BR112014016523B1 - Método para produção de uma planta com tamanho de caule aumentado, peso seco aumentado, velocidade de crescimento aumentada, tamanho de folha aumentado, crescimento de raiz aumentado, tolerância aumentada à seca e senescência retardada - Google Patents

Abstract

GRF3 MUTANTES, MÉTODOS E PLANTAS. A presente divulgação proporciona um novo gene modificado, rGRF3, ou um ortólogo do mesmo, o qual é mostrado para ser dissociado do controle por miR396, particularmente, na presença de super-expressão de pelo menos um gene GIF, tais como GIF1, AtGIF 2, AtGIF 3, Os11g40100, Os12g31350, Os03g52320 ou suas combinações. Quando presentes em uma planta, o rGRF3 resulta em um fenótipo de maior produtividade (por exemplo, rendimento aumentado, biomassa aumentada, resistência ao estresse aumentado, tolerância à seca, senescência foliar atradaso, produção de sementes aumentadas, produção de sementes aumentadas, crescimento das raízes aumentado, velocidade de alongamento da raiz aumentada ou suas combinações).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] As plantas que exibem melhoria da produtividade e/ou fenótipos de rendimento e/ou um aumento da tolerância à seca pela introdução dentro de tais plantas mutações no fator de crescimento GRF3, ou em um ortólogo GRF3, os quais os mutantes desregulam o ortólogo GRF3 ou GRF3 de controle miR396 (opcionalmente, em combinação com superexpressão de pelo menos um gene GIF).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Em contraste com os animais, as plantas continuam a produzir novos órgãos durante todo o seu ciclo de vida. Os órgãos acima do solo são derivados do meristema apical (SAM), o qual inclui um conjunto de células troncos residentes na ponta do crescimento da planta.

[003] Proliferação de células SAM produz um excesso de células—filhas que são tanto incorporados ao primórdio de desenvolvimento foliar na periferia SAM quanto se tornam parte das raízes. O maquinário central que controla a conservados entre eucariotas. É, no entanto, a integração dos mecanismos básicos do ciclo celular, com o programa de desenvolvimento, que gera a enorme variação fenotípica entre os organismos multicelulares, um processo que é muito menos entendido (Inze e De Veylder, 2006).

[0004] Em contraste com o SAM indeterminado em Arabidopsis thaiiana, as folhas são órgãos determinados que têm uma morfologia definida. O desenvolvimento da folha envolve a ação combinada de várias vias de sinalização hormonal e redes de fator de transcrição. Alguns dos principais reguladores da transcrição envolvidos no controle da proliferação celular em folhas incluem AINTEGUMENTA (Mizukami and Fischer, 2000), PEAPOD (White, 2006), JAGGED (Dinneny et al., 2004; Ohno et al., 2004), BLADE ON PETIOLE (Ha et al., 2003), TCPs (Nath et al., 2003) e GROWTH-REGULATING FACTORs (GRFs) (Kim et al., 2003).

[0005] Para obter a sua característica de dimensão e forma final, o crescimento do desenvolvimento da folha necessita ser rigorosamente controlada, pela primeira vez através da proliferação celular e, em seguida, pela expansão da célula (Piazza et al, 2005;. Tsukaya, 2006). Inicialmente, a proliferação de células é observada durante todo o desenvolvimento da folha (Donnelly et al., 1999). Em seguida, o ciclo celular para na ponta da folha e uma terminação da mitose move-se para a base do órgão (Donnelly et al., 1999). Uma vez que as células deixam de se dividir, elas começam a ampliar e crescimento celular torna-se a força motriz que regula o tamanho do órgão (Piazza et al., 2005; Tsukaya, 2006).

[0006] Atualmente, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que coordenam a proliferação de células ao longo de uma folha em desenvolvimento. Um regulador conhecido é o gene TCP Cincinnata (CIN), que controla o avanço da frente da suspensão da mitose em Anthirrhiem um (Nath et al., 2003). As mutações, tais como cin (Nath et al., 2003) e triplos knock-outs de seus homólogos de Arabidopsis tcp2l4/10 (Schommer et al., 2008) causam mudanças na morfogênese de folhas e curvatura do órgão desigual devido à excesso de proliferação celular nas margens da folha. Curiosamente, cinco Arabidopsis TCP (TCP2, 3, 4, 10 e 24), bem como CIN, têm um local alvo para microRNA (miRNA) miR319 (Palatnik et al., 2003). A superexpressão de miR319 provoca a degradação destas TCPs e a geração de folhas plissados semelhantes às observadas em TCP mutantes de perda de função (Palatnik et al., 2003). Mutações no local de destino do PFC que diminuem a interação com o miRNA afetam a morfologia foliar em Arabidopsis (Palatnik et al, 2003; Palatnik et al., 2007) e complexidade da folha em tomate (Ori et al, 2007.) e são letais em casos extremos (Palatnik et al., 2003).

[0007] A família de fatores de transcrição de GRF compreende nove membros em Arabidopsis (Kim et al., 2003). Sete deles tem um local alvo para miR396 (Jones-Rhoades e Bartel, 2004). Mutações de perda de função em diferentes GRF ou super-expressão de miR396, o que diminui os níveis de GRF têm sido mostrados para reduzir o número de células em folhas de Arabidopsis (Horiguchi et al, 2005; Kim et al., 2003; Kim e Kende, 2004; Liu et al., 2009). Os GRFs trabalham em conjunto com FATORES GRF-interagindo (GIFs), uma família pequena de gene que codifica proteínas com homologia com o SYT transcricional co-ativador humano (Horiguchi et al, 2005;. Kim e Kende, 2004). Inativação de GIF1 (Kim e Kende, 2004), também conhecido como ANGUSTIFOLIA 3 (AN3) (Horiguchi et al., 2005), produz folhas mais estreitas, como resultado de uma redução na proliferação celular.

[0008] Foi revelado por Rodriguez et al, Development 137, 103 - 112 (2010), que um microRNA, miR396, desempenha um papel importante na coordenação da proliferação celular em folhas de Arabidopsis. Eles mostraram que, em primórdios foliares, miR396 é expresso em níveis baixos, mas sua expressão aumenta de forma constante durante o desenvolvimento do órgão. Eles mostraram que miR396 antagoniza a expressão padrão de seus alvos, o fatores de transcrição do fator de regulação do crescimento (GRF). miR396 mostrou acumular, preferencialmente, na parte distal de folhas jovens em desenvolvimento, restringindo a expressão de GRF2 para a parte proximal do órgão. Este, por sua vez, foi mostrado de modo a coincidir com a atividade do marcado de proliferação celular CYCLINB1;1. miR396 atenuou a proliferação de células no desenvolvimento de folhas através da repressão da atividade de GRF e uma diminuição na expressão de genes do ciclo celular. Além disso, eles relataram que a super-expressão de miR396 em um mutante faltando o Fator de INTERAÇÃO GRF 1 (GIF1) comprometido severamente ao meristema da raiz. miR396 foi encontrado para ser expresso a níveis baixos ao longo do meristema, sobrepondo-se com a expressão do seu alvo, GRF2. Além disso, foi mostrado que a super-expressão de miR396 pode reduzir a proliferação de células e o tamanho do meristema. Plantas de Arabidopsis com um aumento da atividade do fator de transcrição TCP4, o que reduz a proliferação de células em folhas, mostraram ter miR396 mais elevados e os níveis mais baixos de GRF. GRF2 modificado, o qual foi mutado para interferir com a interação com miR396, mostrou ser independente da regulação miR396 para que o tipo selvagem GRF2 foi sujeitado. Estas plantas foram relatadas para ter folhas ligeiramente maiores do que os de tipo selvagem, no entanto, estas folhas foram curvadas para baixo, o que poderia ser prejudicial para a captura de luz e fotossíntese. Estes resultados indicam que os níveis de miR396 podem restringir significativamente a proliferação celular em plantas.

[0009] Na presente descrição mostra-se que um mutante GRF3 (por vezes, aqui referida como rGRF3) e mutantes GRF3 ortólogos (por vezes, aqui referidos como rGRF3 ortólogos) são liberados da regulação miR396, e que as plantas que compreendem o GRF3 mutante ou mutantes ortólogos GRF3 tem melhorado a produtividade e / ou rendimento (incluindo a área foliar, o número de células, aumento de biomassa, aumento da resistência ao estresse, senescência foliar atrasada, aumento de produção de sementes, aumento da produtividade de grãos, aumento do crescimento da raiz, aumento da velocidade de alongamento da raiz e maior tolerância à seca), tanto em comparação com plantas de tipo selvagem quanto em plantas que compreende um mutante GRF2 aliviado de regulação miR396. Além disso, as folhas de plantas ou plantas mutantes GRF3 ou mutantes GRF3 ortólogo não foram curvados para baixo, como as de mutante GRF2. O ligeiro aumento da área foliar observada em plantas GRF2 mutantes foram causadas por aumentar o seu nível, pelo menos, vinte vezes, em comparação com o nível de GRF2 em plantas de tipo selvagem; no entanto, apenas três a cinco vezes mais mutante GRF3 comparado com o nível de GRF3 em plantas de tipo selvagem foi observado para causar um impacto muito maior em tamanho de folha e de biomassa vegetal.

[0010] Quando a modificação GRF3 ou modificação do GRF3 ortólogo é combinado em uma unidade com superexpressão GIF1, estes efeitos são muito aumentados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] A Figura 1 mostra constructos de ácidos nucleicos e sequências de relevância para a presente invenção; o painel superior mostra a sequência de GRF3 sequência de tipo selvagem na região que é substancialmente complementar a miR396b, que mostra a afinidade de ligação (AG = -33,9 kcal / mol); o painel do meio mostra a sequência GRF3 modificada (rGRF3), que inclui cinco mudanças de base da sequência do tipo selvagem (uma alteração A-> U, G-> A, U-> A, G-> A e A- > G), todas as quais retêm a sequência de aminoácidos nativa, mas que desestabiliza substancialmente a interação com o miR396b microRNA, (reduzindo o AG para -14,4 kcal / mol); e o painel inferior mostra um gráfico de um constructo de expressão 35S.GIF1.

[0012] A Figura 2 mostra os níveis relativos de expressão de GRF3 e GIF1 em plantas transgênicas de Arabidopsis como estimado por RT-qPCR, bem como em cruzamentos entre essas plantas transgênicas, que representam os níveis de GRF3 em plantas de tipo selvagem como tendo um valor relativo de 1, que pode ser visto que a super-expressão de miR396 (sob o controle do promotor 35S), reduz a expressão GRF3, enquanto que o nível de expressão de GRF3 em transgênicos rGRF3 é cerca de cinco vezes o nível de expressão de GRF3 em plantas de tipo selvagem. Este aumento de GRF3 em plantas transgênicas que expressam a versão mutante é causado pelo alívio da repressão miARN. No cruzamento entre rGRF3 e 35S: plantas GIF1, a expressão rGRF3 é ligeiramente (mas, não de forma significativa) mais baixa do que o nível de expressão de cinco vezes visto nas plantas rGRF3. A título de comparação, os níveis de GIF1, novamente representando os níveis de expressão nas plantas do tipo selvagem como 1, não é significativamente alterado em 35S:miR396 expressando plantas, mas é quase quarenta vezes o nível de tipo selvagem em plantas rGRF3 e cruza entre plantas rGRF3xGIF1. As medições são triplicadas ± SEM

[0013] A Figura 3 mostra a modificação no desenvolvimento foliar observada em plantas, plantas rGRF3 35S.GIF1 e plantas rGRF3x35S:GIF1. No painel esquerdo, área foliar, massa fresca e massa seca foram determinadas para folhas completamente expandidas primeiros, que mostram mais facilmente alterações observadas; o painel direito mostra fenótipos do desenvolvimento da folha em plantas em dias curtos, enquanto o painel inferior direito mostra as plantas cultivadas em grandes vasos em condições de dias curtos.

[0014] A Figura 4 mostra, no painel superior, senescência foliar atrasada de plantas rGRF3x35S:GIF1 cruzadas; no painel inferior, senescência foliar atrasada de uma folha individual é mostrado para 5 folhas totalmente expandida, que foram destacadas e incubadas no escuro (senescência induzida no escuro). A progressão da senescência foi seguida por medição da fluorescência da clorofila (Fv / Fm).

[0015] A Figura 5 mostra a área foliar das plantas transformadas com a versão de tipo selvagem de GRF3 (GRF3) e / ou com a versão resistente miR396 de GRF3 (rGRF3).

[0016] A Figura 6 mostra o peso fresco (Figura 6A) 35S:miR396, todos em condições de dia longo, com o eixo vertical, sendo em unidades de gramas.

[0017] A Figura 7 mostra uma análise de ligação vizinha de GRF de Arabidopsis thaliana (AtGRF #), Oryza sativa (OsGRF #), Zea mays (ZmORF #), Glycine max (GmGRF), Populus trichocarpa (PtGRF), Prunus persica (PpGRF), Medicago truncatula (MtGRF) e Carica papaya (CpCRF) mostrado como um cladograma não enraizadas. Sublinhado: GRFs com um sítio de ligação miR396: marcados com um asterisco: GRFs com um FFD motife conservado.

[0018] A Figura 8 mostra a distribuição de motifes proteicos QLQ, WRC e FDD em GRF de Arabidopsis thaliana (AtGRF #), Oryza sativa (OsGRF #), Zea mays (ZmORF #), Glycine max (GmGRF), Populus trichocarpa (PtGRF), Prunus persica (PpGRF), Medicago truncatula (MtGRF) e Carica papaya (CpGRF)

[0019] A Figura 9 mostra uma análise de ligação vizinha GIF de Arabidopsis thaliana e Oryza sativa mostrado como um cladogram não enraizado: As sequências foram recuperados a partir de PlantTFDB 2,0 (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn).

[0020] A Figura 10 mostra as alterações prejudiciais da folha em forma de (baixo "rolamento"), que são encontradas com <cGRF2, mas não em rGRF3.

[0021] Figura 11 mostra que um ligeiro aumento da GRF3 (3x), provoca maior aumento da produtividade, por exemplo, na biomassa em comparação com um grande acúmulo de GRF2 (25x).

[0022] A Figura 12 mostra que as plantas tGRF3 apresentam taxas mais elevadas de crescimento do caule e acúmulo de biomassa no caule. Esquerda: alongamento de um segmento de haste 4,5 cm em 10 dias de tipo selvagem (wt) e plantas rGRF3.

[0023] A Figura 13 mostra - fenótipos roseta de dias curtos de plantas cultivadas. Nota aumento do tamanho das folhas e a acumulação de biomassa de plantas de acordo com a presente invenção.

[0024] A Figura 14 mostra os efeitos da seca nas diferentes plantas transgênicas.

[0025] A Figura 15 mostra GRF de Arabidopsis são expressos em tecidos proliferativos. Painel esquerdo: padrão de expressão GRF3 durante o desenvolvimento foliar (DAS = dias após a semeadura). Painel direito: GRF3 é co- expressos com genes específicos da mitose durante o desenvolvimento de Arabidopsis.

[0026] A Figura 16 mostra que o GRF de milho são co-expressos com os genes específicos da mitose.

[0027] A Figura 17 mostra um aumento no tamanho da planta causada por Arabidopsis GRF3 resistentes miR396. A) plantas de 30 dias correspondentes a linhagens de plantas transgênicas independentes: vetor vazio (WT, à esquerda), GRF3 resistente miR396 (centro rGRF3) e do tipo selvagem GRF3 (GRF3, à direita). Observe o tamanho maior das rosetas transformadas com o rGRF3. B) completamente expandidas primeira área foliar das plantas transgênicas diferentes descritos em (A). Pelo menos 50 plantas independentes foram pontuadas para cada vetor. Barras marcadas com letras diferentes são significativamente diferentes, tal como determinado por ANOVA e teste de gama múltipla de Duncan (P <0,05).

[0028] A Figura 18 mostra que a expressão tecido- específico melhora o desempenho rGRF3 na produtividade da planta. Área de primeira folha totalmente expandida de plantas transgênicas expressando rGRF3 de diferentes promotores: GRF3, ASYMMETRIC FOLHAS 1 (AS1) ou AINTEGUMENTA {ANT). Pelo menos 50 plantas foram classificadas para cada vetor. Para AS1: rGRF3 e ANT: rGRF3 os dados representam os transgênicos primários independentes, enquanto que para GRF3: uma linha representante rGRF3 foi usado. Barras diferentes, conforme determinado pelo teste de Kruskal- Wallis e o teste de gama múltipla de Dunn (P <0,05).

[0029] A Figura 19 mostra um aumento no diâmetro do caule devido à rGRF3. Diâmetro do caule de plantas transgênicas expressando rGRF3 de diferentes promotores: GRF3, ASYMMETRIC LEA VES 1 (AS1) e AINTEGUMENTA (ANT). Barras marcadas com letras diferentes são significativamente diferentes conforme determinado pelo teste de Kruskal-Wallis e teste de gama múltipla de Dunn (PO.05).

[0030] A Figura 20 mostra desacoplamento dos efeitos sobre o tamanho da folha daqueles em tempo de folha-senescência usando promotores específicos de tecido. Como aqui é mostrado GRF3: rGRF3 aumenta o tamanho da folha e atrasos senescência foliar. Este último efeito pode ser dissociado do aumento no tamanho da folha, se desejado. Expressão de rGRF3 de promotores ANT e AS1 aumentou significativamente o tamanho da folha com um efeito menor sobre senescência foliar. Senescência escuro induzida de folhas completamente expandidas # 5. Fotos foram tiradas imediatamente após as folhas expandidas cheias foram cortadas a partir da roseta (dia 1) e depois foram incubadas 6 dias em escuridão (dia 6). Para GRF3: uma linhagem representante rGRF3 foi usada, e para os vetores AS1:rGRF3 e ANT:rGRF3 as 4 plantas transgênicas primárias com a maior área foliar foram selecionadas.

[0031] A Figura 21 mostra as sequências de nucleotídeos dos GRF de Arabidopsis thaliana dos quais há 9, nomeadamente AtGRFI (SEQ ID N° 40), M.GRF2 (SEQ ID N° 87), MGRF3 (SEQ ID N° 2), AtGRF4 (SEQ ID N° 19), AtGRF5 (SEQ ID N° 41), AtGRF6 (SEQ ID N° 42), AtGRF7 (SEQ ID N° 43), AtGRF8 (SEQ ID N° 44), e AtGRF9 (SEQ ID N° 45 ). A seção das sequências sublinhadas representam a porção da sequência de nucleotídeo que codifica o domínio WRC (Trp, Arg, Cys); e a seção sublinhada e em negrito das seqüências representam o site de destino miR396, se estiver presente.

[0032] A Figura 22 mostra as sequências de aminoácidos dos GRFs de A. thaliana dos quais há 9 (AtGRFI (SEQ ID N° 46), MGRF2 (SEQ ID N° 47), AtGRF3 (SEQ ID N° 20), AtGRF4 (SEQ ID N° 21), AtGRF5 (SEQ ID N° 48), AtGRF6 (SEQ ID N° 49), AtGRF7 (SEQ ID N° 50), AtGRF8 (SEQ ID N° 51), e AtGRF9 (SEQ ID N° 52), a seção sublinhada das sequências representam a porção da sequência de aminoácidos conhecida como o domínio WRC (Trp, Arg, Cys) e a seção sublinhada e negrito das sequências representam o padrão FFD.

[0033] A Figura 23 mostra as sequências de nucleotídeos de GRF de Oryza sativa (arroz) dos quais existem 12 (OsGRFI (SEQ ID N° 3), OsGRF2 (SEQ ID N° 4), OsGRF3 (SEQ ID N° 5), OsGRF4 (SEQ. ID N° 6), OsGRF5 (SEQ. ID N° 53), OsGRF6 (SEQ. ID N° 54), OsGRF7 (SEQ. ID N° 55), OsGRF8 (SEQ ID N° 56), OsGRF9 (SEQ. ID N° 57), OsGRFI10 (SEQ. ID N°58), OsGRF11 (SEQ. ID N° 59), e OsGRF12 (SEQ. ID N° 60)), a parte sublinhada e o negrito das sequências representam local alvo miR396, se estiver presente.

[0034] A Figura 24 mostra as sequências de aminoácidos de GRF de Oryza sativa (arroz) dos quais existem 12. (OsGRFI (SEQ ID No. 22), OsGRF2 (SEQ ID No. 23), OsGRF3 (SEQ ID No. 24), OsGRF4 (SEQ ID N ° 25), OsGRF5 (SEQ ID No. 61), OsGRF6 (SEQ ID No. 62), OsGRF7 (SEQ ID No. 63), OsGRF8 (SEQ ID No. 64), OsGRF9 (SEQ ID No. 65), OsGRF10 (ID SEQ N ° 66), OsGRF11 (SEQ ID No. 67), e OsGRF12 (SEQ ID No. 68)).

[0035] A Figura 25 mostra as sequências de nucleotídeos dos GRF de Zea mays (milho) das quais existem 14) (ZmORFI (SEQ ID No. 7), ZmORF2 (SEQ ID No. 69), ZmORF3 (SEQ ID No. 8), ZmORF4 ( SEQ ID No. 70), ZmORF5 (SEQ ID No. 9), ZmORF6 (SEQ ID No. 10), ZmORF7 (SEQ ID N ° 11), ZmORF8 (SEQ ID No. 71), ZmORF9 (SEQ ID No. 12), ZmORFI 0 (SEQ ID No. 72), ZmORF11 (SEQ ID No. 13), ZmORF12 (SEQ ID No. 73), ZmORF13 (SEQ ID No. 74), e ZmORF14 (SEQ ID No. 14)). A seção sublinhada e em negrito das seqüências representam o site de destino miR396, se estiver presente.

[0036] A Figura 26 mostra as sequências de aminoácidos de GRF de Zea mays (milho) dos quais existem 12. (ZmORFI (SEQ ID No. 26), ZmORF2 (SEQ ID No. 75), ZmORF3 (SEQ ID No. 27), ZmORF4 (SEQ ID N° 76), ZmORF5 (SEQ ID No. 28), ZmORF6 (SEQ ID No. 29), ZmORF7 (SEQ ID No. 30), ZmORF8 (SEQ ID No. 77), ZmORF9 (SEQ ID No. 31), ZmORFI S (SEQ ID N° 78), ZmORF11 (SEQ ID No. 32), ZmORF12 (SEQ ID N° 79), ZmORF13 (SEQ ID N° 80), e ZmORF14 (SEQ ID N° 33)).

[0037] A Figura 27 mostra a sequência de nucleotídeos de um GRF com elevada similaridade com AtGRF3, ou seja, GRF de Glycine max (soja)(GmGRF) (SEQ ID No. 16). A seção sublinhada e em negrito das seqüências representam o site de destino miR396, se estiver presente.

[0038] A Figura 28 mostra a sequência de nucleotídeos de um GRF com elevada similaridade com AiGRF3, nomeadamente, GRF de Medicago truncatula (MtGRF) (SEQ ID N° 7).

[0039] A Figura 29 mostra a sequência de nucleotídeos de um GRF com elevada similaridade com AtGRF3, nomeadamente, GRF de Populus trichocarpa (PtGRF) (SEQ ID No. 18).

[0040] A Figura 30 mostra a sequência de nucleotídeos de um GRF com elevada similaridade com AiGRF3, ou seja, GRF de Prunus persica (PpGRF) (SEQ ID No. 15).

[0041] A Figura 31 mostra a sequência de aminoácidos para um GRF de Medicago truncatula (MtGRF) (ID SEQ N° 36); a seção sublinhada das sequências representam a porção da sequência de aminoácidos conhecida como o domínio WRC (Trp, Arg, Cys); e a seção sublinhada e em negrito das seqüências representam o motife FFD.

[0042] A Figura 32 mostra a sequência de aminoácidos para um GRF de Glycine max (soja) (GmGRF) (SEQ ID N° 35); a seção de sequências sublinhadas representam a porção da sequência de aminoácidos conhecida como o domínio WRC (Trp, Arg, Cys); e a seção de sequências sublinhado e em negrito representam o motife FFD.

[0043] A Figura 33 mostra a sequência de aminoácidos para um GRF de Populus trichocarpa (PtGRF) (ID SEQ N° 37); a seção de sequências sublinhadas representam a porção da sequência de aminoácidos conhecida como o domínio WRC (Trp, Arg, Cys); e a seção de sequências sublinhada e em negrito representam o motife FFD.

[0044] A Figura 34 mostra a sequência de aminoácidos para um GRF de Prunus persica (PpGRF) (SEQ ID N° 34); a seção de sequências sublinhadas representam a porção da sequência de aminoácidos conhecida como o domínio WRC (Trp, Arg, Cys); e a seção de sequências sublinhado e em negrito representam o motife FFD.

[0045] A Figura 35 mostra a sequência de nucleotídeos para a GRF3 de Arabidopsis com uma mutação local miR396-alvo (GRF3 At-r) (SEQ ID N° 81); a parte sombreada e sublinhada da seqüência é o site miR396-alvo mutado. O caso mais baixo refere-se a substituições de base para fazer o GRF resistentes a miR396. Para evitar dúvidas, quando o AIGRF3 mutante é referido aqui, a menos que indicado de outra forma, é esta sequência que está sendo referida. Esta sequência também é aqui referido como At- rGRF3 e rGRF3. Esta mutação Ai-rGRF3 foi aqui utilizada para gerar nomeadamente plantas de Arabidopsis transgênicas.

[0046] A Figura 36 mostra a sequência de nucleotídeos para um GRF de Glycine max com um sítio-alvo miR396 mutado (Gm-rGRF) (SEQ ID N° 82); a parte sombreada e sublinhado da seqüência é o site miR396-alvo mutado. O caso mais baixo refere-se a substituições de base para fazer o GRF resistentes a miR396. Este mutante Gm-rGRF foi aqui utilizado para gerar plantas transgênicas de Arabidopsis.

[0047] A Figura 37 mostra a sequência de nucleotídeos para um GRF4 de Oryza sativa com um sítio-alvo miR396 mutado (Ss-rGRF4.1) (SEQ ID N° 83); a parte sombreada e sublinhado da sequência é o site miR396-alvo mutado. O caso mais baixo refere-se a substituições de base para fazer o GRF resistentes a miR396. Este mutante Os- rGRF4 foi aqui utilizado para gerar plantas transgênicas de Arabidopsis. Esta seqüência também é aqui referida como Os- rGRF4.1 e rOsGRF4.1.

[0048] A Figura 38 mostra tabelas de similaridade entre At-GRF3 e GRFs de outras espécies de plantas com base na sequência de aminoácidos primária. A semelhança global entre GRF3 e cada GRF de At, Os e Zm (além de outros GRFs altamente similares de espécies selecionadas) foi marcado com agulha (EMBOSS:http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/). Identidade refere-se quando um aminoácido é idêntico na posição correspondente; Considerando similaridade refere-se quando uma substituição conservativa de um aminoácido se encontra em uma posição correspondente.

[0049] A Figura 39 mostra a sequência de nucleotídeos que codifica JD16_GIF1 (incluindo o promotor 35S (nt 427 - 1295) - seção sublinhada; GIF1 Sequência de codificação (nt 1310 - 1942) - Seção em itálico e negrito; e a seção terminal (nt 2106 - 2755) - em negrito e sublinhada.

[0050] A Figura 40 mostra a sequência de nucleotídeos que codifica RER32 e GRF3 (SEQ ID No. 85) (incluindo GRF3 Promotor (427-1707) - seção sublinhada; 5' UTR (caso e itálico 1708-1913) inferior; GRF3 sequência de codificação + introns [em minúsculas] (1914-4231) - Itálico e negrito; 3'UTR (4232-4454) - minúsculas e itálico, e seção terminal (4455-5105) - em negrito e sublinhado.

[0051] A Figura 41 mostra um mapa do vetor 35S.GIF1 (JD16) (SEQ ID No. 84) - tamanho do vetor: 11332 pb Digest com BamHI e Vela. Produtos: 10682 e 650 pb.

[0052] A Figura 42 mostra um mapa do vetor GRF3: GRF3r (RER32) - tamanho do Vetor: 13642 pb Digerir com XbaI e Vela. Produtos: 11962 e 1680 pb.

[0053] A Figura 43 mostra que a super-expressão de GIF1, MIC2, e GIF3 promove a proliferação celular e o tamanho da folha e que as proteínas MIC2 e GIF3 são equivalentes funcionais de GIF1 (ver Figura 43, em combinação com a Figura 9).

[0054] A Figura 44 mostra os mapas dos plasmídeos que compreendem dois TGRF3:GIF1 no pBRACT1 14. pBRACT1 14 está disponível a partir de www.bract.org. Os pBRACTs baseiam-se no sistema de vetor pGreen / pSoup e a referência original é pGreen: Hellens et al, 2000.

[0055] A Figura 45 mostra senescência foliar atrasada em plantas de Arabidopsis transgênicas primários por um mutante de GRF de Arabidopsis (At-rGRF3) e por um GRF de soja mutante (GM-rGRF).

[0056] A Figura 46 mostra que a expressão em Arabidopsis de ortólogos GRF3 de soja e de arroz, quando dissociada da regulação miR396 também aumentam a biomassa da planta. A área da primeira folha totalmente expandida de plantas transgênicas expressando GRF de Arabidopsis, soja ou arroz foi medida.

[0057] A Figura 47 mostra a sequência de nucleotídeos de um GRF com elevada similaridade com AtGRF3, nomeadamente, de GRF de Carica papaya (CpGRF) (SEQ ID No. 88).

[0058] A Figura 48 mostra a sequência de aminoácidos para um GRF de Carica papaya (CpGRF) (SEQ ID N° 89); a seção de sequências sublinhadas representam a porção da sequência de aminoácidos conhecida como o domínio WRC (Trp, Arg, Cys); e a seção de sequências sublinhada e em negrito das seqüências representam o motife FFD.

[0059] A Figura 49 mostra dados comparando a largura da haste de 10 centímetros acima do nível do solo no florescimento e na largura da haste máximo no florescimento em plantas Brassica oleracea transformadas com Arabidopsis rGRF3 e plantas controle (sem o At rGRF3).

[0060] A Figura 50 mostra a expressão de rGRF3 a partir de promotores específicos de tecidos. A) Superior: Representação esquemática de uma constructo expressando GRF3 como uma fusão de translação de GFP. Conclusão: Padrão de expressão de proteína de fusão GRF3-GFP em folhas de diferentes idades coletados de GRF3: GRF3-GFP e GRF3: plantas rGRF3-GFP. B) O nível de expressão de mRNA em GRF3 ápice e folhas de diferentes idades. C) coloração GUS de plantas transformadas com ANT: GUS e AS1: repórteres GUS. A parte superior, representação esquemática dos repórteres.

[0061] A Figura 51 mostra os níveis de expressão de rGRF3 sob promotores específicos de tecido e a área da folha de transformantes. A) Os níveis de expressão de GRF3 em mudas transgênicas expressando GRF3 de diferentes promotores. As determinações foram realizadas por meio de RT-qPCR e normalizadas para as plantas de tipo selvagem. B) Área de primeira e segunda folhas completamente expandidas. C) Primeira (a esquerda) e terceira (a direita) folhas totalmente expandida.

[0062] A Figura 52 mostra imagens de 40 dias das plantas velhas expressando rGRF3 de seus promotores endógenos e promotores ANT e AS1.

[0063] A Figura 53 mostra a senescência retardada quando rGRF3 é expresso sob o controle do seu próprio promotor. Senescência é evidente no tipo selvagem e quando rGRF3 é expresso sob o controle de AS1 e / ou ANT. A) Fotos de 50 dias de rosetas velhas. Observe a senescência tardia do GRF3: plantas rGRF3 e o desenvolvimento normal da AS1:GRF3 e ANT.GRF3. B) A senescência de uma folha individual é mostrada para folha totalmente expandida 5, que foi destacado e incubada no escuro (senescência induzida escuro). A progressão da senescência foi quantificada por determinação de Fv / Fm

[0064] A Figura 54 mostra a área foliar traçada para plantas transgênicas primários independentes. CHF3 é um controle de vetor vazio, rGRF3 com o motife FFD é o rGRF3 cDNA expresso a partir de seu próprio promotor. rGRF3 AAD é o ADNc de rGRF3 com três mutações no motife FFD (FFDDW) que substituem os dois aminoácidos fenilalanina e triptofano com três aminoácidos alanina (AADDA).

[0065] A Figura 55 mostra uma comparação entre as plantas que expressam rGRF2 e rGRF3. Como mostra a expressão aqui rGRF3 leva à produção de plantas maiores do que o tipo selvagem ou expressão rGRF2. rGRF2 também gera rosetas distorcidas.

[0066] A Figura 56 é uma tabela que mostra a largura da haste maior no florescimento e 10 cm de caule para Brassica oleracea transformantes expressando rGRF3 e plantas controle (CT).

[0067] A Figura 57 apresenta à esquerda, um gráfico que mostra o comprimento da raiz em vários dias após a semeadura para Brassica oleracea do tipo selvagem, e duas plantas de Brassica oleracea transgênicas expressando rGRF3. A direita, é mostrado um gráfico exibindo a velocidade de alongamento radicular para o tipo selvagem ou duas plantas transgênicas expressando rGRF3.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0068] A presente invenção se baseia na descoberta surpreendente de que um novo gene modificado GRF3, rGRF3, o qual é mostrado para ser dissociado do controle por miR396, particularmente, na presença de superexpressão de GIF1, pode ser utilizado para melhorar significativamente a biomassa, melhorar a resistência ao estresse, melhorar a tolerância à seca, retardar a senescência foliar em plantas. A melhora no acúmulo de biomassa é surpreendentemente alta e inesperadamente melhor do que o outro único miRNA relatado dissociado de GRF, nomeadamente, rGRF2, enquanto a tolerância à seca é inesperada de dados anteriormente relatados.

[0069] Os presentes invençãores também descobriram, surpreendentemente, que ortólogos de GRF3 que também são modificados para ser dissociado do controle por miR396 também proporcionam estes efeitos surpreendentes e inesperados.

[0070] Em um primeiro aspecto, é proporcionado um ácido nucleico isolado que codifica um fator de regulação do crescimento modificado (GRF) -3 ou um ortólogo do mesmo, o qual o ácido nucleico é desacoplado do controle por miR396.

[0071] Em outro aspecto, é proporcionado um constructo compreendendo o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, operativamente, ligado a um promotor e um terminador.

[0072] A presente invenção proporciona ainda um vetor compreendendo o ácido nucleico da presente invenção ou o constructo, de acordo com a presente invenção.

[0073] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma planta, célula vegetal ou tecido vegetal compreendendo o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, o constructo de acordo com o presente invenção ou o vetor, de acordo com a presente invenção.

[0074] Ainda em outro aspecto é proporcionado um método para a utilização do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção que compreende a introdução do referido ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou de um constructo de acordo com a presente invenção ou um vetor de acordo com a presente invenção, em uma planta.

[0075] Em outro aspecto da presente invenção proporciona-se o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção ou de um constructo de acordo com a presente invenção ou um vetor de acordo com a presente invenção para utilização na fabricação de uma planta com a produtividade e / ou o rendimento aumentados (incluindo, por exemplo, o aumento de biomassa, aumento da resistência ao estresse, maior tolerância à seca, aumento da produção de sementes, o aumento da produtividade de grãos, o aumento do crescimento da raiz, aumento da velocidade de crescimento radicular, senescência foliar atrasado e suas combinações).

[0076] Em outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de produção de uma planta com a produtividade e / ou o rendimento aumentados (incluindo, por exemplo, um ou mais de aumento da biomassa, o aumento da resistência ao estresse, maior tolerância à seca, senescência foliar retardada, o aumento da produção de sementes, aumentou do rendimento de sementes, aumentou do crescimento da raiz, aumento da velocidade de alongamento da raiz e as suas combinações), compreendendo a transformação da planta com ácido nucleico, de acordo com a presente invenção ou de um constructo, de acordo com a presente invenção ou um vetor, de acordo com a presente invenção.

[0077] Um aspecto adicional proporciona a utilização de um ácido nucleico, de acordo com a presente invenção ou de um constructo, de acordo com a presente invenção ou um vetor, de acordo com a presente invenção na fabricação de uma planta para aumentar a produtividade e / ou o rendimento (por exemplo, um ou mais do aumento da biomassa, resistência ao estresse aumentada, tolerância à seca aumentada, atraso da senescência foliar, aumento da produção de sementes, aumento da produção de sementes, aumento do crescimento das raízes, aumento da velocidade de alongamento da raiz ou suas combinações).

[0078] Em outro aspecto, a presente divulgação proporciona um novo gene modificado, rGRF3, o qual é mostrado para ser dissociado do controle por miR396, particularmente, na presença de superexpressão de GIF1.

[0079] Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar um novo gene modificado GRF3 ou um novo gene ortólogo GRF3 modificado.

[0080] É um outro objetivo da presente invenção proporcionar novas plantas compreendendo um gene GRF3 modificado ou um gene ortólogo GRF3 modificado.

[0081] É um outro objetivo da presente invenção proporcionar novas plantas que compreendem um GRF3 modificado ou um ortólogo GRF3 modificado na presença de superexpressão de GIF1.

[0082] É ainda um outro objetivo da presente invenção proporcionar um método para utilizar o GRF3 modificado ou ortólogo GRF3 modificado aqui descrito.

[0083] É um outro objetivo da presente invenção proporcionar um método para a produção de plantas com um fenótipo de um aumento da produtividade e / ou de rendimento (por exemplo, um fenótipo de senescência foliar retardada, aumento da biomassa, o aumento da resposta ao estresse, maior tolerância à seca, aumento da produção de sementes, aumento da produtividade de grãos, aumento do crescimento das raízes, aumento da velocidade de alongamento da raiz ou suas combinações), em comparação tanto com plantas do tipo selvagem quanto plantas compreendendo um GRF2 modificado (rGRF2).

[0084] Um outro objetivo da presente invenção é o de proporcionar plantas com um fenótipo de um aumento da produtividade e / ou de rendimento (por exemplo, fenótipo de atraso na senescência foliar, aumento da biomassa, aumento da resposta ao estresse, maior tolerância à seca, aumento da produção de semente, aumento do rendimento em sementes, aumento do crescimento das raízes, aumento da velocidade de alongamento da raiz ou suas combinações), sem efeitos colaterais adversos observados em plantas que expressam GRF2 (rGRF2) modificado, tais como mudanças prejudiciais na forma das folhas, por exemplo, folhas curvadas ou folhas de rolamento descendente.

[0085] Outros objetivos e vantagens da presente invenção serão apreciados por referência à totalidade da descrição aqui fornecida, e as reivindicações anexas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERENCIAIS DA INVENÇÃO

[0086] Rodriguez et al. (2010) seguiu a expressão padrão de miR396 diretamente usando pequenas marcaçoes de RNA e hibridização in situ em ápices e, indiretamente, através da expressão diferencial de tipo selvagem e repórteres GRF2-GUS-resistentes miRNA. miR396 foi expresso em baixos níveis no meristema e primórdios foliares, e, em seguida, progressivamente acumulado com o desenvolvimento da folha. Em contraste, os GRF, que são altamente expressos no SAM e folhas jovens, diminuiu durante o desenvolvimento foliar, em conjunto com o recuo da proliferação celular.

[0087] Padrões antagônicos temporais de expressão foram observados para miR156 e miR172 e seus alvos, o SPL e fatores de transcrição AP2-like, respectivamente (Chuck et al, 2007;. Wu e Poethig, 2006). Os miR156 heterocrônicos e miR172 redes correspondentemente regular juvenil para adulto, e vegetativo de transições de fase reprodutiva, que exigem decisões que implicam toda a planta (Aukerman e Sakai, 2003; Chen, 2004;. Chuck et al, 2007;. Schmid et al, 2005 ; Wu e Poethig, 2006). As observações sobre miR396 indicou que este miRNA também está envolvido na coordenação de eventos de desenvolvimento em plantas; no entanto, o seu papel seria restrito aos órgãos individuais.

[0088] O programa de desenvolvimento de Arabidopsis dirige um padrão basiplástico, em que a maturação folha começa na ponta e, em seguida, prossegue em direcção à base do órgão (Donnelly et al., 1999). A divisão celular ocorre em primeiro lugar todo o primórdio e depois uma paragem da mitose movimentos da frente a partir da ponta para a base da folha, de modo que as células na parte distal do ciclismo de paragem da folha e começar a expandir-se, enquanto que as células na base continuam a proliferar (Donnelly et al., 1999). Resultados de Rodriguez et al. mostrou que a parte distal da folha acumula mais miR396 e um gradiente de atividade miARN prossegue em direção à base do órgão. Esse resultado foi suportado por pequenas marcações de RNA e o recuo observado do GRF2-GUS reportes de tipo selvagem, que, em seguida, com o padrão de um CYCB1; um repórter. Essas observações levaram esses autores para implicar a repressão da expressão de GRF por miR396 como um componente da frente para o término da mitose.

[0089] Foram observados os padrões espaciais semelhantes de expressão de mRNA GRF2 e miR396 no meristema e folha primordial, indicando que não é a co-expressão da miRNA e seu alvo nesta fase inicial. A situação era diferente, no entanto, em fases posteriores do desenvolvimento foliar. A de tipo selvagem GRF2-repórter GUS foi ativo apenas na parte proximal das folhas jovens em desenvolvimento, enquanto que o repórter rGRF2-GUS foi expresso em toda a folha. Esta mudança qualitativa na expressão de tipo selvagem GRF2-GUS foi acompanhada por um grande aumento na miR396, cujos níveis mudaram em até 10 - 30 vezes em folhas de diferentes idades de desenvolvimento. Curiosamente, a diminuição na expressão de GRF ocorreu antes que miR396 atingisse o seu nível máximo, o que indica que um aumento parcial de miRNA é suficiente para reprimir os GRF in vivo; no entanto, não pode excluir-se que fatores adicionais que atuam em conjunto com miR396 podem participar neste processo.

[0090] Tem sido proposto que os miRNAs poderiam ter ambos os efeitos qualitativos, levando à completa eliminação dos seus alvos, e os efeitos quantitativos mais subtis (Bartel e Chen, 2004). Nas plantas, essas interações quantitativas têm sido propostos para miR169 (Cartolano et al., 2007) e miR156 (Wang et al., 2008), miR319 (Ori et al., 2007) e miR164 (Baker et al., 2005; Nikovics et al, 2006), e seus alvos. De um ponto de vista mecanicista, é tentador especular que miR396 tem dupla função durante o desenvolvimento foliar: pode regular a expressão quantitativa de GRF em SAM e primórdios foliares, enquanto causando um grande efeito qualitativo contribuindo para o apuramento de atividade GRF dos órgãos mais velhos. Este último papel funcional na limpeza transcrições GRF pode explicar o aumento contínuo dos níveis miR396, mesmo depois de proliferação celular tenha sido finalizada. Por outro lado, o potencial de regulação quantitativa da atividade GRF durante o desenvolvimento foliar precoce pode desempenhar um papel relevante no ajuste fino da proliferação celular, tem sido demonstrado que as modificações do equilíbrio entre miR396 e níveis GRF2 tem consequências importantes para o número final de células no órgão.

[0091] miR396 foi identificado pela primeira vez, devido à sua conservação entre A. thaliana e arroz (Jones- Rhoades e Bartel, 2004). miR396 e GRFs com um site de destino miR396 estão presentes em muitas espécies de plantas (Axtell e Bartel, 2005; Jones-Rhoades e Bartel, 2004), indicando uma origem antiga para a rede reguladora miR396-GRF. A função dos GRFs como reguladores do número de células em folhas está bem estabelecida com base nos fenótipos de grf (Horiguchi et al, 2005;.. Kim et al, 2003; Kim e Lee, 2006) e mutantes gif (Horiguchi et al., 2005; Kim e Kende, 2004), e plantas com altos níveis de miR396 (Liu et al, 2009)..

[0092] Rodriguez et al. (2010) estenderam estas observações e descobriram que os GRF que regulam a proliferação celular no SAM, que pelo menos em parte explica a falta de um meristema funcional em mutantes an3-1 que super-expressam miR396 (este estudo) e em múltiplas grf knock-out (Kim et al, 2003;. Kim e Lee, 2006). Análise do transcriptoma de miR396 superexpressos moderado mostrou que a regulação negativa de genes específicos da mitose é um dos principais efeitos moleculares de níveis elevados de miR396. No entanto, os próprios GRF não alteram a sua expressão durante o ciclo celular (Menges et al., 2005) e o trabalho futuro vai ser necessária para identificar os mecanismos subjacentes à atividade dos GRF.

[0093] As medições dos GRFs por RT-qPCR indicaram que os alvos miR396 e não-alvos são desligados em estágios semelhantes de desenvolvimento das folhas, e que atuam de forma redundante. Estudos anteriores em que os promotores foram fundidos diretamente a um repórter GUS mostraram que a transcrição dos genes de GRF pode ocorrer em diferentes regiões da folha (Horiguchi et al., 2005). Rodriguez et al. observou que o controle pós-transcricional da GRF2 por miR396 contribui significativamente para o seu padrão de expressão final, e concluíram que é possível que o miRNA também desempenha um papel fundamental no ajuste da expressão de outros GRF.

[0094] O gene CIN TCP de erva-de-lobo demonstrou ser expresso em um padrão dinâmico durante o desenvolvimento da folha e para regular a expressão de ciclina (Nath et al., 2003). genes semelhantes a CIN de Arabidopsis, que são regulados por miR319, também têm sido implicados na coordenação da proliferação e diferenciação celular em folhas (Efroni et al, 2008; Koyama et al, 2007; Masuda et al., 2008; Palatnik et al., 2003; Schommer et al., 2008). Um aumento dos níveis de TCP4 devido a mutações que prejudicam a interação com miR319 produz folhas menores (Efroni et al, 2008; Palatnik et al, 2003; Schommer et al, 2008).

[0095] Rodriguez et al. observaram que as plantas que expressam formas resistentes miR319 de TCP4 induzidiu a miR396. À medida que o equilíbrio quantitativo entre miR396 e os GRF que regula o número de células em folhas, o aumento em miR396 causada por TCP4 pode ser responsável por pelo menos parte da redução no número de células em mutantes soj8. Eles observaram, no entanto, que o aumento dos níveis de TCP4 também causou uma redução dos GRF que não foram regulados por miR396 e GIF1, indicando um efeito ao nível da transcrição. Circuitos reguladores, em que um fator de transcrição provoca tanto a repressão da transcrição de genes alvo, e pela indução de um miRNA que por sua vez, pós-transcricionalmente inibe o mesmo grupo de genes, são bem descritas em animais, onde eles são referidos circuitos de alimentação para a frente como coerentes (Hornstein e Shomron, 2006).

[0096] miR319 superexpressos (Efroni et al, 2008; Hori. et al, 2007; Palatnik et al., 2003) e TCP Knock-out (Nath et al, 2003;.. Schommer et al, 2008) marcaram mudanças na morfologia foliar, bem como outros defeitos fenotípicos, como um atraso no tempo de floração (Palatnik et al., 2003). Isso indica que os PFC têm funções que vão além do desenvolvimento foliar. No entanto, é possível que miR319-regulado a TCPs recruta a parte biológica miR396 como parte de sua função. Rodriguez et al. propos que a rede miR396 poderia haver uma ligação entre os meios de desenvolvimento diferentes ou estímulos ambientais e os componentes da maquinaria do ciclo celular.

[0097] Nesta revelação, os efeitos em plantas de mutação GRF3 (e ortólogos dos mesmos) para produzir uma nova molécula, rGRF3 (ou ortólogos dos mesmos), de uma maneira análoga àquela para a GRF2 relatado por Rodriguez et al. são mostrados. Surpreendentemente, no entanto, é aqui relatado que o resultado seja uma planta com um aumento acentuado na produtividade e / ou de rendimento (por exemplo, com um aumento acentuado na biomassa, o aumento da resposta ao estresse, senescência foliar retardada, aumento da produção de semente, aumento do rendimento em sementes, aumento do crescimento radicular, aumento da velocidade de alongamento da raiz e / ou aumento da tolerância à seca), se comparado com as plantas com o GRF3 tipo selvagem (por exemplo, não-mutante), GRF2 tipo selvagem ou o GRF2 mutante (rGRF2) descritos por Rodriguez et al.

[0098] Além disso, mostra-se que quando, pelo menos, um GIF (por exemplo, GIF1) é superexpresso na presença do GRF3 mutado (rGRF3) ou um ortólogo mesmos, estes efeitos são aumentados.

[0099] Além disso, as folhas de plantas GRF3 mutantes e / ou plantas GRF3 ortólogo mutantes não foram curvada para baixo, como as de GRF2 mutante (rGRF2) relatado em Rodriguez et al.

[00100] Um ligeiro aumento da área da folha pode ser observado nas plantas rGRF2 se o seu nível for aumentada para, pelo menos, vinte vezes o nível de GRF2; no entanto, um impacto muito maior na produtividade (por exemplo, tamanho da folha e biomassa da planta) pode ser visto em plantas e plantas rGRF3 rGftF3-ortólogo com apenas três a cinco vezes mais GRF3 ou GRF3-ortólogo.

[00101] Assim, de acordo com esta divulgação, como mostrado em detalhe nos exemplos e métodos experimentais fornecidos abaixo, rGRF3 ou ortólogos destas é / são produzidos compreendendo várias mutações sinônimas na sequência de ácido nucleico - isto é, não há nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de GRF3.

[00102] O resultado é uma planta em que a repressão de outro modo conseguido por miR396 é desacoplado da rGRF3, e plantas, com o aumento da produtividade e / ou o rendimento (incluindo com o aumento da biomassa, o aumento da resistência à tensão, senescência da folha retardada e aumento da tolerância à seca ou suas combinações) são assim produzíveis.

[00103] Em um primeiro aspecto, é proporcionado um ácido nucleico isolado que codifica um fator de regulação do crescimento modificado (GRF) -3 ou um ortólogo do mesmo, o qual o ácido nucleico é desacoplado do controle por miR396.

[00104] O ácido nucleico pode ser dissociado do controle por miR396 por mutação sítio-alvo do miR396.

[00105] De preferência, o ácido nucleico mutado ou modificado é modificado apenas em local alvo miR396, por exemplo, com o restante do gene sendo não modificado ou não sendo mutado.

[00106] Em uma concretização preferida, o ácido nucleico modificado é modificado, de tal modo que compreendem alterações conservadas de ácidos nucleicos. Em outras palavras, o ácido nucleico é modificado, de tal modo que não há nenhuma alteração na sequência de aminoácidos da GRF3 ou o ortólogo GRF3 expressado pelo ácido nucleico.

[00107] A modificação do ácido nucleico desacopla essencialmente o ácido nucleico (por exemplo, genes) do controle por miR396.

[00108] De preferência, o ácido nucleico é desacoplado do controle por miR396 por mutação do ácido nucleico no sítio alvo do miR396.

[00109] De preferência, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção codifica para uma proteína com o motife FFD.

[00110] Em algumas concretizações, de preferência, o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção codifica uma proteína tendo um motife FFD (D / E) WP.

[00111] Para evitar dúvidas, "(D / E)" significa que a posição que não seja um resíduo de um D ou E. Em outras palavras, FFD (D / E) WP significa FFDDWP ou FFDEWP.

[00112] A fim de determinar se um GRF é um ortólogo- GRF3, de acordo com a presente invenção, pode-se olhar para GRF, que codifica uma proteína possuindo o FFD, (por exemplo, motife FFD (D / E) WP).

[00113] GRF3-ortólogos, em conformidade com a presente invenção será GRF que compreendem pelo menos um local alvo miR396.

[00114] Adequadamente, o local alvo miR396 (por exemplo, no ácido nucleico de acordo com a presente invenção, tal como no gene GRF3 ou no gene GFF3-ortólogo) pode ter, compreender ou consistir na seguinte sequência de nucleotídeos

[00115] CGTTCAAGAAAGCCTGTGGAA (SEQ ID No. 1). Em algumas concretizações, esta sequência de nucleotídeos pode ser considerada a sequência do local alvo miR396 de tipo selvagem.

[00116] O GRF3-ortólogo, de acordo com a presente invenção é, de preferência, um ou mais dos seguintes GRF selecionados a partir do grupo que consiste em: GRF4 de Arabidopsis thaliana; GRF 1, 2, 3, 4, ou 5 de Oryza sativa; GRF 1, 3, 5, 6, 7, 9, 1 1 ou 14 de Zea mays; GRF de Glycine max; GRF de Medicago truncatula; GRF de Populus trichocarpa, GRF de Carica papaya e GRF de Prunus persica que foram dissociados do controle por miR396.

[00117] Em uma concretização, os GRF ortólogos são aqueles que cluster com AtGRF3 no cladogram representado na Figura 7. Foi encontrado que estes GRF3-ortólogos funcionam de forma semelhante ao AIGRF3.

[00118] Para evitar dúvida, que se aglomeram em GRF com qualquer AtGRF2 ou AtGRF9 não são de interesse no presente pedido de patente, uma vez que se verificou que estes GRF não funcionam como MGRF3.

[00119] Um GRF3-ortólogo, de acordo com a presente invenção é aquele que tem a mesma funcionalidade que AiGRF3.

[00120] O termo "ortólogo", tal como aqui utilizado, significa genes de função semelhante ou igual, mas ocorrendo em diferentes espécies.

[00121] Como mostrado na Figura 7, o GRF3-ortólogo pode ser de preferência um que compreende um local alvo miR396 e que codifica para uma proteína que tem a FFD (por exemplo, motife FFD (D / E) WP).

[00122] Os GRF-3 ortólogos, em conformidade com a presente invenção será GRF que compreendem pelo menos um local alvo miR396.

[00123] A presente invenção relaciona-se com o ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo i) uma sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID No. 2 (AtGRF3); ou ii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 45%, preferencialmente, pelo menos 50%, preferencialmente, pelo menos 60%, preferencialmente, pelo menos 65%, idêntico à SEQ ID N° 2; ou iii) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma de i) ou ii), em que a sequência de nucleotídeos compreende uma modificação no local alvo miR396 para dissociar o ácido nucleico de controle por miR396.

[00124] O ácido nucleico isolado, de acordo com a presente invenção pode compreender i) uma sequência de nucleotídeos apresentada como SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, ou SEQ ID No. 19; ou ii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 45%, preferencialmente, pelo menos 50%, preferencialmente, pelo menos 60%, preferencialmente, pelo menos 65%, idêntico à SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, or SEQ ID No. 19; ou iii) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com uma sequência de nucleotídeos de qualquer um de i) ou ii), em que a sequência de nucleotídeos de i), ii) ou iii) compreende uma modificação no local alvo miR396 para dissociar o ácido nucleico do controle por miR396.

[00125] O ácido nucleico isolado, de acordo com a presente invenção pode compreender i) uma sequência de nucleotídeos que codifica para um polipeptídeo aqui mostrada como SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No.30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 36 ou SEQ ID No. 37; ou ii) uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 45%, preferencialmente, pelo menos 50%, preferencialmente, pelo menos 60%, preferencialmente, pelo menos 65%, de identidade com a sequência de nucleotídeos de i); ou iii) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com uma sequência de nucleotídeos de qualquer um de i) ou ii), em que a sequência de nucleotídeos de i), ii) ou iii) compreende uma modificação no local alvo miR396 para dissociar o ácido nucleico de controle de miR396.

[00126] De preferência, o ácido nucleico de controle de miR396 dissociado de acordo com a presente invenção exibe maior reforço na presença de superexpressão de pelo menos um gene de GIF (por exemplo GIF1).

[00127] Superexpressão de pelo menos um GIF (por exemplo GIF1) pode ser realizada por transformar uma planta ou uma célula de planta, ou um tecido de planta, com uma constructo que compreende pelo menos um GIF (por exemplo, GIF1) sequência de codificação ligada operativamente a um promotor.

[00128] Em uma concretização da planta, célula vegetal ou tecido vegetal compreende, pelo menos, dois, por exemplo, 2 ou 3, genes GIF super-expressos.

[00129] O gene GIF, de acordo com a presente invenção pode ser qualquer gene GIF adequado, incluindo AtGIFI (por vezes aqui referida como GIF1), AtGIF 2, AtGIF 3, Os11g40100, Os12g31350, Os03g52320 ou suas combinações.

[00130] A sequência codificadora GIF (por exemplo, GIF1) pode estar sob o controle de um promotor constitutivo, tal como o promotor CaMV 35S, ou pode ser um promotor específico do tecido.

[00131] Como mostrado em detalhe nos exemplos e métodos experimentais fornecidos abaixo, vGRF3 ou ortólogos dos mesmos podem ser produzidos, compreendendo várias modificações de ácidos nucleicos sinônimas - isto é, não há nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de GRF3.

[00132] Em uma concretização, o GRF3 ortólogo ou modificada podem compreender pelo menos uma ou todas as seguintes alterações de bases no local alvo miR396 um alteração A-> U, G-> A, U-> G, U-> A , G-> C, A-> T, G-> A, T-> A, G-> A, A-> G. Estas alterações podem manter a sequência de aminoácidos nativa, mas, substancialmente, desestabilizam a interação de miR396 com o referido rGRF3.

[00133] Em uma concretização, o GRF3 ortólogo ou modificado pode compreender pelo menos uma ou todas as seguintes alterações de bases no local alvo miR396 um alteração A-> U, G-> A, U-> A, G-> A, A-> G. Estas alterações podem manter a sequência de aminoácidos nativa, mas, substancialmente, desestabilizam a interação de miR396 com o referido rGRF3.

[00134] Em uma concretização preferida, o GRF-3 modificado ou ortólogo do mesmo, compreende um local alvo mR396 modificado tendo a seguinte sequência: CGTTCxAGAAAxCCxGTxGAx (SEQ ID No. 86), na qual x designa bases que tenham sido modificadas (por exemplo, mutadas) (por exemplo, em comparação com a sequência de tipo selvagem).

[00135] O GRF 3 modificado ou seu ortólogo, compreende um local alvo modificado miR396 tendo a seguinte sequência: CGTTCtAGAAAaCCaGTaGAg (SEQ ID No. 38), em que as letras minúsculas designa bases modificadas (por exemplo, em comparação com a sequência de tipo selvagem).

[00136] Sequências mutantes podem ser produzidas por qualquer método conhecido e vários métodos estão prontamente disponíveis por um técnico versado no assunto. Como um técnico versado no assunto irá apreciar, é possível produzir inúmeras sítio dirigidos ou mutações aleatórias na sequência de um nucleotídeo e a tela, posteriormente, para a funcionalidade melhorada do polipeptídeo codificado por vários meios.

[00137] As mutações podem ser introduzidas usando oligonucleotídeos sintéticos. Estes oligonucleotídeos contêm sequências de nucleotídeos que flanqueiam os sítios de mutação desejada. Um método adequado é divulgado em Morinaga et al., (Biotechnology (1984) 2, p646-649). Outro método para a introdução de mutações em sequências nucleotídicas é descrito em Nelson e Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151).

[00138] Um método para a introdução de mutações em uma sequência nucleotídica seria usar um kit QuikChange ® mutagênese dirigida da Stratagene.

[00139] Em algumas concretizações direcionadas Induzidos locais das lesões nos genomas de tecnologia (Tilling) descrito em Colbert et al 2001 (Plant Physiology junho de 2001, vol. 126, pp480-484) pode ser usado para o rastreio de mutações induzidas, por exemplo, mutações pontuais induzidas.

[00140] Em outro aspecto é proporcionado um constructo compreendendo o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção operacionalmente ligado a um promotor e / ou um terminador.

[00141] O promotor pode ser um promotor constitutivo, tal como o promotor 35S de CaMV, o promotor AtGRF3 nativa, ou o promotor GRF3 ortólogo nativa, ou pode ser um promotor específico do tecido.

[00142] Em uma concretização, o promotor pode ser um promotor específico do tecido.

[00143] Quando se deseja desacoplar as diferentes funções de GRF3 (tal como para dissociar o aumento da biomassa a partir de senescência foliar retardada), de preferência, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção encontra-se operacionalmente ligado a um promotor específico do tecido.

[00144] Além disso, a utilização de um promotor específico de tecido pode melhorar o desempenho de produção de planta e melhorar ainda mais a produtividade.

[00145] Em algumas concretizações, o promotor específico de tecidos pode compreender um promotor (ou pode ser) que é expresso transitoriamente durante o desenvolvimento precoce da folha.

[00146] Em uma concretização, o promotor específico de tecido pode compreender uma promotor (ou pode ser) FOLHAS ASSIMÉTRICAS 1 (AS-1) ou um promotor AINTEGUMENTA (ANT).

[00147] Um técnico versado no assunto estaria ciente de outros promotores específicos de tecidos adequados para atingir a expressão do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, no local da planta adequada. Sem pretender ser limitado pela teoria, uma GRF3 mutante ou mutante ortólogo GRF3 desacoplada de controle miR396 com ou sem a co-superexpressão do GIF podem modificar o número de células em folhas ou outros órgãos, quando os ácidos nucleicos são expressos especificamente nos tecidos. Portanto, rGRF3 afetará apenas essa parte da planta onde a expressão ocorre.

[00148] Um técnico versado no assunto poderia também estar ciente de que os padrões temporais e nível de expressão também podem ser modificado. Por exemplo, o promotor AS-1 é ativo durante um período de tempo maior do que o promotor do ANT, e, assim, gera folhas maiores quando expressando o GRF3 mutado (rGRF3) ou mutado sequências ortólogo GRF3.

[00149] Portanto, o promotor específico de tecido pode ser um que está espacialmente e / ou temporalmente regulando a expressão.

[00150] A presente invenção proporciona ainda um vetor compreendendo o ácido nucleico da presente invenção ou o constructo de acordo com a presente invenção.

[00151] Em um aspecto adicional a presente invenção proporciona uma planta, célula vegetal ou tecido vegetal compreendendo o ácido nucleico de acordo com a presente invenção, constructo de acordo com o presente invenção ou o vetor de acordo com a presente invenção.

[00152] Em uma concretização, a planta, célula vegetal ou tecido vegetal de acordo com a presente invenção pode ainda compreender um GRF2 modificado (rGRF2), o qual GRF2 modificado também é desacoplada do controle por miR396. Em outras palavras, o GRF2 também pode ser mutado em miR396 local alvo de acordo com a presente invenção. Para evitar dúvidas, esta concretização refere-se apenas a combinação do xGRF3 ou rGRF3-ortólogo de acordo com a presente invenção em combinação com TGRF2.

[00153] AtGRF2 e AtGRF9 não são GRF3-ortólogos de acordo com a presente invenção.

[00154] Portanto, o termo "GRF3-ortólogo" como aqui utilizado não inclui AtGRF2 e AtGRF9.

[00155] Por isso, a sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção não compreende uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de nucleotídeos aqui apresentadas como SEQ ID N° 87 ou ID SEQ N° 45.

[00156] Da mesma forma, os termos "GRF3-ortólogo utilizado não incluem AtGRF2 modificado ou AtGRF9 modificados.

[00157] Em uma concretização da presente invenção, a planta, célula vegetal ou tecido vegetal podem, em adição superespressar, pelo menos, um GIF (por exemplo, GIF1).

[00158] Superexpressão de pelo menos um GIF (por exemplo, GIF1) pode ser realizada por transformação da referida planta, ou uma célula vegetal, ou de um tecido vegetal com um constructo que compreende pelo menos uma sequência de codificação GIF (por exemplo, GIF1) ligada operativamente a um promotor.

[00159] Em algumas concretizações, a planta, célula vegetal ou tecido vegetal de acordo com a presente invenção pode compreender mais do que um (por exemplo, dois, por exemplo, três) de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.

[00160] A título de exemplo apenas, a planta, célula vegetal ou tecido vegetal, de acordo com a presente invenção pode compreender mais do que um (por exemplo, dois, por exemplo, três) genes rGRF3 e / ou ortólogos rGRF3. Por exemplo, a planta, célula vegetal ou tecido vegetal, de acordo com a presente invenção pode compreender rGRF3 em combinação com uma ou mais rGRF3-ortólogos.

[00161] O termo "GRF3", tal como aqui utilizado, significa o fator de regulação do crescimento 3 obtido (preferencialmente obtido) de Arabidopsis thaliana.

[00162] O termo "rGRF3" como aqui utilizado significa um fator de regulação do crescimento 3 mutado ou modificado (de preferência, obtido) de Arabidopsis thaliana. De preferência, o FATOR de regulação do crescimento mutado ou modificado 3 foi mutado ou modificado para dissociá-lo do controle por miR396.

[00163] O termo "GRF3 ortólogo", tal como aqui utilizado pode compreender um ou mais dos seguintes GRF selecionados a partir do grupo que consiste em: GRF4 de Arabidopsis thaliana; GRF 1, 2, 3, 4, ou 5 de Oryza sativa; GRF 1, 3, 5, 6, 7, 9, 1 1 ou 14 de Zea mays; GRF de Glycine max; GRF de Medicago truncatula; GRF de Populus trichocarpa; GRF de Carica papaya e GRF de Prunus persica.

[00164] O termo "rGRF3-ortólogo", tal como aqui utilizado pode compreender um ou mais dos seguintes GRF selecionados a partir do grupo consistindo de GRF4 de Arabidopsis thaliana; GRF 1, 2, 3, 4 ou 5 de Oryza sativa; GRF 1, 3, 5, 6, 7, 9, 1 1 ou 14 de Zea mays; GRF de Glycine max; GRF de Medicago truncatula; GRF de Populus trichocarpa; GRF de Carica papaya e GRF de Prunus persica que foram dissociados da controle por miR396.

[00165] O ácido nucleico que codifica para uma modificação de GRF-3 ou um ortólogo podem compreender íntrons ou pode excluir íntrons.

[00166] Em uma concretização, o ácido nucleico que codifica para um GRF-3 modificado ou um ortólogo do mesmo, compreende íntrons. Sem querer estar ligado por teoria, íntrons pode aumentar a expressão dos transgenes.

[00167] Ainda em outro aspecto, é proporcionado um método para a utilização do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção que compreende a introdução do referido ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou de um constructo de acordo com a presente invenção ou um vetor de acordo com a presente invenção, em uma planta.

[00168] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um constructo de acordo com a presente invenção ou um vetor de acordo com a presente invenção para utilização na fabricação de uma planta com o aumento da biomassa, aumento da resistência ao estresse, aumento de tolerância à seca, atraso de senescência foliar e suas combinações.

[00169] Em outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de produção de uma planta com o aumento da biomassa, aumento da resistência ao estresse, maior tolerância à seca, senescência foliar retardada e suas combinações, compreendendo transformar a planta com o ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um constructo de acordo com a presente invenção ou um vetor de acordo com a presente invenção.

[00170] Um aspecto adicional proporciona a utilização de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um constructo de acordo com a presente invenção ou um vetor de acordo com a presente invenção na fabricação de uma planta para aumentar a biomassa, aumentar a resistência ao stress, aumentar a tolerância à seca, atrasar a senescência foliar ou suas combinações.

[00171] De preferência, as plantas de acordo com a presente invenção aumentaram de biomassa, aumentaram a resistência ao estresse, aumentaram a tolerância à seca, atrasaram a senescência foliar ou suas combinações.

[00172] O termo "aumento de biomassa" pode compreender um ou mais dos seguintes selecionado a partir do grupo que consiste em: biomassa total das plantas aumentada, peso fresco aumentado, o aumento da área ou o tamanho da folha, comprimento de raiz aumentada, peso seco aumentado, aumento do crescimento da haste, aumento da biomassa da haste, maior diâmetro do caule e aumento da largura da haste na floração.

[00173] Uma vantagem técnica surpreendente da utilização de rGRF3 ou ortólogos rGRF3 (que difere do uso rAtGRF2) é que o aumento da biomassa, maior tolerância à seca, senescência foliar retardada ou combinações dos mesmos ocorre sem alterações prejudiciais da forma de folha, por exemplo, laminagem de queda.

[00174] Em algumas concretizaçõs pode ser preferível para desacoplar o aumento da biomassa a partir de senescência foliar retardada. Os invençãores descobriram, surpreendentemente, que esta pode ser conseguida através de promotores específicos de tecidos.

[00175] O termo "aumento da resistência ao estresse", como usado aqui, significa a capacidade de uma planta para permanecer produtiva (por exemplo, manter ou aumentar a biomassa, etc.), mesmo em condições que colocam a planta sob estresse, por exemplo, secas, etc.

[00176] Os termos "biomassa aumentada", "resistência ao estresse aumentado", "aumento da tolerância à seca", "senescência atrasada folha", "maior crescimento da raiz", "aumento da velocidade de alongamento da raiz" significam aumento ou atrasado em comparação tanto com plantas do tipo selvagem (por exemplo, plantas compreendendo um GRF3 não modificado ou GRF3-ortólogo) ou plantas compreendendo um GRF2 modificado (rGRF2).

[00177] Os termos "biomassa total da planta aumentada", "aumento de peso fresco", "aumento da área foliar ou tamanho", "aumento do peso seco", "aumento do crescimento da haste", "aumento da biomassa da haste", "aumento do diâmetro da haste" e "aumento da largura do tronco na florescimento" significam aumento ou atrasado em comparação tanto com plantas do tipo selvagem (por exemplo, plantas que compreendem uma GRF3 não modificado ou GRF3- ortólogo) ou plantas compreendendo um GRF2 modificado {rGRF2).

[00178] O termo "modificado", tal como aqui utilizado pode significar mutado. O termo "modificado", tal como aqui utilizado significa que é diferente do tipo selvagem.

[00179] O termo "tipo selvagem", como aqui utilizado, significa um ácido nucleico de ocorrência natural. Isto quer dizer um ácido nucleico encontrado em um código genético endógeno e isolado a partir do seu organismo hospedeiro endógeno que não foi mutado (isto é, não contem deleções, adições ou substituições) em comparação com o código genético do organismo hospedeiro.

[00180] O vetor, de acordo com a presente invenção, pode ser um vetor de expressão. O termo "vetor de expressão" significa um constructo capaz de expressão in vivo ou in vitro.

[00181] De preferência, o vetor de expressão é incorporado no genoma de um organismo hospedeiro adequado, por exemplo, planta. O termo "incorporado", de preferência, cobre incorporação estável no genoma.

[00182] A sequência de nucleotídeos da presente invenção pode estar presente em um vetor em que a sequência de nucleotídeos está operacionalmente ligada a sequências de regulação capazes de proporcionar a expressão da sequência de nucleotídeos de um organismo hospedeiro adequado, por exemplo, planta.

[00183] Os vetores para serem usados na presente invenção podem ser transformados em uma célula hospedeira adequada, por exemplo, célula vegetal, como descrito abaixo.

[00184] Os vetores para serem usados na presente invenção podem conter um ou mais genes marcadores selecionáveis, tais como um gene que confere resistência a antibióticos, por exemplo, resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou a tetraciclina.

[00185] Os vetores podem ser utilizados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA ou utilizados para transfectar, transformar, transduzir ou infectar uma célula hospedeira.

[00186] Assim, em uma outra concretização, a invenção proporciona um método de fabricação de sequências de nucleotídeos da presente invenção, através da introdução de uma sequência de nucleotídeos da presente invenção em um vetor replicável, introdução do vetor em uma célula hospedeiro compatível (por exemplo, planta), e o crescimento do hospedeiro (por exemplo, planta) em condições que conduzem sobre a replicação do vetor.

[00187] O termo "ligado operacionalmente" como aqui utilizado se refere a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar no seu modo pretendido. Uma sequência reguladora "operacionalmente ligada" a uma sequência de codificação está ligada, de tal modo que a expressão da sequência de codificação é alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[00188] O termo "sequências reguladoras" inclui promotores e intensificadores e outros sinais de regulação da expressão.

[00189] O termo "promotor" é utilizado no sentido normal do estado da técnica, por exemplo, um local de ligação da RNA polimerase.

[00190] O termo "constructo" - que é sinônimo de termos tais como "conjugado", "cassete" e "híbrido" - inclui uma sequência de nucleotídeos para o uso, de acordo com a presente invenção diretamente ou indiretamente ligada a um promotor.

[00191] Um exemplo de uma fixação indireta é a provisão de um grupo separador adequado, tal como uma sequência de íntron, tal como o Sh1-íntron ou o íntron ADH, o promotor intermediário e a sequência de nucleotídeos da presente invenção. O mesmo é verdade para o termo "fusão" em relação a presente invenção, que inclui ligação direta ou indireta. Em alguns casos, os termos não cobre a combinação natural da sequência de nucleotídeos que codifica para a proteína normalmente associada com o promotor de gene de tipo selvagem e quando ambos estão no seu ambiente natural.

[00192] O constructo pode ainda conter ou expressar um marcador, o qual permite a seleção do constructo genético.

[00193] Para algumas aplicações, preferencialmente, o constructo da presente invenção compreende, pelo menos, a sequência de nucleotídeos da presente invenção operacionalmente ligada a um promotor.

[00194] Um organismo hospedeiro adequado para a transformação com o ácido nucleico do presente invenção pode ser uma planta. A este respeito, o princípio básico no constructo de plantas geneticamente modificadas é inserir informação genética no genoma da planta, de modo a obter uma manutenção estável do material genético inserido. Uma revisão das técnicas gerais podem ser encontrados em artigos por Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) and Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)).

[00195] Infecção direta dos tecidos vegetais por Agrobacterium é uma técnica simples que tem sido amplamente utilizada e que é descrito em in Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208.

[00196] Outras técnicas para transformar plantas incluem transformação balística, técnica de carboneto de silício whisker (ver Frame BR, Drayton PR, Bagnaall SV, Lewnau CJ, Bullock WP, Wilson HM, Dunwell JM, Thompson JA & Wang K (1994) Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker-mediated transformation, The Plant Journal 6: 941-948) e técnicas de transformação virais (por exemplo, ver Meyer P, Heidmann I & Niedenhof I (1992) The use of cassava mosaic virus as a vector system for plants, Gene 110: 213-217).

[00197] Outros ensinamentos sobre a transformação de plantas podem ser encontrados no documento EP-A-0449375.

[00198] As células vegetais podem ser cultivadas e mantidas de acordo com os métodos de cultura de tecidos bem conhecidos, tais como por cultura das células em um meio de cultura adequado, fornecido com os fatores de crescimento necessários, tais como aminoácidos, hormônios vegetais, vitaminas, etc.

[00199] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um sistema de vetor que transporta uma sequência de nucleotídeos ou de constructo de acordo com a presente invenção e que é capaz de introduzir a sequência de nucleotídeos ou constructo no genoma de um organismo, tal como uma planta. O sistema vetor pode compreender um vetor, mas o mesmo pode compreender dois vetores. No caso de dois vetores, o sistema vetor é normalmente referido como um sistema vetor binário. Os sistemas binários do vetor estão descritos em maiores detalhes em Gynheung An et al., (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1 - 19.

[00200] Um sistema largamente utilizado para a transformação de células vegetais utiliza o plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou um plasmídeo Ri de Agrobacterium rhizogenes An et al., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 and Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208. Após cada método de introdução do promotor, ou constructo desejado ou a sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção, em plantas, a presença e / ou inserção de outras sequências de DNA pode ser necessária. Se, por exemplo, para a transformação de Ti-ou Ri-plasmídeo das células vegetais é utilizada, pelo menos o limite da direita e muitas vezes, no entanto, o direito e o limite esquerdo do ADN-T-Ti e Ri-plasmídeo, que flanqueia áreas de genes introduzidos, podem ser ligados. A utilização de T-ADN para a transformação de células de plantas tem sido intensivamente estudado e está descrito no documento EP-A-120516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1 - 46; and An et al., EMBO J. (1985) 4:277 - 284.

[00201] O termo GIF, tal como aqui utilizado, significa- fatores de intereção GRF (GIFs), uma família de genes que codificam proteínas com pequena homologia com o SYT co-activador transcricional humano (Horiguchi et al, 2005;. Kim e Kende, 2004).

[00202] GIF1 (Kim e Kende, 2004) também é conhecido como ANGUSTIFOLIA 3 (AN3).

[00203] Em uma concretização, de preferência, o GIF utilizado de acordo com a presente invenção é GIF1. GIF1 pode também ser referido aqui como AtGIF1

[00204] Em uma concretização, o GIF utilizado de acordo com a presente invenção pode ser GIF1, em que GIF1 i) compreende o aminoácido mostrado aqui como MQQHLQMQPMMAGYYPSNVTSDHIQQYLDENKSLILKIVESQNSGKLSECAENQARLQR NLMYLAAIADSQPQPPSVHSQYGSAGGGMIQGEGGSHYLQQQQATQQQQTQQSLMAARS SMLYAQQQQQQQPYATLQHQQLHHSQLGMSSSSGGGGSSGLHILQGEAGGFHDFGRGKP EMGSGGGGEGRGGSSGDGGETLYLKSSDDGN (SEQ ID No. 95) ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com esse; ou ii) é codificado pela sequência de nucleotídeos: ATGCAACAGCACCTGATGCAGATGCAGCCCATGATGGCTGGTTACTACCCCAGCAATGT TACCTCTGATCATATCCAACAGTACTTGGACGAAAACAAATCGTTGATTCTGAAGATTG TTGAGTCTCAAAACTCTGGAAAGCTTAGCGAATGCGCCGAGAATCAAGCAAGGCTTCAA CGCAACCTAATGTACCTAGCTGCAATAGCAGATTCTCAGCCTCAGCCACCAAGTGTGCA TAGCCAGTATGGATCTGCTGGTGGTGGGATGATTCAGGGAGAAGGAGGGTCACACTATT TGCAGCAGCAACAAGCGACTCAACAGCAACAGATGACTCAGCAGTCTCTAATGGCGGCT CGATCTTCAATGTTGTATGCTCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCCTTACGCGACGCTTCA GCATCAGCAATTGCACCATAGCCAGCTTGGAATGAGCTCGAGCAGCGGAGGAGGAGGAA GCAGTGGTCTCCATATCCTTCAGGGAGAGGCTGGTGGGTTTCATGATTTTGGCCGTGGG AAGCCGGAAATGGGAAGTGGTGGTGGCGGTGAAGGCAGAGGAGGAAGTTCAGGGGATGG TGGAGAAACCCTTTACTTGAAATCATCAGATGATGGGAATTGA (SEQ ID No. 39);; ou iii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70%, preferencialmente, 80%, mais preferencialmente, 90%, ainda mais preferencialmente, 95% idêntica com SEQ ID No. 39; ou iv) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com a SEQ ID No. 39.

[00205] Como pode ser visto a partir da Figura 9, um número de sequências de GIF de Arabidopsis thaliana e Oryza sativa agrupam em conjunto. Prevê-se que qualquer uma destas GIFs podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. Por conseguinte, o GIF para o uso de acordo com a presente invenção pode ser um ou mais dos GIFs designados OS11g40100, Os12g31350, Os03g52320 obtidos (preferencialmente obtidos) de Oryza sativa, ou podem ser uma ou mais das GIFs designados AXGIF1, AtGIF2 ou AtGIF3 obtido (preferencialmente obtidos) de Arabidopsis thaliana. Em uma concretização, o GIF utilizado de acordo com a presente invenção pode ser AtGIF2, em que AtGIF2 i) compreende o aminoácido é aqui mostrada como MQQQQSPQMFPMVPSIPPANNITTEQIQKYLDENKKLIMAIMENQNLGKLAECAQYQAL LQKNLMYLAAIADAQPPPPTPGPSPSTAVAAQMATPHSGMQPPSYFMQHPQASPAGIFA PRGPLQFGSPLQFQDPQQQQQIHQQAMQGHMGIRPMGMTNNGMQHAMQQPETGLGGNVG LRGGKQDGADGQGKDDGK (SEQ ID No. 96) ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade com esta; ou ii) é codificado pela sequência de nucleotídeos: ATGCAGCAGCAGCAGTCTCCGCAAATGTTTCCGATGGTTCCGTCGATTCCCCCTGCTAA CAACATCACTACCGAACAGATCCAAAAGTACCTTGATGAGAACAAGAAGCTGATTATGG CCATCATGGAAAACCAGAATCTCGGTAAACTTGCTGAGTGCGCCCAGTACCAAGCTCTT CTCCAGAAGAACTTGATGTATCTTGCTGCAATTGCTGATGCTCAACCCCCACCACCTAC GCCAGGACCTTCACCATCTACAGCTGTCGCTGCCCAGATGGCAACACCGCATTCTGGGA TGCAACCACCTAGCTACTTCATGCAACACCCACAAGCATCCCCTGCAGGGATTTTCGCT CCAAGGGGTCCTTTACAGTTTGGTAGCCCACTCCAGTTTCAGGATCCGCAACAGCAGCA GCAGATACATCAGCAAGCTATGCAAGGACACATGGGGATTAGACCAATGGGTATGACCA ACAACGGGATGCAGCATGCGATGCAACAACCAGAAACCGGTCTTGGAGGAAACGTGGGG CTTAGAGGAGGAAAGCAAGATGGAGCAGATGGACAAGGAAAAGATGATGGCAAGTGA (SEQ ID No. 90), ou iii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95% idêntica com SEQ ID No. 90; ou iv) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com SEQ ID No. 90.

[00206] Em uma concretizaçãodo GIF utilizado de acordo com a presente invenção pode ser caracterizado por AtGIF3 em que AtGIF3 i) compreende o aminoácido que é aqui mostrada como MQQSPQMIPMVLPSFPPTNNITTEQIQKYLDENKKLIMAILENQNLGKLAECAQYQALL QKNLMYLAAIADAQPQPPAATLTSGAMTPQAMAPNPSSMQPPPSYFMQQHQAVGMAQQI PPGIFPPRGPLQFGSPHQFLDPQQQLHQQAMQGHMGIRPMGLNNNNGLQHQMHHHETAL AANNAGPNDASGGGKPDGTNMSQSGADGQGGSAARHGGGDAKTEGK (SEQ ID No. 97) ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80 % de identidade com este; ou ii) é codificado pela sequência de nucleotídeos: ATGCAGCAATCTCCACAGATGATTCCGATGGTTCTTCCTTCATTTCCGCCCACCAATAA TATCACCACCGAACAGATCCAAAAGTATCTTGATGAGAACAAGAAGCTGATAATGGCGA TCTTGGAAAATCAGAACCTCGGTAAACTTGCAGAATGTGCTCAGTATCAAGCTCTTCTC CAGAAGAATTTGATGTATCTCGCTGCAATTGCGGATGCTCAACCTCAGCCACCAGCAGC TACACTAACATCAGGAGCCATGACTCCCCAAGCAATGGCTCCTAATCCGTCATCAATGC AGCCACCACCAAGCTACTTCATGCAGCAACATCAAGCTGTGGGAATGGCTCAACAAATA CCTCCTGGGATTTTCCCTCCTAGAGGTCCATTGCAATTTGGTAGCCCGCATCAGTTTCT GGATCCGCAGCAACAGTTACATCAACAAGCTATGCAAGGGCACATGGGGATTAGACCAA TGGGTTTGAATAATAACAACGGACTGCAACATCAAATGCACCACCATGAAACTGCTCTT GCCGCAAACAATGCGGGTCCTAACGATGCTAGTGGAGGAGGTAAACCGGATGGGACCAA TATGAGCCAGAGTGGAGCTGATGGGCAAGGTGGCTCAGCCGCTAGACATGGCGGTGGTG ATGCAAAAACTGAAGGAAAATGA (SEQ ID No. 91), ou iii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70%, preferencialmente, 80%, mais preferencialmente, 90%, ainda mais preferencialmente, 95% idêntica com a SEQ ID No. 91; ou iv) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com SEQ ID No. 91.

[00207] Em uma concretização, o GIF utilizado de acordo com a presente invenção pode ser o GIF Os11g40100 designado em que OS11g40100 i) compreende o aminoácido como aqui mostrado: MQQQMAMPAGAAAAAVPPAAGITTEQIQKYLDENKQLILAILENQNLGKLAECAQYQAQ LQKNLLYLAAIADAQPPQNPGSRPQMMQPGATPGAGHYMSQVPMFPPRTPLTPQQMQEQ QQQQLQQQQAQALAFPGQMLMRPGTVNGMQSIPVADPARAADLQTAAPGSVDGRGNKQD ATSEPSGTESHKSAGADNDAGGDIAEKS (SEQ ID No. 98) ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade com este; ou ii) é codificado pela sequência de nucleotídeos: ATGCAGCAGCAGATGGCCATGCCGGCGGGGGCCGCCGCCGCCGCGGTGCCGCCGGCGGC CGGCATCACCACCGAGCAGATCCAAAAGTATTTGGATGAAAATAAACAGCTAATTTTGG CCATCCTGGAAAATCAAAACCTAGGGAAGTTGGCTGAATGTGCTCAGTACCAAGCTCAG CTTCAAAAGAATCTCTTGTATCTGGCTGCCATTGCAGATGCCCAACCACCTCAGAATCC AGGAAGTCGCCCTCAGATGATGCAGCCTGGTGCTACCCCAGGTGCTGGGCATTACATGT CCCAAGTACCGATGTTCCCTCCAAGAACTCCCTTAACCCCACAACAGATGCAAGAGCAG CAGCAGCAGCAACTCCAGCAACAGCAAGCTCAGGCTCTAGCCTTCCCCGGCCAGATGCT AATGAGACCAGGTACTGTCAATGGCATGCAATCTATCCCAGTTGCTGACCCTGCTCGCG CAGCCGATCTTCAGACGGCAGCACCGGGCTCGGTAGATGGCCGAGGAAACAAGCAGGAT GCAACCTCGGAGCCTTCCGGGACCGAGAGCCACAAGAGTGCGGGAGCAGATAACGACGC AGGCGGTGACATAGCGGAGAAGTCCTGA (SEQ ID No. 92), ou iii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que é apenas pelo menos 70%, preferivelmente 80%, mais preferencialmente, 90%, ainda mais preferencialmente, 95% idêntica com a SEQ ID No. 92; ou iv) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com SEQ ID No. 92.

[00208] Em uma concretização, o GIF utilizado de acordo com a presente invenção pode ser o GIF Os12g31350 designado, em que Os12g31350 i) compreende o aminoácido como mostrado aqui: MQQQPMPMPAQAPPTAGITTEQIQKYLDENKQLILAILENQNLGKLAECAQYQAQLQKN LLYLAAIADTQPQTTISRPQMVPHGASPGLGGQYMSQVPMFPPRTPLTPQQMQEQQLQQ QQAQLLSFGGQMVMRPGVVNGIPQLLQGEMHRGADHQNAGGATSEPSESHRSTGTENDG GSDFGDQS (SEQ ID No. 99); ou ii) é codificado pela sequência de nucleotídeos: ATGCAGCAGCAGCCGATGCCGATGCCCGCGCAGGCGCCGCCGACGGCCGGAATCACCAC CGAGCAGATCCAAAAGTATCTGGATGAAAACAAGCAGCTTATTTTGGCTATTTTGGAAA ATCAGAATCTGGGAAAGTTGGCAGAATGTGCTCAGTATCAAGCGCAGCTTCAGAAGAAT CTCTTGTACTTGGCTGCAATTGCTGATACTCAACCGCAGACCACTATAAGCCGTCCCCA GATGGTGCCGCATGGTGCATCGCCGGGGTTAGGGGGGCAATACATGTCGCAGGTGCCAA TGTTCCCCCCCAGGACCCCTCTAACGCCCCAGCAGATGCAGGAGCAGCAGCTGCAGCAA CAGCAAGCCCAGCTGCTCTCGTTCGGCGGTCAGATGGTTATGAGGCCTGGCGTTGTGAA TGGCATTCCTCAGCTTCTGCAAGGCGAAATGCACCGCGGAGCAGATCACCAGAACGCTG GCGGGGCCACCTCGGAGCCTTCCGAGAGCCACAGGAGCACCGGCACCGAAAATGACGGT GGAAGCGACTTCGGCGATCAATCCTAA (SEQ ID No. 93), ou iii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70%, preferencialmente, 80%, mais preferencialmente, 90%, ainda mais preferencialmente, 95% idêntica com SEQ ID No. 93; ou iv) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com a SEQ ID No. 93.

[00209] Em uma concretizaçãod, o GIF utilizado de acordo com a presente invenção pode ser o GIF Os03g52320 designado em que Os03g52320 i) compreende o aminoácido como mostrada aqui: MQQQHLMQMNQGMMGGYASPTTVTTDLIQQYLDENKQLILAILDNQNNGKVEECARNQA KLQHNLMYLAAIADSQPPQTAAMSQYPSNLMMQSGARYMPQQSAQMMAPQSLMAARSSM MYAQPALSPLQQQQQQQAAAAHGQLGMGSGGTTSGFSILHGEASMGGGGGGGGAGNSMM NAGVFSDFGRGGGGGGKEGSTSLSVDVRGANSGAQSGDGEYLKGTEEEGS (SEQ ID No. 100) ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com esta; ou ii) é codificados pela sequência de nucleotídeos ATGCAGCAGCAACACCTGATGCAGATGAACCAGGGCATGATGGGGGGATATGCTTCCCC TACCACCGTCACCACTGATCTCATTCAGCAGTATCTGGATGAGAACAAGCAGCTGATCC TGGCCATCCTTGACAACCAGAACAATGGGAAGGTGGAAGAGTGCGCTCGGAACCAAGCT AAGCTCCAGCACAATCTCATGTACCTCGCCGCCATCGCCGACAGCCAGCCGCCGCAGAC GGCCGCCATGTCCCAGTATCCGTCGAACCTGATGATGCAGTCCGGGGCGAGGTACATGC CGCAGCAGTCGGCGCAGATGATGGCGCCGCAGTCGCTGATGGCGGCGAGGTCTTCGATG ATGTACGCGCAGCCGGCGCTGTCGCCGCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGCGGCGGC GGCGCACGGGCAGCTGGGCATGGGCTCGGGGGGCACCACCAGCGGGTTCAGCATCCTCC ACGGCGAGGCCAGCATGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGCCGGTAACAGCATGATG AACGCCGGCGTGTTCTCCGACTTCGGACGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAAGGAGGGGTC CACCTCGCTGTCCGTCGACGTCCGGGGCGCCAACTCCGGCGCCCAGAGCGGCGACGGGG AGTACCTCAAGGGCACCGAGGAGGAAGGCAGCTAG (SEQ ID No. 94),, ou iii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70%, preferencialmente, 80%, mais preferencialmente, 90%, ainda mais preferencialmente, 95% idêntica com a SEQ ID No. 94; ou iv) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com a SEQ ID No. 94.

[00210] Além disso, os invençãores demonstraram que a superexpressão de GIF1, GIF2, e GIF3 promove a proliferação celular e o tamanho da folha e que as proteínas GIF2 e GIF3 são equivalentes funcionais de GIF1 (ver, Figura 43 em combinação com a Figura 9).

[00211] Anteriormente, Horiguchi et al. (2005) têm mostrado que a superexpressão do gene GIF/AN3 estimula a proliferação celular, bem como, levando a aumento de folhas de cerca de 20%.

[00212] Estes resultados sugerem que todos os genes GIF funcionam de forma redundante como reguladores positivos da proliferação de células, determinando, assim, o tamanho de órgãos de plantas.

[00213] Portanto, o uso de qualquer gene GIF de acordo com a presente invenção, é aqui contemplado.

[00214] Além disso, combinações de genes GIF são também aqui contempladas.

[00215] Em um aspecto, de preferência, a sequência é de uma forma isolada. O termo "isolado" significa que a sequência de, pelo menos, substancialmente livre de, pelo menos, um outro componente com o qual a sequência está naturalmente associada na natureza e como encontrada na natureza.

[00216] Em um aspecto, de preferência, a sequência é de uma forma purificada. O termo "purificado" significa que a sequência está em um estado relativamente puro - por exemplo, pelo menos cerca de 90% pura, ou, pelo menos, cerca de 95% puro ou, pelo menos, cerca de 98% puro.

[00217] Os termos "sequência de nucleotídeos", ou "ácido nucleico", tal como aqui utilizado se refere a uma sequência oligonucleotídica ou sequência polinucleotídica, e seus homólogos, variantes, fragmentos e seus derivados (tais como, as porções dos mesmos). A sequência de nucleotídeos pode ser de origem genômica ou sintética ou recombinante, que pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples, quer representando a cadeia senso ou anti-senso.

[00218] Os termos "sequência de nucleotídeos", ou "ácido nucleico" em relação a presente invenção inclui DNA genômico, cDNA, DNA sintético e RNA. De preferência, isso significa que o DNA, mais preferencialmente, codifica para a sequência de cDNA da presente invenção.

[00219] Em uma concretização preferida, a sequência de nucleotídeos quando se relaciona com e quando englobadas pelo escopo per si da presente invenção não inclui a sequência de nucleotídeos nativa, de acordo com a presente invenção, quando no seu ambiente natural e quando é ligada à sua sequência naturalmente associada (s) que está / estão também no seu / seus ambientes naturais. Para facilitar a consulta, esta concretização preferencial será chamada de "sequência de nucleotídeos não-nativa" ou "ácido nucleico não-nativo"

[00220] Tipicamente, a sequência de nucleotídeos ou de ácido nucleico abrangidas pela escopo da presente invenção é preparada usando técnicas de DNA recombinante (por exemplo, DNA recombinante). No entanto, em uma concretização alternativa da invenção, a sequência de nucleotídeos ou de ácido nucleico pode ser sintetizada, no todo ou em parte, usando métodos químicos bem conhecidos na técnica (ver Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).

[00221] Devido à degenerescência do código genético, as sequências de nucleotídeos podem ser facilmente produzidas, em que o uso de códons triplos, para alguns ou todos os aminoácidos codificados pela sequência de nucleotídeos original tenha sido alterada, produzindo, assim, uma sequência de nucleotídeos com baixa homologia com a sequência de nucleotídeos original, mas que codifica para a mesma, ou uma variante, sequência de aminoácidos como codificada pela sequência de nucleotídeos originais. Por exemplo, para a maioria dos aminoácidos da degenerescência do código genético é a terceira posição do códon triplo (posição oscilante) (para referência ver Stryer, Lubert, Biochemistry, Terceira Edição, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7), por conseguinte, uma sequência de nucleotídeos, em que todos os códons tripletos foram "balanceados" na terceira posição seria de cerca de 66% idêntica à sequência de nucleotídeos originais. No entanto, a sequência de nucleotídeos alterados que codificam para a mesma, ou uma variante, a sequência primária de aminoácidos que a sequência de nucleotídeos originais.

[00222] Portanto, a presente invenção, em algumas concretizações se refere ainda a qualquer sequência de nucleotídeos que tem utilização alternativa de códons tripleto para, pelo menos, uma codificação de aminoácidos de códons tripletos, mas que codifica para a mesma, ou uma variante, a sequência de polipeptídeo como a sequência do polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos original.

[00223] Além disso, os organismos específicos têm tipicamente um viés de codons tripleto para o qual são usados para codificar os aminoácidos. Tabelas de utilização de codons preferidos são amplamente disponíveis, e podem ser usadas para preparar os genes de códons otimizados. Tais técnicas de optimização de códons são rotineiramente utilizadas para otimizar a expressão de transgenes em um hospedeiro heterólogo.

[00224] A presente invenção também engloba a utilização de sequências que possuem a identidade ou semelhança com as sequências de acordo com a presente invenção.

[00225] Aqui, o termo "identidade", uma entidade com uma certa identidade com as seqüências de aminoácidos e as sequências de nucleotídeos. Significa a percentagem de identidade de aminoácidos ou das bases que são as mesmas em uma sequência quando comparada com uma outra sequência.

[00226] Aqui, o termo "semelhança" significa uma entidade com propriedades químicas / funções semelhantes. Daí o termo semelhança leva em conta as mudanças conservadoras.

[00227] No presente contexto, uma sequência que tem uma certa percentagem de identidade ou de similaridade é feita para incluir uma sequência que pode ser pelo menos 90% idêntica, de preferência, pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a uma sequência da presente invenção (a seqüência do indivpiduo). Normalmente, as seqüências irão compreender as mesmas sequências que codificam para os sítios ativos etc. como a seqüência do indivíduo.

[00228] Comparações de identidade ou de similaridade podem ser realizadas a olho, ou mais geralmente, com a ajuda de programas de comparação de sequências facilmente disponível. Os programas de computador disponíveis podem calcular a % de identidade e % de semelhança entre duas ou mais sequências.

[00229] % de identidade pode ser calculada ao longo de sequências contíguas, isto é, uma sequência que é alinhada com a outra sequência e cada um dos aminoácidos em uma sequência é comparado diretamente com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isso é chamado de um alinhamento "sem folga". Normalmente, esses alinhamentos sem folga somente são realizados ao longo de um período relativamente curto de número de resíduos.

[00230] Embora este seja um método muito simples e consistente, que não leva em consideração de que, por exemplo, em um par de sequências de outro modo idênticas, uma inserção ou deleção fará com que os seguintes resíduos de aminoácidos serem colocados fora do alinhamento, assim, resultando potencialmente em uma grande redução da % de homologia quando um alinhamento global é executado. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de seqüência são projetados para produzir alinhamentos ideais que levam em consideração possíveis inserções e deleções, sem penalizar indevidamente a pontuação geral de homologia. Isto é conseguido através da inserção de "hiatos" no alinhamento de sequências para tentar maximizar a homologia local.

[00231] No entanto, estes métodos mais complexos atribuiem "penalidades de hiato" a cada lacuna que ocorre no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequências com poucas lacunas quanto possível - refletindo parentesco superior entre as duas sequências comparadas - irá conseguir uma pontuação maior do que um com muitas lacunas. "Os custos de gap afim" são normalmente usados que cobram um custo relativamente alto para a existência de uma lacuna e uma penalidade menor para cada resíduo subseqüente a lacuna.

[00232] Este é o sistema de pontuação lacuna mais comumente usado. Penalidades de lacunas alta vai, naturalmente, produzir alinhamentos otimizados com menos lacunas. A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalidades de hiato sejam modificadas. No entanto, prefere-se utilizar os valores predefinidos quando se utiliza esse software para comparaes de sequências. Por exemplo, quando usando o pacote GCG Wisconsin Bestfit a pena de abertura padrão para sequências de aminoácidos é de -12 para uma lacuna e -4 para cada ramal.

[00233] Cálculo da % de identidade máxima, portanto, em primeiro lugar, exige a produção de um alinhamento ideal, levando-se em consideração penalidades gap. Um programa de computador adequado para a realização de tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Devereux ef a / 1984 Nuc. Pesquisa dos ácidos 12 P387). Os exemplos de outros softwares que podem realizar comparações de sequências incluem, mas não estão limitados a, o pacote BLAST (see Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) and the GENEWORKS e o conjunto de ferramentas de comparação. Ambos BLAST e FASTA estão disponíveis para pesquisa off-line e on-line (ver Ausubel et ai, 1999, Protocolos curtos em Biologia Molecular, páginas 7 - 58 a 7 - 60).

[00234] No entanto, para algumas aplicações, é preferido utilizar o programa GCG Bestfit. Uma nova ferramenta, chamada Blast 2 Sequences também está disponível para a comparação de proteínas e sequência de nucleotídeos (ver FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 87-8 e tatiana@ncbi.nlm . nih.gov).

[00235] Embora a % de identidade final possa ser medida em termos de identidade, o processo de alinhamento, tipicamente em si não é baseado em uma comparação de pares de tudo-ou-nada. Em vez disso, uma matriz de pontuação de similaridade em escala é geralmente usada que atribui pontuação para cada comparação par a par com base na similaridade química ou a distância evolutiva. Um exemplo de uma tal matriz geralmente utilizada é a matriz BLOSUM62 - a matriz por defeito para a suite de programas BLAST. Programas GCG Wisconsin geralmente usar os valores públicos padrão ou uma tabela de comparação símbolo personalizado se detalhes). Para algumas aplicações, prefere-se usar os valores públicos por defeito para o pacote GCG, ou no caso de outro software, a matriz por defeito, tal como BLOSUM62.

[00236] Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser calculada usando o recurso de alinhamento múltiplo em DNASIS ™ (Hitachi Software), com base em um algoritmo, análogo ao CLUSTAL (Higgins DG & afiada PM (1988), Gene 73 (1), 237-244).

[00237] Geralmente percentagem de identidade é calculada sobre, pelo menos, 50, de preferência, pelo menos 100, de preferência, pelo menos 200 bases contíguas ou resíduos. De preferência, a percentagem de identidade é calculada utilizando a sequência de comprimento total.

[00238] Uma vez que o software tenha produzido um alinhamento ideal, é possível calcular a % de identidade de sequência. O software faz tipicamente isto como parte da comparação de sequências e geram um resultado numérico.

[00239] As sequências podem também ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. substituições deliberadas de aminoácidos podem ser feitas com base na semelhança das propriedades de aminoácidos (tais como, hidrofilicidade, e / ou a natureza anfipática dos resíduos) e, é, portanto, útil para aminoácidos agrupar-se em grupos funcionais. Os aminoácidos podem ser agrupados em conjunto com base nas propriedades da cadeia lateral por si só a sua. No entanto, é mais útil para incluir dados de mutação também. Os conjuntos de aminoácidos, assim, derivados são susceptíveis de ser conservada por razões estruturais. Estes conjuntos podem ser descritos na forma de um diagrama de Venn (Livingstone C.D. and Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput.Appl Biosci. 9: 745-756)(Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205 - 218). As substituições conservadoras podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a tabela seguinte, a qual descreve um diagrama de Venn de agrupamento de aminoácidos geralmente aceito.

[00240] As sequências de nucleotídeos para a utilização na presente invenção podem incluir dentro delas nucleotídeos sintéticos ou modificados. Um número de diferentes tipos de modificações aos oligonucleotídeos são conhecidos no estado da técnica. Estes incluem cadeia principal metilfosfonato e fosforotioato e / ou a adição de cadeias de acridina ou polilisina nas posições 3' e / ou 5' da molécula. Para os fins da presente invenção, é para ser entendido que as sequências nucleotídicas aqui descritas podem ser modificadas por qualquer método disponível no estado da técnica. Tais modificações podem ser realizadas de modo a aumentar a atividade in vivo ou tempo de vida de sequências de nucleotídeos da presente invenção.

[00241] A presente invenção também engloba a utilização de sequências de nucleotídeos que são complementares às sequências aqui apresentadas, ou qualquer seu derivado, fragmento ou derivado. Se a sequência é complementar de um seu fragmento, em seguida, que a sequência pode ser utilizada como uma sonda para identificar as sequências codificantes semelhantes em outros organismos, etc.

[00242] Os polinucleotídeos que não são 100 % idênticos às sequências da presente invenção, mas caem dentro do escopo da invenção podem ser obtidas em um número de maneiras. Outras variantes das sequências aqui descritas podem ser obtidas, por exemplo, por sondagem de bibliotecas de DNA feitas a partir de uma variedade de indivíduos, por exemplo, indivíduos de diferentes populações. Além disso, outros homólogos podem ser obtidos e tais homólogos e seus fragmentos em geral serão capazes de hibridizar seletivamente com as sequências apresentadas na listagem de sequências aqui. Tais sequências podem ser obtidas por sondagem de bibliotecas de DNAc feitas a partir de bibliotecas de DNA genômico ou a partir de outras espécies, e sondagem de tais bibliotecas com sondas compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das sequências na Listagem de Sequências em anexo, em condições de meio de elevado rigor. Considerações semelhantes aplicam-se à obtenção de espécies homólogas e variantes alélicas das sequências de polipeptídeos ou de nucleotídeos da invenção.

[00243] As variantes e cepas / ortólogos de espécies podem também ser obtidos usando PCR degenerado que utiliza iniciadores concebidos para atingir sequências dentro das variantes e homólogos que codificam sequências de aminoácidos conservadas dentro das sequências do presente invenção. Sequências conservadas podem ser previstas, por exemplo, através do alinhamento das sequências de aminoácidos de várias variantes / homólogos. Alinhamentos de seqüência podem ser realizados utilizando programas de computador conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, o programa GCG Wisconsin PileUp é amplamente usado.

[00244] Os primers utilizados no PCR degenerado irá conter uma ou mais posições degeneradas e serão usados em condições de restringência mais baixas do que os utilizados para a clonagem de sequências com primers de sequência simples contra sequências conhecidas.

[00245] Em alternativa, tais polinucleotídeos podem ser obtidos por mutagênese dirigida de sequências caracterizadas. Isso pode ser útil onde, por exemplo, alterações silenciosas de códons da sequência são necessárias para optimizar às preferências de códons para uma célula hospedeira particular, em que as sequências polinucleotídicas estão a ser expressas. Outras alterações de sequência podem ser desejadas de modo a introduzir locais de reconhecimento de enzimas de restrição, ou para alterar a propriedade ou a função dos polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos.

[00246] Polinucleotídeos (sequências de produzir um iniciador, por exemplo, um iniciador de PCR, um iniciador para uma reação de amplificação alternativa, uma sonda, por exemplo, marcado com um marcador revelador por meios convencionais utilizando marcadores radioativos ou não radioativos, ou os polinucleotídeos podem ser clonados em vetores. Tais iniciadores, sondas e outros fragmentos serão de pelo menos 15, preferencialmente, pelo menos 20, por exemplo, pelo menos, 25, 30 ou 40 nucleotídeos de comprimento, e também são abrangidos pelo termo polinucleotídeos da invenção como aqui utilizado.

[00247] Polinucleotídeos, tais como polinucleotídeos de DNA e sondas, de acordo com a invenção podem ser produzidos de forma recombinante, sinteticamente, ou por quaisquer meios disponíveis pelos técnicos versados no assunto. Eles podem também ser clonados por técnicas convencionais.

[00248] Em geral, os iniciadores serão produzidos por meios sintéticos, envolvendo uma fabricação por etapas da sequência de ácido nucleico de um nucleotídeo desejado de cada vez. Técnicas para conseguir isto utilizando procedimentos automatizados estão prontamente disponíveis no estado da técnica.

[00249] Polinucleotídeos mais longos geralmente serão produzidos usando meios recombinantes, por exemplo, utilizando a técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase), técnicas de clonagem. Os iniciadores podem ser concebidos para conter locais de reconhecimento de enzimas de restrição adequadas de modo a que o DNA amplificado possa ser clonado em um vetor de clonagem adequado.

[00250] A presente invenção também engloba as sequências que são complementares às sequências de ácido nucleico da presente invenção ou as sequências que são capazes de se hibridizar, quer para as sequências da presente invenção ou sequências que são complementares a estas.

[00251] O termo "hibridização", tal como aqui utilizado deve incluir "o processo pelo qual uma cadeia de ácido nucleico se junta com uma cadeia complementar através do emparelhamento de bases", bem como o processo de amplificação como realizado em tecnologias de reação em cadeia da polimerase (PCR).

[00252] De preferência, a hibridização é determinada sob condições rigorosas (por exemplo, 50° C e 0,2 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M de Na3citrato de pH 7,0}).

[00253] Adequadamente, a hibridização pode ser determinada sob condições rigorosas elevadas (por exemplo, 65° C e 0,1 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M de Na3citrato de pH 7,0)).

[00254] A presente invenção se refere também a sequências de nucleotídeos que podem hibridizar com as sequências de nucleotídeos da presente invenção (incluindo sequências complementares daquelas aqui apresentadas).

[00255] Um técnico versado no assunto irá compreender que a GRF3-ortólogo modificado pode ser obtido a partir de qualquer planta. Em uma concretização preferida, o GRF3-ortólogo é obtido, de preferência, obtida, a partir de uma ou mais das plantas selecionadas a partir do grupo que consiste em: Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Zea mays, Glycine max, Medicago truncatula, Populus trichocarpa, Prunus persica, Carica mamão, Triticum aestivum, Sorghum bicolor, Gossypium hirstutum, cana-de- açúcar (Saccharum spp.), Panicum virgatum, Helianthis annus, Beta vulgaris, e as espécies de Brassica.

[00256] Em uma concretização ainda mais preferida, o GRF3-ortólogo é obtida, de preferência, obtida, a partir de uma ou mais das plantas selecionadas a partir do grupo que consiste em: Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Zea mays, Glycine max, Medicago truncatula, Populus trichocarpa, Prunus persica, Carica papaya.

[00257] O ácido nucleico, vetor ou constructo, de acordo com a presente invenção pode ser transformado em qualquer planta (hospedeira).

[00258] A planta, célula vegetal ou tecido vegetal de acordo com a presente invenção pode ser uma planta monocotiledônea (monocot) ou uma planta dicotiledônea (dicot).

[00259] Em uma concretização, a planta, célula vegetal ou tecido vegetal de acordo com a presente invenção pode ser uma dicotiledônea.

[00260] Uma planta monocotiledônea pode, por exemplo, ser selecionada de entre as famílias Arecaceae, Amaryllidaceae ou Poaceae. Por exemplo, a planta pode ser uma colheita de cereais, como o trigo, arroz, cevada, milho, aveia, sorgo, centeio, cebola, alho-poró, milho, trigo, grama a grama, azevém, gramíneas, Miscanthus, grama cana, falsa aveia, festuca, grama Bermuda, bromo, grama saúde, prado gramíneas (por exemplo, pastos naturalmente misturados a pastagem, grama de pomar, azevém, grama Timothy) ou espécies de Festuca.

[00261] Uma planta dicotiledônea pode ser selecionada de entre as famílias, incluindo, mas não limitado a Asteraceae, Brassicaceae (por exemplo, Brassica napus), Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Leguminosae (Caesapiniaceae, Aesalpiniaceae Mimosaceae, Papilionaceae ou Fabaceae), Malvaceae, Rosaceae ou Solanaceae. Por exemplo, a planta pode ser selecionada a partir de alface, girassol, Arabidopsis, espinafre, melancia, abóbora, semente de colza oleaginosa (incluindo canola), repolho, brócolis, couve, nabo, couve-nabo (sueco), tomate, batata, pimentão, tabaco, algodão, beterraba legumes, quiabo, maçã, rosa, morango, alfafa (luzerna), cornichão, feijão, soja, campo (fava) de feijão, ervilha, lentilha, amendoim, grão de bico, café, cacau, damascos, maçãs, peras, pêssego, videira ou espécies de citros.

[00262] Também estão incluídos os biocombustíveis e culturas de bioenergia como cana de açúcar, colza / oleaginosas, linhaça, pinhão manso, óleo de palmeiras, copra e salgueiro, eucalipto, álamo, híbridos de álamo. Miscanthus ou gimnospermas, como o pinus. Também estão incluídas as culturas para silagem (por exemplo, espécies forrageiras e milho forrageiro), pastagem ou forrageiras (gramíneas, trevo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco, esparceta, alfafa), fibras (por exemplo, algodão, linho), materiais de constructo (por exemplo, pinheiro, carvalho), polpa (por exemplo, choupo), os estoques de alimentação para a indústria química (por exemplo, semente de óleo ácido, linhaça), plantas de borracha, e as culturas para fins de serviço (por exemplo, gramados para esportes e superfícies comodidade), plantas ornamentais para jardins públicos e privados (por exemplo, espécies de Angelonia, Begônia, Catharanthus, Euphorbia, Gazania, Impatiens, Nicotiana, Pelargonium, Petúnia, Rosa, Verbena e Viola) e flores de todas as plantas para o mercado de flores de corte (como tulipas, rosas, narcisos, lírios, garanhões, gerbera, cravos, crisântemos, lírios, gladíolos, alstromerias, calêndula, ervilha doce, freesia, anêmona papoula).

[00263] De preferência, a planta, célula vegetal ou tecido vegetal ou planta hospedeira é uma planta de colheita. Por planta de colheita entende-se qualquer planta que é cultivada em escala comercial para consumo humano ou animal, ou usar para outro uso não alimentício. Plantas preferidas são o milho (amido), milho-miúdo, trigo, trigo duro, arroz, colza (canola ou), sorgo, cana de açúcar, soja, girassol, batata, tomate, cevada, centeio, aveia, ervilha, feijão, fava, beterraba, óleo de palmeiras, amendoim, amendoim, mandioca, alfafa, trevo, copra, passas, café, algodão, alface, banana, brócolis e outros vegetais de Brassicas.

[00264] Em uma concretização, a planta, célula ou tecido vegetal ou planta hospedeira é Brassica, adequadamente, Brassica oleracea (por exemplo, brócolos ou outro vegetal de Brassica).

[00265] A planta pode ser uma árvore, como o eucalipto, álamo, ou coníferas, como espécie de Picea (por exemplo, abeto) ou espécies de Pinus (pinheiros), uma espécie de madeira de árvores como a teca, uma árvore de plantação, como a borracha (Hevea), palmeira (data ou óleo de palma) ou jatropha ou uma árvore de pomar de frutas (como ameixa, pêssego, maçã e pêra).

EXEMPLOS

[00266] Embora a invenção aqui descrita seja descrita acima em uma forma geral, e os técnicos versados no assunto baseado na descrição poderiam ser permitido a praticar esta invenção, incluindo o seu melhor modo, os exemplos seguintes são fornecidos para apoiar ainda mais esta descrição escrita e possibilidade de divulgação. Os detalhes destes exemplos são, no entanto, não limitativos. Para uma compreensão do escopo da presente invenção, deve ser feita referência às reivindicações anexas e suas equivalentes.

Transgenes

[00267] Ver Tabela 1 para uma lista de plasmídeos binários usados. Tabela 1

a destacado em negrito (amarelo), nucleotídeos de anelamento com miR396. Sublinhado, resíduos mutados. Destaque em itálico (vermelho), códons a montante e a jusante.

Análise da expressão

[00268] Primeiro, 0,5 - 1,0 μg de RNA total, foi tratado com RQ1 RNase livre de DNase (Promega). Em seguida, síntese de cDNA da primeira cadeia foi realizada utilizando Superscript III transcriptase reversa (Invitrogen). As reações de PCR foram realizadas em um termociclador Mastercycler ep realplex (Eppendorf) utilizando SYBR Green I (Roche) para monitorar a cadeia dupla (ds) a síntese de DNA. PCR Quantitativo (q) de cada gene foi realizado por pelo menos três repetições biológicas, com duplicatas técnicas para cada réplica biológica. O nível de transcrição relativa foi determinada para cada amostra, normalizada utilizando PROTEÍNA FOSFATASE nível cDNA 2A (Czechowski et al., 2005). As sequências dos primers são apresentadas na Tabela 2: Tabela 2. Locus Relevantes IDs e primers de oligonucleotídeos utilizados no RT-qPCR.

Análise de pequeno RNA

[00269] O RNA foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen). O RNA total foi colocado em gel de poliacrilamida a 17% sob condições desnaturantes (ureia 7 M). Os blots foram hibridizados utilizando quer sondas de oligonucleotídeos de ácido nucleico de bloqueio marcada na extremidada com digoxigenina ou radiativamente marcadas concebidss contra miR396 (Exiqon, Dinamarca).

[00270] Alternativamente, os níveis de miR396 foram determinados pela RT-qPCR de haste curvada, como anteriormente descrito (Chen et al., 2005). As sequências dos oligonucleotídeos utilizados foram: retrotranscrição oligo haste-curvadao, 5' GTCTCCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGGAGACMAGTTC 3'; Iniciador dianteiro de PCR, 5' GGCGGTTCCACAGCTTTCTT 3'; e iniciador reverso de PCR, 5’ TGGTGCAGGGTCCGAGGTATT 3'.

Análises de Microarranjo

[00271] O RNA total foi extraído da parte aérea de mudas cultivadas em placas durante 10 dias, utilizando o mini kit RNeasy planta (QIAGEN). Análises de Microarranjos usando a plataforma Affymetrix ATH1 foram realizadas em duas repetições biológicas, tal como descrito (Schmid et al., 2005). Genes diferencialmente expressos foram identificados utilizando variação per-gene, calculado usando logit-T (Lemon et al., 2003). A mudança de dobragem correspondente das transcrições foi obtida por estimativas de expressão utilizando gcRMA (www.bioconductor.org), uma modificação da análise robusta de algoritmo multi-matriz (RMA) (Irizarry et al., 2003). A expressão de grupos de genes foi avaliada por análise de conjunto de genes de enriquecimento utilizando AGEE-P 2,0 (Subramanian et al, 2007.;_Subramanian et al., 2005).

Observações microscópicas

[00271] O tecido foi fixado em FAA e embebido em parafina. Seções 10 m de espessura foram corados com Azul de Toluidina.

[00272] Para obter visualizações paradérmicas de células em paliçada, folhas foram fixadas com FAA e limpo com solução de hidrato de cloral como descrito (Horiguchi et al., 2005). Células folha Palisada foram observadas usando microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC).

Hibridização in situ

[00273] Sondas anti-senso e sendo DIG-marcadas foram sintetizadas por transcrição com RNA polimerase SP6 ou T7 utilizando o kit de marcação DIG RNA (SP6/T7) (Roche) utilizando cDNAs clonados de GRF2 e HISTONA H4 como modelos. Para a sonda miR396, oligonucleotídeos LNA (Exiqon) foram marcados na extremidade com o kit de marcação de extremidade 3’ DIG oligonucleotídeo (Roche). Ápices da raiz de plantas de 5 dias de idade cultivadas em fotoperíodos curtos foram dissecadas e fixadas em FAA. Material incluído em parafina foi secionado a 8 μm de espessura. A hibridização e a detecção foram realizadas como anteriormente descritas (Palatnik et al., 2003).

Ensaios GUS

[00274] Para visualizar a atividade dos repórteres, plantas transgênicas foram submetidas a coloração GUS, de acordo com a Donnelly et al. (Donnelly et al., 1999). Tecido marcado foi incluído em parafina, seccionado e montado em bálsamo do Canadá.

Números de adesão

[00275] A lista de identificadores de identificadores de lócus AGI relevantes é apresentado na Tabela 2. O número de acesso para os experimentos de microarranjos é GSE11250. Tabela 3. Expressão GRF em plantas 3SS:miR396b comparada com a de tipo selvagem, tal como estimado pela Affymetrix microarray

Exemplo # 1 Uma versão resistente miR396 de GRF3 aumenta o tamanho da planta e acúmulo de biomassa

[00276] A família de fatores de transcrição de GRF compreende nove membros em Arabidopsis (Kim et al., 2003). Sete deles, inclusive GRF3, tem um local alvo para miR396 (Jones-Rhoades e Bartel, 2004). GRF têm mostrado perda de função ou a superexpressão por miR396 para reduzir o número de células em folhas de Arabidopsis (Kim e Kende, 2004.; Liu et al, 2009) (Horiguchi et al, 2005.) (Kim et al, 2003.).

[00277] Para estudar a importância de miR396 em restringir a expressão GRF3, dois GRF3 fragmentos genômicos foram introduzidos em plantas de Arabidopsis thaliana. Um deles continha o gene GRF3 de tipo selvagem (Figura 1, painel de cima), enquanto que o segundo abrigava sequência modificada de GRF3, na qual o motife miARN-alvo foi modificado através de mutações sinônimas que impedem o alvejamento miR396 (chamado rGRF3, Figura 1, meio painel).

[00278] A sequência de tipo selvagem de GRF3 contém uma região complementar de miR396 com uma energia de interação elevada ( = -33,9 kcal / mol). Em contraste, a sequência modificada GRF3 (rGRF3), que inclui cinco alterações em relação à seqüência do tipo selvagem (modificação A-> U, G-> A, U-> A, G-> A e A-> G) não tem um local claro de intereção miR396 interagindo, como a energia de interação é reduzida de -33,9 kcal / mol para -14,4 kcal / mol. A sequência completa de GRF3 é detalhada nas Figuras 21 e 22. A sequência completa de rGRF3 é detalhado na Figura 35. A sequência completa e um mapa do vetor binário usado (chamado RER32, ver Tabela 1) podem ser encontrados nas Figuras 40 e 42, respectivamente.

[00279] Plantas de Arabidopsis transgênicas expressando rGRF3 tinha folhas maiores e rosetas do que o tipo selvagem ou plantas transgênicas que expressam a sequência GRF3 miR396-regulado (Figuras 3, 5, 13 e 17). Elas também acumulam mais biomassa, a julgar pela massa fresca e seca de folhas e rosetas (Figura 6). Em geral, observou-se que rGRF3 quase duplicou o tamanho e peso da primeira folha com respeito a plantas do tipo selvagem (Figura 3). O domínio de FFD rGRF3 aumentou a atividade da proteína (Figura 54).

[00280] As plantas que expressam rGRF3 também tinham um caule mais grosso com maior peso e velocidade de crescimento seco de plantas de tipo selvagem (Figura 12). Observou-se que o diâmetro do caule aumentou 20% em plantas rGRF3 com respeito ao do tipo selvagem (Figura 12).

Materiais e Métodos

[00281] O acesso a Arabidopsis thaliana Columbia (Col- 0) foi usado como um tipo selvagem. Todos os transgênicos estão em um background Col-0. As plantas foram cultivadas em fotoperíodos longos (16 horas de luz / 8 h escuro) ou em fotoperíodos curtos (8 horas luz/16 hr escuros) a 23° C. Ver Tabela 1 para uma lista de plasmídeos binários gerados e detalhes sobre como as plantas transgênicas foram preparados. O alvo motife miRNA em AtGRF3 foi alterada introduzindo mutações sinônimas em um fragmento genômico clonado AtGRF3 tipo selvagem utilizando o kit mutagênese dirigida QuikChange ® (Stratagene).

[00282] Todas os constructos foram clonados no vetor binário pCHF3 (Jarvis et al., 1998). Constructos de T-DNA foram introduzidos em cepas de Agrobacterium tumefaciens ASE e as plantas transgênicas de Arabidopsis foram obtidas por mergulho floral.

[00283] A área foliar foi medida por primeiro tirando uma fotografia de folhas destacadas completamente expandidas, em seguida, medindo a área foliar com o ImageJ software NIH.

[00284] Para determinar o acúmulo de biomassa, rosetas completas ou folhas individuais foram pesadas para medir o peso fresco. Em seguida, o tecido foi seco a 60° C durante 2 dias e o peso seco foi medido. Para determinar o crescimento da haste, o alongamento foi medido partindo com 5 cm de comprimento decorrendo durante 10 dias até sua máxima extensão tenha sido alcançada. Velocidade máxima de alongamento foi calculada a partir do enredo de alongamento. Acumulação de biomassa no caule foi estimado por medição do peso a seco de 10 cm de comprimento segmentos de caule completamente alongadas. Diâmetro do caule, finalmente, foi medida na parte inferior do caule, 0,5 cm acima da roseta.

[00285] O motife FFD em AtGRF3 foi alterada a introdução de mutações em um AtGRF3 cDNA clonado utilizando o kit de mutagênese dirigida QuikChange ® (Stratagene). A sequência de codificação nativa rGRF3 cDNA "TTCTTTGACGATTGG" para FFDDW foi mutada para sequencia de codificação "GCTGCTGACGATGCT" para AADDA, substituindo todos os aminoácidos aromáticos para alaninas no motife FFD. O peso (rGRF3 (FFD)) e mutados (rGRF3 (DAA)) dos genes foram colocados sob o promotor AtGRF3.

Conclusões

[00286] - Plantas transgênicas de Arabidopsis transformadas com a versão resistente miR396 de GRF3 (nomeada, rGRF3) mostram um aumento impressionante no tamanho das folhas e acúmulo de biomassa em relação às plantas do tipo selvagem ou plantas transgênicas expressando uma seqüência GRF3 com um sítio de ligação miR396.

[00287] - RGRF3 promove o crescimento de outros tecidos, assim, tal como as hastes.

[00288] - O domínio FFD aumenta a atividade da rGRF3.

Exemplo # 2 A superexpressão de GIF1 aumenta o efeito de rGRF3

[00289] A família de fatores de transcrição de GRF compreende nove membros em Arabidopsis (Kim et al., 2003). Sete deles tem um site alvo para miR396 (Jones-Rhoades e Bartel, 2004). As mutações em diferentes GRF ou superexpressão de miR396 foram mostrados para reduzir o número de células em folhas de Arabidopsis (Horiguchi et al, 2005;. Kim e Kende, 2004; Rodriguez et al, 2010.). Os GRFs interagem com fatores GRF-interagindo (GIFs), uma família de genes pequena composta por três membros (GIF1, GIF2 e GIF3) que codificam proteínas com homologia com o co-ativador transcricional SYT humano (Kim e Kende, 2004). Inativação de GIF1, também conhecido como ANGUSTIFOLIA 3 (AN3), produz folhas mais estreitas, como resultado de uma redução na proliferação das células de uma forma semelhante à das plantas de GRF-deficientes (Horiguchi et al., 2005).

[00290] Plantas transgênicas super-expressando GIF1 (Figuras 1 e 2) a partir do promotor 35S do vírus (G/F7 chamado 35S) foram preparadas. A sequência completa e um mapa do vetor binário usado (chamado JD16, ver na Tabela 1) podem ser encontrados nas Figuras 39 e 41, respectivamente. Estas plantas foram semelhantes aos das plantas de tipo selvagem. Mais tarde, 35S: G/F7 foi cruzado com plantas que expressam rGRF3 (GRF3 insensível a miR396, descrito no exemplo # 1). As plantas resultantes de co-superexpressaram rGRF3 e GIF1 (denominados, rGRF3 x 35S:GIF1) foram analisadas com maiores detalhes (figuras 1 e 2).

[00291] Ao analisar a produtividade de biomassa das plantas verificou-se que rGRF3 em combinação com a superexpressão de GIF1 produzem plantas com folhas maiores e acumulam mais massa fresca e seca, o dobro do que as plantas do tipo selvagem (Figuras 3 e 13). O desempenho do rGRF3 x GIF foi melhor do que rGRF3 sozinho. Materiais e métodos

[00292] O acesso a Arabidopsis thaliana Columbia (Col- 0) foi usado como um tipo selvagem. Todos os transgênicos estão no background de Col-0. As plantas foram cultivadas em fotoperíodos longos (16 horas de luz / 8 h escuro) ou em fotoperíodos curtos (8 horas luz/16 hr escuros) a 23° C. Ver Tabela 1 para uma lista de plasmídeos binários gerados e detalhes sobre como as plantas transgênicas foram preparados. O motife alvo miARN no AtGRF3 foi alterada a introdução de fragmento genômico clonado de mutações sinônimas AtGRF3 tipo selvagem utilizando o kit de mutagênese dirigida QuikChange ® (Stratagene). Todas os cosntructos foram clonados no vetor binário pCHF3 (Jarvis et al., 1998). Constructos de T-DNA foram introduzidos em cepas de Agrobacterium tumefaciens ASE e as plantas transgênicas de Arabidopsis foram obtidas por mergulho floral.

[00293] Para a análise da expressão por meio de RT- PCR, o RNA foi preparado a partir de ápices de plantas de 20 dias de idade, cultivadas em fotoperíodos curtos, incluindo o desenvolvimento de folhas menores do que 3 milímetros. 0,5 a 1,0 μg de RNA total foi tratado com RQ1 RNase Dnase (Promega). Em seguida, a síntese de cDNA da primeira cadeia foi realizada utilizando SuperScriptTM III Transcriptase Reversa (Invitrogen). As reações de PCR foram realizadas em um termociclador Mastercycier ep realplex (Eppendorf) usando SYBRGreen I (Roche) para monitorar a síntese de dsDNA ®. qPCR para cada gene foi feito em, pelo menos, três repetições biológicas com duplicados técnicas para cada réplica biológica. O nível de transcrição relativa foi determinada para cada amostra, normalizados utilizando PROTEÍNA FOSFATASE nível cDNA 2A (Czechowski et al., 2005).

[00294] A área foliar e medidas de peso fresco e seco foram feitas como no Exemplo # 1.

Conclusões

[00295] - O desempenho rGRF3 na produtividade da planta pode ser aumentada por co-superexpressão de GIF1.

Exemplo # 3 Senescência foliar atrasada e aumento da resistência à seca das plantas rGRF3

[00296] Como mostrado no Exemplo # 1, plantas rGRF3 produzem folhas maiores do que as plantas de tipo selvagem, acumulando mais biomassa. Este efeito é reforçado pela co- superexpressão de rGRF3 e GIF1 (rGRF3 x 35S.GIF1) (veja o exemplo # 2 para maiores detalhes). Além disso, inventores observaram que rGRF3 e rGRF3/35S:GIF1 ficam verdes por um período mais longo de tempo do que as plantas de tipo selvagem (Figura 4).

[00297] Para testar se há este atraso na senescência foliar em plantas transgênicas GIF1 rGRF3 e rGRF3 x 35S:, um experimento de senescência induzida por escuro foi realizada. A incubação de folhas destacadas no escuro induz senescência e este processo pode ser seguido por medição da diminuição da eficiência máxima do fotossistema II (FSII) fotoquímica (Fv / Fm), tal como descrito anteriormente (Baker, 2008;. Schommer et al, 2008). Para fazer isto, a quinta folha de tipo selvagem, rGRF3, 35S.G / 7 e rGRF3 x 35S.GIF1 foram recolhidos e mantidos no escuro, e Fv / Fm foi medido todos os dias. Conforme detalhado na Figura 4, não existe diferença entre plantas do tipo selvagem e 35S:G/F7. No entanto, a senescência no rGRF3 de folhas de 2 dias após as folhas do tipo selvagem. Curiosamente, deixa que a co-super-expressam níveis elevados de rGRF3 GIF1 e mostrou um atraso maior ainda no decaimento de Fv / Fm, indicando que a superexpressão de GIF1 aumenta ainda mais o atraso de senescência de plantas rGRF3.

[0001] Além disso, o desempenho do transgénico sob privação de água (Figura 14) foi determinada. Plantas de 25 dias de idade de 35S: miR396, do tipo selvagem, rGRF3, 35S: GIF1 e rGRF3 x 35S.GIF1 foram privadas de água durante 2 semanas. Em seguida, as plantas foram irrigadas uma vez por semana. miR396 super-expressadores, do tipo selvagem e 35S:GIF1 foram severamente afetadas no seu crescimento até o final da privação de água e, posteriormente, a ele (Figura 14). Em contraste, tanto as linhagens rGRF3 e rGRF3 x 35S.GIF1 recuperada e bem desenvolvida seguindo a privação de água (Figura 14).

Materiais e métodos

[00298] Para estudar a senescência foliar, a quinta parte de folhas completamente expandidas foram destacadas e armazenadas na escuridão. Senescência induzida-ao escuro foi seguido por medição máxima de eficiência fotoquímica (Fv / Fm) do fotossistema II, como descrito (Baker, 2008). Nos ensaios de privação de água, as plantas foram cultivadas em fotoperíodos longos (16 horas de luz / 8 horas escuro) a 23 ° C. Quando as plantas foram 25 dias de idade, eles foram privados de água durante duas semanas. Depois disso, as plantas foram irrigadas uma vez por semana. As fotografias foram tiradas quando as plantas foram de 50 dias de idade.

Conclusões

[00299] — Plantas rGRF3 têm um atraso na senescência foliar. Este efeito é ainda reforçado pela co- superexpressão de GIF1.

[00300] - Plantas RGRF3 são mais tolerantes à privação de água.

Exemplo # 4 Expressão de promotores específicos de tecido melhora o desempenho rGRF3 na produtividade da planta

[00301] A família de fatores de transcrição de GRF compreende nove membros em Arabidopsis (Kim et al., 2003). Sete deles, inclusive GRF3, tem um local alvo para miR396 (Jones-Rhoades e Bartel, 2004). MiR396 é expresso em níveis baixos no meristema e primórdios foliares e em seguida, de forma constante acumula-se com o desenvolvimento da folha, em conjunto com o recuo da proliferação celular (Rodriguez et al., 2010). É mostrado nos exemplos 1 e 2, que a abolição de miR396-repressão da GRF3 em Arabidopsis gera plantas com um aumento significativo no acúmulo de biomassa e em um atraso na senescência.

[00302] Para estudar se é possível melhorar ainda mais o desempenho de rGRF3 esta versão resistente miR396 de GRF3 foi expressa a partir de promotores específicos de tecidos. Os promotores AS1 (FOLHAS ASSIMÉTRICA 1) e ANT especificamente na fase de proliferação do desenvolvimento foliar, foram selecionados (figura 50).

[00303] Plantas transgênicas de Arabidopsis transformadas com os vetores de AS1:rGRF3 e ANT:rGRF3 tinham folhas maiores do que as plantas de tipo selvagem e até do que as plantas que expressam o rGRF3 do promotor GRF3 nativo (Figuras 18 e 51). Estas plantas também tinham hastes mais grossas (Figura 19).

[00304] Curiosamente, a expressão a partir de promotores de rGRF3 ANT e AS1 teve apenas um efeito menor sobre a senescência foliar, e menos do que a observada em plantas que expressam plantas rGRF3 a partir do promotor endógeno (Figuras 20 e 54).

[00305] A expressão de rGRF3 do ANT e promotores AS1 mostra dominância apical semelhante (Figura 52) para as plantas de tipo selvagem.

Materiais e Métodos

[00306] O acesso a Arabidopsis thaliana Columbia (Col- 0) foi usado como um tipo selvagem. Todos os transgênicos estão no background Col-0. As plantas foram cultivadas em fotoperíodos longos (16 horas de luz / 8 h escuro) ou em fotoperíodos curtos (8 horas luz/16 hr escuros) a 23° C. Ver Tabela 1 para uma lista de plasmídeos binários gerados preparadas. O motife alvo miARN no AtGRF3 foi alterado a introdução de fragmento genômico clonado de mutações sinônimas AtGRF3 tipo selvagem utilizando o kit QuikChange ® de mutagênese dirigida (Stratagene).

[00307] A área foliar foi medida primeiramente tirando uma fotografia de folhas destacados completamente expandidas, em seguida, medindo a área foliar com o ImageJ software NIH. Diâmetro do caule, finalmente, foi medido na parte inferior do caule, 0,5 cm acima da roseta.

[00308] fenótipo de Senescence foi analisado por meio de experimentos de senescência induzida por escuridão nas folhas completamente expandidas # 5. Fotos foram tiradas logo após as folhas expandidas completas tenham sido destacados a partir da roseta (Dia 1) e depois que elas foram incubadas por seis dias na escuridão (dia 6). Degradação da clorofila é um indicador de senescência (Schommer et al., 2008).

Conclusões

[00309] - Expressão de promotores específicos de tecido da forma rGRF3 pode melhorar o seu desempenho na produtividade da planta.

[00310] - Expressão de rGRF3 a partir de promotores específicos de tecidos podem desacoplar as diferentes funções de GRF3, tais como o controle de tamanho das folhas e senescência.

Exemplo # 5 rGRF3 supera rGRF2 no aumento do tamanho da planta e acúmulo de biomassa

[00311] Tal como foi mostrado anteriormente, os níveis elevados de miR396 reduzem consideravelmente folha (Rodriguez et al., 2010). Por outro lado, as plantas que expressam uma versão resistente miR396 de GRF2 (rGRF2) acumulam níveis elevados de GRF2 que causam um ligeiro decréscimo do tamanho da folha (Rodriguez et al., 2010). Foi demonstrado nos Exemplos # 1 e # 2 que as plantas rGRF3 também acumulam mais biomassa do que as plantas de tipo selvagem. Este exemplo mostra que rGRF3 supera significativamente rGRF2 em aumentar o tamanho da planta e acúmulo de biomassa.

[00312] Para comparar acúmulo de biomassa em linhagens rGRF2 e rGRF3, foram medida massa fresca e seca de rosetas com 40 dias de plantas 35S: miR396, do tipo selvagem, rGRF2 e rGRF3 (Figura 6). As plantas com altos níveis de miR396 teve uma redução da biomassa de 25%. Plantas rGRF2 tiveram apenas um pequeno aumento no acúmulo de biomassa que não foi estatisticamente significativa (Figura 6). Rossettas rGRF3 acumularam quase 40% mais biomassa em comparação com as plantas do tipo selvagem, o que é estatisticamente um peso significativo (Figura 6).

[00313] Outra diferença notável entre plantas rGRF2 e rGRF3 foi observada quando se compara a morfologia da folha. Folhas de plantas rGRF2 têm baixo "rolamento" de forma, enquanto as folhas das plantas rGRF3 são maiores do que o tipo selvagem deixando sem grande mudança na morfologia foliar (Figura 10). Desta forma, produzido plantas rGRF3 com folhas maiores, sem afetar a morfologia da folha.

[00314] Para analisar a correlação entre a acumulação de biomassa e níveis da FRS em plantas rGRF2 e rGRF3, foi selecionada uma linhagem independente de cada linhagem transgênica rGRF. Em seguida, os níveis de mRNA de GRF3 e GRF2 foram medidos por RT-PCR e o peso seco de rosetas de um mês de idade e de plantas rGRF2 e rGRF3. Observou-se que um aumento de 25 vezes nos níveis de RNAm em plantas GRF2 rGRF2 produziu um aumento de biomassa de apenas 30% (Figura 11). Pelo contrário, apenas um aumento de 2,5 vezes nos níveis de RNAm em plantas GRF3 rGRF3 resultou na acumulação de biomassa quase o dobro em comparação com o tipo selvagem Col-0 (Figura 11).

[00315] Como uma outra comparação foi comparado o efeito da expressão rGRF2 ou rGRF3 com o tipo selvagem (Figura 55). A área foliar de plantas expressando rGRF3 foi quase o dobro da do tipo selvagem e aumentou em comparação com rGRF2 (Figura 55). Quando rGRF2 foi colocado sob o controle do promotor GRF3, o aumento da área de folha não foi tão significativo como em plantas que expressam rGRF3, mostrando que a atividade diferencial de rGRF3 e rGRF2 é causada pelas suas diferentes sequências primárias e não pela força do promotor e / ou níveis de expressão (Figura 55).

Materiais e Métodos

[00316] O acesso a Arabidopsis thaliana Columbia (Col- 0) foi utilizado como um de tipo selvagem. Todos os transgênicos estão no background de Col-0. As plantas foram cultivadas em fotoperíodos longos (16 horas de luz / 8 h escuro) ou em fotoperíodos curtos (8 horas luz/16 hr escuros) a 23° C. Ver Tabela 1 para uma lista de plasmídeos binários gerados e detalhes sobre como transgênicos plantas foram preparados. O motife alvo miRNA em AtGRF3 ou AtGRF2 foi alterado pela introdução de mutações sinônimas em um fragmento genômico clonado AtGRF3 tipo selvagem usando o kit QuikChange ® de mutagênese dirigida (Stratagene).

[00317] Todas os constructos foram clonados no vetor binário pCHF3 (Jarvis et al., 1998). Constructos de T-DNA foram introduzidas em cepas de Agrobacterium tumefaciens ASE e plantas transgênicas de Arabidopsis foram obtidas por mergulho floral.

[00318] Para determinar o acúmulo de biomassa, rosetas completas foram pesadas para medir o peso fresco. Em seguida, o tecido foi seco a 60° C durante 2 dias e o peso seco foi medido.

[00319] Para a análise da expressão por meio de RT- PCR, o RNA foi preparado a partir de ápices de plantas de 20 dias de idade, cultivadas em fotoperíodos curtos, incluindo o desenvolvimento de folhas menores do que 3 milímetros. 0,5 a 1,0 μg de RNA total foi tratado com RQ1 RNase Dnase (Promega).

[00320] Em seguida, a síntese de cDNA da primeira cadeia foi realizada utilizando SuperScriptTM III Transcriptase Reversa (Invitrogen). As reações de PCR foram realizadas em um termociclador Mastercycler ep realplex (Eppendorf) usando SYBRGreen I (Roche) para monitorar a síntese de dsDNA ®. qPCR para cada gene foi feito em, pelo menos, três repetições biológicas com duplicados técnicas para cada réplica biológica. O nível de transcrição relativa foi determinado para cada amostra, normalizado utilizando PROTEÍNA FOSFATASE nível cDNA 2A (Czechowski et al., 2005).

Conclusões

[00321] - Altos níveis de rGRF2 são obrigados a aumentar ligeiramente a biomassa vegetal (por exemplo, 25 vezes mais GRF2 causaram 30% de aumento de biomassa).

[00322] - Aumentos moderados da expressão de GRF3 em plantas rGRF3 causou um grande aumento no acúmulo de biomassa (por exemplo, 2,5 vezes mais GRF3 causou 85% de aumento de biomassa).

[00323] - Altos níveis de rGRF2 afetaram o desenvolvimento da folha.

[00324] - Expressão de rGRF3 em plantas conduziu a aproximadamente 2 vezes o aumento da área da folha em comparação com o tipo selvagem

[00325] - Aumento da área foliar em rGRF3 em comparação com rGRF2 é dependente da sequência primária dos genes e não um resultado da força do promotor.

Exemplo # 6 GRF3 de Arabidopsis e homólogos de GIF1 são encontrados em plantas cultivadas: Família GRF em Arabidopsis thaliana e outras espécies vegetais.

[00326] A família de fatores de regulação do crescimento (GRF), de fatores de transcrição é uma família de proteínas específicas da planta definidas pela presença de dois motifes de proteína altamente conservados, o QLQ e WRC (Kim et al. De 2003). O domínio QLQ está envolvido em interações proteína-proteína com proteínas de FATORES DE INTERAÇÃO GRF, e o domínio WRC contém um sinal de localização nuclear funcional e um motife de ligação de dDNA que consiste em três cisteínas conservadas e uma histidina (Kim e Kende, 2004). A família de fatores de transcrição de GRF compreende nove membros em Arabidopsis (Kim et al, 2003) (Figuras 21 e 22), 12 de Oryza sativa (Choi et al., 2004) (Figuras 23 e 24) e 14 em Zea mays (Zhang et ai., 2008) (Figuras 25 e 26). Além disso, o GRF pode ser encontrado em muitas outras espécies de plantas (Zhang et al., 201) (Ver exemplos selecionados a partir de Glycine max, Medicago truncatula, Prunus persica, Carica papaya e Populus trichocarpa nas Figuras 27 - 34).

[00327] Pelo menos duas outras regiões conservadas podem ser encontradas em sequências de codificação de GRF. Em primeiro lugar, ao nível dos nucleotídeos, apenas um subgrupo dos GRF de cada espécie contém um local de miR396- alvo. Por exemplo, apenas 7 das nove GRFs encontrados em Arabidopsis são alvos miR396 (Figura 7 e 8) (Jones-Rhoades e Battel, 2004).

[00328] Em segundo lugar, apenas um subgrupo dos GRF de cada espécie contém o motife FFD conservado (Figura 8). Por exemplo, em Arabidopsis apenas GRF3 e GRF4 tem o motife FFD. Além disso, GRF contendo o motife miR396-alvo e o motife FFD, e com uma elevada homologia com o GRF3 de Arabidopsis pode ser encontrada em arroz, milho e outras espécies de plantas (Figuras 7, 8, 22, 24, 26, 38 31 - 34). Padrões de expressão GRFs em Arabidopsis thaliana e Zea mays

[00329] Padrão de expressão GRF3 foi analisado por RT- qPCR no desenvolvimento de folhas (Figura 15, esquerda). A quinta parte da roseta foliar foi coletada em intervalos de três dias, a partir do dia em que se tornou o primeiro visível (~ 1 mm) a olho nu, que foi de 16 dias após a semeadura (DAS). Em seguida, o nível de GRF3 foi determinado por RT-qPCR. Observou-se que este fator de transcrição foi expresso durante as fases iniciais do desenvolvimento da folha (Figura 15, esquerda). Uma expressão atlas do desenvolvimento Arabidopsis (Schmid et al., 2005) indica que os genes específicos de mitose são expressos em tecidos em proliferação (Figura 15, à direita). Consistente com um papel dos GRF como reguladores positivos da proliferação celular durante o crescimento de órgãos, o seu perfil de expressão é muito semelhante à dos genes específicos de mitose (mostrado para GRF3 na Figura 15, direita).

[00330] Para confirmar a equivalência funcional de GRFs entre Arabidopsis e Zea mays seus padrões de expressão durante o desenvolvimento das folhas de milho foram analisados usando o navegador do Milho PQE (Li et al, 2010;.. Winter et al, 2007). Conforme detalhado na Figura 16, GRF de milho, da mesma forma como GRF de Arabidopsis, são co-expressos com os genes específicos de mitose.

FATORES DE INTEREÇÃO GRF em plantas de colheira e Arabidopsis

[00331] Conforme descrito no exemplo # 2, o desempenho de rGRF3 na produtividade da planta pode ser muito maior, co-superexpressão de GRF-INTERAÇÃO FATOR 1. Este gene pertence a uma família de genes pequeno composto por três membros (GIF1, GIF2 e GIF3) em Arabidopsis. Além disso, os homólogos GIF1 são facilmente encontrados em outras espécies de plantas, tais como arroz (Figura 9). Os três GIFs em Arabidopsis são altamente redundantes, como mutantes em GIF1 pode ser complementados pela superexpressão de GIF2 ou GIF3 (Figura 43) (Lee et al., 2009). Estes resultados sugerem que o aumento do fenótipo rGRF3 pela superexpressão de GIF1 também é alcançado através da co-superexpressão de GIF2 e GIF3.

Materiais e Métodos

[00332] O RNA foi preparado a partir de ápices de plantas de 20 dias de idade, cultivadas em fotoperíodos curtos, incluindo o desenvolvimento de folhas menores do que 3 milímetros. 0,5 a 1,0 μg de RNA total foi tratado com RQ1 RNase Dnase (Promega). Em seguida, a síntese de cDNA da primeira cadeia foi realizada utilizando SuperScriptTM III Transcriptase Reversa (Invitrogen). As reações de PCR foram realizadas em um termociclador astercycler ® EP realplex (Eppendorf) usando SYBRGreen I (Roche) para monitorar a síntese de ADNcd. qPCR para cada gene foi feito em, pelo menos, três repetições biológicas com duplicados técnicas para cada réplica biológica. O nível de transcrição relativa foi determinada para cada amostra, normalizada utilizando PROTEÍNA FOSFATASE nível cDNA 2A. As sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela 2.

[00333] Sequências de GRF de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e Zea maize foram obtidas a partir de Genbank usando os números de acesso fornecidos na literatura (Choi et al, 2004;. Kim et al, 2003; Zhang et al, 2008). Alinhamentos de sequências de pares e os cálculos da percentagem de identidade e semelhança foram realizados com agulha, utilizando o algoritmo de alinhamento de Needleman- Wunche (Rice et al., 2000). Vários alinhamentos de sequência de sequências de proteínas foram realizados utilizando MCOFFE (Moretti et al., 2007). O pacote PHYLIP versão 3.67 (Felsenstein, 1989) foi utilizado para realizar 100 réplicas de bootstrap de uma arvore de ligação vizinha (NJ) com base em uma matriz de distância JTT. Árvores foram visualizados usando TreeView 1.6.6. (Página, 1996).

Conclusões

[00334] - GRF em geral e homólogos (ortólogos) de GRF3 em particular existem em muitas espécies de plantas.

[00335] - GIFs também existem em muitas espécies de plantas.

[00336] - De acordo com a sua função como um regulador positivo da proliferação celular, GRF3 é co-expresso com os genes da mitose durante o desenvolvimento da folha em Arabidopsis. Tal como esperado para genes equivalentes funcionais, a expressão de GRF em Zea mays também co- expressa com os genes da mitose durante o desenvolvimento da folha.

[00337] - A valorização do fenótipo rGRF3 por superexpressão de GIF1 também pode ser alcançado por homólogos (ortólogos) de Arabidopsis e plantas cultivadas.

Exemplo # 7 Introdução de rGRF3 e rGRF3 + GIF em BRASSICA OLERACEA Materiais e Métodos Material vegetal

[00338] Um genótipo de Brassica oleracea haploide duplicado geneticamente uniforme, DH 1012 (Sparrow et al., 2004) foi utilizado neste estudo. Este genótipo é derivado de um cruzamento entre um ciclo rápido de B. oleracea alboglabra (A12) e uma B. oleracea italica Verde Duke (GD33).

Cepas bacterianas

[00339] As transformações foram realizadas utilizando a cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens que aloja os plasmídeos adequados pBRACT114 rGRF3 e pBRACT114xGRF3: GIF1 e (ver a Figura 44) que contém um gene marcador de neomicina fosfotransferase (nptII) selecionável dirigido pelo promotor 35S e o gene (s) de interesse (ou seja, rGRF3 movido pelo seu próprio promotor, ou o constructo combinado que continha ambos os rGRF3 conduzidos pelo seu próprio promotor, e, adicionalmente, GIF dirigido pelo promotor 35S, respectivamente).

[00340] O processo de clonagem usado para fazer o vetor de transformação de 14-pBRACTI rGRF3 GIF1 é descrito abaixo. pBRACT114-rG F3 GIF1 contém tanto o gene rGRF3 movido pelo seu promotor nativo e a região de codificação de GIF1 super-expresso pelo promotor CaMV 35S.

[00341] Digestão de ~ 1,7 μg de pGRF3: DNA GRF3r em um volume de reação total de 20 μl com PvuII (Invitrogen) no tampão apropriado foi realizada a 37° C durante 1 hora em um banho de água. Um fragmento de 4950 pb contendo o promotor rGRF3 nativa, a região de codificação, 3'UTR e terminador foi isolado por extração de gel.

[00342] O vetor de transformação de Brassica pBRACT1 14 (www.bract.org) baseia-se na pGreen (Hellens et al., 2000) e é de Gateway™ (Invitrogen) compatível. Aproximadamente 1 g de pBract1 14 foi digerido com a enzima de restrição Stu \ (Roche) no tampão adequado, durante 1 hora a 37° C. O vetor linearizado foi desfosforilado por incubação a 37° C durante mais uma hora com fosfatase alcalina de camarão (SAP). A SAP foi desnaturada por aquecimento a 65° C durante 15 minutos.

[00343] Uma reação de ligação foi realizada durante a noite a 14° C e continha o fragmento rGRF3 e o linear pBRACT114 na proporção de 3:1, respectivamente. Utilizaram- se cinco unidades de T4 ligase (Invitrogen) em 10 l de ligante de atunuação final. Para 50 l de células de E. coli competentes ccdB (Invitrogen) 2 l da reação de ligação foi adicionada e transformação por choque térmico. As células foram cultivadas em 250 l de meio SOC durante 1 hora a 37° C e agitada a 200 rpm. 20 l e 100 l da cultura foram espalhada sobre placas de meio LB sólido (Sambrook e Russel, 2001) contendo uma seleção apropriada e incubou-se durante a noite a 37° C.

[00344] Colónias de E. coli foram selecionadas por PCR de colônias direta para garantir que elas continham o pBRACT114 com a inserção na orientação desejada. Doze colônias PCR individuais positivas foram transferidas para 10 ml de meio líquido LB contendo a seleção apropriada e incubou-se a 37 ° C agitado de 220 rpm durante a noite. O DNA de plasmídeo foi isolado usando um kit de mini-prep (Qiagen). A integridade do constructo conhecida como pBRACTI 4-xGRF3 foi confirmada por digestão enzimática e sequenciamento dos sítios de inserção.

[00345] A segunda fase do processo de clonagem para criar pBRACT-rGRF3 GIF1 utilizou o sistema de Gateway ™ (Invitrogen) para recombinar a região de codificação de GIF1 a jusante do promotor CaMV 35S. A região de codificação de GIF1 foi amplificada por PCR utilizando polimerase de elevada fidelidade Platinum™ (Invitrogen) e Topo T / A clonado no vetor de entrada Gateway™ pCR8/GW/Topo ® TA (Invitrogen). Para 50 l de céluluas de E.coli quimicamente competentes DH5-a (Invitrogen) 2 l da reação do Topo foi adicionado e transformação por choque térmico. As células foram cultivadas em 250 l de meio SOC durante 1 hora a 37° C e agitados a 200 rpm. 20 l e 100 l da cultura foram espalhadas sobre placas de meio LB sólido (Sambrook e Russel, 2001) contendo uma seleção apropriada e incubou-se durante a noite a 37 ° C.

[00346] Colônias de E. coli foram testadas por PCR de colónias direta para garantir que elas continham pCR8 com o amplicon GIF1 na orientação desejada. Seis colônias de PCR individuais positivas foram transferidas para 10 ml de meio LB líquido contendo a seleção apropriada e incubou-se a 37° C e agitada por 220 rpm durante a noite. O DNA de plasmídeo foi isolado usando um kit de mini-preparação de plasmídeo (Qiagen). A entrada do vetor pCR8-G/F7 foi verificado por digestão enzimática. O sequenciamento de toda a região de codificação de GIF1 foi realizada para garantir a sua integridade.

[00347] A reação de recombinação de Gateway ™ LR foi realizada para introduzir a região codificadora de GIF1 no pBRACTI 4-xGRF3 entre os locais de gateway a jusante do promotor CaMV 35S. A reação de 10 l de LR continha ~ 100 ng de pBRACT114-rGRF3 + 35 ng de pCR8-GIF1 com 2 l de mistura enzimática Gateway ® LR Clonase ™ II ™ (Invitrogen) em tampão TE. A reação de LR foi incubada à temperatura ambiente durante a noite. Um tratamento com proteinase K foi realizada a 37° C durante 10 minutos. Para 50 l de célilas DH-5 de E. coli quimicamente competentes (Invitrogen) 1 μl da reação LR foi adicionado e transformação por choque térmico. As células foram cultivadas em 250 μl de meio SOC durante 1 hora a 37° C e agitadas a 200 rpm. 20 l e 100 l da cultura foram espalhadas sobre placas de meio LB sólido (Sambrook e Russel, 2001) contendo uma selecção apropriada e incubou-se durante a noite a 37° C.

[00348] Doze colônias isoladas foram transferidas para 10 ml de meio líquido LB contendo a seleção adequada e incubadas a 37° C agitado de 220 rpm durante a noite. O DNA de plasmídeo foi isolado usando um kit de mini-prep (Qiagen). A integridade do constructo conhecida como pBRACTI14 rGRF3 GIF1 foi confirmada por digestão enzimática e sequenciamento dos locais de inserção de GIF1.

[00349] O plasmídeo pBRACT-rGRF3 de GIF juntamente com o seu plasmídeo ajudante pSoup (Hellens et al. De 2000) foi transformada em cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens por eletroporação. O plasmídeo pGRF3:rGRF3 também foi transformado por eletroporação em A. tumefaciens. Resumidamente, 100 ng de DNA de plasmídeo foi adicionado a 40 l de células eletro-competente de A. tumefaciens em um cuvete de eletroporação de pré-refrigerada com separação de elétrodo de 2 mm. As células foram eletroporadas em um GenePulser (BioRad) com o 2.50kV seguintes configurações, 25t/FD e 400 Ohms. Imediatamente 300 μl de meio LB líquido foi adicionado ao recuperar as células, e estas foram cultivadas a temperatura ambiente, agitou-se a 180 rpm durante 6 horas. Culturas de A. tumefaciens foram espalhadas em meio LB sólido (Sambrook e Russel, 2001) contendo uma seleção apropriada e incubou-se a 28° C durante 48 horas. Colônias isoladas foram selecionadas e usadas para inocular 10 ml de meio líquido LB contendo os antibióticos adequados e incubou-se a 28° C, agitado a 200 rpm durante 48 horas. Estoques de glicerol e os inóculos padrão foram preparados e armazenados a -80° C. Os plasmídeos foram verificados mais uma vez, por digestão enzimática, antes de iniciar os experimentos de transformação em Brassica.

[00350] A. tumefaciens foi semeada em meio LB sólido (Sambrook e Russel, 2001) contendo uma seleção apropriada e incubada a 28° C durante 48 horas. Uma única colônia foi transferida para 10 ml de meio LB líquido contendo a selecção apropriado e transferido para um agitador de 28° C durante 48 horas. A 50 l de alíquota da suspensão bacteriana resultante foi transferido para 10 ml de meio líquido com seleção MGL e cultivadas durante a noite em um agitador de 28° C. Culturas noturnas foram centrifugadas a 3000 rpm durante 5 minutos à TA, antes de ser novamente suspensas em meio líquido MS. Suspensões de OD650 = 0,3 foram utilizadas para a inoculação (diluições feitas utilizando meio MS líquido).

Transformação de Plantas

[00351] As sementes foram esterilizadas à superfície em etanol a 100% durante 2 minutos, hipoclorito de sódio a 15% e mais 0,1% de Tween-20 durante 15 minutos e lavada três vezes durante 10 minutos em água destilada estéril. As sementes foram germinadas em plena força MS (Murashige e Skoog, 1962) base de sal vegetal, que contém 3% de sacarose e 0,8% phytagar (Difco) em pH 5.6. Antes de se verter, esterilizadas por filtração, vitaminas foram adicionadas ao meio; mio-lnositol (100 mg / l), Tiamina-HCl (10 mg / l), Piridoxina (1 mg / l) e ácido nicotínico (mg / l). As sementes foram semeadas a uma densidade de 15 sementes por 90 milímetros de placa de Petri e transferida para um quarto frio de 10° C durante a noite, antes de ser transferida para uma sala de cultura de 23° C em 16 horas a duração do dia com iluminação de 70 mol m-2 seg-1 de.

[00352] Com base no protocolo de transformação desenvolvida para Brassica napus (Moloney et al. 1,989), e desenvolvidos por Bráctea (www.bract.org), pecíolos cotiledonares excisados a partir de sementes de 4 dias de idade foram mergulhados durante a noite em uma suspensão de Agrobacterium. Os explantes foram mantidos, 10 explantes por placa, em meio co-cultivo (meio de germinação suplementado com 2 mg / l de 6-benzilaminopurina); com os pecíolos embebidos e a garantia a lamela cotiledonar foram claros do meio. As culturas foram mantidas em câmaras de crescimento a 23° C, com a duração do dia 16 horas, ao abrigo da luz difusa de 40 mol m-2 seg-1 durante 72 horas. Após 72 horas, os explantes foram transferidos para meio de selecção (meio de co-cultura suplementado com 160 mg / l timentin (ou Agrobacterium apropriada eliminando antibiótico) e 15 mg / l de canamicina como agente de seleção. Controles foram estabelecidas em meio isento de canamicina, como explantes que continham ou não foram inoculados com Agrobacterium.

Isolamento da Raiz e Regeneração de Plantas

[00353] Regeneração de brotos verdes foram excisados e transferido para meio Br de Gamborgs (Gamborg et al. 1968), contendo 1% de sacarose, 0,8% Phytagar, 160 mg / l de timentina e 50 mg / l de canamicina. Onde vários raízes densas foram isoladas, ainda sub-cultura foi feita após o alongamento de brotos para garantir uma haste principal tenha sido isolada reduzindo, assim, a probabilidade de fugas e a freqüência de plantas multi-haste, quando transferido para a estufa. Raízes foram mantidas em meio B5 de Gamborgs até as raízes tenham sido desenvolvidas. As mudas foram transferidas para vasos de turfa estéril (Jiffy No.7) para permitir um maior desenvolvimento da raiz, antes de ser transferida para a estufa.

Manutenção da Planta e Produção da Semente

[0002] As plantas transgênicas foram mantidas em uma estufa iluminada contenção (16 horas de fotoperíodo, 18/12° C dia / noite) e auto-polinizadas para gerar a semente T1. As plantas foram cobertas com claros, perfuradas 'pão-sacos' (Cryovac (UK) Ltd), logo que entrou em flor para evitar a polinização cruzada. O genótipo fundo DH1012 é um genótipo auto-compatível e agitação diária do "pão-saco' foi realizado para facilitar a polinização. Mudas foram autorizadas a desenvolver na planta até totalmente inchado e foram colhidos quando vagens tinha secado e ficou marrom. Vagens colhidas foram trilhadas quando seca e sementes armazenadas na loja de semente John Innes Centre (+ 1,5° C, 7 - 10 umidade relativa).

Análise Molecular

[00354] O tecido foliar de raízes transgénicas putativos (in vitro) foi usada para extração de DNA iniciais para teste de PCR para a presença dos transgenes.

Análise do número de cópias por PCR em tempo real multiplexado

[00355] O número de cópias do transgene foi medido utilizando ensaios de PCR em tempo real multiplex (TaqMan) realizados por 'genética' iDNA (www.idnagenetics.com). O gene nptII alvo foi detectado usando um marcador Fam, Tamra extinta sonda, e, simultaneamente, um gene de controle interno positivo foi detectado usando um Vic marcado, Tamra extinta sonda. As reações foram realizadas utilizando-se 5 - 20ng de DNA genômico a partir de cada amostra, em um volume de reação de 20 l com cada amostra ensaiada duas vezes. O limiar de ciclo (CTS) para os sinais de Fam e Vic foram encontrados para cada tubo, e a média DeltaCt (CtFam - CtVIC) calculada para cada amostra. As amostras foram classificadas por DeltaCt (onde a alta delta Ct diz respeito a amostras com baixo número de cópias, e baixo DeltaCt para um elevado número de cópias). As amostras de plantas foram classificadas em relação a amostras de referência (número de cópias conhecido).

[00356] Investigações preliminares mostram que o crescimento reforçado e melhorada da produtividade da planta é obtido em plantas de Brassica que compõem o MxGRF3 ou MxGRF3: GIF1

[00357] A Figura 49 mostra os dados comparando plantas Brassica oleracea transformadas com Arabidopsis rGRF3 e plantas controle (sem o No rGRF3). Plantas transformadas de Brassica oleracea com No rGRF3 melhorou significativamente o crescimento e a produtividade das plantas. Por exemplo, no florescimento, a largura da haste 10 cm acima do nível do solo e a largura máxima do caule na floração foram ambos significativamente maiores nas plantas transformadas com Brassica oleracea No rGRF3 em comparação com plantas controle. Estes resultados foram significativos utilizando o teste t (p <0,01) ou a análise de regressão (p = 0,008).

[00358] A Figura 56 mostra os dados para plantas Brassica oleracea transformadas com Arabidopsis rGRF3 (rGRF3) e um controle de regeneração (TC). A largura da haste mais larga na floração é aumentada em rGRF3 quando comparado com o controle (Figura 56). A figura mostra também que 10 cm de caule é aumentada em rGRF3 quando comparado com o controle (Figura 56).

[00359] O crescimento das raízes das plantas Brassica oleracea transgênicas expressando Arabidopsis rGRF3 foi medido. Para fazer isto, plantas de tipo selvagem e transgénicas foram cultivadas em placas de MS verticais. Comprimento radicular foi medido em, pelo menos, 10 plantas de cada genótipo de 4 a 7 dias após a semeadura (Figura 57, esquerda). A partir do declive da linha, a taxa de crescimento da raiz foi avaliada (Figura 57, direita).

Conclusões

[00360] - Plantas Brassica oleracea transgênicas expressando Arabidopsis rGRF3 e rGRF3:GIF1 mostraram maior crescimento e melhoria da produtividade da planta.

[00361] - Plantas Brassica oleracea transgênicas transformadas com a versão miR396-resistente de GRF3 (nomeado, rGRF3) mostram um aumento notável no crescimento da raiz.

Exemplo # 8 Expressão em Arabidopsis de ortólogos GRF3 de soja e arroz também aumenta a biomassa vegetal

[00362] No Exemplo # 6, GRFs de outras espécies alem das que foram descritas para Arabidopsis. Para testar se estes GRF que se comportam de uma forma semelhante à de rGRF3 de Arabidopsis, sequências selecionadas foram introduzidas em Arabidopsis. Os GRF com a homologia mais elevada de A-e rGRF3 contendo um motife FFD e um local alvo miR396 foram selecionados de arroz (Figura 37) e soja (Figura 36). O GRF3 de soja e arroz foram desacoplados do controle miR396, através da introdução de mutações no sítio de ligação a miRNA como descrito anteriormente para GRF3 de Arabidopsis.

[00363] Um vetor de expressão destas sequências do promotor de GRF3 de Arabidopsis foi preparado e, em seguida, as plantas transgênicas de Arabidopsis foram obtidas. De uma forma semelhante ao das plantas que expressam At-rGRF3, as plantas transgênicas de Arabidopsis expressando Os-rGRF4 e Gm-rGRF tinham folhas maiores do que as plantas de tipo selvagem (Figura 46). Estas plantas transgênicas que expressam os ortólogos rGRF3 de soja e arroz também teviram um atraso na senescência foliar (não mostrado).

Materiais e Métodos

[00364] o acesso a Arabidopsis thaliana Columbia (Col- 0) foi usado como um controle do tipo selvagem. Todos os transgênicos estão no background de Col-0. As plantas foram cultivadas em fotoperíodos longos (16 horas de luz / 8 h escuro) ou em fotoperíodos curtos (8 horas luz/16 hr escuros) a 23° C. Ver Tabela 1 para uma lista de plasmídeos binários gerados e detalhes sobre como as plantas transgênicas foram preparados. O motife alvo miRNA no OsGRF4 e Gm-GRF foi alterado por introdução de mutações utilizando o kit QuikChange ® de mutagênese dirigida (Stratagene), como descrito anteriormente para GRF3 de Arabidopsis. O motife miR396 mutado em Os-GRF4 e GM-GRF é mostrado na Figura 37 e Figura 36, respectivamente.

[00365] Todas os constructos foram clonadas no vetor binário pCHF3 (Jarvis et al., 1998). Constructos de T-DNA foram introduzidas em cepa ASE de Agrobacterium tumefaciens e plantas de Arabidopsis transgênicas foram obtidas por mergulho floral.

[00366] A área da folha foi medida primeiramente tirando uma fotografia de folhas destacadas completamente expandidas, e, em seguida, medindo a área foliar com o software ImageJ NIH (conforme descrito no Exemplo # 1 e outros exemplos acima).

Conclusões

[00367] Ortólogos de rGRF3 de outras espécies do que Arabidopsis (por exemplo, pelo menos, arroz e soja) também podem aumentar o tamanho da planta e acumular biomassa. REFERÊNCIAS Aukerman M. J., Sakai H. (2003). Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-like target genes. Plant Cell 15, 2730 - 2741. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. (1998). Current protocols in molecular biology. John Wiley and Sons. Inc. publication. Axtell M. J., Bartel D. P. (2005). Antiquity of microRNAs and their targets in land plants. Plant Cell 17, 1658 - 1673. Baker C. C., Sieber P., Wellmer F., Meyerowitz E. M. (2005). The early extra petals1 mutant uncovers a role for Arabidopsis. Curr. Biol. 15, 303 - 315. Baker, N.R. (2008). Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu Rev Plant Biol 59, 89-113. Bartel D. P., Chen C. Z. (2004). 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Claims (8)

1. Método para produção de uma planta com tamanho de caule aumentado, peso seco aumentado, velocidade de crescimento aumentada, tamanho de folha aumentado, crescimento de raiz aumentado, tolerância aumentada à seca e senescência retardada em comparação com uma planta do tipo selvagem, caracterizado pelo fato de que compreende transformar a planta com um ácido nucleico que codifica o fator regulador de crescimento 3 (GRF-3) de Arabidopsis thaliana; o referido GRF compreendendo um motivo FFD, sendo que o referido ácido nucleico é desacoplado do controle por miR396 por compreender um sítio alvo de miR396 mutado consistindo em uma sequência selecionada a partir de: a) CGTTCxAGAAAxCCxGTxGAx (SEQ ID No. 86), em que x designa bases que foram modificadas; e b) CGTTCtAGAAAaCCaGTaGAg (SEQ ID No. 38), em que as letras minúsculas designam bases modificadas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico consiste em SEQ ID No. 2 (AtGRF3); em que a sequência de nucleotídeos compreende uma modificação no sítio alvo de miR396 para desacoplar o ácido nucleico do controle por miR396.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico consiste em uma sequência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19 ou SEQ ID No. 88; em que a sequência de nucleotídeos compreende uma modificação no sítio alvo de miR396 para desacoplar o ácido nucleico do controle por miR396.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a planta superexpressa pelo menos um gene GIF em comparação com uma planta do tipo selvagem.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene GIF é selecionado dentre o grupo que consiste em GIF1 (SEQ ID NO: 95) e AtGIF 3 (SEQ ID NO: 81).

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico está operacionalmente ligado a um promotor e um terminador.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor tecido específico.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o promotor compreende um promotor ASYMMETRIC LEAVES 1 (AS-1) ou um promotor AINTEGUMENTA (ANT).

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