KR20030067689A - 형질전환 식물에서의 스틸벤의 생산 및 그것의 생산 방법 - Google Patents

형질전환 식물에서의 스틸벤의 생산 및 그것의 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20030067689A
KR20030067689A KR10-2003-7006894A KR20037006894A KR20030067689A KR 20030067689 A KR20030067689 A KR 20030067689A KR 20037006894 A KR20037006894 A KR 20037006894A KR 20030067689 A KR20030067689 A KR 20030067689A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plant
gene
resveratrol
red
transformed
Prior art date
Application number
KR10-2003-7006894A
Other languages
English (en)
Inventor
치아텟패트
응아이렌
Original Assignee
난양 테크놀러지컬 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 난양 테크놀러지컬 유니버시티 filed Critical 난양 테크놀러지컬 유니버시티
Publication of KR20030067689A publication Critical patent/KR20030067689A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01095—Trihydroxystilbene synthase (2.3.1.95)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은, 내부에 1종 이상의 스틸벤 신타제(STS) 유전자 작제물이 형질전환되어 있고, 형질전환 STS 효소에 의해 합성된 대응 스틸벤이 구성적 수준으로 생산되며, 정상적인 생리적 성장은 유지되는 형질전환 식물에 관한 것이다. 바람직한 구체예는 적색 식물에 형질전환된 형질전환 레스베라트롤 신타제(RS)를 함유한다. 생산 방법은 고농도의 형질전환 RS 효소의 전구체를 함유하는 수용체 식물을 선택하는 것을 포함한다.

Description

형질전환 식물에서의 스틸벤의 생산 및 그것의 생산 방법{PRODUCTION OF STILBENES IN TRANSGENIC PLANTS AND THE METHOD OF PRODUCING THEREOF}
암은 남녀 모두에 있어서 최대의 단일 사망 원인이며, 암의 화학적 예방은 암의 질병률 및 사망률을 감소시키기 위해 가장 지향하는 방법 중 하나이다. 암 예방제에는 비스테로이드성 항염증 약물, 예를 들면 인도메타신, 아스피린, 피록시캠 및 설린닥이 포함되는데, 이들은 모두 COX를 억제한다. 새로운 암 예방제를 연구함에 있어서, 과거 30년에 걸쳐 수천종의 식물 샘플 및 추출물이 연구되었고, 그 추출물 중 수백종이 COX에 대해 억제 가능성이 있는 것으로 평가되었다. 1974년에, 페루산(産) 카시아 퀸콴굴라타(Cassia quinquangulata)의 추출물이 강력한 억제제로서 확인되었고 활성 성분은 레스베라트롤(3,5,4'-트리히드록시-트랜스-스틸벤)으로 확인되었다. 1997년, 사이언스지(Science Journal)에, 포도 및 기타 음식물에서 발견된 피토알렉신(phytoalexin)인 레스베라트롤을 정제하였고 이것은 발암의 주요 3단계를 표현하는 분석에서 암의 화학적 예방 활성을 갖는 것으로 나타났다고 보고되었다. 레스베라트롤은 항산화제 및 항돌연변이제로서 작용하며 II상 약물-대사 효소(항개시 활성)를 유도하는 것으로 밝혀졌으며, 항염증 효과를 매개하고 시클로옥시게나제 및 히드로퍼옥시다제 기능(항촉진 활성)을 억제하며, 암의 항진행 활성을 유도하였다. 또한, 배지 중의 카르시노겐 처리된 마우스 유선에서 전암단계 병변의 성장을 억제하고 마우스의 피부암 모델에서 종양 형성을 억제하였다[Jang, M. S., Science, 275:218-220, 1997]. 이러한 데이터와 전 세계의 다수의 다른 과학자들은 음식물에 들어있는 일반 성분인 레스베라트롤이 인체에 있어서 암의 강력한 화학예방제로서의 연구에 가치가 있음을 현재 강력하게 주장하고 있다.
알콜, 심혈관 질환 및 프렌치 파라독스(French paradox)는 지난 20년 동안 전 세계의 의과학 위원회에 의해 맹렬히 연구 추적되었다. 그 기간 동안의 수많은 연구 결과, 알콜 섭취량과 허혈성 심장 질환이 반비례 관계 또는 U-형 곡선 중 하나의 관계를 나타내는데, 어떤 종류의 알콜이든 1일 2회 동일량을 마시는 것은 마시지 않은 경우에 비해 심장 질환의 발생률 감소와 관련이 있는 한편, 음주량이 많으면 경색 및 발작의 위험이 증가하는 결과를 가져오는 것으로 밝혀졌다. 대부분의 알콜성 음료의 심장 보호 효과는 고밀도 지단백질 및 혈소판 응고를 방지하고 섬유소 분해를 증가시키는 알콜의 성능에 기인하는 것으로 생각되나, 적색 포도주에는 더 증가된 유효한 효과가 있다. 적색 포도주의 특이한 심장 보호 효과는 백색 포도주(샴페인은 제외)에서는 최소인 플라보노이드 및 스틸베노이드의 활성에 있다. 연구된 가장 우수한 플라보노이드는 레스베라트롤 및 퀘르세틴(quercetin)인데, 이들은 알파-토코페롤보다도 더 강력한 항산화성을 제공한다. 포도 액즙(juice)은 적색 포도주와 동일 부피로 절반 정도 분량의 플라보노이드를 함유한다. 그러나, 피토알렉신인 레스베라트롤은 미생물 병원체에 의해 공격을 받거나 감염되지 않으면 포도에서는 통상적으로 생성되지 않는다.
레스베라트롤은 피토알렉신으로서, 31개의 속 및 12개의 과에 걸쳐 분포하는 72종 이상의 식물에 의해 생성된다. 레스베라트롤을 생성하는 가장 우수한 식물은 포도와 땅콩이다. 미국 및 특히 독일의 대학들은 상기 2종의 식물에서의 식물-병원체 상호관계를 열성적으로 연구한 바 있다. 대형 화학 및 제약 회사인 바이엘 아게(Bayer AG)는 상기 피토알렉신에 대한 적극적인 지원활동과 연구활동을 행하였다. 이들은 레스베라트롤(피토알렉신)의 생성에 관계된 유전자(스틸벤 신타제)를 분리해 내었고, 형질전환 식물에서 발현될 때 레스베라트롤은 식물에 대한 병원체의 공격에 대해 저항성을 증가시킬 수 있음을 밝혀 내었다. 바이엘은 또한 그들이 분리해 낸 포도 스틸벤 신타제 유전자에 대한 특허들을 출원하였다. 피셔[Fischer R.; Plant J. 11(3):489-498, 1997]는 플랜트지(The Plant Journal)의 한 논문에서, 형질전환 담배에서의 스틸벤 신타제 유전자의 과발현은 열매를 맺지 못하는 화분(공동 전구체 기질 상에서의 칼콘 신타제와 스틸벤 신타제 간의 경쟁반응에 기인함)을 유도할 수 있다고 공표하였다.
현재, 캐나다의 한 회사(PharmaScience)는 화학적으로 합성되는 것을 특허청구한 분말 형태의 레스베라트롤을 판매하고 있다. 상품명은 "Resverin"이다. 이들은 매우 높은 가격에 소량씩만을 공급할 수 있다. 또한, 과거 수년 동안, 레스베라트롤은 피토에스트로겐(phytoestrogen)이라고 발표한 보고서도 다수 있다. 따라서, 레스베라트롤은 모의 에스트로겐 활성에도 연루되어 있는데, 즉 비스테로이드성 에스트로겐 보충 작용을 할 수 있으며 골다공증을 예방할 수 있다.
그러한 스틸벤의 항산화성 및 항돌연변이성의 이점을 타진해 보는 데 있어서의 어려운 점 중 하나는, 그들이 피토알렉신인 경우도 종종 있기 때문에, 유전자가 식물에 천연적으로 존재하더라도, 감염되거나 상처 입은 식물에서만 발견되고 건강한 식물에서는 발견되지 않는다는 점이다. 즉, 예를 들면 포도가 스틸벤 신타제(STS) 유전자와 활성 STS 효소를 갖고 있지만, 레스베라트롤은 신선하고 건강한 포도에서는 통상적으로 발견되지 않기 때문에, 소비자들이 먹는 포도에서는 일반적으로 그러한 이점을 취할 수 없다. 따라서, 목적하는 1종 이상의 스틸벤을 구성적 수준의 고농도로 함유하는 식물을 생산할 필요가 있다.
(발명의 개요)
따라서, 본 발명의 일 실시 형태는 1종 이상의 스틸벤 신타제(STS) 유전자 작제물이 그 내부에 형질전환되어 있고, 형질전환 STS 효소에 의해 합성된 대응 스틸벤이 구성적 수준으로 생산되는 형질전환 식물이다. 다른 실시 형태에서, 형질전환 식물의 수정 및 생리적 성장은 특정의 스틸벤 발현 범위의 클론을 선택함으로써 제어할 수 있다. 식물은 식용 부분에서 고농도의 형질전환 STS 전구체를 천연적으로 생성하는 통상의 야채가 바람직하다. 식물은 보통은 날로 먹지만 필요에 따라 조리할 수 있는 잎 모양의 야채가 더 바람직하다. 바람직한 STS 유전자는 레스베라트롤 신타제(RS)이다. 레스베라트롤 신타제 유전자의 형질전환을 위해 적합한 수용체(recipient) 식물의 일례는 붉은 잎상추(Lactura Sativa)이다. 붉은 잎상추는 또한 붉은 상추로 표현하기도 한다. 본 발명에 의한 수용체 식물의 다른 예에는 유색 야채 및 과일, 예를 들면 수박, 딸기, 시금치, 붉은 배추, 붉은 사탕수수가 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
즉, 다른 실시 형태에 의하면, 본 발명은 1종 이상의 레스베라트롤 신타제(RS) 유전자 작제물이 그 내부에 형질전환되어 있고, 형질전환 RS 효소에 의해 합성된 대응 레스베라트롤이 구성적 수준으로 생산되는 형질전환 식물이다. 식물은 붉은 잎상추가 바람직하다.
또 다른 실시 형태에 의하면, 본 발명은 형질전환 식물을 일부 포함하는 식용 조성물에 관한 것으로, 한 구체예는 그러한 형질전환 식물로부터 개발된 것으로 그것의 액즙을 포함하는 음료이다. 즉, 이 구체예에 바람직한 식물은 음료로 가공될 형질전환 레스베라트롤 함유 액즙을 충분히 다량 생산하는 것이다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 형질전환 레스베라트롤을 함유하는 건조 야채 및 과일을 제공한다. 이 구체예에서, 식물의 식용 부분은 임의량의 유체를 함유할 수 있다. 다른 구체예에서, 형질전환 식물로부터의 레스베라트롤을 함유하는 식물 추출물을 생산할 수 있다. 그 추출물은 농축 형태 또는 비농축 형태, 예컨대 분말 형태일 수 있다.
다른 실시 형태에 의하면, 본 발명은 그 내부에 형질전환된 특정 형질전환 STS 효소를 함유하는 건강한 형질전환 식물을 생산하는 방법이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법을 이용하여 얻은 형질전환 식물은 정상적인 생리적 성장을 유지하면서 구성적 수준의 고농도 형질전환 레스베라트롤을 더 함유한다. 그 방법은, (1) 고농도의 형질전환 STS 효소 전구체를 함유하는 수용체 식물을 선택하는 단계, (2) STS 효소를 암호화하고 수용체 식물에서의 상기 STS 효소의 구성적 발현에 적합한 프로모터를 구비하는 STS 유전자 또는 STS 유전자의 일부를 포함하는 유전자 벡터를 제공하는 단계, (3) 유전자 벡터를 수용체 식물에 형질전환시키는 단계, 및 (4) 구성적 수준의 고농도 스틸벤을 함유하는 형질전환 식물을 선택하여 성장시키는 단계를 포함한다.
내생성 스틸벤 신타제를 검사하기 위해서, 공지된 STS 유전자의 보존 영역에 따라 작제한 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용하고, 후보 수용체 식물의 게놈에 대해 서던 블롯 분석을 수행할 수 있다.
전구체 농도의 분석을 위해서는, 생화학 테스트, 예컨대 HPLC를 이용할 수 있다. 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA는 RS와 기타 스틸벤 신타제 효소에 공통된 2개의 전구체이다. 또한, 높은 전구체 농도는 동일한 생화학 경로의 다른 중간체의 농도, 예컨대 천연 상태의 식물의 "붉기" 외관으로부터 추정할 수 있다. "붉기"는 안토시아닌의 축적에 기인하는 것이며, 안토시아닌의 중간체는 공지의 RS 전구체이다.
유전자 벡터의 STS 유전자는 적당한 STS 유전자를 함유하는 식물로부터 분리된 mRNA 또는 게놈성 DNA로부터 얻어진 cDNA일 수 있다. 목적하는 스틸벤을 합성할 수 있는 임의의 식물은 후보 공여체(donor) 식물일 수 있다. 목적하는 STS 유전자 또는 STS 유전자의 cDNA는 공지의 STS 유전자의 보존 영역과 상동성인 올리고프라이머를 사용하여 얻을 수 있다. 분리된 STS DNA는, 수용체 식물에서 삽입 STS DNA의 구성적 발현을 유발할 수 있는 통상의 프로모터 및 통상의 선택성 마커(예컨대, 항생작용성 내성 유전자)를 사용하여 통상의 유전자 벡터에 클로닝시킬 수 있다.
상기 방법의 특히 바람직한 구체예에서, 유전자 벡터는 RS 유전자를 암호화하여 구성적 수준의 고농도 형질전환 레스베라트롤을 형질전환 식물에서 발현시키는 RS 유전자 또는 RS 유전자의 일부를 함유한다. 형질전환 RS 효소로 유용한 전구체는 안토시아닌 생산을 위해서 비형질전환 식물에 의해 천연적으로 이용된다. 수용체 식물은 적색을 띠는 종으로서, 적색은 천연 발생 안토시아닌 및 그 전구체가 고농도라는 증거이다.
다른 바람직한 구체예에서, 수용체 식물은 조직 배양법에 의해 재생시킬 수 있으며, 전구체 농도는 유합조직(callus)을 분석하여 확인한다. 구성적 수준의 고농도로 형질전환 레스베라트롤 신타제 효소의 전구체를 발현하는 것으로 밝혀진 유합조직 및 묘목이 선택된다. 이렇게 함으로써 형질전환 식물(형질전환 RS 효소를 발현하기 시작하고 그에 따라 형질전환 스틸벤의 생합성을 위한 전구체가 고갈되기 시작한 것)이 성숙한 식물로 성장하더라도 조직 배양 중에 우수한 건강 상태를 유지할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 STS 유전자는 다양한 STS 효소를 암호화하는 유전자류를 의미한다. STS 효소는 스틸벤류의 다른 구성원의 합성에 촉매 작용을 한다. 레스베라트롤 신타제(RS) 유전자는 레스베라트롤 신타제 효소(RS 효소)를 암호화하는 STS 유전자류의 한 특정 구성원을 나타낸다. RS 효소는 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA의 3,4',5-트리히드록시-트랜스-스틸벤(레스베라트롤)로의 전환에 촉매 작용을 한다.
붉기는 당업자들에게 일반적으로 용인되고 공지되어 있는 일반적 방법으로 결정하는데, 육안으로 관찰할 수 있다. "적색"으로 간주되는 식물의 예에는 붉은 잎상추(Lactuca sativa), 붉은 시금치(Amaranthus species), 붉은 배추(Brassica oleracea), 붉은 사탕무(Beta vulgaris), 자주색 배추, 근대 뿌리, 붉은 아마란스, 붉은 사탕 줄기, 붉은 시금치(red spinach), 붉은 수박(Citrullus lanatus), 붉은 딸기(Fragaria species), 나무딸기가 포함된다.
본 명세서에 사용된 "건강한"이란 표현은 외관, 예컨대 크기 및 색깔에 따라 관찰했을 때 그 종의 정상 범위에 드는 일반적 건강 상태를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "수정"이란 용어는 생육 가능한 종자를 형성하는 종의 능력을 의미한다.
본 발명은 형질전환 식물 및 식물 재료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 식물에서 레스베라트롤(resveratrol) 및 기타 스틸벤(stilbene)을 생산하는 것에 관한 것이다.
도 1은 레스베라트롤 및 나링게닌 칼콘(naringenin chalcone)의 생합성 경로의 최종 단계를 예시한다.
도 2A-2D는 R1 RS 유전자(도 2A), R65 RS 유전자(도 2B), R14 RS 유전자(도 2C) 및 R17 RS 유전자(도 2D)를 가진 플라스미드 pBI 121의 유전자 지도이다.
도 3은 (a) 비티스 비니페라 종(Vitis viniferacv.) 옵티마 RS(pSV21), (b) 아라키스 히포가에(Arachis hypogaea) RS(아크레솔; arqresol), (c) 피너스 실베스트리스(Pinus sylvestris) STS(PSTS1) 및 (d) 팔레놉시스 종(Phalenopsis sp.) BS(pBibsy811)의 하이드로패시(Hydropathy) 곡선이다.
도 4A-4D는 ClustralW를 사용하여 정렬시킨 4종의 기존 포도 RS cDNA, 즉 pSV21, pSV25, pSV368 및 VVLSTS를 예시한다. 전장 비티스 비니페라 종 레드 플레임(Red Flame) RS 유전자를 분리하는 데 사용된 프라이머는 박스(box) 처리한 부분으로 표시한다.
도 5는 (a) 포도 RS(pSV21, pSV25, pSV368 및 VVLSTS), (b) 포도 RS 인트론(Vst1-1 및 Vst2-1), (c) 비티스 비니페라 종 레드 플레임 cDNA(R1, R5 및 R8), (d) 비티스 비니페라 종 레드 플레임 gDNA(G13, G14 및 G17)의 제한 지도이다. 박스 처리한 부분은 인트론이다.
도 6은 추정 포도 RS cDNA R6, gDNA G14 및 포도 RS VVLSTS 간의 DNA 정렬이다.
도 7은 추정 RS cDNA R12, gDNA G13 및 포도 RS pSV21 간의 DNA 정렬이다.
도 8A-8E는 대조군(도 8A)과 플라스미드 G14(도 8B), G17(도 8C), R1(도 8D) 및 R15(도 8E)를 함유하는 형질전환 세포주에서의 RV의 분석에 대한 HPLC 용출 프로파일이다. RV 피크는 화살표로 표시한다.
다음은 실시예를 이용하여 본 발명의 다양한 실시 형태를 예시한다.
(붉은 잎상추에서의 레스베라트롤의 생산)
이 실시예에서 클로닝 및 형질전환을 위한 STS 유전자 패밀리의 구성원으로서 사용한 스틸벤 신타제 유전자는 비티스 비니페라 종 레드 플레임으로부터의 레스베라트롤 신타제(RS) 유전자이다. 설명 및 이해가 용이하도록, 형질전환 RS 효소에 의해 생산된 RV와 형질전환 STS 효소에 의해 생산된 스틸벤은 각각 형질전환 RV 및 형질전환 스틸벤으로 표현한다. 이 실시예에서는 RS 유전자의 수용체 식물로서 붉은 잎상추를 선택하는데, 그 이유는, 붉은 잎상추가 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA가 전구체인 안토시아닌 안료를 고농도로 함유하기 때문이다. 예를 들면, 나링게닌 칼콘은 안토시아닌 생합성 경로의 중간체이고, 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA가 전구체이다. 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA는 또한 도 1에 도시된 바와 같이 레스베라트롤(RV)의 공지된 전구체이다. 즉, 형질전환된 상추에서 RS에 의해 RV로 전환되는 전구체가 다수 존재한다. 또한, 상추 종에 대해, 다양한 공지의 RV 유전자의 상동성 영역을 표현하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 하이브리드화시켜서 그것의 천연 게놈에 RV-관련 유전자가 존재하는지를 테스트하였다. 서던 블롯 분석 결과, 하이브리드화가 일어나지 않은 것으로 나타났는데, 이것은, 상추에는 상추를 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 적합한 수용체 식물이 될 수 있게 하는 내생성 RS 유전자가 없다는 증거이다. 결과적으로, 그와 같은 구성적 수준의 고농도 RV는 형질전환 붉은 잎상추에서 얻을 수 있다.
착수를 위해, 약간의 붉은 포도(cultivar Red Flame)를 시장에서 구입하였다. 레스베라트롤 신타제 전사체의 전사를 위해 포도에 UV를 10분간 조사하고 12시간 기다린 다음, UV 조사된 포도로부터 mRNA를 추출하였다. RS 유전자의 5' 및 3' 올리고프라이머를 제조하고 역전사 PCR을 통해 유전자의 cDNA 서열을 알아 내었다. 레드 플레임 포도의 게놈성 DNA를 추출하고, 다시 PCR을 통해 게놈성 RS 유전자(1개의 인트론을 가진 것)를 분리하였다. RS는 복합 유전자류이다. 그것들을 모두 지도화하고, 서열화하여 특성 규명하였다.
2개의 전장 cDNA 클론(RI 및 R65로 명명)과 2개의 게놈성 클론(G14 및 G17로 명명)을 선택하고, 이들을 콜리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosiac Virus; CaMv) 35S 프로모터에 의해 작동된 발현 벡터(pBI 121)에 연결시켰다. 클론 R65, G14 및 G17은 BamH1 및 Sac1 제한 부위를 통해 pBI 121에 연결시키는 한편, 클론 R1은 BamH1 및 EcoR1 제한 부위를 통해 pBI 121에 연결시켰다. 이어서 이 플라스미드 발현 벡터를 아그로박테리아(Agrobacterium; 숙주 LBA4404)에 형질전환시켰다. RS 유전자를 포함하는 pBI 121를 보유하는 아그로박테리아를 카나마이신 저항성 선택법을 이용하여 선택하였다. 이렇게 해서, 도 2A-2D에 도시된 바와 같은 4개의 상이한 작제물을 보유하는 4개의 상이한 아그로박테리아 콜로니를 얻었다.
동시에, 5종의 상이한 붉은 잎상추를 선별하고, 떡잎 외식편으로부터의 조직 배양물에서의 재생 가능성을 평가하였다. 레드 샐러드 보울(Red Salad Bowl)종의붉은 잎상추를 선택하였는데, 그 이유는 본 발명자들의 조직 배양 프로토콜에서 얻은 묘목 중 가장 높은 비율로 가장 빠르게 재생하는 것으로 나타났기 때문이다.
실험을 반복하되, 떡잎을 2 ㎟ 면적의 네모 모양으로 잘라 아그로박테리아에서 30분간 배양하였다. 이어서 배양물을 세정하였으며, 레드 샐러드 보울에 대해 본 발명자들이 설정한 조직 배양 프로토콜은 다음과 같았다. 새싹(shoot) 유도 배지 중의 농도가 150 ㎎/ℓ인 카나마이신을 사용하여 재생된 묘목을 선택하였다. 이들 묘목이 뿌리를 내리게 하고, 옮겨 심은 다음, 30 내지 35일간 성장시킨 후, HPLC를 사용하여 레스베라트롤을 정량 분석하기 위한 RNA, DNA 및 추출물을 위해 잎을 수확하였다.
노던 앤 서던(Northern and Southern) 분석 결과, RS 유전자(R1, R65, G14 및 G17)가 발현된 것으로 나타났다. 레스베라트롤 분석을 위한 보고된 프로토콜에 따라 잎 샘플의 유기 용매 추출을 수행하고, HPLC를 사용하여 분석하였으며, 시그마 케미칼스(Sigma chemicals)에서 구입한 순수한 레스베라트롤 샘플을 비교 표준으로서 사용하였다.
유사하게 형질전환시키고, 선택한 담배 식물을 사용하는 실험을 수행하여 정상 녹색 식물의 양성 대조군으로 제공하였다.
HPLC 정량 분석 데이터는 형질전환된 붉은 잎상추가 담배(최대 약 0.36 ㎍/g(신선한 잎의 중량))와는 대조적으로 구성적 수준의 고농도 레스베라트롤(4 ㎍/g(신선한 잎의 중량) 이상)을 생산할 수 있음을 나타낸다. 형질전환된 붉은 잎상추는 건조 중량을 사용하여 비교할 때 형질전환 담배에 비해 10배까지의 레스베라트롤을 생산할 수 있다. 형질전환되지 않은 식물은 검출 가능한 레스베라트롤이 존재하지 않는 것으로 나타났다. 형질전환된 붉은 잎상추의 안토시아닌 농도를 정량 분석하여 얻은 중요한 결과 및 데이터는 비형질전환 대조군과 비교할 때 안토시아닌 농도가 반으로 감소한다는 것이다. 이 데이터는 전구체 중 일부, 즉 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA가 RS에 의한 레스베라트롤 생산에 전용되었고, 본 발명자들이 야채에서 레스베라트롤 신타제(RS) 유전자를 과발현시켰다면 붉은 잎상추의 레스베라트롤 농도를 더 높은 수준으로 상승시켰을 가능성도 있음을 보여준다. 과발현 방법에는 더 강한 구성적 프로모터 또는 이중 프로모토의 사용, 더 효율적인 번역을 위한 비루스성 오메가 서열의 사용, 및 액틴 프로모터와 같은 다른 프로모터의 사용이 포함된다.
이 시스템은 또한 고농도 레스베라트롤 생산을 위해 다른 색깔의 식물 및 과일에도 사용할 수 있는 것으로 보인다. 우리가 야채를 매일 100 g 먹는다고 가정하면, 우리의 몸에는 매일 ＞400 ㎍의 레스베라트롤이 공급될 것이다. 따라서, 본 발명은 암, 심혈관 질환 및 기타 가능한 질환에 대한 화학적 예방능을 가진 차세대 식물성 기능 식품의 길을 열 수 있을 것으로 예상된다.
다음은 형질전환 붉은 잎상추를 얻는 데 사용된 상세한 절차를 설명한다.
(수용체 식물 재료의 선택 및 설정)
4종의 붉은 잎상추, 즉 락투카 사티바 종 카나스타(Lactuca sativacv. Canasta), 롤로 롯사(Lollo Rossa), 레드 샐러드 보울(Red Salad Bowl: 네덜란드의Novatis seeds B.V) 및 레드 라피드(Red Rapid; 대만의 Known-you Seeds Co.)에 대해 붉기 및 조직 배양물에서의 재생능을 테스트하였다.
재생의 전 공정은 문헌[Curtis 등, 1995, Methods in Molecular Biology, Vol. 44, Humana Press Inc. USA, pp. 59-70]에 기재된 것을 약간 변형시켜 수행하였다. 각 종으로부터의 종자 10개를 10% Clorox를 사용하여 10분동안 표면 멸균 처리하고 멸균 역삼투압수를 사용하여 3회 세정하였다. 이어서 종자를 250 ㎖ 들이 원추형 플라스크에 들어있는 MS+B5 배지(Sigma Catalogue No. M-5519)에 파종하고 23±2℃, 18 μmol/s/㎡(일광 형광 튜브) 광강도의 16시간 광주기를 포함하여 7일간 성장시켰다.
7일 성장한 접종물의 떡잎을 절제하고, 떡잎의 엽두(apices)를 제거하여 잎자루(petiole)를 손상되지 않게 남겼다. 바늘을 사용하여, 배축 표면을 떡잎의 엽맥을 따라 반복해서 찔렀다. 떡잎을 액체 UM 배지(4.71 g/ℓ MS 염 및 비타민, 30 g/ℓ 수크로스, 2 g/ℓ 카제인 가수분해물, 2 ㎎/ℓ 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D, Sigma), 0.25 ㎎/ℓ 키네틴, 9.9 ㎎/ℓ 티아민 HCl, 9.5 ㎎/ℓ피리독신-HCl, 4.5 ㎎/ℓ 니코틴산, 5.5 g/ℓ 피타겔, pH 5.8)에, 그것의 상처 난 표면이 배지와 접촉하도록 10분동안 부유시켰다. 떡잎을 꺼내어 UM 아가 배지에 침적시켰다. 외식편을 종자의 발아 조건과 동일한 조건하에 2일간 배양하였다.
UM 고체 배지에서 2일 후, 배축 표면이 SI 아가 배지와 접촉하도록 떡잎을 SI 아가 배지(4.71 g/ℓ MS 염 및 비타민, 30 g/ℓ 수크로스, 0.04 ㎎/ℓ NAA(나프탈렌 아세트산), 0.5 ㎎/ℓ 벤질 아미노푸린(BAP), 500 ㎎/ℓ 카르베이실린, 100 ㎎/ℓ 세포탁심, 150 ㎎/ℓ 카나마이신 설페이트, 5.5 g/ℓ 피타겔, pH 5.8)로 옮겼다. 떡잎을 종자의 발아 조건과 같은 조건으로 배양하고 21일간 매일 새로운 SI 아가 배지로 계대배양하였다.
49일 후, 유합조직 및 새싹이 생성된 외식편을 0.11%(w/v) 2[N-모르폴리노]에탄설폰산(MES)을 함유하는 SI 아가 배지 50 ㎖로 옮겼다.
약 1 ㎝ 높이의 새싹을 발근(rooting) 아가 배지(4.71 g/ℓ MS 염 및 비타민, 30 g/ℓ 수크로스, 0.04 ㎎/ℓ NAA(나프탈렌 아세트산), 150 ㎎/ℓ 카나마이신 설페이트, 5.5 g/ℓ 피타겔, pH 5.8) 50 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 들이 원추형 플라스크로 옮겼다. 새싹은 종자의 발아 조건과 동일한 조건에서 배양하였다.
(포도로부터의 STS 유전자의 분리 및 유전자 벡터의 작제)
(식물 재료)
시판되는 포도덩굴 비티스 종 레드 플레임의 성숙한 과일을 포도덩굴 RS 유전자의 분리를 위한 식물 재료로서 사용하였다.
(총 RNA 및 게놈성 DNA 추출)
비티스 종 레드 플레임 피부 조직 0.2 g을 막자 사발과 막자를 사용하여 액체 질소 중에서 분쇄하였다. 문헌[Knapp and Chandlee, RNA/DNA Mini-Prep from a Single Sample of Orchid Tissue. Bio Techniques, 21:54-56]에 기재된 것을 약간변형시킨 방법을 이용하여 총 RNA 및 gDNA를 추출하였다. 3% CTAB; 2% PVP; 1.42M NaCl; 20 mM EDTA, pH 8.0; 100 mM Tris, pH 8.0 및 5 mM 아스코르브산을 함유하는 추출 완충액 2 ㎖를 사용하여 비티스 종 레드 플레임 피부 조직의 총 RNA 및 gDNA를 추출하였다. 샘플을 65℃에서 15분간 가열한 후, 클로로포름으로 추출하여 단백질성 물질을 제거하였다. 1/5 부피의 5% CTAB(5% CTAB 및 0.7M NaCl)를 샘플의 수상에 첨가하여 폴리사카라이드를 제거하고 65℃에서 15분간 가열하였다. 다시 클로로포름 추출을 수행하였다. 2배 부피의 얼음 냉각된 100% EtOH를 샘플의 수상에 첨가하고 -20℃에서 15분간 배양하였다. Eppendorf(등록상표) 5410C 냉장 원심분리기를 사용하여 실온에서 11,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후, 총 RNA 및 gDNA를 펠릿화하였다. 펠릿을 70% EtOH로 세정하고 Eppendorf(등록상표) 농축기로 건조시킨 후, 50 ㎕ TE(10 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 1 mM EDTA, pH 8.0)에 용해시켰다. 총 RNA 또는 gDNA 3 ㎕를 분리하였고, 각각 0.25 ㎍의 람다 DNA/HindIII 및 phiX174 DNA/HaeIII 마커와 함께 부하 완충액(1X TBE 중의 0.025% 브로모페놀 블루, 0.025% 크실렌 시아놀, 30% 글리세롤) 1 ㎕를 1% 아가로스 겔에 부하하였다. 수평 겔 전기영동을 100V에서 1/2시간동안 수행하였다. EtBr 스테인 및 Stratagene's Eagle-Eye II Junior 서류작성 시스템을 사용하여 추출된 총 RNA 또는 gDNA의 양 및 품질을 관찰 및 계산하였다.
(프라이머 결정)
비티스 종 옵티마(Optima) STS(pSV21, pSV25 및 pSV368), 비티스 종 람브루스코아 포글리아 프라스타글리아타(Vitiscv. Lamburuscoa Foglia Frastagliata) STS(VVLSTS), 팔레놉시스 종 BS(pBibsy811 및 pBibsy212), 아라키스 히포가에(땅콩) STS(아크레솔 및 a00769) 및 피너스 실베스트리스(구주 적송) STS(PSTS1 및 PSTS2)의 기존의 모든 유전자 서열은 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 웹사이트의 진뱅크(GenBank)에서 얻었다. 미국 텍사스주 휴스턴에 소재하는 베일러 컬리지 오브 메디신, 휴먼 게놈 센터(Human Genome Center, Baylor College of Medicine)로부터 입수한 BCM 서치 런쳐(Search Launcher)의 ClustalW 다중 서열 정렬(Multiple Sequence Alignment)을 이용하여 모든 상동성 조사를 수행하였다.
전장 포도덩굴 RS 유전자의 분리에 사용된 프라이머는 도 4A-4D에 표시된 바와 같은 기존의 pSV21, pSV25, pSV368(Melchior and Kindl, Optima. Arch. Biochem. and Biophy. 288:552-557, 1991) 및 VVSLTS(Spavoli F. Plant Mol. Biol. 24:743-755, 1994)의 다중 정렬에 의해 결정하였다.
프라이머 서열 및 프라이머의 융점을 결정한 후, 이들은 깁코 BRL 커스텀 올리고뉴클레오티드 신테시스 서비스(Gibco BRL Custom Oligonucleotide Synthesis, L.T.I., U.S.A.)에 의해 상업적으로 합성되었다.
(총 RNA의 역전사)
UV-유도 비티스 종 레드 플레임 피부 총 RNA 잎 총 RNA 1㎍을 주형으로서 사용하여 65℃에서 10분간 3' 프라이머-35GSTS2a를 어닐링시켰다. 프라이머를 어닐링시킨 후, 총 RNA를 최종 부피 50 ㎕로 200 units/㎕ Superscript(등록상표)II 역전사효소(Gibco BRL, LTI, U.S.A), Superscript II(등록상표) 1X 반응 완충액, 10 mM DTT 및 200 μM dNTP를 사용하여 역전사시켰다. 역전사는 42℃에서 1시간동안 퍼킨 엘머 진앰프(Perkin Elmer GeneAmp) PCR 시스템 2400으로 수행한 후, Superscript(등록상표)II 역전사효소는 70℃에서 15분간 불활성화시켰다.
cDNA는 Tris-완충처리된 페놀 및 클로로포름:이소아밀 알콜(24:1) 추출을 통해 정제하였다. 이어서 수상을 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨과 2.5배 부피의 얼음 냉각된 100% EtOH로 침전시켰다. 펠릿을 20 ㎕의 멸균 밀리-Q 수(milli-Q water)에 용해시켰다.
(cDNA 및 gDNA의 폴리머라제 연쇄 반응)
비티스 종 레드 플레임 피부의 cDNA 20 ㎕ 및 gDNA 20 ng을 퍼킨 엘머 진앰프 PCR 시스템 2400에서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. 총 부피 50 ㎕의 PCR 반응물은 1X 테르무스 플라부스(Thermus flavus: Tfl)반응 완충액(Promega, U.S.A.) 중의 5 units/㎕TflDNA 폴리머라제, 각각 200 ng/㎕의 5' 프라이머 35GSTS1 및 3' 프라이머 35GSTS2a, 200 μM dNTP, 1.5 mM 황산마그네슘을 포함하고 나머지를 멸균 밀리-Q 수로 채운 것이었다.
포도덩쿨 RS 유전자의 PCR 증폭은 92℃에서 5분간 고정시켜 수행한 후, 92℃에서 1분간의 변성 주기 40회, 55℃에서 2분간의 어닐링 주기, 그리고 72℃에서 2분간의 연장 주기를 수행하였다. 72℃에서 6분간 더 연장시켜 PCR을 종결하였다.
PCR 반응물 5 ㎕를 분리하고 1% 아가로스 중에서 수평 겔 전기영동으로 정량 분석하였다. 목적하는 MW 단편의 존재를 결정한 후, 나머지 PCR 반응물 45 ㎕를 1/10 부피의 10X STE(10 mM Tris.Cl, pH 8.0; 100 mM NaCl 및 1 mM EDTA, pH 8.0), 1/10 부피의 4M NH4OAc 및 2.5배 부피의 얼음 냉각된 100% EtOH로 선택적 침전시켰다. pGEM-T(+) 벡터에 연결시키기 위해 펠릿을 TE에 용해시켰다.
(pGEM-T(+)에의 클로닝)
비티스 종 레드 플레임 피부의 cDNA 및 gDNA PCR 생성물을 pGEM-T(+)(등록상표) 벡터 시스템 키트(Promega, U.S.A)를 사용하여 pGEM-T(+) 벡터에 클로닝하였다. 1:3 비율(벡터:삽입체)의 cDNA 및 gDNA PCR 생성물을 총 부피 10 ㎕로 3 units/㎕ T4 DNA 리가제, T4 DNA 리가제 1X 완충액을 사용하여 pGEM-T(+) 벡터에 연결시키고 16℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
연결 후, 연결반응 혼합물 10 ㎕를 XL1-블루 항체반응성 세포(Stratagene, U.S.A) 200 ㎕에 형질전환시켰다. 이들을 얼음에서 10분간, 37℃에서 5분간, 다시 얼음에서 1분간 놓아두었다. 순수한 LB 브로스 1 ㎖를 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 1시간의 회수 시간 후에, 11,000 rpm으로 30초간 원심분리하여 세포를 수집하고, 순수 LB 브로스 50 ㎕에 재현탁하였다. 50 ㎕를 사용하여 100 ㎍/㎖ 암피실린 농도로 1.5% LB 아가로스 평판에 펴 발랐다. 이 평판을 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 미니프렙(miniprep) 처리 후, 제조자가 추천하는 조건에 따라 제한 효소SalI및ClaI(NEB Biolabs, U.S.A.)를 사용하여 정확한 크기의 삽입체를 함유한 양성 클론을 선택하였다.
(추정 비티스 종 레드 플레임 STS 유전자의 특성)
추정 비티스 종 레드 플레임 RS 유전자를 분리한 후, 이들을 제한 효소 지도화(도 5), 서열 분석(도 6 및 도 7) 및 히드로패시 곡선 플로팅(도 3)에 의해 특성 규명하였다.
(제한 효소 지도화)
기존의 덩굴포도 RS 유전자(pSV21, pSV25, pSV368 및 VVLSTS)의 제한 효소 지도화는 웹사이트 Webcutter 2.0을 사용하여 확인하였다.
얻어진 제한 효소 지도에 의하면,PstI, KpnI및HindIII(NEB, U.S.A.)를 사용하여 비티스 종 레드 플레임 RS 유전자의 추정 클론을 제조자가 추천하는 조건에서 분해하였다. 분해 후, 100V에서 작동하는 수평 겔 전기영동을 이용하여 1% 아가로스 겔에서 45분간 반응물을 분석하였다. Eagle-Eye II Junior 서류작성 시스템(Stratagene, U.S.A.)을 사용하여 겔을 관찰하였다.
(서열 분석)
추정 비티스 종 레드 플레임 RS 유전자의 서열은 디데옥시 뉴클레오티드 연쇄 말단화법을 이용하여 분석하였다. 포워드 프라이머(ssDNA 서열화) 및 리버스 프라이머(dsDNA 서열화)에 의한 서열화 반응에 Sequenase(등록상표) 버전 2 서열화 키트(Amersham-Pharmacia, 스웨덴)를 사용하였다. 35S-dATP(NEN, U.S.A.)를 사용하여 반응물을 표지화하였다. 서열화 장치 S2(L.T.I., INC., U.S.A.)를 사용하여 50W에서 6% 폴리아크릴아미드 겔을 작동시켰다. Kodax 증강 스크린 카셋에서 Kodax MR Bio-Max 필름에 대략 16시간동안 노출시켜서 방사선 사진을 찍었다. 이어서 필름을 Kodax 현상제 및 Kodax 고정제로 현상하였다. 서열은 수동으로 판독하였다. 클론 R65의 5' 서열의 처음 300개의 염기는 그것이 포도 RS 유전자의 PSV21 군에 속하는 것임을 나타냈다.
(하이드로패시 곡선)
미국 펜실베니아 주립대학의 생화학부 및 분자생물학부에 의해 운영되는 하이드로패시 플롯 웹사이트를 이용하여 비티스 종 옵티마 RS(pSV21), 팔레놉시스 종 BS(pBibsy811), 아라키스 히포가에 RS(아크레솔) 및 피너스 실베스트리스 STS(PSTS1)에 대한 하이드로패시 곡선을 플롯팅하였다. 하이드로패시 곡선은 카이트와 돌리틀(Kyte and Dolittle)의 방법에 기초하여 플로팅하였다.
(비티스 종 레드 프레임 RS 유전자의 발현 벡터에의 클로닝)
비티스 종 레드 프레임 RS 유전자의 4개의 클론을 발현 벡터 pBI 121에 클로닝하였다. 클론 R65, G14 및 G17은 BamH1 및 Sac1 제한 부위를 통해 pBI 121 벡터에 클로닝하였다. 클론 R1은 BamH1 및 EcoR1 제한 부위 각각을 통해 pBI 121에 클로닝하였다. 유전자를 구성성 CaMV 35S RNA 프로모터에 의해 작동시켰다. 클로닝된 벡터는 도 2A-도 2D에 도시되어 있다.
(RS 유전자 작제물을 함유하는 플라스미드의 아그로박테리아 LBA4404에의 형질전환)
1. 액체 배지용과 형질전환체의 평판배양 및 리스트릭(restreak) 처리를 위한 충분량의 YEP를 제조한다. 형질전환용 액체 배지 5 ㎖, 부산물용 1 ㎖, 평판용 20-40 ㎖가 필요하다.(YEP: Bacto-펩톤 10 g, Bacto-효모 추출물 10 g, NaCl 5 g; 고체 10 g/ℓ 피트아가).
2. 아그로박테리아 LBA 4404 콜로니 O/N을 YEP 2 ㎖ 중에서 28℃에서 성장시킨다.
3. 250 ㎖ 들이 예비용 플라스크에 YEP 50 ㎖를 넣고 파장 600 nm에서의 OD가 0.5 내지 1이 되도록 250 rpm에서 진탕한다.
4. 배양물을 얼음에서 5분간 냉각시킨다. ∼5,000 rpm으로 5분간 회전시킨다.
5. 상청액을 조심스럽게 경사 분리하고 0℃의 20 mM CaCl21 ㎖에 재현탁한다. 0℃에서 완전 혼합되도록 완만하게 재현탁한다.
6. 0.1 ㎖ 분량을 미리 냉각시킨 미세원침관(microfuge tube)으로 분배해 넣는다.
7. DNA 1 ㎍을 세포에 첨가하고, 완전 혼합되도록 완만하게 혼합한 후, 드라이아이스-EtOH 배스에서 동결시킨다.
8. 세포를 37℃ 배스에 5분간 놓아둔다.
9. YEP 1 ㎖를 첨가하고 2-4시간동안 완만히 진탕하면서 배양한다.
10. 미세원침관에서 4000 rpm으로 45초간 원심분리한다. 피펫 끝으로 100-200 ㎕의 배지 전부를 제거하고, 피펫팅(pipeting) 및/또는 와류 형성에 의해 세포를 나머지 배지에 재현탁하여 25 ㎍/㎖ 카나마이신으로 평판화한다. 28℃에서 배양한다. 콜로니는 2-3일 내에 나타날 것이다.
(아그로박테리아에 의한 붉은 잎상추의 형질전환)
1. 상추 종자인 바르 레드 샐러드 보울(Var Red Salad Bowl)을 10% w/v 클로록스로 10분간 표면 멸균 처리하고 깨끗한 증류수로 3회 세정한다.
2. 9 ㎝ 직경의 페트리 디쉬를 함유하는 발아 배지에서 종자를 발아시킨다(30개의 seeds/dish). 24℃에서, 18 μmol/s/㎡ 광강도의 16시간 광주기를 포함하여 배양한다.
3. 2원 벡터 pBI121 작제물(R1, R65, G14 및 G17)을 함유하는 아그로박테리아 투메파시엔스(tumefaciens) 숙주 LBA4404를, 210 rpm의 진탕기에서 50 ㎎/ℓ의 카나마이신 설페이트 및 2 ㎎/ℓ의 테트라사이클린-HCl을 함유하는 pH 7의 LB 배지에서 1일간 성장시킨다.
4. 20 ㎖ 분량의 UM 아가 배지를 9 ㎝ 직경의 페트리 디쉬에 주입하고 고화시킨다.
5. 7 ㎝ 직경의 와트만(Whatman) 여과지 1매를 액체 UM에 침지시키고 UM 아가 배지의 표면에 놓아둔다.
6. 7일 성장한 접종물로부터 떡잎을 제거하고, 잎자루를 손상되지 않게 남기되, 떡잎의 엽두는 제거한다. 가는 바늘을 사용하여 배축 면에 금을 긋는다. 외과용 메스를 사용하여, 떡잎의 표면을 가로방향으로 횡단하는 얕은 절단부(1 ㎜ 간격)를 형성한다. 떡잎을 아그로박테리아 액체 배지에 10분간 부유시킨다. 아그로박테리아를 사용하지 않는 것을 제외하고는 대조군도 유사하게 처리한다.
7. 떡잎을 제거하여 멸균 여과지로 흡입 건조시키고 준비된 UM 디쉬(디쉬당 떡잎 10개)로 옮긴다. 종자의 발아 조건과 동일한 조건 하에 2일간 배양한다.
8. 시험 평판은 다음과 같이 설정한다:
9. A. 아그로박테리아를 접종하지 않은 대조 외식편:
i. SI 배지;
ii. SI 배지 + 100 ㎎/ℓ 카나마이신 설페이트;
iii. SI 배지 + 150 ㎎/ℓ 카나마이신 설페이트.
B. 아그로박테리아를 접종한 외식편:
i. SI 배지 + 100 ㎎/ℓ 카나마이신 설페이트;
ii. SI 배지 + 150 ㎎/ℓ 카나마이신 설페이트.
10. 외식편을 SI 배지로 옮기고, 떡잎의 잎자루 단부를 약 2 ㎜ 깊이로 배지에 침적시킨다. 종자의 발아 조건과 같은 조건으로 배양하고 17일간 매일 새로운 SI 아가 배지로 계대배양한다.
11. 40일 후, 유합조직과 새싹이 생성된 외식편을 각각 0.11% w/v 칼베이실린을 함유하는 SI 아가 배지 60 ㎖가 들어있는 250 ㎖ 용량의 플라스크로 옮긴다. 플라스크당 4개의 외식편을 넣고, 80 μmol/s/㎡의 고강도 노광하에 배양한다.
12. 약 1 ㎝ 높이가 되었을 때 새싹을 발근 배지로 옮기고, 80 μmol/s/㎡의 고강도 노광하에 배양한다.
13. 뿌리가 나오면, 식물을 용기에서 조심스럽게 꺼내어 아가를 세정 제거하고 그 식물을 버미큘라이트로 채워진 10 인치 용기에 이식한다. 깨끗한 폴리에틸렌 주머니에 식물을 3일간 넣어둔 다음, 그것을 꺼낸다. 이어서 식물을 충분한 햇빛 하에 성장시키고 그라비오타(Graviota) 수정기로 수정시킨다. 35일 후, 식물의 노던, 서던 분석을 수행하고, 레스베라트롤 수율 분석을 위해 HPLC 분석용 유기 용매를 사용하여 추출한다.
(형질전환 식물의 선택)
구멍을 낸 다음, 작제물을 포함하는 아그로박테리아로 떡잎을 처리하였다. 이어서 떡잎을 UM 아가 배지(∼15개의 떡잎/평판)에 침적시키고 23±2℃에서 18 μmol/s/㎡(일광 형광 튜브) 광강도의 16시간 광주기를 포함하여 2일간 배양하였다.
2일 후, 떡잎을 배축 표면이 배지와 접촉하도록 SI 아가 배지에 놓아 두었다. 전술한 조건에서 떡잎을 성장시켰다. 색깔 선택을 위해, 21일간 매일 새로운 SI 아가 배지로 떡잎을 계대배양하였다. ∼1 ㎜의 작고 붉은 색의 새싹을 제거하고 핑크색 및 녹색의 묘목을 UM 아가 배지에 2일간 놓아 두었다. 이 단계에서 붉은 색으로 변한 핑크색 및 녹색의 묘목도 제거하고, 핑크색 및 녹색이 유지된 것들을 새로운 SI 아가 배지로 계대배양하였다. 높이가 ∼1 ㎝인 식물들을 발근 아가 배지에 놓아두었다.
카나마이신 선택을 위해, 1주일간 SI 아가 배지에 놓아둔 후, 떡잎을 SI + 150 ㎍/㎖ 카나마이신 설페이트 아가 배지로 옮겼다. 4주간 매일 SI + 150 ㎍/㎖ 카나마이신 설페이트 아가 배지로 계대배양을 수행하였다.
전술한 절차를 이용하여 레드 플레임 RS 유전자를 형질전환 식물에서 생산된 형질전환 레스베라트롤과 붉은 잎상추에 연속적으로 클로닝하였다. 전술한 방법을 이용하여 얻은 결과는 다음과 같다:
(수용체 식물 재료)
4개의 재배종 락투카 사티바(Lactuca sativa)에 대해 시험관내에서 안토시아닌 농도 및 재생능을 테스트하였다. 이어서 레스베라트롤(즉, 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA) 전구체의 양을 안토시아닌 농도로부터 추정할 수 있는데, 그 이유는 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA가 이들 두 합성 경로의 공통 전구체이기 때문이다. 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA의 농도는 당업자들이 직접 결정할 수 있을 것으로 이해되며, 이것은 본 발명의 범위 내로 간주된다.
표 1은 락투카 사티바 종인 카나스타, 롤로 롯사(Lollo Rossa), 레드 래피드 및 레드 샐러드 보울에 대해, UM 배지에서 2주 후의 떡잎의 붉기, SI 배지에서 14일 후의 칼리(calli)의 색깔 및 SI 배지에서 37일 후의 재생능을 분석한 결과이다.
하기 표 1로부터, UM 배지에서 2주 후에 락투카 사비타 종 레드 샐러드 보울의 떡잎은 최대의 붉은 색을, 락투카 사비타 종 롤로 롯사의 떡잎은 최소의 붉은 색을 띠는 것으로 나타났다. 칼리는 SI 배지에서 2주 후에 형성되었고, 락투카 사티바 종 카나스타, 롤로 롯사 및 레드 라피드는 다른 색 칼리보다 밝은 녹색의 칼 리가 많았다. 락투카 사티바 종 레드 샐러드 보울의 경우, 붉은 색 칼리는 다른 색 칼리보다 더 높은 비율로 존재하였다. 락투카 사티바 종 레드 라피드 및 레드 샐러드 보울은 핑크색, 탁한 붉은 색 및 흰색의 칼리를 가졌다.
락투카 사티바 종 떡잎의 붉기 칼리 재생능
연녹색 진녹색 붉은색 핑크색 탁한 붉은색 흰색
카나스타 ++ +++ + ± - - - +
롤로 롯사 + +++ ± + - - - ++
레드 라피드 +++ +++ ± ++ + ± ± +++
레드 샐러드 보울 ++++ + + ++++ + + + ++++
주: ±는 ＜30%를 의미하고, +는 30% 내지 50%를 의미하며, ++는 50% 내지 70%를 의미하고, +++는 70% 내지 90%를 의미하며, ++++는 ＞90%를 의미한다.
옥신(auxin)인 2,4-D(2,4-디클로로페녹시아세트산)은 안토시아닌의 형성을 유발한다. 다량의 안토시아닌 생산은 형질전환에 사용할 재배종의 선택 기준 중 하나이다. 안토시아닌 농도가 높다는 것은, 더 많은 유용한 기질(4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA)이 존재함을 의미하는 것이다. 따라서, STS 유전자가 붉은 잎상추에형질전환되면, 유전자 생성물은 사용하기에 충분한 기질을 갖는다. 이것은 형질전환 식물의 색깔 선택을 용이하게 하는데, 떡잎의 비형질전환 부분이 붉은 색이면 연핑크색 또는 진핑크색으로의 색깔 변화가 더 우세할 것이기 때문이다. 또한, 락투카 사티바 종 레드 샐러드 보울의 떡잎은 떡잎 전체적으로 균일한 색깔을 띤다(도 3a).
재생능의 경우, 락투카 사티바 종 레드 샐러드 보울의 캘리의 90% 이상은 묘목으로 재생되었다. 락투카 사티바 종 레드 샐러드 보울은 락투카 사티바 종 카나스타, 롤로 롯사 및 레드 라피드에 비해 최고의 재생능을 나타내었다. 락투카 사티바 종 레드 라피드는 약 70% 내지 90%의 칼리가 묘목으로 재생되었다. 이것은 형질전환 식물을 선택하는 데 필요한 시간을 단축시킬 것이다. 따라서, 락투카 사티바 종 레드 샐러드 보울은 비티스 비니페라 종 레드 플레임 RS 유전자를 형질전환시키기 위한 식물 재료로서 선택된다.
(레드 플레임 포도로부터의 RS 유전자)
(프라이머 결정)
비티스 비니페라 종 옵티마(pSV21, pSV25 및 pSV368) 및 비티스 비니페라 종 람브루스코아 포글리아 프라스타글리아타(VVLSTS)로부터 분리된 기존의 포도 RS cDNA의 ClustalW 정렬 결과, 이들은 아주 유사하였으며 87.5%의 높은 상동성을 공유하는 것으로 나타났다(도 4). 비티스 비니페라 종 레드 플레임으로부터 전장 유전자를 분리하기 위해 서열의 5' 및 3' 말단에 있는 일치 영역을 결정하였다. 결정된 5' 프라이머는 5'GTC GACCTT CCT CAA CTT AAT CTT3'(35GSTS1로 표시)이었고 3' 프라이머는 5'ATC GATTTC CTT CAC TTA ATT TGT 3'(35GSTS2a로 표시)이었다. 이들은 도 4에서 붉은 색으로 강조하였다. 35GSTS1은 5' 단부에SalI링커를 함유한 반면, 35GSTS2a는 5' 단부에ClaI링커를 함유하였다.
(비티스 비니페라 종 레드 플레임 RS 유전자의 cDNA 및 gDNA 추정 클론)
RT 및 PCR 후에 MW 1.3 kb의 비티스 비니페라 종 레드 플레임 cDNA를 얻었다. pGEM-T(+)의 18개의 클론 중, 12개의 클론은SalI및ClaI로 분해한 후 0.9 kb 내지 1.6 kb 범위의 크기를 가진 삽입체를 함유하였다. 한편, gDNA의 경우에는 1.6 kb 단편을 얻었다.SalI및ClaI로 분해된 18개의 클론은 모두 1.5 kb 내지 1.6 kb의 크기를 가진 삽입체를 함유하였다.
(제한 효소 지도화)
비티스 비니페라 종 레드 플레임의 12개의 cDNA 클론과 18개의 gDNA 클론에 대해,PstI, KpnI및HindIII분해를 수행하였다. 비티스 비니페라 종 레드 플레임의 cDNA의 3개의 클론은 기존의 포도 RS 유전자와 유사한 제한 효소 지도를 갖는 것으로 밝혀졌다(도 5a). cDNA의 3개의 클론, R1, R5 및 R8의 제한 지도는 도 5c에 도시되어 있다. R1의 크기는 1.3 kb이고, 이것은 1개의KpnI부위를 보유하였으나PstI및HindIII는 보유하지 않았다. R5의 경우는, 크기가 1.2 kb이고,PstI,KpnI및HindIII부위를 각각 1 부위씩 보유하였다(표 2). 이들 3개의 클론은 3개의 다른 클론(R3, R6, R12)과 함께 제한 효소 지도가 기존의 포도 RS의 것과 전혀 유사하지 않은 것으로 나타났는데, 이들에 대해 서열 분석을 수행하였다.
비티스 비니페라 종 레드 플레임의 gDNA 클론의 삽입체의 MW는 표 2에 기재하였다. 18개의 클론 중, 4개의 클론은 크기가 1.5 kb이었고 5개의 클론은 크기가 1.6 kb이었다. 모든 클론은PstI및KpnI부위를 보유하였으며, 1개의 클론(G13)만이HindIII부위를 보유하였다. G13, G14 및 G17의 제한 지도는 도 5d에 도시하였는데 이들은 서로 유사하였다. 9개의 클론 모두에 대해 서열 분석을 수행하였다.
비티스 비니페라 종 레드 플레임 cDNA 및 gDNA 제한 지도에서클론의 MW(kb) 및PstI, KpnI및HindIII의 존재 여부
추정 클론 크기(kb) PstI KpnI HindIII
cDNA R1 1.3 X V X
R5 1.2 V V V
R8 0.9 V V V
gDNA G4 1.5 V V X
G5 1.5 V V X
G9 1.5 V V X
G11 1.5 V V X
G13 1.6 V V V
G14 1.6 V V X
G15 1.6 V V X
G16 1.6 V V X
G17 1.6 V V X
주: V는 부위가 존재함을, X는 부위가 존재하지 않음을 표시함.
(서열 분석)
BLAST 프로그램(웹사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용하여 앞부분 300 bp의 서열 분석을 한 결과, cDNA 클론인 R1 및 R5는 표 3에 나타낸 바와 같이 pSV25와 94.5%의 상동성을 가졌다. 그러나 R5는 85 bp가 누락되어 있었다. R3, R65 및 R12의 경우, 이들은 동일한 서열을 가졌으며 pSV21과 97.5%의 상동성을 공유하였다. R6은 VVLSTS와 99%의 상동성을 가졌으나 도 6에 도시된 바와 같이 82 bp가 누락되어 있었다.
비티스 비니페라 종 레드 플레임의 gDNA의 경우, G13은 pSV21과 93%의 상동성을 나타내었다(표 3). 4개의 gDNA 클론(G5, G9, G14 및 G17)은 표 3에 표시된 바와 같이 VVLSTS와 99%의 상동성을 가졌다. 앞부분 300 bp의 서열 분석 후, 이들 4개의 gDNA 클론은 동일한 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.
비티스 비니페라 종 레드 플레임 cDNA 및 gDNA STS 추정 클론과기존 포도 RS 유전자(pSV21, pSV25, pSV368 및 VVLSTS의 상동성
추정 클론기존 STS 유전자 cDNA gDNA
클론 % 클론 %
pSV21 R3, R12 97.5 G13 93
pSV25 R1, R5 94.5 - -
pSV368 - - - -
VVLSTS R6 99 G5, G9, G14, G17 99
cDNA 및 gDNA로부터 pSV21 및 VVLSTS와 상동성인 클론을 분리하였기 때문에, 정렬은 이들 클론 사이에서 수행하였다. 도 7에서, R12 및 G13은 유사하였으나, 서로 동일하지는 않았다. 동일한 결과는 R6 및 R14에서도 얻어진다(도 6).
(히드로패시 곡선)
도 6에 도시된 비티스 비니페라 종 옵티마 RS(pSV21), 팔레놉시스 종 BS(pBibsy811), 아라키스 하이포가에 RS(아크레솔) 및 피너스 실베스트리스STS(PSTS1)은 서로 유사하였다. 이들은 3개의 주요 도메인, 즉 소수성 N-말단(a.a. 1 내지 127), 친수성 중간부(a.a. 128 내지 313) 및 소수성과 친수성 C-말단의 혼합물(a.a. 314 내지 392)로 나뉘었다. a.a 위치는 pSV21에 기초한 것이다.
클론 pUCSTS-R1, R3 및 R12은 비티스 비니페라 종 레드 플레임으로부터의 전장 cDNA STS 유전자이다. 서열 분석에 의하면, 이들은 pSV25(R1) 및 pSV21(R3 및 R12)와 상동성을 갖는다. 이들 cDNA 클론의 MW는 예상 MW, 즉 5'(35GSTS1) 및 3'(35GSTS2a)를 사용했을 때의 1.179 kb 내지 1.237 kb의 범위에 대응하지 않는다. 이들은 pSV21, pSV25, pSV368 및 VVLSTS의 MW, 즉 각각 1.323 kb, 1.3 kb, 1.251 kb 및 1.547 kb에 대응한다[Melchior 및 Kindl, Optima. Arch. Biochem. and Biophy. 288:552-557, 1991 및 Spavoli F., Plant Mol. Biol. 24:743-755, 1994]
또한, R1, R3 및 R12의 제한 지도는 기존의 포도 RS 유전자와 동일하지 않다(도 5a 및 도 5c). 이러한 차이는 사용한 재배종이 다르다는 점에 의해 설명될 수 있다.
pUCSTS-R5 및 R6의 경우, 서열 분석 결과, 이들은 각각 85bp 및 82 bp의 결실이 있는 것으로 나타났다. R5가 pSV25와 상동성이 있고 R6이 VVLSTS와 상동성이 있지만, 이 결실은 오픈 리딩 프레임에서의 이동의 원인이 된다. 번역은 3개의 코돈을 사용하여 아미노산을 만들기 때문에, 오픈 리딩 프레임에서의 이동은 생산된 단백질의 기능에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 이러한 2개의 클론은 클로닝 인공 산물로서 간주된다.
분리된 gDNA 클론 pUCSTS-G5, G9, G13, G14 및 G17은 비티스 비니페라 종 레드 플레임으로부터의 전장 STS 유전자이다. 1.5 kb 내지 1.6 kb 범위에 있는 클론의 크기는 비티스 비니페라 종 옵티마에서 분리된 gDNA STS 유전자Vst1및Vst2에 해당한다[Wiese W., Plant Mol. Biol. 26:667-677, 1994].
인트론의 서열을 제외하고Vst1및Vst2의 서열은 입수할 수가 없기 때문에, gDNA STS 클론의 서열 분석은Vst1및Vst2에 비교할 수가 없다. 그러나,Vst1은 pSV25와 98% 상동성을 갖는다[Wiese W., Plant Mol. Biol. 26:667-677, 1994]. 따라서, gDNA STS 클론은 pSV25와 비교할 수도 있다. 서열 분석 결과, 얻어진 gDNA 클론은 pSV21(G13) 또는 VVLSTS(G5, G9, G14 및 G17)와 상동성이 있다. 이것은 다시 사용한 재배종이 다르다는 것으로 설명될 수 있다. 다른 이유는 pSV25와 유사한 유전자가 이 실험에서 분리되지 않기 때문일 것이다.
비티스 비니페라 종 레드 플레임으로부터의 gDNA RS 클론의 제한 지도는 기존의 RS 유전자와는 조금도 유사성이 보이지 않는다(도 5a, 도 5b 및 도 5d). 다른 재배종을 사용한 것이 그러한 결과의 이유일 것이다.
전 서열은 비티스 비니페라 종 레드 플레임의 cDNA 및 gDNA RS 유전자에 대해 서열화되었던 것이기 때문에, RS 유전자의 이들 클론에 대한 하이드로패시 곡선을 플로팅할 수가 없다. 그러나, 비티스 비니페라 종 옵티마 STS(pSV21), 팔레놉시스 종 BS(pBibsy811), 아라키스 하이포가에 STS(아크레솔) 및 피너스 실베스트리스 STS(PSTS1)은 도3에 도시된 바와 같이, 3개의 주요 도메인에 의해 서로 유사하였다. 문헌[Preisig-Muller R. Biochem. 36:8349-8358, 1997]은, STS 및 BS의 N-말단은 기질 인식 또는 특이성의 역할을 하는 한편, C-말단은 생성물 형성의 역할을 한다고 개시하고 있다. 다른 식물의 STS(들)는 잘 보존된다. 또한 비티스 비니페라 종 옵티마(pSV21) 및 아라키스 하이포가에 RS(아크레솔)는 생성물로서 레스베라트롤을 생산하는 한편, 피너스 실베스트리스 STS(PSTS1)는 생성물로서 피노실빈을 생산하였고[Schanz S., FEBS. 313(1):71-74, 1992], 세 식물간의 STS(들)은 유사하다.
STS 및 BS는 역시 보존된다. STS는 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA를 이용하는 한편, BS는 m-히드로페닐프로피오닐-CoA 및 말로닐-CoA를 이용하는데, 이것에 불구하고 이들의 하이드로패시 곡선은 유사하다. 플리그만[Fliegmann J., Plant Mol. Biol. 18:489-503, 1992]에 의하면, STS는 원래 바람직한 것들 이외의 다른 기질을, 낮은 비율(즉, Km 값이 낮은 것)로 사용할 수도 있다. 이것은 유사한 하이드로패시 곡선에 대한 설명을 제공할 수 있다.
(형질전환 식물의 분석)
다양한 유전자 작제물로 형질전환된 식물의 RV 농도를 분석하였다. 그 결과는 표 4에 표시한다.
STS 작제물 레스베라트롤 농도 추정치(㎍/g.f.w)
니코티아나 타바쿰 락투카 사티바 붉은 잎상추
G14 0.09 0.60
G17 0.27 4.80
R1 0.15 0.94
R65 0.36 0.40
대조군 0.00 0.00
안토시아닌 농도도 분석하였다. 표 5에서는 안토시아닌의 농도는 대조군과 형질전환된 엘. 살비타 종 레드 샐러드 보울에 대해 A530/g으로 표시하였다.
샘플 A530/g
PBI(대조군) 0.0102
G14 0.0133
G17 0.0048
R1 0.0133
R65 0.0047
분석 결과, 식물을 충분한 햇빛 하에 생육하고 육안으로 관찰할 때 안토시아닌 농도가 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 즉, 형질전환 상추에서 보이는 안토시아닌 농도는 레스베라트롤 수율에 역비례한다.
종자는 고농도(＞3 ㎍/g.f.w)를 함유하는 붉은 잎상추 식물에서는 생육 불가능하다. 낮은 RV 농도(＜1.5 ㎍/g.f.w)에서, 종자는 생육 가능하다. 이러한 형질전환 붉은 잎상추 식물의 액즙은 RV 농도가 약 1 ㎍/㎖(약 1.2 RV ㎍/g.f.w를 표현하는 형질전환 식물의 비희석 액즙을 얻음으로써) 내지 약 4 ㎍/㎖(약 4.8 ㎍ RV/g.f.w를 표현하는 형질전환 식물의 비희석 액즙을 얻음으로써)인 액즙을 제공할 수 있다. 액즙은 직접 사용할 수 있고, RV는 음용자에 흡수되는데, 식물에서 천연적으로 발현된 RV는 글리코실화되어 몸에 용이하게 흡수되는 것으로 알려져 있다. 또한, 형질전환 식물은 건조 과일 또는 야채로서 사용될 수 있기 때문에, 각 분야에서 다량의 RV가 소비될 수 있다.
(유전자의 안전성)
- 형질전환 식물의 종자를 ＜1.5 ㎍/g.f.w의 RV 발현으로 재생한 결과, 형질전환 유전자는 적어도 2세대 동안은 안정한 것으로 나타났다.
- 형질전환 식물의 조직 배양물을 ＞3 ㎍/g.f.w의 RV 발현으로 재생한 결과, 형질전환 유전자는 시험관내에서 10세대 후에도 여전히 안정한 것으로 나타났다. 다른 형질전환 식물의 RV에 대한 HPLC 분석은 도 8A-8E에 도시되어 있다. HPLC 분석 방법은 다음과 같다:
(추정 엘. 사티바 종 레드 샐러드 보울 및 엔. 토바쿰 종 크산티(N. tobacum cv Xanthi)로부터의 레스베라트롤 추출)
하인의 문헌[Hain R., Plant. Mol. Bio. 15:325-335, 1990] 및 세롤티의 문헌[Celotti E., J. Chromatogr. A.730;47-52, 1996]에 기재된 것을 약간 변형시켜 추정 형질전환 엘. 사티바 종 레드 샐러드 보울 및 엔. 토바쿰 종 크산티로부터 레스바라트롤을 추출하였다.
추정 형질전환 엘. 사티바 종 레드 샐러드 보울 및 엔. 토바쿰 종 크산티로부터 새로 나온 잎 5 g을 액체 질소 중에서 막자 사발과 막자로 분말상이 될 때까지 분쇄하였다. 분말이 해동을 시작하기 전에, 메탄올(MeOH) 1 ㎎/g(새로운 중량)을 첨가하여 실온에서 24시간동안 추출하였다. MeOH 추출 후, 슬러리를 7,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하였다. 2배 부피의 밀리-Q 수를 상청액에 첨가하였다. 이 용액을 에틸 아세테이트 9 ㎖와 15초간 혼합하였다. 튜브를 4℃로 3분간 냉각시킨 후, -20℃에서 5분간 놓아두었다. 튜브를 냉각시키는 것에 의해 유기상과 수상의 분리가 개선되었다. 유기상은 회수하고 수상은 에틸 아세테이트 6 ㎖로 2회 더 추출하였다. 유기상을 회수하고 무수 황산나트륨을 첨가하여 미량의 물을 제거하였다. 수상은 안토시아닌 결정에 사용하였다. 유기상은 Eppendorf(등록상표) 진공 농축기에서 농축시켰다. MeOH 50 ㎕를 건조 샘플에 첨가하였다.
(HPLC 분석)
시마즈(Shimadzu) 모델 CBM-10A 역상 HPLC 시스템(일본)을 사용하여 추정 형질전환 샘플을 분석하였다. 화학적으로 합성된 트랜스-레스베라트롤(Sigma, U.S.A.) 6 ng/㎕를 표준으로 사용하였다. 이동상으로 물:빙초산:아세토니트릴 (75:5:20)을 사용하여 추출 샘플 50 ㎕를 C18 컬럼(125 ㎜×5 ㎜)를 통해 작동시켰다. 유속은 0.5 ㎖/분으로 설정하고 다이오드 어레이 UV 검출기(SPD-M10AVP)를 306 nm로 설정하였다. 레스베라트롤의 체류 시간은 약 17분이었다.
(가시광 분광광도계를 사용하는 안토시아닌의 결정)
추정 형질전환 엘. 사티바 종 레드 샐러드 보울 및 엔. 토바쿰 종 크산티에서의 안토시아닌의 결정에 사용된 방법은 문헌[Mancinelli(1990)]에 기재된 것을 약간 변형시킨 것이었다. 안토시아닌은 수상에 용해시키고 레스베라트롤은 유기상에 용해시켰기 때문에, 추출 방법은 레스베라트롤 결정 시의 방법으로 하였다. 수상 1 ㎖를 광경로 10 ㎜의 큐벳에서 Du(등록상표) 650 분광광도계(Beckman, U.S.A.)에 의해 판독하였다. 530 nm 및 657 nm에서의 흡광도를 측정하고 안토시아닌 농도를 식(A530-0.25A657)(g 단위의 새로운 중량)으로 계산하였다. 안토시아닌 농도는 A530/g으로 표현하였다. 안토시아닌의 흡수 피크는 흡광도 530 nm에서 측정하였다. 657 nm에서의 흡광도 피크의 경우, 산성 MeOH 중의 클로로필의 퇴화물을 측정하였다.

Claims (16)

  1. 내부에 형질전환된 유전자 벡터를 포함하고, 그 벡터는 스틸벤 신타제 유전자를 암호화하는 분리 DNA 또는 합성 DNA를 포함하는 것인 형질전환 적색 식물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 스틸벤 신타제 유전자가 레스베라트롤 신타제 유전자를 암호화하는 것인 형질전환 적색 식물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유전자 벡터가 플라스미드이고 상기 스틸벤 신타제 유전자가 레스베라트롤 신타제 유전자인 형질전환 적색 식물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 형질전환 식물이 붉은 잎상추인 형질전환 적색 식물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 형질전환 식물이 생육 가능한 종자를 생산할 수 있는 것인 형질전환 적색 식물.
  6. 스틸벤 신타제 유전자 또는 스틸벤 신타제 유전자의 일부로 형질전환된 형질전환 식물로서, 상기 스틸벤 신타제 유전자는 특정 스틸벤 신타제 효소를 암호화하고, 상기 특정 스틸벤 신타제 효소는 상기 형질전환 식물에서 구성적 수준의 특정 스틸벤을 합성하며, 형질전환되지 않은 천연 상태의 상기 형질전환 식물은 고농도의 상기 스틸벤 신타제 유전자 전구체를 함유하는 형질전환 식물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 스틸벤 신타제 유전자는 레스베라트롤 신타제 유전자이고, 상기 특정 스틸벤 신타제 효소는 레스베라트롤 신타제이며, 상기 특정 스틸벤은 레스베라트롤인 형질전환 식물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 형질전환 식물이 붉은 잎상추인 형질전환 식물.
  9. 내부에 형질전환된 특정 형질전환 스틸벤 신타제(STS) 효소를 함유하며 수용체 식물로부터 얻어지는 형질전환 식물의 생산 방법으로서,
    (a) 고농도의 형질전환 STS 효소 전구체를 함유하는 수용체 식물을 선택하는 단계,
    (b) 상기 특정 STS 효소를 암호화하고 수용체 식물에서의 상기 특정 STS 효소의 구성적 발현에 적합한 프로모터를 포함하는 STS 유전자 또는 STS 유전자의 일부를 포함하는 유전자 벡터를 제공하는 단계,
    (c) 유전자 벡터를 수용체 식물에 형질전환시키는 단계, 및
    (d) 구성적 수준의 고농도 형질전환 스틸벤을 함유하는 형질전환 식물을 선택하여 성장시키는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 선택 단계가 상기 수용체 식물을 조직 배양 시스템에서 유합조직 배양물로서 성장시키고, 상기 유합조직 배양물의 상기 STS 효소 전구체의 농도를 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 형질전환된 레스베라트롤 신타제(RS) 효소를 함유하며 수용체 식물로부터 얻어지는 형질전환 식물의 생산 방법으로서,
    (a) 고농도의 4-코우마로일-CoA 및 말로닐-CoA를 함유하는 수용체 식물을 선택하는 단계,
    (b) RS 효소를 암호화하고 수용체 식물에서의 상기 RS 효소의 구성적 발현에 적합한 프로모터를 포함하는 RS 유전자 또는 RS 유전자의 일부를 포함하는 유전자 벡터를 제공하는 단계,
    (c) 유전자 벡터를 수용체 식물에 형질전환시키는 단계, 및
    (d) 구성적 수준의 고농도 형질전환 레스베라트롤을 함유하는 형질전환 식물을 선택하여 성장시키는 단계를 포함하는 방법.
  12. 형질전환된 레스베라트롤 신타제(RS) 효소를 함유하며 수용체 식물로부터 얻어지는 형질전환 식물의 생산 방법으로서,
    (a) 구성적 수준의 고농도 안토시아닌을 함유하는 식용 부분을 가진 수용체 식물을 선택하는 단계,
    (b) RS 효소를 암호화하고 수용체 식물에서의 상기 RS 효소의 구성적 발현에 적합한 프로모터를 포함하는 RS 유전자 또는 RS 유전자의 일부를 포함하는 유전자벡터를 제공하는 단계,
    (c) 유전자 벡터를 수용체 식물에 형질전환시키는 단계, 및
    (d) 식용 부분에 구성적 수준의 고농도 레스베라트롤을 함유하는 형질전환 식물을 선택하여 성장시키는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 수용체 식물이 붉은 잎상추인 방법.
  14. 식물의 식용 부분으로부터의 비발효 액즙을 함유하고, 이 액즙은 1 ㎍/㎖의 레스베라트롤을 함유하는 것인 음료.
  15. 건조 중량 1 g당 1 ㎍ 이상의 레스베라트롤을 함유하는 건조 과일 및 야채.
  16. 건조 중량 1 g당 1 ㎍ 이상의 레스베라트롤을 함유하는 분말형 식물 추출물.
KR10-2003-7006894A 2000-11-21 2001-10-25 형질전환 식물에서의 스틸벤의 생산 및 그것의 생산 방법 KR20030067689A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SGSG-P-2000-06741-3 2000-11-21
SG200006741A SG96587A1 (en) 2000-11-21 2000-11-21 Production of stilbenes in transgenic plants and the method of producing thereof
PCT/SG2001/000220 WO2002042465A1 (en) 2000-11-21 2001-10-25 Production of stilbenes in transgenic plants and the method of producing thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20030067689A true KR20030067689A (ko) 2003-08-14

Family

ID=20430690

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2003-7006894A KR20030067689A (ko) 2000-11-21 2001-10-25 형질전환 식물에서의 스틸벤의 생산 및 그것의 생산 방법

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20040111760A1 (ko)
EP (1) EP1343893A1 (ko)
JP (1) JP2005502304A (ko)
KR (1) KR20030067689A (ko)
CN (1) CN1606623A (ko)
AU (1) AU2002211196A1 (ko)
CA (1) CA2429368A1 (ko)
MY (1) MY140523A (ko)
SG (1) SG96587A1 (ko)
WO (1) WO2002042465A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102606685B1 (ko) 2023-07-28 2023-11-29 (주)대신금형 조향축 제조 시스템

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7666677B2 (en) 2006-07-05 2010-02-23 Luis Fabricio Medina-Bolivar Production of stilbenes in plant hairy root cultures
CN102220350B (zh) * 2010-04-15 2012-09-19 上海科爱生物技术有限公司 利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶和制备白藜芦醇的方法
US9227898B2 (en) 2012-01-27 2016-01-05 The Administrators Of The Tulane Edcational Fund Postharvest production and enhancement of resveratrol and piceatannol in sugarcane
CN102605006B (zh) * 2012-02-17 2014-07-30 天津大学 一种白藜芦醇的生物生产方法
US9598707B2 (en) 2012-11-26 2017-03-21 Arkansas State University-Jonesboro Method to increase the yield of products in plant material
AU2014230459B2 (en) * 2013-03-13 2019-01-17 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V Red spinach plant
CN105378108A (zh) * 2013-03-13 2016-03-02 雅培分子公司 用于分离核酸的系统和方法
US9549526B2 (en) 2013-03-13 2017-01-24 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Red spinach plant
ES2865124T3 (es) * 2013-03-15 2021-10-15 Abbott Molecular Inc Procedimiento en una etapa para la purificación de ácidos nuncleicos
CN115386591B (zh) * 2022-09-05 2024-05-28 中国科学院华南植物园 一种单座苣苔的分子育种方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4440200A1 (de) * 1994-11-10 1996-05-15 Bayer Ag DNA-Sequenzen und ihre Verwendung
US6974895B1 (en) * 1999-01-29 2005-12-13 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Transgenic legume plants modified to produce resveratrol glucoside and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102606685B1 (ko) 2023-07-28 2023-11-29 (주)대신금형 조향축 제조 시스템

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005502304A (ja) 2005-01-27
MY140523A (en) 2009-12-31
WO2002042465A8 (en) 2003-10-23
WO2002042465A1 (en) 2002-05-30
US20040111760A1 (en) 2004-06-10
EP1343893A1 (en) 2003-09-17
SG96587A1 (en) 2003-06-16
CN1606623A (zh) 2005-04-13
CA2429368A1 (en) 2002-05-30
AU2002211196A1 (en) 2002-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2243997T3 (es) Regulacion del metabolismo por modificacion del nivel de trehalosa-6-fosfato.
US20060225154A1 (en) Method for increasing expression of stress defense genes
JP2018529370A (ja) ジャガイモ栽培品種ｙ９
Lim et al. Transgenic tomato plants expressing strawberry d-galacturonic acid reductase gene display enhanced tolerance to abiotic stresses
US8455713B2 (en) Plants with improved morphogenesis and method of constructing the same
KR102540389B1 (ko) 광합성 효율 및 성장이 증가된 형질전환 식물
US10626407B2 (en) Materials and method for modifying a biochemical component in a plant
KR20120007038A (ko) 식물 ｓｎｆ１-관련 단백질 키나제 유전자
CN111100849B (zh) 茶树类胡萝卜素裂解双加氧酶CsCCD4及其在催化合成β-紫罗酮上的应用
KR100379143B1 (ko) 자스몬산 메칠화 효소 유전자 및 이를 이용하여 병충해 및스트레스 저항성 식물체를 제조하는 방법
EP0746615A1 (en) Dna constructs, cells and plants derived therefrom
KR20030067689A (ko) 형질전환 식물에서의 스틸벤의 생산 및 그것의 생산 방법
AU2020100800A4 (en) Use of aegilops tauschii hmt1 gene
JP2006325554A (ja) 遺伝子発現誘導によるストレス予防効果の付与方法
CN114752607B (zh) 香蕉MtLUT5基因、克隆方法、表达载体及应用
US6518486B1 (en) Enhanced storage organ production in plants
JP2013135669A (ja) ＤＨＡのポリヌクレオチド及びｅＩＦ−５Ａのアイソフォーム及びそれらの使用方法
US20230235347A1 (en) Improved Camelina Plants and Plant Oil, and Uses Thereof
Babaei et al. Increasing vitamin E content of canola (Brassica napus L.) by transferring γ-tmt gene
RU2546877C2 (ru) Фарнезен-синтаза
AU772758B2 (en) Enhanced storage organ production in plants
KR101263838B1 (ko) 유전자 조작에 의한 동해 내성 식물체의 제조방법
Podolyan A study of the green leaf volatile biochemical pathway as a source of important flavour and aroma precursors in Sauvignon blanc grape berries
Yoganathan Isolation, expression and functional analysis of acDNA encoding phytoene desaturase, a carotenoid biosynthetic enzyme from rice, Oryza sativa L.
GIULIANO ENGINEERING OF SECONDARY METABOLISM FOR PLANT IMPROVEMENT

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid