtgt cagtagttcc tctccattac 3120

ttcttgtggc aagacagcaa gatactctac tctcgatttt gttgcctctg cttctgtttc 3180

ttgtggatta attcatcatg cgtcatattg ggcggcatcg gtctctcatg tctgagaatt 3240

gtagtaagag caggtacaat agcaggctat aagccagctg caaatatatt ttaaggagat 3300

aaatgaggag agagaagagc agcgggctac agatttgtag ccagctgtag tacagactcc 3360

aagacacagt gtgtgtatga caggtgtgac caggtattaa tagtgtagta tgtaactatt 3420

gtatgaatga gccattagat tagctataga tgaattggag ttagtagttg gctatactat 3480

taaacttgcg agcaacagat gtggaggaag tcccaacaaa atttagagac agcataaaac 3540

<210>6

<211>476

<212>PRT

<213>稻属水稻品系E4

<400>6

Met Glu Ala Val Ile Ala Glu Cys Arg Pro Lys Pro Leu Phe Thr Thr

1 5 10 15

Gly Pro Phe Leu Ser Ala Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Arg

20 25 30

Ile Ser Gly Leu Pro Asp Asp Leu Leu Phe Val Ile Leu Ser Lys Leu

35 40 45

Pro Val Arg Asp Ala Val Ala Thr Ser Ala Leu Ser Pro Arg Trp Lys

50 55 60

Ser Leu Trp Ser Ser Val Pro Leu Arg Leu Asp Asp Ala Gly Leu Leu

65 70 75 80

His Arg Arg Asp Gly Thr Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Ala Ala Thr

85 90 95

Val Ser Ala Val Leu Ala Ala His Pro Gly Pro Val Pro Ala Ala Ser

100 105 110

Val Gly Cys Cys Leu Ser Ser Asp Asp Gln Gly Tyr Gln Leu Gly Gly

115 120 125

Trp Leu Arg Ala Leu Ala Ala Lys Gly Val Arg Gln Leu Cys Leu Met

130 135 140

Gly Ala Pro Trp Ser Pro Arg Ala Ala Leu Pro Ser Ala Val Phe Ser

145 150 155 160

Cys Ser Ser Leu Arg Arg Leu Phe Leu Gly Ser Val Gln Cys Asn Trp

165 170 175

Asp Leu Ile Pro Asp His Ala Cys Phe Pro Glu Leu Arg Glu Ile Gln

180 185 190

Ile Cys Asn Ala Leu Met Lys Ser Gln Asp Leu Ser Leu Val Leu Ala

195 200 205

Val Cys Pro Ala Leu Glu Thr Val Glu Ile Leu Ala Ser Arg Asn Lys

210 215 220

Ile Pro Thr Val Arg Met Ser Ser His Thr Ile Arg Asn Thr Leu Leu

225 230 235 240

Trp Lys Ser Val Ala Lys Glu Val Asn Val Leu Asp Thr Pro Cys Leu

245 250 255

Ser Arg Val Val Leu Trp Gln Asp Leu Leu Leu Pro His Ser Arg Tyr

260 265 270

Asn Ser Lys Val Thr Ile Ser Arg Ala Thr Lys Met Arg Ile Phe Gly

275 280 285

Tyr Leu Asp Thr Gly Ile Asn Thr Leu Val Ile Asn Glu Thr Thr Val

290 295 300

Lys Val Asn Thr Asn Ile Ser Phe Lys Thr Leu Ile Pro Ser Val Lys

305 310 315 320

Val Leu Gly Leu Ser Val His Phe Gly Val Arg Lys Glu Ala Leu Met

325 330 335

Ser Ile Ser Phe Leu Arg Cys Phe Pro Glu Val Glu Thr Leu His Ile

340 345 350

Thr Ser Lys Thr Asp Lys Ala Ser Glu Ala Glu Gln Phe Ser Phe Trp

355 360 365

Gly Lys Val Asp Pro Val Glu Cys Val Thr Ser His Leu Lys Lys Leu

370 375 380

Val Phe His Gly Met Pro Trp Cys Pro Gly Asn Leu Glu Phe Leu Lys

385 390 395 400

Phe Ile Val Glu Gly Ala Tyr Leu Leu Glu Lys Val Leu Ile Val Leu

405 410 415

Pro Lys Gly Thr Tyr Thr Ser Met His Ser Val Ile Thr Lys Leu Lys

420 425 430

Leu Ala Pro Leu Thr Ser Ala Ser Trp Ala Ser His Ile Cys Lys Met

435 440 445

Glu Val Val Gln Ser Ser Gln Gly Thr Leu Ser Tyr Gln Arg Ala Ser

450 455 460

Asp His Ser Val Asp Asp Pro Leu Asp Tyr Ser Leu

465 470 475

<210>7

<211>3540

<212>DNA

<213>稻属水稻品系T65

<220>

<221>CDS

<222>(1161)..(2075)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2162)..(2305)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2522)..(2993)

<223>

<400>7

aggcgcgggt gaagcaaact agaccttttt tctgggccaa aaagggccca agctgaggag 60

aggattttta ttacttttcc aattaaccaa tgaaatgaac tacttccaat gctcacataa 120

tttcatgaaa aaaatcctga aaatacttgg acacttaaag tatttaacaa attaaaatca 180

gatcatttaa tgattaattt attatttaaa tattattgaa atgttctttt attattaaaa 240

ttagtaattg agctctgaaa aatctgaaaa aaattccaca gagtataatt aatcatggag 300

agtttaataa aaattaaatc caaccatact ttatatttag aaaattttat ttcccacatt 360

taacttcact tgtaaattaa taaatattta atataaattc taagaataat ttattaaata 420

atttataaat cctgaaacga aaatcatgat gtgacaatgg tttctgccag tgctcctagc 480

tcccgcaata cccccgtgcc cctggccatt gcacatcact cggtggctcg gtgccattga 540

cgacatcggc aagatggaga caaatcggtt taagagtagt aaaaaaaaat actccctccg 600

tccaataata tagtagccta gtaccggacg agacacttca tagtacaacg aatctggaca 660

gtaagcctgt ccagattcgt tgtactatga agtgtcatat ccggtcctaa gttgctatat 720

tatgggatgg agggagtact cgctaacata taggtcccat ggatgtttct ttagctcttt 780

ctatataaca gccacatata tgctatgtta gtacaggtgg accaaatcag cgtgccaagc 840

catcgaaaac tgcccttaaa accacagagg gagtcatttt gtgttgtttt aatagttaga 900

ggggtcgata taccctagtt ttagggtcga gggagatgaa taagattggg ccactagctg 960

agggactcag attggacttt ctttccccta ttttcacagt tggttttgtg ctgggcccaa 1020

aataaggagg gcctctcagt cgcccacaac ctcagaccaa aaggcttgtg cactcgtctc 1080

tcatctcgtc ctcctcgtgc tcctccgcca aaaccccaat ccaatcgggc tccgactccg 1140

actccgacca ccgcgccggc atggaggcgg tcatcgcgga gtgccgcccc aagcctctct 1200

tcaccaccgg gcccttcctc tccgccgtcg gcggcggcgg cggcggcgtc gaccgcatct 1260

ccgggctccc cgacgacctc ctctttgtca tcctctccaa gctccccgtc agggatgccg 1320

tggcgacgtc cgccctctcc ccccgctgga agagcctctg gtccagcgtc ccgctccgcc 1380

tcgacgacgc cggcctcctc caccgccgcg acggcacgcg cctcggccgg gaaggcgtcg 1440

ccgccaccgt ctccgccgtc ctcgccgccc acccaggccc cgtgcccgcg gcctccgttg 1500

ggtgctgcct ctcctccgac gaccagggct accagctggg aggctggctc cgagccctcg 1560

ccgccaaggg cgttcggcaa ctgtgcctga tgggcgcgcc atggtcgccg cgcgctgctc 1620

tcccctccgc tgtgttctcc tgctcatccc tgcggcgcct cttccttggt tccgtgcaat 1680

gcaactggga cctcatacca gaccatgcct gcttccctga gctacgagag atccagatat 1740

gcaacgccct aatgaagagc caggatctgt cccttgtttt ggctgtctgc ccagcgcttg 1800

agacagtgga gattcttgcg agccgtaaca aaatccccac cgtgcgaatg agtagccata 1860

ctatccgcaa tactttgcta tggaagtcgg tggccaagga agtgaacgtt ttggacaccc 1920

cttgcctcag cagggttgtt ttgtggcagg atcttctgct gccccactca agatataatt 1980

ctaaggtcac aatcagccgt gccaccaaaa tgcgcatttc cggttacctg gacaccggca 2040

tcaacacttt ggtgatcaac gaaaccacag ttaaggtatt tgtccctttg ttggatatat 2100

atctctaatc atatcgaatc tgtgaaactg tgttaacgcg ttttaatcgt tgaatttgaa 2160

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tgttcatttc ggagtacgaa aggaggcttt gatgtccatc agcttcctta ggtgttttcc 2280

agaggttgag acactacata taactgtgag atttctttcc ttctttcatt cccgacatat 2340

atatacataa atgtgagatt gcgagatagc tgtctttctt ctttcattcc tgacatatgc 2400

atcattttac acactcactg cagccattct ttcattcccg acatatgcat cattttacac 2460

actcactgca gccatatgtt cctttgatag ctggaggtga tcaatttttc ttcttgtgca 2520

gagcaaaacg gacaaggctt cagaagccga acaattcagt ttctggggaa aggttgatcc 2580

tgttgagtgt gtgacctctc atctcaagaa gttagtgttc catgggatgc catggtgtcc 2640

tggaaacctt gagtttctca aattcatcgt ggaaggggca tacttgctag agaaggtgtt 2700

gattgttctt cctaaaggaa cttacactag catgcatagc gttatcacca aactcaagtt 2760

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cagtcaagga actttgagct accaaagggc atctgatcat tccgtcgatg atcctttaga 2880

ttattccctg taggctgttc tatctgtttg ttgtgattat aacatattgt cgatatggtt 2940

atcctttagg tccttcatgt ctgtatgcca ttttcatgtg ttttggcttg ttatctagag 3000

aaaaatgtat ggtttgttgg atatgcttag tactatactt gatggggtgc aagtaataga 3060

atgcagagca tccgatgtgt cagtagttcc tctccattac ttcttgtggc aagacagcaa 3120

gatactctac tctcgatttt gttgcctctg cttctgtttc ttgtggatta attcatcatg 3180

cgtcatattg ggcggcatcg gtctctcatg tctgagaatt gtagtaagag caggtacaat 3240

agcaggctat aagccagctg caaatatatt ttaaggagat aaatgaggag agagaagagc 3300

agcgggctac agatttgtag ccagctgtat tacagactcc aagacgcagt gtgtgtatga 3360

caggtgtgac caggtattaa tagtgtagta tgtaactatt gtatgaatga gacattagat 3420

tggctataga tgaattggag ctagtagttg gctatactat taaacttgcg agcaacagat 3480

gtggaggaag tcccaacaaa atttagagac agcataaaac agctgtaatt ccattcgagc 3540

<210>8

<211>476

<212>PRT

<213>稻属水稻品系T65

<400>8

Met Glu Ala Val Ile Ala Glu Cys Arg Pro Lys Pro Leu Phe Thr Thr

1 5 10 15

Gly Pro Phe Leu Ser Ala Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Arg

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Ile Ser Gly Leu Pro Asp Asp Leu Leu Phe Val Ile Leu Ser Lys Leu

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Pro Val Arg Asp Ala Val Ala Thr Ser Ala Leu Ser Pro Arg Trp Lys

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Ser Leu Trp Ser Ser Val Pro Leu Arg Leu Asp Asp Ala Gly Leu Leu

65 70 75 80

His Arg Arg Asp Gly Thr Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Ala Ala Thr

85 90 95

Val Ser Ala Val Leu Ala Ala His Pro Gly Pro Val Pro Ala Ala Ser

100 105 110

Val Gly Cys Cys Leu Ser Ser Asp Asp Gln Gly Tyr Gln Leu Gly Gly

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Trp Leu Arg Ala Leu Ala Ala Lys Gly Val Arg Gln Leu Cys Leu Met

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Gly Ala Pro Trp Ser Pro Arg Ala Ala Leu Pro Ser Ala Val Phe Ser

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Cys Ser Ser Leu Arg Arg Leu Phe Leu Gly Ser Val Gln Cys Asn Trp

165 170 175

Asp Leu Ile Pro Asp His Ala Cys Phe Pro Glu Leu Arg Glu Ile Gln

180 185 190

Ile Cys Asn Ala Leu Met Lys Ser Gln Asp Leu Ser Leu Val Leu Ala

195 200 205

Val Cys Pro Ala Leu Glu Thr Val Glu Ile Leu Ala Ser Arg Asn Lys

210 215 220

Ile Pro Thr Val Arg Met Ser Ser His Thr Ile Arg Asn Thr Leu Leu

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Trp Lys Ser Val Ala Lys Glu Val Asn Val Leu Asp Thr Pro Cys Leu

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Ser Arg Val Val Leu Trp Gln Asp Leu Leu Leu Pro His Ser Arg Tyr

260 265 270

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Val Leu Gly Leu Ser Val His Phe Gly Val Arg Lys Glu Ala Leu Met

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Ser Ile Ser Phe Leu Arg Cys Phe Pro Glu Val Glu Thr Leu His Ile

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Thr Ser Lys Thr Asp Lys Ala Ser Glu Ala Glu Gln Phe Ser Phe Trp

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Gly Lys Val Asp Pro Val Glu Cys Val Thr Ser His Leu Lys Lys Leu

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Phe Ile Val Glu Gly Ala Tyr Leu Leu Glu Lys Val Leu Ile Val Leu

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Pro Lys Gly Thr Tyr Thr Ser Met His Ser Val Ile Thr Lys Leu Lys

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Leu Ala Pro Leu Thr Ser Ala Ser Trp Ala Ser His Ile Cys Lys Met

435 440 445

Glu Val Val Gln Ser Ser Gln Gly Thr Leu Ser Tyr Gln Arg Ala Ser

450 455 460

Asp His Ser Val Asp Asp Pro Leu Asp Tyr Ser Leu

465 470 475

Claims

1、水稻杂种花粉育性基因的等位基因SaM⁺、SaM^-、SaF⁺和SaF^-，其编码蛋白的序列为：

1)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8或

2)它们中替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2、根据权利要求1所述的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7，或它们中替换、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且编码权利要求1所述蛋白同等功能的基因序列。

3、含有权利要求1或2所述基因或其片段的表达载体。

4、根据权利要求3所述的表达载体，其为含有权利要求1或2所述基因或其片段的正义链或反义链或产生RNA干扰的核苷酸序列的表达载体。

5、由权利要求3或4所述载体转化的宿主细胞。

6.一种培育水稻杂种育性亲和系的方法，其特征在于：将权利要求1或2所述基因或权利要求3或4所述载体转化水稻，获得转基因水稻杂种育性亲和系；或用杂交-回交方法和分子标记选择培育含有权利要求1或2所述基因的各种基因型组合的水稻杂种育性亲和系。

7.根据权利要求1或2的核苷酸序列产生的分子标记。

8.权利要求7所述分子标记在水稻杂交育种中的应用。