KR100844314B1

KR100844314B1 - 병저항성 식물체에서 자스몬산 생합성에 관여하는 유전자 ｄｇｌ

Info

Publication number: KR100844314B1
Application number: KR1020060062552A
Authority: KR
Inventors: 이일하; 현유봉
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-07-04
Filing date: 2006-07-04
Publication date: 2008-07-07
Also published as: KR20080004070A

Abstract

본 발명은 병저항성 식물체에서 자스몬산 생합성에 관여하는 유전자 DGL에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 애기장대에서 자스몬산 생합성의 첫 단계를 담당하는 포스포리파제 A를 암호화하는 DGL이 과발현되어 자스몬산이 과생성됨으로써 병충해 저항성을 보이는 dgl-D 식물체를 이용하여 DGL의 기능을 밝힌 내용에 관한 것이다.

본 발명의 DGL 유전자는 로제트(rosette) 잎에서 특이적으로 발현되고, 뿌리에서도 약하게 발현되는데, dgl-D 식물체는 병충해에 대한 방어기작을 나타내고 또한 농작물의 병충해 저항성 증대를 보인다. 이러한 DGL 유전자의 기능의 이해는 실용작물로의 기술 도입에 보다 효율적으로 적용될 식물체를 제공하는데 큰 기여를 할 수 있다.

DGL, dgl-D 식물체, 자스몬산, 포스포리파제 A, 병충해, 저항성, 활성표지돌연변이법

Description

병저항성 식물체에서 자스몬산 생합성에 관여하는 유전자 ＤＧＬ{DGL gene associated with jasmonic acid synthesis in disease resistant plant}

도1은 야생형 Col과 dgl -D 식물체의 표현형을 나타낸 그림이고,

도2는 활성표지돌연변이법에 의해 삽입된 T-DNA에 존재한 4 copy의 35S enhancer에 의하여 주변 유전자가 과발현(점선표시)되는 발현벡터의 모식도이며,

도3은 dgl -D 식물체의 T-DNA가 삽입된 염색체 1번의 대략적인 모식도(위)와 삽입된 염색체 주변의 유전자들과 T-DNA(아래)로부터의 거리를 표시한 그림이며,

도4는 T-DNA 삽입부위 주변 유전자 중 포스포리파제(phospholipase)를 암호화하고 있는 At1g05800 유전자가 dgl - D 에서 과발현 되어 있음을 확인한 그림이며,

도5는 두 개체의 독립적인 35S:: DGL 형질전환체들에서(YB14 .2, YB14 .7) dgl -D와 동일한 표현형을 나타내는 그림이며,

도6은 대표적인 JA 반응성 유전자인 VSP1과 Thi2 .1의 발현이 dgl -D 식물체에서 증 가함을 확인한 그림이며,

도7의 왼쪽은 DGL-GFP 단백질의 녹색 형광이 엽록체가 발현하는 적색 자가형광에서 함께 발현되고 있음을 나타내는 그림이며, 오른쪽은 추출한 원형질체(protoplast)의 형광현미경 사진으로 엽록체의 위치와 적색 자가형광이 일치함을 알 수 있게 하는 그림이며,

도8은 dgl -D 식물체와 JA 관련 유전자 이중돌연변이체의 표현형을 나타낸 그림이며,

도9는 야생형과 dgl -D 식물체의 잎에서 추출한 JA와 MeJA의 함량(ng)을 추출한 샘플의 생체량(g)으로 나눈 값을 표시한 그림이며,

도10은 JA의 농도가 높아질수록 dgl -D 식물체의 표현형인 작고 동그란 잎 모양을 나타내다 황녹화현상이 진행됨을 알 수 있는 그림이며,

도11은 dgl -D 식물체의 병 저항성 병원체에 감염된 후 황백화 현상을 보이며 사멸하는 야생형(좌)과 달리 dgl -D 식물체는 병증을 보이지 않음을 알 수 있고(우), 이를 통하여 dgl-D 식물체의 병저항성이 증가하였음을 확인할 수 있는 그림이며,

도12는 DGL 유전자의 조직별 발현을 나타내는 그림으로, DGL 유전자는 rosette 잎과 뿌리에서 발현되고 있음을 알 수 있는 그림이며,

도13은 DAD1 , DGL 유전자들의 상처 후 발현패턴을 일정시간별로 확인한 그림이다.

자스몬산(jasmonic acid; JA)과 자스몬산 메칠에스터(jasmonate methyl ester; JAMe)는 다양한 식물에 널리 존재하는 성장조절물질일 뿐만 아니라, 물리적 또는 해충에 의한 식물의 상처 또는 병원균의 침입에 대항하는 저항성 반응을 매개하는 물질로 알려져 있다(Creelman and Mullet, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.48; 355-381, 1992). 그리고 이 저항성 반응은 매우 복잡한 신호전달망을 구성하고 있는 것으로 알려져 있다 (Glazebrook,Curr. Opin. Plant Biol.2: 280-286, 1999).

평상시에는 식물체의 생장 조절에 관여하다가 외부로부터 병해충 및 병원균이 식물체에 침입하면 식물체내 자스몬산 농도가 증가하면서 메틸화(methylation)된 자스몬산이 식물체내에서 생산된다. 자스몬산 및 자스몬산 메틸에스테르는 휴면하고 있던 식물체의 방어시스템을 시동하고 자기방어시스템에 필요한 일련의 식물체 유전자를 가동시킨다. 자스몬산 및 자스몬산 메틸에스테르에 의해 시동된 유전자들은 자체 면역 및 방어에 필요한 단백질을 생성해낸다.

JA는 식물계내에 폭넓게 분포하고 있는 식물 생장 조절 물질의 새로운 집단으로 간주되며, 다양한 생리적 활성을 지니고 있을 뿐만 아니라 병원균 침입, 상처 혹은 삼투 스트레스와 같은 생물적 스트레스와 무생물적 스트레스 기간 동안에도 발현되는 신호 전달 물질로 알려져 있다.

JA는 1962년 데몰이라는 과학자에 의해 자스미늄 그랜디플로룸(Jasminum grandiflorum)이라는 식물의 필수 오일 성분을 구성하는 방향성 물질로 처음 알려졌으며, 1971년에는 알드리지라는 과학자에 의해 라시오디플로디아 디오브로매(Lasiodiplodia theobromae)라는 곰팡이의 배양체에서 식물 생장 저해 물질로 처음 분리되었다고 한다. JA의 신호 전달 체계는 아직까지 완전히 구명되지 않고 있으며, JA가 관련된 여러 가지 반응에서 일련의 신호 전달 체계가 활성화되어 있는 세포의 다양한 수용체와 JA는 상호작용 하는 것으로 추정하고 있다. 대한민국 특허출원 제2000-0032365호에서는 자스몬산 메칠화 효소 유전자 및 이를 이용하여 병충 해 및 스트레스 저항성 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

JA 생합성의 시작은 엽록체에서 일어나는 것으로 보고되어 왔으며, 엽록체의 지질막을 분해하는 포스포리파제 A(phospholipase A)의 작용에 의하여 발생한 리놀렌산(linolenic acid)이라는 지방산이 최초의 전구물질로서 작용하게 된다. 이렇게 생성된 JA의 전구물질은 LOX, AOS, AOC 효소들의 연쇄반응을 통하여 OPDA로 합성되게 되고, 이렇게 생성된 OPDA는 엽록체에서 퍼록시좀(peroxisome)이라는 세포내 소기관으로 전달된다. 엽록체로부터 전해 받은 OPDA는 OPR3에 의한 환원반응에 이은 세 번의 β-옥시데이션(β-oxidation) 반응을 거쳐 비로소 JA로 생성된다.

DGL 유전자는 지질을 분해하는 것으로 알려진 리파제(lipase) 단백질을 암호화하는 것으로 데이터베이스 검색결과 밝혀졌으며, 식물호르몬 JA (jasmonic acid)의 생합성에 관련된 것으로 알려진 인지질분해효소 A (phospholipase A) 단백질 DAD1 (Defective in Anther Dehiscence 1)과 아미노산 서열상으로 높은 유사성을 갖는다.

본 발명자들은 JA가 식물에 미치는 영향을 연구하던 중, 식물호르몬 JA (jasmonic acid)의 생합성에 관련된 것으로 알려진 인지질분해효소 A (phospholipase A) 단백질 DAD1 (Defective in Anther Dehiscence 1)과 아미노산 서열상으로 높은 유사성을 갖는 DGL 유전자를 발견하고, 그 특성을 규명하였으며, dgl -D 식물체가 자스몬 산의 과생성을 통해 병충해 저항성과 관련된 다수의 유전자 발현을 촉진하여 결과적으로 다양한 식물 병충해 및 스트레스에 대해 저항성을 부여함과 동시에 식물의 생장에는 부작용이 거의 없음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 애기장대에서 자스몬산 생합성의 첫 단계를 담당하는 포스포리파제 A를 암호화하는 DGL이 과발현되어 자스몬산이 과생성됨으로써 병충해 저항성을 보이는 dgl-D 식물체를 이용하여 DGL의 기능을 밝히고, dgl -D 식물체가 병충해에 대한 방어기작을 나타내고 또한 농작물의 병충해 저항성 증대를 보임으로서 실용작물로의 기술 도입에 보다 효율적으로 적용될 식물체를 제공하는데 큰 기여를 할 수 있으므로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 병저항성 식물체에서 자스몬산 생합성에 관여하는 유전자 DGL에 관한 것이다.
본 발명은 병저항성 식물체에서 자스몬산 생합성에 관여하는 유전자 DGL(서열번호24)을 포함한다.
본 발명은 DGL이 식물호르몬 JA (jasmonic acid)의 생합성에 관련된 것으로 알려진 인지질분해효소 A (phospholipase A) 단백질 DAD1 (Defective in Anther Dehiscence 1, 서열번호25)과 아미노산 서열상으로 35.7% 유사성을 보이는 것을 특징으로 하는 유전자를 포함한다.

삭제

본 발명은 DGL 유전자가 과발현되어 자스몬산과 메틸자스몬산의 생합성량이 증가하여 식물체의 병충해 저항성이 증가한 특징을 갖는 조직배양에 의해 무성번식되는 dgl -D 식물체를 포함한다.

본 발명은 JA 생합성과 관련하여 DGL 유전자가 과발현되어 DGL 단백질의 하위 조절 단계 유전자인 VSP1과 Thi2 .1의 과발현을 유도하는 특징을 갖는 DGL 유전자가 과발현되는 조직배양에 의해 무성번식되는 dgl -D 식물체를 포함한다.

본 발명진은 활성표지돌연변이법(activation tagging mutagenesis)을 이용하여 dongle-D 식물체를 이미 선별/동정한 바 있다. dongle -D 식물체는 야생형에 비하여 작고 동그란 잎모양을 가지고 있으며 개체의 전체적인 크기가 작아지는 왜소성(dwarfism)과 줄기의 정단우성이 약해지는 표현형을 동시에 보인다 (그림 1).

활성표지돌연변이법은 기본적으로 T-DNA 삽입에 의한 표지 돌연변이(T-DNA tagging mutagenesis)와 같은 원리를 갖는다. 그러나 활성표지돌연변이법은 식물체 내에서 유전자의 강하고 항시적인 발현을 유도하는 CaMV 35S 프로모터의 35S 인핸서 4 카피(CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S promoter의 35S enhancer 4 copy)를 T-DNA에 조합함으로써 T-DNA가 삽입된 주변의 유전자들의 과발현을 유도하는 차이점 을 갖는다 (그림 2).

활성표지돌연변이법에 의해 발생한 식물체는 표현형이 우성형질을 지니게 되고 T-DNA 삽입 마커 유전자인 항생제 저항성 유전자와 함께 연관되어 유전된다. dgl -D 식물체도 역시 이러한 활성표지돌연변이체의 고유한 특성을 모두 포함하고 있고, 외형적 표현형으로부터 전체적으로 연상되는 동그란 이미지와 우성형질의 특성을 따라서 동글 우성(dongle-dominant)이란 의미의 dgl-D를 식물체의 이름으로 사용하였다.

T-DNA 표지 식물체들은 이미 돌연변이 생성에 사용한 T-DNA의 염기서열을 알고 있으므로 그러한 염기서열을 토대로 한 식물체 게놈 상의 T-DNA 삽입 부위의 검색을 손쉽게 할 수 있다. 이러한 방법 중 하나로 TAIL(thermal asymmetric interlaced) PCR이 있다. 본 연구진은 이 TAIL PCR 방법을 이용하여 dgl -D 식물체에서 T-DNA가 염색체 1번에 삽입되어 있으며 보다 정확한 삽입 부위는 At1g05790 유전자와 At1g05800 유전자 사이의 염색체 자리인 것을 확인하였다 (그림 3).

앞에서 기술한 것처럼 활성표지돌연변이체는 T-DNA가 삽입된 염색체 주변의 유전자가 T-DNA에 존재하는 35S 인핸서(35S enhancer)에 의해 과발현됨으로써 발생한 것이기 때문에 본 연구진은 야생형 애기장대와 dgl-D 식물체에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 통한 발현 분석을 T-DNA 삽입부위 주변의 유전자들을 대상으로 수행하였다. 그 결과 dgl-D 식물체에서는 At1g05800 유전자가 특이적으로 과발현되어 있음을 확인할 수 있었다 (그림 4).
At1g05800 유전자의 과발현이 실제로 dgl-D 돌연변이의 원인임을 증명하기 위하여 At1g05800 유전자의 단백질 암호화 부위를 35S 프로모터를 가지고 있는 binary vector pCAMBIA1303-BS linker에 삽입한 재조합 DNA를 제작 후 애기장대에 형질전환하였다. 그 결과로 얻어진 35S::DGL 형질전환체는 dgl-D 식물체와 동일한 표현형을 나타냄을 알 수 있었고 (그림 5), 이를 통하여 dgl-D 돌연변이의 원인이 At1g05800 유전자의 과발현에 의한 것으로 결론 내릴 수 있었다. 이 후 본 연구진은 At1g05800 유전자를 DGL(DONGLE, 서열번호24) 유전자로 명명하기로 하였다.

DGL 유전자는 지질을 분해하는 것으로 알려진 리페이즈(lipase) 단백질을 암호화하는 것으로 데이터베이스 검색결과 밝혀졌으며, 식물호르몬 JA (jasmonic acid)의 생합성에 관련된 것으로 알려진 인지질분해효소 A (phospholipase A) 단백질 DAD1 (Defective in Anther Dehiscence 1, 서열번호25)과 아미노산 서열상으로 높은 유사성(35.7%의 identity)을 지닌다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 단백질의 구조적 유사성을 토대로 DGL 단백질 역시 JA 생합성에 관련되었을 가능성을 추정하였고, 이를 검증하기 위하여 JA가 처리되었을 때 발현이 유도되는 유전자인 VSP1과 Thi2.1이라는 유전자의 발현을 야생형과 dgl-D 식물체에서 RT-PCR 방법을 통하여 비교하여 보았다. 그 결과 dgl-D 식물체에서 JA 반응성 유전자들의 발현이 증가하였음을 확인하였고, 이 결과를 토대로 DGL 단백질이 DAD1 단백질과 더불어 JA 생합성에 관련되어 있음을 검증할 수 있었다(그림 6).

삭제

JA 생합성의 첫 단계를 DGL 단백질이 담당할 것이라는 본 발명진의 결과는 DGL 유전자의 과발현에 의해 발생한 dgl -D 식물체의 표현형이 JA 과다생성에 의한 것임을 추측 가능케 한다. 만약 이러한 dgl -D 식물체에 JA 생합성의 보다 하위 단계를 담당하는 유전자 또는 JA의 신호전달을 담당하는 유전자의 돌연변이를 도입하면 dgl -D 식물체의 표현형이 사라지는 결과를 쉽게 예상할 수 있다. 이를 위하여 JA 생합성의 보다 하위 단계를 담당하는 유전자인 OPR3와 JA 신호전달을 담당하는 것으로 알려진 COI1 유전자에 돌연변이가 발생한 opr3 , coi1 돌연변이체와 dgl -D 식물체를 교배하여 opr3dgl -D, coi1dgl-D 이중돌연변이체를 제작하였다. 제작된 이중돌연변이체는 예상한대로 dgl -D 식물체의 대표적인 표현형인 작고 동그란 잎모양, 왜소성(dwarfism), 정단우성의 파괴 등과 같은 표현형이 모두 사라졌으며 더불어 JA 결핍 표현형인 꽃밥의 성숙 파괴에 따른 불임성 표현형을 보였다 (그림 8). 이러한 유전학적 분석 결과를 토대로 dgl -D 식물체의 표현형이 JA 생합성의 과다에 의한 것을 알 수 있었다. 실제로 dgl -D 식물체와 야생형의 잎에서 존재하는 JA의 함량을 질량분석기(mass spectrometer)를 통하여 분석하여 본 결과 위의 유전학적 결과와 동일하게 dgl -D 식물체에서 JA의 함량이 증가하여 있음을 확인할 수 있었다 (그림 9).

한편 DGL 단백질의 생화학적 기능이 DAD1 단백질과 동일하다면 35S 인핸서에 의하여 장소와 시간에 관계없이 항시 DGL 유전자가 과발현되는 dgl -D 식물체에 dad1 돌 연변이를 도입하였을 때 dad1 돌연변이체의 JA 결핍 표현형이 사라지고 dgl -D 식물체의 표현형을 나타내야 함을 예상할 수 있다 (그림 8). 이 예상과 동일하게 dad1dgl -D 돌연변이체는 dad1 돌연변이체의 표현형인 불임성이 사라지고 dgl -D 식물체의 표현형을 따라감을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 위의 opr3 , coi1 와의 이중돌연변이체 표현형 결과와 종합하여 볼 때 DGL 유전자가 JA 생합성에 관여함에 있어서 DAD1 유전자와 동일한 유전적 경로를 공유함을 알 수 있는 것이다.

JA 생합성의 시작은 엽록체에서 일어나는 것으로 보고되어 왔으며, 엽록체의 지질막을 분해하는 포스포리파제 A(phospholipase A)의 작용에 의하여 발생한 리놀레산(linolenic acid)이라는 지방산이 최초의 전구물질로서 작용하게 된다. 이렇게 생성된 JA의 전구물질은 LOX, AOS, AOC 효소들의 연쇄반응을 통하여 OPDA로 합성되게 되고, 이렇게 생성된 OPDA는 엽록체에서 퍼록시좀(peroxisome)이라는 세포내 소기관으로 전달된다. 엽록체로부터 전해 받은 OPDA는 OPR3에 의한 환원반응에 이은 세 번의 β-oxidation 반응을 거쳐 비로소 JA로 생성된다. 애기장대에서 최초로 보고된 DAD1과 더불어 DGL 유전자는 JA 생합성의 첫 단계를 담당할 것으로 추정되는 포스포리파제 A(phopholipase A)를 암호화하고 있으므로, DGL 유전자의 과발현으로 발생한 dgl-D 식물체의 다양한 표현형들이 JA의 과다생성에 의한 것임을 유추해 볼 수 있다.

만약 실제로 DAD1과 유사성을 보이는 DGL 단백질이 JA 생합성 과정의 동일 단계를 매개한다면 DGL 단백질은 엽록체로 수송되어야 할 것이다. 이러한 예상과 동일하게 DGL 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과 N 말단 부위에 단백질을 엽록체로 수송하는 신호로서 작용하는 엽록체 이동 펩타이드(chloroplast transit peptide)가 존재함을 알 수 있었다. 이를 실제로 확인하기 위하여 DGL 유전자에 GFP (green fluorescence protein) 단백질의 DNA 염기서열을 조합한 재조합 DNA를 제작하였다. 이렇게 제작한 재조합 DNA를 발아 후 20일이 지난 애기장대에서 추출한 원형질체(protoplast)에 주입한 후 재조합 DNA로부터 발현된 DGL-GFP 단백질이 어떠한 세포내 소기관에 축적되는 지를 확인하여 보았다. 그 결과 GFP 단백질에 의해 발현되는 녹색 형광이 추출한 원형질체(protoplast)의 엽록체 내부에 특이적으로 발현된다는 것을 확인할 수 있었고 이것으로써 DGL 단백질이 엽록체에 특이적으로 축적된다는 것을 알 수 있었다 (그림 7). 이러한 결과는 JA 생합성이 엽록체에서 일어난다는 기존의 연구 결과와 잘 부합하는 것이었다.

DGL 단백질이 DAD1 단백질과 기능적으로 완벽하게 동일하다고는 할 수 없는 흥미로운 결과는 DAD1 유전자의 경우에는 35S promoter를 이용하여 식물체에 과발현시켰을 경우 유식물 단계에서 엽록체의 파괴에 의한 백화현상(bleaching)을 보이며 사멸한다는 점이다. 이에 반하여 DGL 유전자의 과발현 형질전환체는 개체의 크기가 작아진다는 표현형을 보일 뿐 개체의 사멸은 유도하지 않음을 알 수 있다. 이는 DGL 단백질과 DAD1 단백질이 단백질의 활성 또는 기질 특이성을 다르게 가지고 있을 가능성을 제기한다. 실제로 본 연구진이 JA의 농도를 증가시켜가며 처리한 야생 형 애기장대의 표현형이 낮은 농도에서는 dgl -D 표현형을 보이다가 농도가 높아질수록 백화현상이 심해지며 사멸하는 것을 확인할 수 있었다 (그림 10).

JA 연구 분야의 결과로는 JA의 생합성에 관련된 유전자의 과발현 형질전환체 제작이 위에서 제기한 사멸 표현형에 따른 문제에 의해 가로막혀 있었으나 본 발명진이 동정/선별한 DGL 유전자는 JA 생합성의 증대에 의한 병충해 저항성 개선 유용작물 개발에 중요한 초석을 제공할 것으로 기대할 수 있다. 실제로 dgl -D 식물체의 병충해 저항성을 측정하여 본 결과 식물의 상처 난 조직으로부터 감염하는 것으로 잘 알려진 균류 A. brassicicola와 대표적 병증 유발 세균인 P. syringiae DC3000 모두에게서 병저항성을 보이는 것을 확인할 수 있었다 (그림 11).

이러한 DGL 유전자와 DAD1 유전자의 생물학적 기능상의 차이는 서로의 발현 장소와 시간을 구별함으로써 획득할 수 있을 것이다. 앞에서 언급한 것처럼 DAD1 유전자는 애기장대의 수술대에서 특이적으로 발현되고 이러한 발현패턴은 꽃밥의 성숙에 필요한 JA 생성과 관련되어 있음을 기존의 연구결과를 통하여 보고된 바 있다. 본 연구진은 DGL 유전자는 과연 애기장대 내에서 어떠한 발현패턴을 보이며 DAD1 유전자와 어떠한 차이점을 보이는 지를 확인키 위하여 애기장대의 유식물, rosette 잎, 뿌리, 꽃, 열매 (silique) 등에서 RNA를 추출한 후 DAD1과 DGL 유전자의 발현을 비교하여 보았다. 그 결과 DGL 유전자는 DAD1 유전자와 달리 꽃에서의 발현은 확인할 수 없었으며 rosette 잎에서 특이적으로 발현됨을 알 수 있었다. 또한 이러한 DGL 의 발현은 뿌리에서도 약하게나마 확인할 수 있었다 (그림 12).

이러한 발현패턴은 JA의 생합성을 유도하는 것으로 알려진 상처(wounding)처리 후 나타나는 발현패턴에서 알 수 있는데, 애기장대의 잎을 핀셋으로 상처 준 후 0.5, 1, 2, 4시간이 지날 때마다 상처받은 잎(local)과 동일한 개체의 상처받지 않은 잎(systemic)에서 RNA를 추출하여 각 유전자의 발현패턴을 분석한 것이다. 그 결과 DAD1 , DGL 유전자의 발현이 상처가 처리된 후 0.5시간 만에 발현이 최대로 유도되었다(그림 13).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1 : 식물체의 배양 및 형질전환식물체의 제작>

본 발명에 사용된 모든 식물체는 Col-0라는 실험용 애기장대이다. 종자의 발아를 위해서 75% 에탄올 + 0.5% triton-X-100 용액에 10분간 멸균소독 후 100% 에탄올로 멸균용액을 씻어내고 무균상태로 종자를 건조한다. 건조가 완료된 종자는 MS 배지에 뿌린 후 3일간 저온(4℃)처리하여 22℃ 배양실로 옮겨온다. 배양실의 광주기는 16시간 광상태/8시간 암상태인 장일조건이다.

JA 호르몬 처리를 위해서는 그림 10에 명시된 농도의 JA가 함유된 MS 배지를 제작 후 각 배지에서 애기장대 종자를 발아시킨 후 15일간 관찰하였다.

형질전환식물체의 제작은 아그로박테리아를 통한 형질전환 DNA의 식물체 형질전환방법을 이용하였으며 자세한 실험과정은 Clough와 Bent가 보고한 1998년 Plant Journal 논문을 참고하였다 (Clough, S.J. and Bent, A.F. 1998. Plant J. 16: 735-743).

<실시예 2 : T-DNA 삽입부위의 검색>

T-DNA 삽입부위의 검색을 위해서 TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced-PCR) 방법을 이용하였다. 자세한 실험과정은 Liu et al.이 보고한 1995년 plant journal 논문을 참고하였다 (Liu, Y.G., Mitsukawa, N., Oosumi, T. and Whittier, R.F. 1995. Plant J. 8: 457-463.). PCR에 사용한 프라이머의 염기서열은 각각 LB1 (5'-ATACGACGGATCGTAATTTGTC-3')<서열목록1>, LB2 (5'-TAATAACGCTGCGGACATCTAC-3')<서열목록2>, LB3 (5'-TTGACCATCATACTCATTGCTG-3')<서열목록3> 이다. 위 프라이머들은 활성표지돌연변이법에 사용한 바이너리 벡터인 pSKI015의 염기서열을 토대로 제작하였다.+애기장대를 재료로 사용하였으며 그림 12에서 명시된 각 조직을 구별하여 취합한 후 RNA를 추출하였다. DGL과 DAD1 유전자의 상처 후 발현변화를 조사하기 위해 발아 후 30일이 지난 애기장대를 재료로 사용하였으며, 상처처리는 애기장대의 잎을 핀셋을 이용하여 찝어 주었다. 상처처리 후 그림 13에 표시된 시간에 맞추어 상처를 받은 잎을 Local, 상처를 받지 않은 잎을 Systemic으로 구별하여 취합한 후 RNA를 추출하였다. RNA 추출은 시그마(Sigma)에서 판매하는 TRI-reagent 용액을 이용하였다.

각 유전자의 발현을 조사하기 위해서 RT-PCR (Reverse Transcrition-PCR) 방법을 이용하였다. RT-PCR에 사용한 유전자 특이적 프라이머의 염기서열은 각각 At1G05785 (5‘-ATGGTGTACGAAATAACTGAG-3’<서열목록4> / 5‘-TCAACGAGCACCTCTTACAA-3’<서열목록5>), At1G05790 (5‘-ATGTGGATTTCGAGGTTGAAG-3’<서열목록6> / 5‘-TCTGATCCCGTAAAGCATTG-3’<서열목록7>), At1G05805 (5‘-ATGTACCAATCATCATCCTCC-3’<서열목록8> / 5‘-CTTGCGGACTATAATCACTGG-3’<서열목록9>), DAD1 (5‘-CCATTGGACGACAATCTCCG-3’<서열목록10> / 5‘-AGTAGCCTTGCGATCTCTTC-3’<서열목록11>), DGL (5‘-GCTCAGCTTCTACGTTACGAC-3’<서열목록12> / 5‘-CAATGCGGCATATCTACTTTG-3’<서열목록13>), VSP1 (5‘-GAACTCTTAGAGAAAGAGGG-3’<서열목록14> / 5‘-GGACAATGCCATGAAGATAG-3’<서열목록15>), Thi2.1 (5‘-GCTCATAATGAGTCTGGTCA-3’<서열목록16> / 5‘-GGACTACATAGCTCTTGGTA-3’<서열목록17>), TUB (5‘-CTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA-3’<서열목록18> / 5‘-TCACCTTCTTCATCCGCAGTT-3’<서열목록19>)이다. 위 프라이머들은 아라비도시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 각 유전자 염기서열을 토대로 제작하였다.

<실시예 3 : 단백질의 세포 내 위치 조사 >

DGL과 GFP (Green Fluorescence Protein)가 결합된 재조합 단백질을 애기장대의 원형질체(protoplast)에서 발현시킨 후 세포 내 위치를 관찰하였다. 위의 단백질을 발현할 수 있는 재조합 DNA를 Kang et al. 이 1998년 Plant Molecular Biology에 보고한 방법을 참고하여 애기장대의 원형질체(protoplast)에 삽입하였다 (Kang, S.G., Jin, J.B., Piao, H.L., Pih, K.T., Jang, H.J., Lim, J.H. and Hwang, I. 1998. Plant Mol. Biol. 38: 155-199). GFP의 형광은 488 nm에서 활성화시킨 후 HQ515/30 필터를 이용하여 탐색하였으며, 엽록소의 자가형광은 568 nm에서 활성화시킨 후 E600LP 필터를 이용하여 탐색하였다. 본 작업은 바이오라드(Biorad)에서 제작한 공초점형광현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)을 이용하여 수행하였다.

<실시예 4 : JA의 함량 측정>

식물체 내의 JA 함량 측정은 GC-MS 방법을 이용하여 측정하였다. 발아 후 30일이 지난 애기장대의 잎을 1g 취합하여 JA 추출에 이용하였다. Dichloromethane/methanol 1:1 (v/v) 용액을 이용한 JA추출물을 HPLC를 통하여 메틸자스몬산(methyle jasmonate)와 자스몬산(jasmonate)로 분리하였다. 이 후 각 추출물을 GC-MS 방법을 이용하여 정량하였다.

<실시예 5: 병원체에 대한 저항성 측정 실험>

10 mM MgCl₂ + 250 ppm Tween 80 용액에 107 colony-forming unit / ml 농도로 희석되어진 슈도모나스 시린지( Pseudomonas syringae )를 애기장대의 식물체에 스프레이 한 후 22℃, 100% 습도 조건에서 16시간 배양하여 감염을 유도한다. 이 후 배양실로 옮긴 후 7일이 지난 후 병증을 비교하였다. 알터나리아 브라시시콜라( Alternaria brassicicola)의 경우 5 × 10⁵ conidia / ml 농도로 희석되어진 용액을 공기주입장치(air compressor)를 이용하여 애기장대의 잎에 주입하였다. 이 후 22℃, 100% 습도조건에서 16시간 배양하여 감염 유도 후 배양실로 옮겨 7일 후 병증을 비교하였다.

<실시예 6 :재조합 DNA의 제작>

DGL 유전자의 과발현 재조합 DNA의 제작을 위하여 우선 DGL 유전자의 DNA를 아라비도시스 염색체에서 PCR을 통하여 증폭하였다. 이 때 사용한 프라이머의 염기서열은 5‘-GCGCGGATCCATGGCGGCCAAAGTCTTCAC-3'<서열목록20> 5'-GCGCGGATCCCTAAAATATATTATAATACAAC-3'<서열목록21>이다. 이렇게 증폭된 PCR 반응물을 제한효소 BamHI으로 절단하고 이를 CaMV 35S 프로모터를 가지고 있는 벡터 pCAMBIA1303-BS linker의 BamHI 부위에 삽입하였다. 이 후 염기서열 분석을 통하여 염기서열 상의 문제가 없는 DNA를 선별 후 이 후 식물체 형질전환에 이용하였다.

DGL과 GFP가 결합된 재조합 DNA 제작을 위하여 우선 DGL 유전자의 DNA를 아라비도시스 염색체에서 PCR을 통하여 증폭하였다. 이 때 사용한 프라이머의 염기서열은 5‘-GCGCGGATCCATGGCGGCCAAAGTCTTCAC-3'<서열목록22>/ 5’-GGATCCTAAATATATTATAATACAT-3'<서열목록23>이다. 이렇게 증폭된 PCR 반응물을 제한 효소 BamHI으로 절단 후 이를 GFP를 가지고 있는 벡터 p326:GFP의 BamHI 벡터에 삽입하였다. 이 후 염기서열 분석을 통하여 염기서열 상의 문제가 없는 DNA를 선별한 후 이를 단백질 세포내 위치실험에 이용하였다.

이상의 실시 예를 통하여 명백하게 나타난 바와 같이, 식물체에서 자스몬산 생합성의 첫 단계를 담당하는 포스포리파제 A를 암호화하는 DGL이 과발현되어 자스몬산이 과생성됨으로써 병충해 저항성을 보이는 dgl -D 식물체를 이용하여 DGL의 기능을 밝힘으로써, 병충해에 대한 방어기작을 이해하고 농작물의 병충해 저항성이 증대된 실용작물로의 기술 도입에 보다 효율적으로 적용될 식물체를 제공하는데 큰 기여를 할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

병저항성 식물체에서 자스몬산 생합성에 관여하는 유전자 DGL(서열번호24).
제1항에 있어서, DGL은 식물호르몬 JA (jasmonic acid)의 생합성에 관련된 것으로 알려진 인지질분해효소 A (phospholipase A) 단백질 DAD1 (Defective in Anther Dehiscence 1, 서열번호25)과 아미노산 서열상으로 35.7% 유사성을 보이는 것을 특징으로 하는 유전자.
DGL 유전자가 과발현되어 자스몬산과 메틸자스몬산의 생합성량이 증가하여 식물체의 병충해 저항성이 증가한 특징을 갖는 조직배양에 의해 무성번식되는 dgl-D 애기장대 식물체.
제3항에 있어서, JA 생합성과 관련하여 DGL 유전자가 과발현되어 DGL 단백질의 하위 조절 단계 유전자인 VSP1과 Thi2.1의 과발현을 유도하는 특징을 갖는 DGL 유전자가 과발현되는 조직배양에 의해 무성번식되는 dgl-D 애기장대 식물체.