CN114539372A - 水稻分蘖角度控制基因lazy2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了水稻分蘖角度控制基因LAZY2及其应用。本发明所要保护的一个技术方案是来源于水稻的蛋白质在调控植物分蘖角度或株型中的应用，该蛋白质可为氨基酸序列是序列表中序列1或序列4或序列6的蛋白质。实验证明，通过构建包含LA2基因起始密码子上游1777bp、LA2基因及终止密码子下游822bp在内的基因组DNA序列的互补载体并转化LA2基因突变体植株la2，发现转基因株系能够恢复野生型93‑11的植株分蘖角度和重力反应表型。因此，LA2蛋白可应用于调控水稻的株型及水稻育种。

Description

水稻分蘖角度控制基因LAZY2及其应用
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及LA2蛋白及其相关生物材料在调控植物株型中的应用。
背景技术
植物的株型通常是指植物地上部分的空间分布和组织形态。对于禾本科农作物(如水稻、小麦等)而言，株型是作物多个农艺性状在整体水平上的综合体现，是决定作物产量的重要因素。
分蘖角度作为水稻株型的主要构成因素之一，也是决定水稻产量的重要农艺性状。分蘖角度通常是指主茎与一级分蘖之间的夹角。在耕作栽培中，分蘖角度直接决定了水稻的种植密度。分蘖角度过大的植株在早期可以接受充足的光照，但在生长后期植株易发生倒伏、滋生病虫害；而分蘖角度过小、株型过于紧凑的植株由于基部所处的环境潮湿、通风不良也易发生病虫害，且个体光合面积的减小降低了群体的光合效率从而影响水稻的产量。因此，合适的分蘖角度作为水稻株型改良和高产育种的重要指标，一直都是育种家们关注的重点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的株型或如何调控植物的植株的分蘖角度。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质的应用。所述应用为下述任一种：
P1、所述蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物分蘖角度或降低植物分蘖角度中的应用；
P2、所述蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物重力反应或增加植物重力反应中的应用；
P3、所述蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物株型中的应用；
P4、所述蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用。
所述蛋白质可为如下A1)、A2)、A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；
A3)将A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A4)在A1)、A2)或A3)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质可来源于水稻。
上述蛋白质中，序列表中序列1由185个氨基酸残基组成。
上文所述一个以上氨基酸残基具体可为十个以内的氨基酸残基。
上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活,包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、 RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA 或反义RNA。
上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用：
Q1、所述生物材料在调控植物分蘖角度或降低植物分蘖角度中的应用；
Q2、所述生物材料在调控植物重力反应或增加植物重力反应中的应用；
Q3、所述生物材料在调控植物株型中的应用；
Q4、所述生物材料在植物育种中的应用。
所述生物材料可为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码上文所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)抑制或降低上文所述蛋白质的编码基因的表达或上文中所述蛋白质的活性的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA 分子：
b1)编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
b3)编码序列是序列表中序列5所示的DNA分子；
b4)与b1)、b2)或b3)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码上文所述蛋白质的DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)、b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码上文所述蛋白质的DNA分子。
上文B8)所述核酸分子可为表达靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA的 DNA分子或靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA。
所述靶向所述A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列如序列表序列2的第20-39 位所示和序列表序列2的第273-292位所示。
上文所述植物为单子叶植物或水稻。
术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述具有90％或90％以上同一性可为至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有 99％的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。
可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白编码基因表达盒的重组表达载体。
上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
上文所述植物可为单子叶植物或水稻。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种降低植物分蘖角度和/或增加植物重力反应的方法，包括通过抑制或降低植物基因组中上文所述的蛋白质的的活性或所述的蛋白质编码基因的表达量来降低植物分蘖角度和/或增加植物重力反应。
上述降低或抑制植物中上文所述蛋白编码基因的表达量可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失，具体可为化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑或同源重组等。
上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas9 system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。无论采取哪种方法，既可对上文所述蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控上文所述蛋白编码基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将上文所述蛋白的编码基因的外显子或5’UTR等作为靶标。
上文所述方法可包括向所述植物中导入降低或抑制上文所述的蛋白的活性或所述的蛋白编码基因表达的物质。所述降低或抑制上文所述蛋白的活性或所述的蛋白编码基因表达的物质可为如下c1)-c4)任一种物质：
c1)抑制或降低上文所述蛋白编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
c1)所述的核酸分子可为表达靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA的DNA 分子或靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA。
所述靶向所述A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列如序列表序列2的第20-39 位所示和序列表序列2的第273-292位所示。
上文所述抑制或降低植物基因组中上文所述蛋白的活性或所述的蛋白编码基因表达的物质可为将植物基因组中的序列3所示的所述蛋白编码基因进行下述至少一种突变：
1)缺失了植物基因组中序列表中序列3的第1800位的核苷酸C或者第3421位的核苷酸G；
2)在植物基因组中序列表中序列3的第1799-1800位核苷酸之间插入了核苷酸A或在植物基因组中序列表中序列3的第3421-3222位核苷酸之间的插入了核苷酸T。
所述植物可为水稻。
上文所述的蛋白质和/或上文所述的生物材料也属于本发明的保护范围。
本发明克隆了一个控制水稻分蘖角度的新基因LAZY2(LA2)，实验证明，通过构建包含LA2基因起始密码子上游1777bp、LA2基因及终止密码子下游822bp在内的基因组DNA序列的互补载体pCAMBIA1300-LA2，并将此互补载体转化LA2基因突变体植株la2，发现转化互补载体的la2转基因株系能够恢复野生型93-11的植株分蘖角度和重力反应表型。LA2蛋白可应用于调控水稻的株型及水稻育种。
附图说明
图1为la2突变体的表型鉴定及重力反应分析。(a)突变体la2及野生型93-11表型图；(b)突变体la2及野生型93-11俯视图；(c)突变体la2及野生型93-11分蘖角度统计结果；(d)突变体la2及野生型93-11重力反应图；(e)突变体la2及野生型93-11 重力刺激后茎的弯曲角度统计；(f)突变体la2及野生型93-11成熟期茎重力反应图； (g)突变体la2及野生型93-11成熟期茎重力刺激后茎弯曲角度。
图2为LA2基因的图位克隆及基因功能验证结果。(a)通过利用F2分离群体进行LA2基因的图位克隆，将该基因定位到62kb的区间内，该区间有8个候选基因，其中经测序发现只有基因LOC_Os02g08380外显子上发生了一个C到T的碱基替换，导致单个氨基酸替换，该氨基酸替换位点位于LA2蛋白的保守结构域YbaB DNA-BD区域；(b)通过将LA2的基因组序列构建到互补载体pCAMBIA1300上转化突变体la2,互补转基因表现为和野生型一样的直立表型；(c)互补转基因植株分蘖角度统计结果表明，互补转基因植株分蘖角度和野生型93-11类似；(d)互补转基因植株的重力反应图，显示互补转基因植物的重力反应能够恢复到野生型水平；(e)互补转基因植株的重力反应统计图，统计结果显示互补转基因的茎弯曲角度能够恢复到野生型水平。
图3利用CRISPR-Cas9技术对LA2基因进行敲除转基因植株表型。(a)为 CRISPR-Cas9 gRNA两个独立的靶点位置及序列，敲除转基因突变体的突变位置及信息；(b)为LA2基因四个独立CRISPR-Cas9敲除转基因植株的表型(缺失功能突变体)，均表现为分蘖角度变大的表型；(c)为LA2基因四个独立CRISPR-Cas9敲除转基因植株的分蘖角度统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中野生型水稻材料93-11(Oryza sativa L.subsp.indica cv.9311)、中花11 (Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Zhonghua 11)由本实验室繁殖并保存；水稻散生突变体la2由浙江大学吴殿星教授提供。
本发明包括转基因材料在内的所有水稻材料的田间表型鉴定、拍照以及用于鉴定基因型的样品的采集均在北京完成。
本发明中功能互补载体pCAMBIA1300由本实验室保存(见文献Lin H,Wang RX,Qian Q,et al.Dwarf27,an iron-containing protein required for the biosynthesisof strigolactones,regulates rice tiller bud outgrowth.Plant Cell,2009,21:1512-1525)；用于创制水稻基因敲除突变体材料的CRISPR/Cas9载体系统由华南农业大学刘耀光教授惠赠(Ma X,YG L.Crispr/cas9-based multiplex genome editing inmonocot and dicot plants.Current Protocol in Molecular Biology,2016,115)。
本发明所用试剂及耗材：限制性内切酶及T4 DNA连接酶为NEB公司产品；适合高GC扩增的rTaq酶为TAKARA公司产品；高保真酶KOD FX、KOD Plus Neo购自TOYOBO公司；DNA回收试剂盒为QIAGEN公司产品；质粒提取试剂盒为Promega 公司产品；大规模质粒提取试剂盒购自Macherey-Nagel公司；In-Fusion HD同源重组试剂为TAKARA公司产品。
本发明中实验方法：
农杆菌介导的水稻遗传转化：
(1)水稻愈伤的诱导：挑选饱满的水稻种子脱壳后用75％(v/v)乙醇消毒1分钟，然后用2.5％(w/v)次氯酸钠溶液消毒45分钟，灭菌水漂洗6次，然后点播于NB培养基(附录B)上，28℃暗培养，诱导产生愈伤组织。约15天后，从成熟胚盾片处剥取愈伤并转移至NB培养基上进行继代培养。以后每7天继代一次，每次继代培养时挑选致密、表面光滑和色泽淡黄的胚性愈伤组织。
(2)农杆菌转化：采用电击转化方法将目标质粒转入农杆菌菌株EHA105，并涂布于含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP(附录C)固体培养基上。将平板倒置于28℃培养箱培养48小时之后，挑取单克隆并进行PCR鉴定。将阳性克隆接种于 3mL含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP液体培养基，28℃摇床振荡培养 16小时后转接到30mL含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平以及19.6mg/L乙酰丁香酮的YEP液体培养中。28℃振荡培养3小时后3500rpm离心，收集菌体，并用浸染液(附录D)充分悬浮收菌体，用于转化水稻愈伤。
(3)农杆菌与水稻愈伤的共培养：将生长状态良好的愈伤组织转移到100mL灭菌三角瓶中，加入适量浸染液浸没材料，室温放置10分钟，期间摇动三角瓶两次，然后弃液体，将愈伤置于无菌滤纸上。待充分吸干多余的菌液后将愈伤转移至铺有两层无菌滤纸的培养皿，26℃共培养48小时至60小时。
(4)抗性愈伤的筛选、分化及植株再生：将完成共培养阶段的水稻愈伤转移至含有50mg/L潮霉素和100mg/L羧苄青霉素的选择培养基上进行第一次筛选培养。7天后将存活的愈伤转移至含有50mg/L潮霉素和50mg/L羧苄青霉素的选择培养基上进行第二轮筛选，以后每7天进行一次筛选，共进行4次筛选。之后挑选生长旺盛的抗性愈伤转移至分化培养基(附录E)上进行为期30天至40天的分化。将分化出的水稻幼苗切去根系后转移至生根培养基上进行两次生根培养后，炼苗1周后移栽至大田。
水稻材料的田间栽培及分蘖角度测量：
水稻种子室温浸种3天后转入28℃培养间催芽1天。将露白的种子播种于苗床上，常规育秧，1个月后按每穴1株移栽至稻田。试验用地为北京昌平试验农场和海南省陵水县南繁基地。用于测量分蘖角度、拍照及其它表型鉴定的水稻材料的株行距为30cm×30cm，用于全面评估la2产量相关性状的材料的株行距为17cm×20cm。水肥及病虫害防治等田间管理均按照当地生产条件进行。在开花期至成熟期之间用量角器测量分蘖角度，成熟期调查株高、分蘖数相关性状。
实施例一、LA2基因的定位和图位克隆
1.1水稻散生突变体突变体la2的表型观察及重力反应
水稻散生突变体la2是来源于籼稻品种93-11的一个自发突变体，以下又称93-11突变体la2，简称la2突变体或la2。la2突变体成熟期呈现典型的散生生长特性(图1 中a,b,c)。通过对la2突变体地上部分的重力反应进行了考察，结果发现光下生长3天的la2幼苗地上部的重力反应与野生型93-11相比显著降低(图1中d和e)。成株期植株进行重力刺激3周结果显示，la2植物的茎秆重力反应相比野生型显著降低(图1 中f和g)
1.2LA2基因的图位克隆
以la2与秀水110B杂交获得F1代植株，F1代植株自交获得F2代分离群体。在抽穗期挑选F2代具有突变体表型的单株，取幼嫩叶片0.5g左右，提取基因组DNA，用于基因定位。
通过比较籼、粳稻的基因组序列差异设计引物。使用平均分布于水稻11条染色体上的180对分子标记筛选小的定位群体进行初定位，将LA2定位在两个分子标记 M1与M2之间。以M1和M2标记筛选F2群体中具有野生型表型的单株，将两个位点基因型均为杂合型的单株进行标记，并在成熟期单株收种。种植F3代种子，得到 F2:3分离群体。进一步在M1与M2之间开发新的分子标记，利用F2:3分离群体将LA2 限定在相对较小的物理区间内。采用RiceGenome Browser在线工具 (http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/ rice/)分析该区间范围内所有的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)并设计引物。分别以野生型93-11和la2突变体基因组 DNA为模板，扩增所有ORFs，测序并分析序列差异，寻找可能的突变位点和候选基因。
通过利用F2:3分离群体进一步将其精细定位到M6和M9两个分子标记之间约62 kb的区间内(图3中a)。该区间共有8个ORFs，测序分析发现其中一个ORF的第5 个外显子上发生C到T的单碱基替换(对应序列表序列3的第4333位核苷酸)，导致该基因编码的蛋白序列第121位(L121F突变位点，对应于序列表中序列1的第121 位由亮氨酸L突变为苯丙氨酸F)氨基酸残基由亮氨酸(Leu,L)突变为苯丙氨酸(Phe,F) (图3中a)。序列分析表明，野生型93-11中LAZY2基因(下面简称LA2基因)的编码链的核苷酸序列是序列表中序列3的第1778-4800位，含有7个外显子和6个内含子。编码一个含有185个氨基酸残基的LA2蛋白(氨基酸序列是序列表中序列1)。 LA2蛋白的编码序列(CDS)全长558bp，其编码链的核苷酸序列是序列表中的序列 2。93-11突变体la2中la2突变体蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4所示，其编码链的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
实施例二、LA2蛋白对水稻分蘖角度的调控功能验证
2.1遗传互补载体的构建及LA2蛋白功能验证
2.1.1遗传互补载体的构建并转化la2突变体
使用引物SacI-HF 5’-CTGGAGCTCCGACATAGCGGACTGAAGTATC-3’和 BamHI-HF 5’-ACGGGATCCCCATTGGCGGCTAGTAGATTG-3’扩增野生型材料93-11 的基因组DNA，得到的PCR产物为含有SacI和BamHI酶切位点的如下序列：LA2基因起始密码子上游1777bp至终止密码子下游822bp在内的基因组DNA序列(序列表中序列3)。将得到的PCR产物使用限制性内切酶SacI和BamHI进行双酶切得到酶切后的PCR产物；同时使用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切功能互补载体 pCAMBIA1300得到线性化的pCAMBIA1300载体。然后使用T4连接酶催化连接酶切后的PCR产物和线性化的pCAMBIA1300载体得到遗传互补载体质粒 pCAMBIA1300-LA2。经测序验证，pCAMBIA1300-LA2含有LA2基因起始密码子上游 1777bp至终止密码子下游822bp在内的基因组DNA序列(序列表中序列3)，能够表达序列表中序列1所示的LA2蛋白。
将遗传互补载体质粒pCAMBIA1300-LA2转化大肠杆菌DH5a进行扩繁后提取质粒，然后转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1300-LA2。将重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1300-LA2按照农杆菌介导的水稻遗传转化方法转化水稻散生突变体la2突变体的愈伤组织，得到T0代转基因株系LA2:LA2/la2。
2.1.2转基因株系表型观察
通过田间种植后表型鉴定和统计分析表明，与la2突变体相比，含有互补转基因载体的LA2:LA2/la2转基因株系(图2的b中如LA2:LA2/la2-1和LA2:LA2/la2-2所示) 的分蘖角度变小，即恢复了野生型93-11的分蘖角度(图2中b)。考察幼苗的重力反应发现，LA2:LA2/la2转基因株系也恢复了突变体重力反应缺陷的表型，即与la2突变体相比，LA2:LA2/la2转基因株系(图2的d和e中如LA2:LA2/la2-1和LA2:LA2/la2-2 所示)的重力反应变小，与野生型93-11表型相同(图2中d和e)。这些结果表明，LA2 参与调控水稻的分蘖角度，并且la2突变体的L121F突变位点与表型密切相关，是调控植株分蘖角度和地上部分重力反应的功能位点。
2.2 CRISPR-Cas9敲除突变体的构建及LA2蛋白功能验证
la2是来源于93-11遗传背景下的散生突变体，存在着遗传转化困难的限制因素。为了便于开展后续研究，本发明采用CRISPR-Cas9技术创建了粳稻品种ZH11背景下的la2突变体la2-ZH11。
2.2.1 CRISPR-Cas9载体的构建
在LA2基因外显子区域选择了两个靶位点对其进行基因敲除。
靶序列如下：
靶序列1：5’-CTTGAAGGCCACCGGAGAGA-3’(对应于序列表序列2的第20-39 位)；靶序列2：5’-TGTCCAAGTTGAGGCTGTCC-3’(对应于序列表序列2的第273-292 位)。
根据上述靶序列，设计gRNA。
合成下述带有接头序列(下划线部分)的单链引物:
LA2-sgRNA-1：5’-GGCACTTGAAGGCCACCGGAGAGA-3’
LA2-sgRNA-2：5’-GGCATGTCCAAGTTGAGGCTGTCC-3’
Uctcg-B1’：5’-TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(U3/6 上游引物)
gRctga-B2：5’-AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(gRNA 下游引物)
Uctga-B2’：5’-TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’
Rcggt-BL：5’-AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’
CRISPR-Cas9双靶点敲除载体构建参考文献A Robust CRISPR/Cas9 System forConvenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and DicotPlants。
2.3.2 CRISPR-Cas9载体转化中花11
将上述构建的CRISPR-Cas9载体，按照农杆菌介导的水稻遗传转化方法转化水稻中花11(ZH11)的愈伤组织，得到T0代LA2敲除突变体株系，T0代自交获得T2代LA2敲除突变体株系la2-ZH11。4个纯合的敲除突变体株系CR-la2-1、CR-la2-1、 CR-la2-3和CR-la2-4的测序结果如图3中(a)所示，靶向LA2基因的四个独立的转基因株系在靶位点均发生了有效编辑。4个纯合的敲除突变体在LA2基因中分别缺失了植物基因组中序列表中序列3的第1800位的核苷酸C、序列3的第3421位的核苷酸G 或在序列表中序列3的第1799位和1800位核苷酸之间插入了核苷酸A、在序列表中序列3的第3421位和3222位核苷酸之间插入了核苷酸T。
表型鉴定结果表明，纯合的敲除突变体株系CR-la2(图3的(b)中CR-la2-1、 CR-la2-1、CR-la2-3和CR-la2-4所示)均呈现散生生长的特征。与ZH11相比，CR-la2 各纯合植株的分蘖角度显著增大(图3(c)的CR-la2-1、CR-la2-1,CR-la2-3和CR-la2-4 所示)。LA2基因敲除缺失功能突变体表型为分蘖角度变大的表型，因此，LA2负调控水稻分蘖角度及株型。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 水稻分蘖角度控制基因LAZY2及其应用
<130> GNCSQ210621
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 185
<212> PRT
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 1
Met Ala Pro Ser Thr Ala Leu Ser Pro Val Ala Phe Lys Ser Ser Phe
1 5 10 15
Ser Pro Leu Leu Phe Asn Pro Thr Arg Ser Lys Ile Asn Val Glu Gly
20 25 30
Ala Phe Cys Leu Pro Cys Tyr Asn Arg Lys Lys Ala Ser Asn Arg Ser
35 40 45
Phe Arg Val Tyr Ser Leu Phe Gly Gly Lys Lys Asp Lys Asp Glu Asn
50 55 60
Gly Glu Glu Ala Pro Ser Lys Ala Gly Ile Phe Gly Asn Met Gln Asn
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Thr Val Lys Lys Ala Gln Met Val Val Gln Val Glu Ala
85 90 95
Val Arg Val Gln Lys Glu Leu Ala Ala Thr Glu Ile Asp Gly Tyr Cys
100 105 110
Glu Gly Glu Leu Ile Lys Val Thr Leu Ser Gly Asn Gln Gln Pro Val
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Ala Ala Met Glu Val Gly Ala Glu Lys Leu
130 135 140
Ser Glu Leu Val Asn Asp Ala Tyr Lys Asp Ala His Gln Arg Ser Val
145 150 155 160
Gln Ala Met Lys Glu Arg Met Ala Asp Leu Ala Gln Ser Leu Gly Met
165 170 175
Pro Ala Gly Leu Gly Asp Gly Leu Lys
180 185
<210> 2
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
atggctccct ccaccgccct ctctccggtg gccttcaagt cctccttctc gccgctcctc 60
ttcaacccga cccgttctaa gataaatgtc gaaggtgcat tctgtttgcc atgttacaat 120
aggaaaaagg ctagcaatag atcctttcgc gtgtacagtt tatttggggg aaaaaaggac 180
aaagacgaga atggtgaaga agcaccatca aaggcaggaa ttttcggaaa tatgcaaaat 240
ctttatgaaa ctgtgaagaa ggcccagatg gttgtccaag ttgaggctgt ccgggtgcaa 300
aaggagcttg cagcgactga gatcgatggt tactgtgaag gggaactaat caaggtaaca 360
ctttctggga accagcagcc tgtaagagtt gaaatcaccg aagctgcaat ggaagtgggt 420
gctgaaaaac tttctgagct ggtgaacgac gcctacaagg atgcacatca gaggagtgtc 480
caggcaatga aggagaggat ggctgatctg gcacagagct taggaatgcc agcaggcctt 540
ggtgatggac tcaagtga 558
<210> 3
<211> 5622
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
cgacatagcg gactgaagta tcatcgcgta gtcgacaaca gagtaatctt cctcctcgaa 60
tccgtgccct gcgagatcag agacagcgct agattcctct ctttggttcc cgtaggtacc 120
atatggggct ttgctaggct tatctctgat gtcgatatct ggcagcttat cttggcgtat 180
gtaggtttgt attggcttgt ggctttgtgg cgtctatgtt gtccgtgtcc cctctcctct 240
tagggggcct tgtatttata cccataggtg tctccttgtc caagtagaac taggaaaacc 300
aatatggata caatccgagt agttcttgtc gtttccatgt aaaactctag tcatcctttc 360
ttatgcggaa ctcctcctat atcccaaagt tgtttccgta taagacatgg tatgtggtgg 420
gtcctgccaa gatttagtca actactatta ggtatgtggt atctataacc ctgacaatct 480
tatatagtca cgattaatgt aaagataaaa agaaatatta ttggatcaat tcaataaata 540
taatgtgatt aaagatatca agggtgaagg attaaaaaaa ctcccttaaa aaggatttaa 600
aaaaacaaat ttaaaggaga gaggtgctgg ttaattacat tcacgtatat gtaaaattat 660
aagctttttt gttataacaa atttggccat gttattttcg ttacacaaat ctaaacaata 720
gatatggtca aagctaacat ataaatcttg gctgcccaga ttctgaaatg atactacctc 780
tattttatat tttaacttat tttgattttt ttgtcaattt ttttaagttt gactaaatgt 840
atagaaaaat ttagcaacat ctacaatatc aaattagttt gattatatgt aacattgaat 900
atatttttga taatatattt gttatgtgta aatatattgc tacattttta ctctataaac 960
ttagtcaaac ttaaaaaata gagtaaattt cacaaaacta catgtatttt gcacaattta 1020
tcacgaaact acagatttaa gagcttgttt cacaaaacta aagatttagt gtgttcggtt 1080
atcacaaaac tacagattta agaacttagt ttcacaaaaa tatagattta gtgtattcat 1140
ttatcacagt gctacacatt tagtgtcttc atttatcaca aaactacaaa tttaatgtct 1200
ccattctcac aaaactacag gttttagcat tgttaaaacg tgtagtttta tgagaatgga 1260
gacactaaat ctgtagtttt gtgataaatg aagatattaa acctgtagtt ttgtgaaaca 1320
agtttttaaa tctgtagttt tgtgatatat tgttcaaagt acatgtagtt ttgtgataaa 1380
cgaagatatt gaatctgtag ttttgtgaaa ctagttctaa aatctatagt tttgtgatag 1440
attgtgcaaa gtatatgtag ttttatgaaa tttactctaa aaaatattaa ctatgaaaaa 1500
aaataaaact aggattgagt actactcatg tgtactttgc attatgaaac ataaaaaaat 1560
tactatcatg tctcatattt tgagatgaga agaatgccaa aaaaaaaaaa agtatcctca 1620
gattattcaa ttggtcattt acccatctct ctctctctct accttttctc ttcaacgata 1680
tcctctatcc caaaaatcga gccttttcct ccccccttcc tcctccaccg ccgcggctcc 1740
accaccgccg cccatctcgc cgccgccgcc gccgccgatg gctccctcca ccgccctctc 1800
tccggtggct ttcaagtcct ccttctcgcc gctcctcttc aacccgaccc gtaagccatc 1860
ctctccctcc atccttctct ctccgcgcgg cggagtcagc cgtagccggg cgcttttcgt 1920
cgtcgggcgc agctgccagc gcgcgcgcgc gcgcggagga atcttccacg gcggtattct 1980
tcagagccca attcgattgg ggtggcctcg tctccgatgc cgccgcggcc caccgctttg 2040
cctggcgttc gtattatcgg gtggtctctt aactctaatt agtgcggatg cgagttgggt 2100
tgctgtgctt gcggttaggg tttcactggg cgttaaaaga gagaaaaaga aattcattaa 2160
gtctcaattt agttgaatgt ttttgcagcg gtgtgtgggg ggagattgtt gcgtttgtgc 2220
tgttctaggt gacggccgga aatatttggt ttgtttttag gtttgacaat aatcttttcg 2280
tcggttttcg gggtccttgt acaattctat catttcaacc atgtacaaag atgttccttt 2340
tttatgttag gaattggttt catttagttc tagtggacat acgattctgg catgtaggta 2400
atttatttca ttatggtaag ttttctgttg tagtagtatc tgtttattca gggaattgta 2460
taaaatggag cattacacat tagcttagtc cttgggcttc cgttctcccc ttttcttttg 2520
atcggtggag ctttgatctt tgttgaccag tgcgtccttg ttgattattt ttcttatgtt 2580
atagcaacac ctgaacattt tgcacctgtt gtttctttgt tgttcaggtt ctaagataaa 2640
tgtcgaaggt gcattctgtt tgccatgtta caataggaaa aaggctagca atagatcctt 2700
tcgcgtgtac agtttatttg ggggaaaaaa ggacaaagac gagaatggtg aagaagcacc 2760
atcaaaggta agaaaattag atgccttctt tcaatttgaa cttctgttgt actcccaata 2820
actaaaagag tatcttcatg gatgcctgaa atgaaaacaa ttgcaaattc acaggtggat 2880
gtctacctta atcagttcaa tactatgtgc tattcatatc tttatacttt tatctgaata 2940
gtaatatgct caagataatg ccttgctcat tgcaaattct gttgaagtct taaactcctg 3000
tagaaaatag ttaagagtgt aactcatcat gttgatattt cagttcgtgc tgaaattaaa 3060
ttctgcatat aattttaagg gaatataaaa tattttaact aatatgtact tttgttatca 3120
cctctacttt atagcttcta tgttcagttt tcttctcttt ccaatgaatg atgccacttc 3180
taaaatgaca aacttttact ttatttgggt atttgtatag ttgactaaga tgcatgagct 3240
gtattcacta tgttcccttg tttgtgcaca aatacctagt atagtaggca tttttatttt 3300
tgtttgtaaa catcctgtag ttctcatttt tgtacgtact tttaggcagg aattttcgga 3360
aatatgcaaa atctttatga aactgtgaag aaggcccaga tggttgtcca agttgaggct 3420
gtccgggtgc aaaaggagct tgcagcgtat gcatttggat atctgagtaa tatttgatat 3480
gttatcgcta aatagcacag cagtgtgact tttttcctct tgttttagga ctgagatcga 3540
tggttactgt gaaggggaac taatcaaggt atgctttgga ttagttgatt aatgttgttg 3600
ttaactgaat tcttgctagc tgtatgtttc attgtgcctt gaacattgaa gggtttcttt 3660
gttaaatgac tgacatttta gcattgttga aaaagcctgt tgaacttgag ccaggctata 3720
aagatcacat attatcactg acaaacattg atctttgttt cactgagaaa gggcggtcat 3780
ttcctacagt aaaaccaaat atattccctt atatgttctt atactgaaga atggcatgtg 3840
ttttttatga tcttaattag gttgatcgct atatgaagta attaaaatca tttggtatct 3900
cttttagctt tggcttagat aaagttatgt tgaaaaggta ctattttggc acaagaacac 3960
tgtcaaatct gtgggcaggg aggtggttat aagtcatcaa atgatttatg gtggcatagg 4020
ttgttaccgt ttgaaaaggt cattgtctta actcttaaag ccatttgaaa atgtgcatgt 4080
taataatgtc ttagcttttc aaatgacaaa aataacgttg caataccttg acattttctc 4140
ccatgagcta tgtgctatgc tggtatattt tgtagagcca tatgctgtca aagtttgcta 4200
aatcttattt gtttcttata agtttagcag gactatccga ttattacatt cctttgcttt 4260
tctcgaaagt agaaaatcac atgcatatac ttccggtgca agtatttgac ctgattcatt 4320
aaccaggtaa cactttctgg gaaccagcag cccgtaagag ttgaaatcac cgaagctgca 4380
atggaagtgg gtgctgaagt atgtatttta tctaccattt taatcatttt ctttgacgat 4440
ttcttgcatg ttcgcatgat ttttggcatg agtcaaccat ttcaatgttc acacatgaat 4500
ttgataaata ccttatgtat gtacccgtta gcagaccaaa acaaaaccaa attgttcaaa 4560
gtgtgatata tatagtatcc tttcagaaac tttctgagct ggtgaacgac gcctacaagg 4620
atgcacatca gaggagtgtc caggtgcgaa tcctgctatt actttttgcg tagaaattga 4680
aacttgcgtt ctatactaac acggtactgt acttaaaacc tgcaggcaat gaaggagagg 4740
atggctgatc tggcacagag cttaggaatg ccagcaggcc ttggtgatgg actcaagtga 4800
tagtgtggta catgaatgct tttcaataaa aaaaaaagtg tatctcaatt ttgtatacta 4860
gctgtattga gtcatcagtt taaaattcgt ggcgagtact gttagctgtg taagaactgt 4920
aatcgagaac atctgatcct gttttcctta atcattggca caccataatg cattgacgca 4980
agtgtgctgt tttacaactg ctgttgatgt gcagaatgaa atctgttcca aacagagaaa 5040
tgggtggata tggggaggct aattcatggg gcacttggca cttggctgag ctttatatag 5100
tttcagaagc cttaatagta tataatggct ttgtttggcc caattaaggc cattgttggg 5160
gtcaatagta tataatggct ttggttggag atgtgccaaa cagggtcatg ttaggcccaa 5220
cttagcagtt gttatttctg tgagtgttag catgagatga aagtgtctac tgtcttaggc 5280
tgtgtttggc acccttttcc caacctctct tcctcgtttt ccgtgtgcac acttttcaaa 5340
ctgctaaacg gtgcgtttat tgacaaaaag tttctatatg aaaattacta agaaaatcaa 5400
attaattttt ttttaaaagc taatacttaa ttaatcacac gttaatggac tgctccgttt 5460
tctgtgcgta atgttactgg aacaagaaat ggcgaacaca ggctaaagta ctagctcgct 5520
ttttcatgaa cttccatgga agatggaacc ttctagttcg agtctacact ctacacatat 5580
agttaccagt tgttaatgtt gcaatctact agccgccaat gg 5622
<210> 4
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
Met Ala Pro Ser Thr Ala Leu Ser Pro Val Ala Phe Lys Ser Ser Phe
1 5 10 15
Ser Pro Leu Leu Phe Asn Pro Thr Arg Ser Lys Ile Asn Val Glu Gly
20 25 30
Ala Phe Cys Leu Pro Cys Tyr Asn Arg Lys Lys Ala Ser Asn Arg Ser
35 40 45
Phe Arg Val Tyr Ser Leu Phe Gly Gly Lys Lys Asp Lys Asp Glu Asn
50 55 60
Gly Glu Glu Ala Pro Ser Lys Ala Gly Ile Phe Gly Asn Met Gln Asn
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Thr Val Lys Lys Ala Gln Met Val Val Gln Val Glu Ala
85 90 95
Val Arg Val Gln Lys Glu Leu Ala Ala Thr Glu Ile Asp Gly Tyr Cys
100 105 110
Glu Gly Glu Leu Ile Lys Val Thr Phe Ser Gly Asn Gln Gln Pro Val
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Ala Ala Met Glu Val Gly Ala Glu Lys Leu
130 135 140
Ser Glu Leu Val Asn Asp Ala Tyr Lys Asp Ala His Gln Arg Ser Val
145 150 155 160
Gln Ala Met Lys Glu Arg Met Ala Asp Leu Ala Gln Ser Leu Gly Met
165 170 175
Pro Ala Gly Leu Gly Asp Gly Leu Lys
180 185
<210> 5
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
atggctccct ccaccgccct ctctccggtg gccttcaagt cctccttctc gccgctcctc 60
ttcaacccga cccgttctaa gataaatgtc gaaggtgcat tctgtttgcc atgttacaat 120
aggaaaaagg ctagcaatag atcctttcgc gtgtacagtt tatttggggg aaaaaaggac 180
aaagacgaga atggtgaaga agcaccatca aaggcaggaa ttttcggaaa tatgcaaaat 240
ctttatgaaa ctgtgaagaa ggcccagatg gttgtccaag ttgaggctgt ccgggtgcaa 300
aaggagcttg cagcgactga gatcgatggt tactgtgaag gggaactaat caaggtaaca 360
ttttctggga accagcagcc tgtaagagtt gaaatcaccg aagctgcaat ggaagtgggt 420
gctgaaaaac tttctgagct ggtgaacgac gcctacaagg atgcacatca gaggagtgtc 480
caggcaatga aggagaggat ggctgatctg gcacagagct taggaatgcc agcaggcctt 540
ggtgatggac tcaagtga 558

Claims (10)

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
P1、所述蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物分蘖角度或降低植物分蘖角度中的应用；
P2、所述蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物重力反应或增加植物重力反应中的应用；
P3、所述蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物株型中的应用；
P4、所述蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质是如下A1)、A2)、A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；
A3)将A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A4)在A1)、A2)或A3)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于水稻。
3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用：
Q1、所述生物材料在调控植物分蘖角度或降低植物分蘖角度中的应用；
Q2、所述生物材料在调控植物重力反应或增加植物重力反应中的应用；
Q3、所述生物材料在调控植物株型中的应用；
Q4、所述生物材料在植物育种中的应用；
所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)抑制或降低权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达或权利要求1中所述蛋白质的活性的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：
b1)编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
b3)编码序列是序列表中序列5所示的DNA分子；
b4)与b1)、b2)或b3)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)、b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
B8)所述核酸分子为表达靶向所述权利要求1中A1)所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向权利要求1中A1)所述蛋白编码基因的gRNA；
所述靶向所述A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列如序列表序列2的第20-39位所示和序列表序列2的第273-292位所示。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或水稻。
6.一种降低植物分蘖角度和/或增加植物重力反应的方法，包括通过抑制或降低植物基因组中权利要求1中所述的蛋白质的的活性或所述的蛋白质编码基因的表达量来降低植物分蘖角度和/或增加植物重力反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法包括向所述植物中导入降低或抑制权利要求1中所述的蛋白的活性或所述的蛋白编码基因表达的物质；所述降低或抑制权利要求1中所述蛋白的活性或所述的蛋白编码基因表达的物质为如下c1)-c4)任一种物质：
c1)抑制或降低权利要求1中所述蛋白编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
c1)所述的核酸分子为表达靶向所述权利要求1中A1)所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向权利要求1中A1)所述蛋白编码基因的gRNA；
所述靶向所述A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列如序列表序列2的第20-39位所示和序列表序列2的第273-292位所示。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述抑制或降低植物基因组中权利要求1中所述蛋白的活性或所述的蛋白编码基因表达的物质为将植物基因组中的序列3所示的所述蛋白编码基因进行下述至少一种突变：
1)缺失了植物基因组中序列表中序列3的第1800位的核苷酸C或第3421位的核苷酸G；
2)在植物基因组中序列表中序列3的第1799位和1800位核苷酸之间插入了核苷酸A或在序列表中序列3的第3421位和3222位核苷酸之间插入了核苷酸T；
所述植物为水稻。
10.权利要求1或2中所述的蛋白质和/或权利要求3或4中所述的生物材料。
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