KR101438526B1 - 식물체의 종자 발아를 조절하는 ｍｙｂ７ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체의 종자 발아를 조절하는 MYB7 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 애기장대 유래의 MYB7 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 종자 발아가 증진되는 식물체 및 이의 종자, 상기 MYB7 유전자를 포함하는 재조합벡터로 식물체를 형질전환하여 MYB7 유전자를 과발현시켜 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의하면, 종자 발아율을 향상된 식물체를 제공할 수 있고, 재배자가 원하는 시기에 종자 발아를 유도할 수 있는 이점이 있다.

Description

식물체의 종자 발아를 조절하는 ＭＹＢ７ 유전자 및 이의 용도 {MYB7 gene regulating seed germination of plant and use thereof}

본 발명은 식물체의 종자 발아를 조절하는 MYB7 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 애기장대 유래의 MYB7 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 종자 발아가 증진되는 식물체 및 이의 종자, 상기 MYB7 유전자를 포함하는 재조합벡터로 식물체를 형질전환하여 MYB7 유전자를 과발현시켜 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법에 관한 것이다.

앱시스산(abscisic acid)은 식물의 성장 중에 일어나는 여러 과정을 억제하는 식물호르몬으로 흔히 에이비에이(ABA)라고 줄여서 말하기도 한다. 세스키테르펜의 일종으로 휴면 중의 종자, 나무눈, 구근 등에 많이 들어 있으며, 보통 발아되면서 함량이 감소한다. 식물의 수분결핍시 ABA가 많이 합성되면서 기공이 닫혀 증산을 억제하여 건조로부터 식물을 보호한다. 또한, 휴면을 유도하기도 하고, 식물이 스트레스를 받을 때 ABA의 함량이 증가하여 각종 스트레스로부터 식물이 견딜 수 있도록 한다 (McCarty, D.R., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46, 71-93 (1995), Giraudat, J. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 232-240 (1995); Addicott, F.T. (편집), 'Abscisic Acid', Praeger Scientific, 미국 뉴욕 (1983)). 또한, 앱시스산의 합성 저하는 식물 (예를 들어 옥수수)의 조숙한 발아 및 시들음 (wilting)의 원인이 되는 것으로 추측되고 있다 (McCarty, D.R. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46, 71-93 (1995); Addicott, F.T. ). 또한 ABA는 호분층에서 지베렐린에 의한 α-아밀라아제 mRNA의 증가를 방해한다.

앱시스산 합성을 제어할 수 있다면, 조숙한 발아의 억제 및 건조내성과 같은 식물 발현의 조절 또는 부여가 가능해질 것이다. 앱시스산 생합성에 관련하는 2종의 유전자가 식물로부터 분리되었다. 2종의 유전자 중 하나는 담배로부터 분리된 VP14이며 (Marvin, E. 등, EMBO J., 15: 2331-2342, 1996), 다른 하나는 옥수수로부터 단리된 VP14인데 (Tan, B-C 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12235-12240, 1997; Scheartz, S.H. 등, Science 276, 1872-1874), 이들 둘 모두는 트랜스포존을 이용하여 분리되었다.

그리고 ABA에 의해 유도되는 많은 유전자(앱시스산유도 유전자)도 알려져 있다. 대한민국 등록특허 제10-0990317호에는 식물병 저항성 및 세포 사멸에 관련된 유전자의 하나인 앱시스산 반응 단백질 유전자 1(Abscisic acid-responsive protein gene 1, CaABR1)에 대해 기재되어 있다.

한편, 식물에서 많은 종류의 MYB 단백질들은 염기 특이적인 DNA 결합(binding)을 통해서 특정 유전자들의 발현을 조절하여 대사과정 및 발육 과정의 전사 조절에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 애기장대에는 약 125종이 알려져 있다. MYB 단백질, 예컨대 AtMYB2, AtMYB52, AtMYB15 및 AtMYB44는 또한 ABA 및 비생물학적 스트레스 반응을 조절한다.

MYB 단백질은 ABA 및 스트레스 반응뿐만 아니라 다수의 기타 세포 과정에 관여한다. 일련의 최근 연구들은 MYB52을 포함하는 다수의 MYB 유전자가 2차세포벽 생합성 조절에 관여한다는 것을 보여줬다. 예를 들어, MYB58 및 MYB63은 리그닌 생합성의 조절자들이고, MYB103, MYB85, MYB52 및 MYB54는 2차벽 비후를 제어한다. MYB 전사 인자들 사이에는 계층적인 관계가 존재하며, MYB52가 애기장대(Arabidopsis)에서의 2차세포벽 형성을 위한 마스터 스위치인 MY46의 다운스트림 표적들 중 하나임이 증명된 바 있다.

대한민국 공개특허 제2012-0097555호에는 애기장대 유래 MYB52 유전자로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 가뭄 내성 및 ABA에 대한 민감성을 조절하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 가뭄 내성 및 ABA에 대한 민감성이 조절된 식물체 및 그의 종자에 관해 기재되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제2012-0061518호에는 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 MYB96 (myb domain protein 96) 유전자를 포함하는 재조합벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 에피큐티클 왁스(epicuticular wax) 생합성을 증가시키는 방법, 애기장대 유래 MYB96 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 에피큐티클 왁스 생합성이 증가된 형질전환 식물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 에피큐티클 왁스 생합성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자에 대해 기재되어 있다. 그러나, 애기장대 유래 MYB7 유전자가 ABA 신호전달의 네거티브 조절자로서 식물 종자의 발아를 조절하는 것에 대해 알려진 바는 없다.

대한민국 공개특허 제2012-0097555호(2012.09.05) 대한민국 공개특허 제2012-0061518호(2012.06.13)

본 발명은 상기와 같은 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명자들은 애기장대 유래 MYB7 유전자가 ABA 신호전달의 네거티브 조절자로서 식물 종자의 발아를 조절한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 애기장대 유래의 MYB7 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 종자 발아가 증진되는 식물체 및 이의 종자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 MYB7 유전자를 포함하는 재조합벡터로 식물체를 형질전환하여 MYB7 유전자를 과발현시켜 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 MYB7 (myb domain protein 7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 종자 발아가 증진되는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 MYB7 (myb domain protein 7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 MYB7 유전자를 과발현시켜 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 MYB7 (myb domain protein 7) 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하여 식물체의 종자 발아를 억제시키는 방법 및 이에 의한 발아가 억제된 종자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 MYB7 (myb domain protein 7) 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하거나 과발현하여 식물체의 잔뿌리 생장을 조절하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.

본 발명은 MYB7 (myb domain protein 7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 종자 발아가 증진되는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 MYB7 (myb domain protein 7)는 바람직하게는 애기장대 유래일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, MYB7 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 식물 유래의 MYB7 (myb domain protein 7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 MYB7 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(하이그로마이신), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(아그로박테리움 tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나,이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두,살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리 및 유채 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대이다.

본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 종자는 쌍자엽 식물의 종자일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대의 종자이다.

본 발명은 또한, MYB7 (myb domain protein 7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 MYB7 유전자를 과발현시켜 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법을 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202,179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다. 식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루,종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법에서, 상기 MYB7 유전자는 배추, 애기장대, 보리, 옥수수, 완두, 기장, 해바라기, 밀 등의 유래일 수 있으며, 바람직하게는 애기장대 유래일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대이다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 MYB7 (myb domain protein 7) 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하여 식물체의 종자 발아를 억제시키는 방법 및 이에 의한 발아가 억제된 종자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 MYB7 단백질 코딩 유전자의 발현의 저해는 MYB7 단백질 코딩 유전자의 돌연변이, MYB7에 대한 RNAi 또는 MYB7 단백질 저해제에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 MYB7 단백질 코딩 유전자의 돌연변이는 MYB7 단백질 코딩 유전자의 녹아웃 돌연변이일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 MYB7 (myb domain protein 7) 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하거나 과발현하여 식물체의 잔뿌리 생장을 조절하는 방법을 제공한다. 식물성체의 경우엔 RD29a와 DREB2a같은 ABA 경로 하위의 유전자들이 M7 KO의 경우 발현을 적게 하는 것으로 나타나 종자와는 다르게 ABA 경로를 유도하며, 특히 뿌리 쪽 생장에 관여하는 것을 확인하였다(도 7 참조).

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 종자 발아가 증진된 식물체를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 MYB7 유전자를 특정 식물에 과발현을 통해 좋지 못한 환경에서도 발아를 유도하거나, knock-out 시켜서 종자의 발아를 억제하여 재배자가 원하는 시기에 발아를 유도할 수 있다.

나아가, 본 발명에 의하면 향후 ABA signaling 연구를 통한 내염성 혹은 내건성 유전자 변형식물을 육종 시 key factor로써, 중요한 marker gene으로도 사용이 가능하다.

또한, 본 발명에 의해 MYB7 유전자의 발현을 저해하거나 과발현하여 식물체의 잔뿌리 생장을 조절할 수 있다.

도 1 및 도 2는 MYB 유전자의 종류 및 분류를 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 3은 RT-PCR을 통한 스트레스별 MYB7 발현 양상을 나타내는 도면이다.
도 4는 Northern blotting을 통한 ABA signaling 관련 유전자들의 발현 양상을 나타낸 도면이다.
도 5는 Real-time PCR을 통한 ABA signaling 하위 유전자들의 발현 양상을 나타낸 도면이다.
도 6은 MYB7 돌연변이와 과발현체의 발아율을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 MYB7 돌연변이와 과발현체의 잔뿌리 길이를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실험방법

1. MYB7 cloning

발아 후 2주일 된 Wild-type 애기장대 성체의 mRNA를 ATA 방법을 통해 추출하였다. 이 mRNA를 RT-PCR을 통해 cDNA로 합성 후, 이를 주형으로 MYB7 promoter 양 끝 자리 20, 23bp(F-ATGGGAAGATCTCCTTGCTG, R-TTATTTCATTTCCAAGCTTCGAA)와 같은 sequence를 갖는 primer를 이용하여 PCR 하였다. 그 후 전기영동을 통하여 증폭된 MYB7을 확인하고, 젤에서 용출하였다. 용출된 DNA조각(0.8kb)을 topo vector(pCR　8/GW/TOPO : invitrogen)에 삽입하고 이를 다시 Over-expression vector인 pMDC32 vector에 LR reaction(LR Clonase　 : invitrogen)하였다. 이후 E.coli cell(TOP10 cell : invitrogen)에 heat-shock transformation 방법으로 형질전한 후 colony가 생성 될 때까지 배양하였다(37도, 12시간). 이후 생성된 colony를 다시 LB 배지에 다시 배양 후 plasmid vector를 추출하였다.

2. 식물에 MYB7 형질전환

위와 같이 준비된 MYB7 OX vector를 Agrobacteria에 electric shock transformation방법으로 형질전환한 후 배양하였다. 형질전환된 Agrobacteria를 floral dipping transformation을 통해 준비된 wild-type 애기장대에 형질전환하였다. 이후 형질전환된 식물로부터 씨를 수확하고 3세대까지 selfing하여 homologous line을 확보하였다. 이후 GUS staining solution을 이용하여 씨를 염색하였다.

3. 스트레스 처리

발아 후 4일 된 Wild-type과 MYB7 돌연변이 애기장대 유묘를 75, 100mM NaCl, 2% sucrose MS 배지에 각각 옮긴다. 그 후 일주일 뒤 표현형을 관찰하였다.

건조된 Wild-type과 MYB7 돌연변이, 과발현 애기장대 씨를 2일간 물에 4℃ 암처리 춘화처리 후 각각 100, 150mM NaCl, 0.1, 1μM ABA 2% sucrose MS 배지에 심고 시간별로 발아율을 확인하였다.

4. Real-time PCR

Real-time PCR mixture로는 3차 증류수 3 μl template DNA 1 μl, 10x SYBR mixture 10μl(Evergreen사), 1 μM forward 및 reverse primer를 사용하였다.

Real-time PCR 조건은 95℃에서 15분간 실시 후, 95℃에서 30초, 56℃에서 40초, 72℃에서 30초를 42 cycle 수행하고 마지막에 72℃에서 5분간 반응하였다. 기기는 Real-Time PCR(Bio-rad : CFX-96)을 이용하였다. Ct값은 형광커브와 역치선이 만나는 cycle 값으로 CFX manager(Bio-rad)로 분석하였다.

5. Northern Blotting

발아 후 2주일 된 Wild-type 애기장대 성체의 mRNA를 ATA 방법을 통해 추출하였다. 20μg의 mRNA를 1% agarose/2M MOPS/2.2M formaldehyde gel에서 80V로 2시간 전기영동을 한 후 Hybond-XL membrane(GE Healthcare: RPN 303S)에 이틀 transfer 시켰다. 이후 1200x100 μJ/㎠ 로 UV crosslinking을 하고 hybridaztion buffer로 1hr동안 65℃에서 pre-hybridaztion을 하였다. probe로는 MYB7 유전자를 [32P]-dCTP (50μCi)로 random primer mixture와 dNTP mixture를 같이 넣어 1시간 incubation을 통해 labeling을 한다. 표지된 probe를 65℃에서 membrane과 함께 18시간 hybridaztion시켰다. 1xSSC/0.1% SDS solution으로 15분간 2번, O.1xSSC/0.1% SDS solution으로 10분간 한번 42℃에서 washing 한 후 BAS에 붙여 카셋트에 하루 암반응 시킨 후 Multiplex Bio-Imaging System(Fujifilm : FLA-7000)을 통해서 이미지를 현상하였다.

실시예 1. RT-PCR을 통한 스트레스별 MYB7 발현 양상

MYB7의 경우 도 1과 같이 MYB family 유전자에 속하며, 그 중에서도 R2/R3 type에 속한다. 그리고 M7과 비슷한 염기서열을 가진 subfamily가 있는데, 도 2와 같이, 여기에는 MYB32, 4, 6, 3 등이 속한다. 그 중 가장 높은 유사성을 가진 유전자가 MYB32로 이미 애기장대에서 화분 생성 등에 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다. 그리고 MYB 유전자들은 전사조절이 주 기능이기에, 이 유전자 자체가 많은 다른 신호들에 의해 조절 받는 것으로 알려져 있다. 따라서, 조사한 것이 도 2의 (B)이며, 표에서 보이는 MBS라는 자리는 MYB binding site의 약자로, 다른 MYB 도메인을 가진 단백질이나 혹은 MYB7 자체가 저 자리에 붙어 전사를 조절할 것으로 예상된다.

그리고 이러한 MYB7이 어떠한 스트레스에 특이적으로 발현하는지 알아보기 위하여, 애기장대의 야생형인 col-0 식물을 대표적 호르몬과 스트레스를 처리한 후 RT(Reverse transcription)-PCR을 이용하여 확인하였다. 그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, ABA와 NaCl 처리시 발현 양이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. MYB7 녹아웃(knock-out) 돌연변이 식물에서의 ABA signaling 관련 유전자들의 발현 양상

실시예 1에서 나타난 특이적 발현과 기존에 알려진 다른 스트레스 마커 유전자들과 어떠한 관계가 있는지 알아보기 위해, 도 4와 같이 야생형 col-0와 MYB7 유전자가 발현하지 못하는 knock-out 돌연변이 식물(myb7)에 스트레스를 처리 한 후 northern blot을 해보았다. 그 결과, 염화, 건조 스트레스에 반응하는 RD29a, DREB2a 같은 유전자들이 MYB7 유전자가 녹아웃되자 발현이 적어지는 것을 확인하였다. 그리고 이 유전자들은 ABA 경로에 의해 크게 조절 받는 것으로 알려져 있기 때문에, 도 3에서와 같이 MYB7은 ABA에 의해 조절 되고, ABA 경로 상에 위치한다고 추측하였다. 도 5의 경우 이러한 양상을 다시 확인하기 위하여 real-time PCR을 통해 재확인한 결과이다.

또한 ABA는 식물 종자 발아에 밀접한 관련이 있기 때문에, M7이 발아에도 어떠한 관련이 있는지 알아보기 위하여 Col-0, M7 KO 돌연변이, M7 과발현 돌연변이 식물의 종자를 스트레스 처리하여 발현 양상을 확인해 보았다. 도 4의 아래 도면에 나타난 바와 같이, ABA 경로 상에서 중요한 유전자로 알려진 ABI5와 3을 확인하였다. 그 결과, ABI5가 스트레스 하에서 MYB7이 없는 경우 야생형에 비해 발현양이 현격히 증가함을 알 수 있었다. 이것으로 미루어 보아, M7이 ABI5를 직, 간접적으로 억제하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. MYB7 돌연변이와 과발현체의 표현형 분석

1) 발아율 비교

유전자의 발현측면을 확인하였으므로 그에 따른 표현형이 있는지 확인하기 위해 발아율을 측정하였는데, 그 결과를 도 6에 나타내었다. NaCl과 ABA 스트레스 배지 하에서 종자를 심고 최대 6일 동안 발아율을 측정하였다. 그 결과 MYB7 녹아웃 종자(atmyb7)는 발아율이 모든 스트레스 하에서 Col-0보다 낮았으며 MYB7 과발현체는 Col-0와 비슷하거나 높았다. 이로써 MYB7이 발아율에 직접적 영향을 준다는 것을 확인하였다.

2) 잔뿌리 길이 비교

도 4에서도 나타난 바와 같이, 성체에서도 스트레스에 발현양이 변하였기에 그에 따른 표현형이 없는지 성체에서 확인해 보았다. 발아 후 4일된 성체를 스트레스 배지에 옮긴 후 일주일 후 관찰하였다. 그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 주뿌리의 길이는 차이가 없는데 반해, 잔뿌리의 경우 MYB7 녹아웃 종자(atmyb7)가 NaCl 스트레스 하에서 그 수가 적고 길이가 짧아지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 식물의 성체의 경우 MYB7이 뿌리 생장에 영향을 끼친다는 것을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, MYB7은 종자와 성체에서 각각의 역할이 다르며, ABA 경로, 특히 NaCl에 특이적으로 발현하였다. 또한 종자의 경우, 스트레스 하에서 발아 억제를 방해하는 역할을 하는 것으로 확인 하였다. ABI5는 ABA 경로 상에서 종자 발아를 지연, 혹은 휴면 유도를 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 유전자가 M7 KO 돌연변이에서 발현이 증가하는 것은, 역으로 ABI5가 MYB7에 의해 억제되고 있음을 말해준다. 그렇기 때문에 종자에서 MYB7의 역할은, 스트레스가 오면 ABA경로가 굉장히 강하게 발아를 억제하므로 균형을 유지하기 위한 조절자라는 것이 확인되었다. 식물성체의 경우엔 RD29a와 DREB2a같은 ABA 경로 하위의 유전자들이 M7 KO의 경우 발현을 적게 하는 것으로 나타나 종자와는 다르게 ABA 경로를 유도하며, 특히 뿌리 쪽 생장에 관여하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> MYB7 gene regulating seed germination of plant and use thereof <130> P11-121203-01 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 810 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgggaagat ctccttgctg cgagaaagaa cacatgaaca aaggtgcttg gactaaagaa 60 gaagatgaga gactagtctc ttacatcaag tctcacggtg aaggttgttg gcgatctctt 120 cctagagccg ctggtctcct tcgctgcggt aaaagctgcc gtcttcggtg gattaactat 180 ctccgacctg atctcaaaag aggaaacttt acacatgatg aagatgaact tatcatcaag 240 cttcatagcc tcctaggcaa caagtggtct ttgattgcgg cgagattacc tggaagaaca 300 gataacgaga tcaagaacta ctggaacaca catataaaga ggaagctttt gagcaaaggg 360 attgatccag ccactcatag agggatcaac gaggcaaaaa tttctgattt gaagaaaaca 420 aaggaccaaa ttgtaaaaga tgtttctttt gtgacaaagt ttgaggaaac agacaagtct 480 ggggaccaga agcaaaataa gtatattcga aatgggttag tttgcaaaga agagagagtt 540 gttgttgaag aaaaaatagg cccagatttg aatcttgagc ttaggatcag tccaccatgg 600 caaaaccaga gagaaatatc tacttgcact gcgtcccgtt tttacatgga aaacgacatg 660 gagtgtagta gtgaaactgt gaaatgtcaa acagagaata gtagcagcat tagctattct 720 tctattgata ttagtagtag taacgttggt tatgacttct tgggtttgaa gacaagaatt 780 ttggattttc gaagcttgga aatgaaataa 810

Claims (7)

1. MYB7 (myb domain protein 7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 종자 발아가 증진되는 식물체.
2. 제1항에 따른 식물체의 종자.
3. MYB7 (myb domain protein 7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 MYB7 유전자를 과발현시켜 식물체의 종자 발아를 증진시키는 방법.
4. MYB7 (myb domain protein 7) 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하여 식물체의 종자 발아를 억제시키는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 MYB7 단백질 코딩 유전자의 발현의 저해는 MYB7 단백질 코딩 유전자의 돌연변이, MYB7에 대한 RNAi 또는 MYB7 단백질 저해제에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제4항 또는 제5항에 의해 제조된 종자 발아가 억제된 식물체.
7. MYB7 (myb domain protein 7) 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하거나 과발현하여 식물체의 잔뿌리 생장을 조절하는 방법.

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