CN101423549A

CN101423549A - 来源于甘薯根的IbTIP1基因及其启动子

Info

Publication number: CN101423549A
Application number: CNA2007101608921A
Authority: CN
Inventors: 郭尚洙; 李幸顺; 金且英; 金善衡; 梁暻实; 宋完根
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 2007-10-30
Filing date: 2007-12-27
Publication date: 2009-05-06
Anticipated expiration: 2027-12-27
Also published as: CN101423549B; KR101054853B1; KR20090043754A

Abstract

本发明涉及一种来源于甘薯根的IbTIP1基因及其启动子，更具体而言，涉及在甘薯根部强表达且其表达被各种应激所诱导的来源于甘薯根(Ipomoea batatas L.Lam)的IbTIP1基因及其启动子。本发明的IbTIP1基因及其启动子可适用于适合条件不良地区的耐环境应激性植物体、能够生产出淀粉、功能性蛋白质等有用原料的转型甘薯的开发，或者生产生物乙醇用的亲环境性代替能源作物的开发。

Description

来源于甘薯根的IbTIP1基因及其启动子

技术领域

本发明涉及来源于甘薯根的IbTIP1基因及其启动子(promoter)，更具体而言，涉及在甘薯(Ipomoea batata)根部能够强表达且其表达被各种应激(stress)所诱导的来源于甘薯根的IbTIP1基因及其启动子。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas L.Lam)不仅可以在比较贫瘠的土壤中栽培，而且每公顷的产量可高达约22吨，是被用作粮食和家畜饲料的具有代表性的根作物。尤其，干燥甘薯的重量中约70％由淀粉构成，因此一直以来利用于酒精的原料作物，最近还被用作用于生产生物乙醇的亲环境性代替能源作物。

最近，因快速的产业化和人口增加而提出了全球性的环境问题和粮食问题，因而对于在沙漠化地区、公害地区、寒冷地区等条件不好的地区也适于生存的耐环境灾害性农作物的开发也非常活跃。特别是，为了开发适于不良条件地区的产业用甘薯，已有人开始进行基于分子育种的耐环境灾害性转型甘薯的研究(Lim et al.Mol Breeding 19，227—239，2007)。

为了开发在干燥、寒冷等恶劣的土壤中使幼植物体的初期生长变得良好的耐环境灾害性甘薯，迫切需要开发出在甘薯须根(fibrous root)异常高表达的基因。认为在由水分不足导致的干燥应激条件下，须根的发达程度对块根的成长很重要。还有，由于须根发达、生长为块根，因此认为若要从块根生产出有用的原料，则在须根高表达的基因的开发研究尤为重要。但是在甘薯的幼根异常高表达的基因尚未被报道。只是很久以前在块根(tuber)高表达的对孢子囊(sporamin)蛋白质编码化的基因被分离并进行研究(Hattori et al.Plant Mol Biol 14，595—604，1990)。

从这种观点出发，可以认为在甘薯须根异常强表达的基因的分离，能够有效地利用于耐环境灾害性植物体及生产各种有用原料的转型甘薯的开发。即，如果根据利用尖端生命工学技术的代谢工学开发出可生长在干燥地区、荒地、公害地区等极限农地(条件不良地区)且可生产出淀粉、功能性蛋白质等在产业上有用的原料的甘薯品种，则有望在不影响粮食供求的情况下生产亲环境性生物能源等。

本发明的TIP(tonoplast intrinsic protein)是被分类为与耐干燥性有密切关系的作为水分传输通道的蛋白质(water channel protein)即水通道蛋白(aquaporin)基因群的基因(Chrispeels et al.Trends Biochem Sci 19，421—425，1994)。有人报道了从耐干燥的Craterostigma plantagineum分离得到的TIP基因，在经过干燥处理及作为植物应激激素的脱落酸(abscisicacid，ABA)处理之后其表达会增强(Mariaux et al.Plant Mol Biol 38，1089—1099，1998)。还报道有水分应激也可以诱导从橄榄树(Olea europaea)分离得到的TIP基因的表达(Secchi et al.Genbank accession numberABB76813，2005)。但从未报道过甘薯中的TIP基因。

发明内容

针对于此，本发明人等确认了从已干燥的甘薯须根分离的IbTIP1基因不仅够强在甘薯根特别是在须根组织能表达，而且通过分离该基因的启动子并确定碱基序列，确认了与应激相关的主要的顺式作用要素(cis—actingelement)的存在，从而完成了本发明。

本发明的目的在于提供来源于甘薯根的IbTIP1基因及其启动子。

为了实现所述目的，本发明提供来源于甘薯根的IbTIP1蛋白质及其氨基酸序列。

另外，本发明提供对所述IbTIP1蛋白质编码的多核苷酸。

另外，本发明提供包含所述多核苷酸的载体。

另外，本发明提供用包含所述多核苷酸的载体转型(transformation)的转型体。

另外，本发明提供显示能诱导须根异常基因表达的启动子活性的多核苷酸。

另外，本发明提供包含所述多核苷酸的全部或一部分的载体。

另外，本发明提供用包含所述多核苷酸的全部或一部分的载体转型的转型体。

另外，本发明提供在应激下可诱导外来蛋白质的生产的转型体的制造方法。

另外，本发明提供使外来蛋白质在根部高表达的方法。

附图说明

图1是表示本发明的来源于甘薯根的IbTIP1基因的碱基序列和由此推断的氨基序列的图。NPA是存在于水通道蛋白中的天冬酰胺—脯氨酸—丙氨酸基序。

图2a是表示本发明的IbTIP1基因的推断蛋白质的氨基酸序列和拟南芥膜内在蛋白质(MIP)之间的类缘关系的图。在此，PIP表示质膜嵌入蛋白(plasmamembrane intrinsic protein)，SIP表示小且基本的嵌入蛋白(small and basic intrinsic protein)，NIP表示结瘤素-26类似嵌入蛋白(nodulin—26 like intrinsic protein)。

图2b是表示对本发明的IbTIP1基因的推断蛋白质的氨基酸序列和拟南芥植物的TIP基因氨基酸序列进行比较的图。

图3是甘薯根的照片和本发明的IbTIP1基因在甘薯的各组织表达的状态的RT—PCR电泳照片。L，leaf(叶)；S，stem(茎)；Fr，fibrous root(须根)；Tp，thick pigmented root(粗根)；Tb，tuberous root(贮藏根)。

图4是对甘薯叶和须根进行干燥和植物激素ABA处理之后本发明的IbTIP1基因表达的状态的RT—PCR电泳照片。

图5是确认本发明的IbTIP1基因存在于甘薯的基因组相的萨慎印迹照片。

图6是进行用于分离本发明的来自甘薯根的IbTIP1基因启动子的基因组步查(

)的电泳照片。通过2次PCR，从Dral和Stul基因文库得到1.0kb和3.4kb的大小不同的两种PCR产物。

图7是表示本发明的来源于甘薯根的IbTIP1基因启动子的碱基序列的图。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

本发明提供来源于甘薯根的IbTIP1蛋白质及其氨基酸序列。

本发明的IbTIP1蛋白质的特征在于具有以序列号2记载的氨基酸序列。

本发明的IbTIP1蛋白质包括251个氨基酸，在水通道蛋白质结构中存在于环(loop)B和E相的NPA(Asn—Pro—Ala，天冬酰胺—脯氨酸—丙氨酸)基序(motif)还很好地保存在IbTIP1蛋白质氨基酸序列中(参照图1)。还有，当利用基因研究的计算机程序(Blastx)检查本发明的IbTIP1的编码部分时发现，其显示出与含羞草(Minosapudica)的TIP1；2、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的gamma—TIPs组[At4g01470(AtTIP1；3)，At3g26520(AtTIP1；2)，At2g36830(AtTIP1；1)]的高的相同性(74％～78％氨基酸)(参照图2a及2b)。

还有，本发明提供对所述IbTIP1蛋白质编码的多核苷酸。

所述多核苷酸对具有以序列号2记载的氨基酸序列的蛋白质编码，优选具有以序列号1记载的碱基序列。

本发明的IbTIP1 cDNA基因的总长度为1065bp，包含82bp的5’—非翻译区(UTR)和197bp的3’—非翻译区以及753bp的编码部分(包括251个氨基酸)(参照图1)。

对本发明的来自甘薯的IbTIP1蛋白质编码的基因，在甘薯的基因组相中以多数群(family)存在(参照图5)，在须根(fibrous root)强表达，还在粗根(thick pigmented root)、贮藏根(tuberous root)组织有被表达。不过，在叶(leaf)和茎(stem)组织中显示出弱表达的状态(参照图3)。因而，可知从经干燥处理的甘薯根组织中分离得到的本发明的IbTIP1基因，为在包括须根的根部中高表达的基因。

还有，本发明的IbTIP1基因在叶组织中进行干燥处理开始过1小时之后其表达逐渐增加且在过4—8小时时显示表达顶点，之后显示出减少的状态(参照图4a)。相反，在须根组织中未观测到基于干燥处理的IbTIP1的表达量的增减(参照图4a)。这可能是由于在正常状态下IbTIP1基因的表达量高的缘故。

还有，通过用与干燥应激有关的植物激素即脱落酸(ABA)处理，也显示出了与干燥处理相似的表达图案(参照图4b)。

另外，本发明提供包含所述多核苷酸的载体。

包含于本发明载体的基因，包括对本发明的IbTIP1编码的多核苷酸，优选包括具有以序列号1记载的碱基序列的多核苷酸。作为用于插入所述基因的载体，优选使用pKBS1—1载体、pBI101载体、pCAMBIA载体中的任意一种，只要是通常的植物转型用表达载体，则利用哪一个都无妨。

另外，本发明提供用包含所述多核苷酸的载体转型的转型体。

所述转型体包括被转型的微生物、动物细胞、植物细胞、被转型的动物或植物体以及来自它们的培养细胞等。

本发明的多核苷酸是IbTIP1基因的启动子，其特征在于具有以序列号3记载的碱基序列。即，IbTIP1基因的启动子包括与从IbTIP1p_1.6的翻译起点的上端至—1,597bp的区域相对应的碱基序列(参照图7)。本发明的IbTIP1p_1.6启动子中存在对脱落酸及干燥应激进行反应的各种顺式作用要素(cis—acting element)，还存在有多个植物抗病性相关因子。还有，从与根部表达相关的因子的存在来看，可适用于根部特异表达启动子的研究。特别是由于包含很多干燥应激反应因子，因此可适用于对干燥应激具有耐性的植物体的开发。

具体而言，对启动子的碱基序列进行分析的结果，确认了IbTIP1p_1.6启动子如下所述地具有各种真核生物启动子的控制因子区。用于引发转录的TATA—盒存在于—115～—106位，另外CAAT—盒存在于—155～—152位。作为转录控制蛋白质的结合区，被公认的对脱落酸(ABA)反应的重要因子的ABRE的共同序列(consensus sequence)ACGTG序列反复存在于—208～—204及—196～—191两个位置，还存在于

—196～—191位置。对脱落酸(ABA)的信号传递过程及干燥应激反应的MYB蛋白质要结合的多个MYB—认别部位共同序列(CNGTTR或者C/TAACG/TG)存在于—1577～—1572、—1406～—1401

—1398～—1393、—470～—465、—468～—462

位。还有，对干燥反应的MYC蛋白质要结合的MYC—认别部位共同序列(CANNTG)在—926～—921及—149～—144位被发现。还有，作为对干燥应激及低温反应的DREB1/CBF蛋白质要结合的位置的DRE/CRT(dehydration—responsiveelement/C—repeat)因子的共同碱基序列(G/ACCGAC)在—332～—327位被发现。对抗病性起重要作用的WRKY蛋白质要结合的多个W—盒(TTGAC)的碱基序列存在于—1236～—1232、—738～—734

、—672～—668、—648～—644位。根据植物体内的信号传递物质赤霉素(gibberellin，GA)而控制表达的GARE—因子的共同碱基序列(TAACAGA)在—431～—425及—371～—365位被发现。还有，作为与根部表达相关的ACGT—基序(motif)的GCCACGTGGC序列也在—198～—189位被发现。除此之外，还发现多个作为对光反应的因子而已知的GT1—盒(GGTTAA)(参照图7)。

如上所述，本发明的IbTIP1基因的启动子根据应激可以有效地诱导基因的表达。为此，本发明的启动子包含辨认脱落酸、干燥、植物病、光或低温引起的应激的因子。IbTIP1基因的启动子利用这些特性可利用于融合基因构造物的制造，所述融合基因构造物包括由以序列号3记载的碱基序列的全部或它们的一部分构成且显示启动子活性的DNA序列及以能够与所述DNA序列作用的方式连结的结构基因构成。所述融合基因构造物使与有用物质的生产相关的结构基因与IbTIP1基因的启动子连结，在各种应激下根据IbTIP1基因的启动子的控制来表达有用物质，从而可适用于用于生产有用物质的转型体的制造。

还有，如果在所述融合基因构造物中作为结构基因使用对各种环境应激显示耐性的基因，则还可利用于在施加外部应激的情况下对此具有耐性的转型体的制造。

另外，本发明提供包含所述多核苷酸的载体。

包含于本发明的载体中的多核苷酸是本发明的IbTIP1基因的启动子的全部或一部分，优选包含以序列号3记载的碱基序列的全部或一部分。作为用于插入所述基因的载体，优选使用pKBS1—1载体、pBI101载体、pCAMBIA载体中的任意一种，只要是通常的植物转型用表达载体，则利用哪一个都无妨。

并且，本发明提供在各种应激下可利用所述IbTIP1基因的启动子诱导外来蛋白质的生产的转型体的制造方法。

所述转型体的制造方法包括：

1)制造表达载体的步骤，该载体包含如下的基因组成(gene construct)，所述基因组成包含由以序列号3记载的碱基序列的全部或一部分构成且显示启动子活性的多核苷酸、以及对以能与所述多核苷酸作用的方式连结的外来蛋白质编码的多核苷酸，

2)向宿主细胞导入所述表达载体的步骤，

3)挑选导入了所述表达载体的转型体的步骤。

所述“转型体”是指利用表达载体来转型的细胞或植物体，所述表达载体包含IbTIP1基因的启动子和包括对以能够与启动子作用的方式连结的外来蛋白质编码的DNA序列的基因组成。在本发明中转型体包括被转型的微生物、动物细胞、植物细胞、被转型的动物或植物体以及来自它们的培养细胞等。

本发明的方法中，外来蛋白质包括发挥药理效果的蛋白质或向转型体赋予对于应激的耐性的蛋白质等。因而，根据本发明的方法，可以制造可生产出有用物质的转型体以及对于各种环境应激具有耐性的转型体。

所述各种环境应激可被脱落酸、干燥、植物病、光或低温等诱导，辨认这些的因子被包含于所述启动子中。

并且，本发明提供使外来蛋白质在根部高表达的方法，该方法包括：

1)制造表达载体的步骤，该载体包含如下的基因组成，所述基因组成包含由以序列号3记载的碱基序列的全部或一部分构成且显示启动子活性的多核苷酸、以及对以能与所述多核苷酸作用的方式连结的外来蛋白质编码的多核苷酸，

2)向宿主植物细胞导入所述表达载体的步骤，

3)挑选导入了所述表达载体的转型植物细胞的步骤，

4)诱导所述转型植物细胞的发芽而制造胼胝体(callus)的步骤，

5)诱导所述胼胝体的分化而制造转型植物体的步骤，

6)栽培所述转型植物体的步骤。

所述植物细胞优选为单子叶植物或双子叶植物，但不限于此。

所述单子叶植物优选泽泻科(Alismataceae)、水鳖科(Hydrocharitaceae)、水麦冬科(Juncaginaceae)、冰沼草科(Scheuchzeriaceae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)、茨藻科(Najadaceae)、大叶藻科(Zosteraceae)、百合科(Liliaceae)、血草科(Haemodoraceae)、龙舌兰科(Agavaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、雨久花科(Pontederiaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、水玉簪科(Burmanniaceae)、灯心草科(Juncaceae)、鸭跖草科(Commelinaceae)、谷精草科(Eriocaulaceae)、禾本科(稻科，Gramineae，Poaceae)、天南星科(Araceae)、浮萍科(Lemnaceae)、黑三棱科(Sparganiaceae)、香蒲科(Typhaceae)、莎草科

，Cyperaceae)、芭蕉科(Musaceae)、姜科(Zingiberaceae)、美人蕉科(Cannaceae)、兰科(Orchidaceae)，但不限于此。

所述双叶植物优选岩梅科(，Diapensiaceae)、山柳科(Clethraceae)、鹿蹄草科(Pyrolaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、紫金牛科(Myrsinaceae)、报春花科(Primulaceae)、白花丹科(Plumbaginaceae)、柿科(Ebenaceae)、安息香科(Styracaceae)、

山矾科(Symplocaceae)、木犀科(

Oleaceae)、马钱科(Loganiaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、莕菜科(Menyanthaceae)、夹竹桃科(

Apocynaceae)、萝藦科(Asclepiadaceae)、茜草科(Rubiaceae)、花荵科(Polemoniaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)、唇形科(Labiatae)、茄科(Solanaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、紫葳科(Bignoniaceae)、爵床科(Acanthaceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、列当科(Orobanchaceae)、苦苣苔科(Gesneriaceae)、狸藻科(Lentibulariaceae)、透骨草科(Phrymaceae)、车前科(Plantaginaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、五福花科(Adoxaceae)、败酱科(Valerianaceae)、川续断科(Dipsacaceae)、桔梗科(Campanulaceae)、菊科(Compositae)、杨梅科Myricaceae、胡桃科(Juglandaceae)、杨柳科(Salicaceae)、桦木科(Betulaceae)、壳斗科(

Fagaceae)、榆科(Ulmaceae)、桑科(Moraceae)、荨麻科(Urticaceae)、檀香科(Santalaceae)、桑寄生科(Loranthaceae)、蓼科(

Polygonaceae)、商陆科(

Phytolaccaceae)、紫茉莉科(Myctaginaceae)、番杏科(Aizoaceae)、齿苋科(Portulacaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、苋科(Amaranthaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、八角科(llliciaceae)、樟科(Lauraceae)、连香树科(Cercidiphyllaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、小檗科(Berberidaceae)、木通科(Lardizabalaceae)、防己科(

Menispermaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、金鱼藻科(Ceratophyllaceae)、莼菜科(Cabombaceae)、三白草科(Saururaceae)、胡椒科(Piperaceae)、金粟兰科(Chloranthaceae)、马兜铃科(Aristolochiaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、山茶科(

Theaceae)、藤黄科(Guttiferae)、茅膏菜科(Droseraceae)、罂粟科(Papaveraceae)、白花菜科(Capparidaceae)、十字花科(Cruciferae)、悬铃木科(

Platanaceae)、金缕梅科(Hamamelidaceae)、景天科(

Crassulaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、杜仲科(Eucommiaceae)、海桐花科(Pittosporaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、豆科(Leguminosae)、酢浆草科(Oxalidaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、金莲花科(Tropaeolaceae)、蒺藜科(Zygophyllaceae)、亚麻科(Linaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、水马齿科(Callitrichaceae)、芸香科(Rutaceae)、苦木科(Simaroubaceae)、楝科(Meliaceae)、远志科(Polygalaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、槭树科(

Aceraceae)、无患子科(Sapindaceae)、七叶树科(Hippocastanaceae)、清风藤科(Sabiaceae)、凤仙花科(

Balsaminaceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、卫矛科(

Celastraceae)、省沽油科(Staphyleaceae)、黄杨科(Buxaceae)、岩高兰科(Empetraceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae)、杜英科(Elaeocarpaceae)、椴树科(Tiliaceae)、锦葵科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、瑞香科(Thymelaeaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、刺篱木科(Flacourtiaceae)、堇菜科(Violaceae)、西番莲科(Passifloraceae)、柽柳科(Tamaricaceae)、沟繁缕科(Elatinaceae)、秋海棠科(Begoniaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、千屈菜科(

Lythraceae)、石榴科(Punicaceae)、柳叶菜科(Onagraceae)、小二仙草科(Haloragaceae)、八角枫科(Alangiaceae)、山茱萸科(

Cornaceae)、五加科(

Araliaceae)、伞形科(Umbelliferae(Apiaceae))，但不限于此。

最优选植物细胞由属于十字花科、茄科、蔷薇科及旋花科的植物中选择。

所述步骤2)的向宿主植物细胞导入表达载体的步骤，可根据公知的植物转型方法导入植物体内。即，可以利用土壤杆菌属介质方法、基因枪(gene gun)、利用PEG的方法及电穿孔法(electroporation)等在本发明的技术领域人员中公知的方法。优选所述双子叶植物利用土壤杆菌属介质方法，单子叶植物利用基因枪的方法，但不限于此。

转型后，植物细胞应再生为整个植物。已知有多种用于从胼胝体或原生质体再生成熟的植物的技术(Handbook of Plant Cell Culture，1—5册，1983—1989 Momillan，N.Y.)。因而，一旦实现转型，则从已转型的植物细胞再生成熟的植物就在本领域的知识范围内。

本发明的方法中，外来蛋白质包括发挥药理效果的蛋白质或向转型体赋予对于应激的耐性的蛋白质等。

本发明的IbTIP1基因在甘薯根部能够强表达，且其表达会被各种应激所诱导，因此本发明的基因及其启动子可适用于适合不良条件地区的耐环境应激性植物体、能够生产出淀粉、功能性蛋白质等有用原料的转型甘薯的开发，或者生物乙醇生产用亲环境性代替能源作物的开发。

以下，根据实施例详细说明本发明。

不过，以下实施例只例示本发明，本发明的内容不限于下述实施例。

<实施例1>甘薯IbTIP1基因的复制

对甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.cv.White star)的须根(fibrous root)组织进行6小时的干燥处理后通过CTAB方法(Kim and Hamada，Biotechnol Lett 27，1841-1845，2005)分离整体RNA。使用Poly(A)TractmRNA分离系统(Promega社)分离mRNA，使用SMART cDNA文库(library)构筑试剂盒(Clontech社)制造甘薯干燥处理根cDNA文库。文库的第1次效价(titer)显示约1.5×10⁶pfu/ml值。通过根据随机抽出的碱基序列分析确保了983种EST克隆。

使用T3引物而确定cDNA的5’部分的碱基序列，通过NCBI(www.ncbi.nlm.gov)的Blast数据库分析确认了相关基因的信息及资料。其中，通过分析资料，复制了在干燥及根部有可能显示出特异表达的候选基因即作为水分传输通道蛋白质(water channel protein)的属于水通道蛋白系列的TIP(tonoplast intrinsic protein)基因(Chrispeels et al.TrendsBiochem Sci 19，421—425，1994)，确定cDNA整体的碱基序列。将该cDNA基因命名为“IbTIP1”cDNA。确认了IbTIP1 cDNA基因的总长度为1065bp，并包括82bp的5’一非翻译区(UTR)和197bp的3’—非翻译区以及753bp的编码部分(包括251个氨基酸)(图1，序列号1)。在水通道蛋白质结构中存在于环(loop)B和E相的NPA(Asn—Pro—Ala，天冬酰胺—脯氨酸—丙氨酸)基序也很好地保存在IbTIP1蛋白质氨基酸序列中(图1，序列号2)。

当利用基因研究的计算机程序(Blastx)检查甘薯的IbTIP1的编码部分时，与含羞草(Minosa pudica)的TIP1；2显示出了最高的相同性(84％氨基酸)，与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的gamma—TIPs组[At4g01470(AtTIP1；3)，At3g26520(AtTIP1；2)，At2g36830(AtTIP1；1)]显示出了高的相同性(74％～78％氨基酸)(图2a及2b)。利用ClustalW程序()调查甘薯IbTIP1的推定蛋白质的氨基酸序列和拟南芥膜内在蛋白质(MIP)之间类缘关系，根据其结果可以推定甘薯IbTIP1使γ系列的TIP蛋白质进行编码化(图2a)。

<实施例2>甘薯各组织的IbTIP1基因的表达分析

为了分析从已进行干燥处理的甘薯根分离得到的本发明的甘薯水分传输通道蛋白质基因IbTIP1的各组织的表达状态，进行了RT-PCR。用CTAB方法(Kim and Hamada 2005)从甘薯组织(叶、茎、须根、粗根、贮藏根)抽出整体RNA，之后使用总RNA2.5μg，利用ImPro-H ReverseTranscrirption System cDNA合成试剂盒(promega社)合成cDNA。使用IbTIP1基因特异引物，并使用Ex—Taq DNA聚合酶(TaKaRa社)，调查了IbTIP1基因的表达状态。作为IbTIP1特异引物使用了碱基序列(Forward：5’—GTCACGTAAACCCTGCTGTCAC—3’：序列号4)及(Reverse：5’—GCTAGAATGTTGGCACCCACTA—3’：序列号5)。

其结果，IbTIP1基因在须根(fibrous root)强表达，还在粗根(thickpigmented root)、贮藏根(tuberous root)组织表达。不过，在叶(leaf)和茎(stem)组织中显示出弱表达的状态(图3)。

因而，可知从经干燥处理的甘薯根组织中分离得到的本发明的IbTIP1基因是在根中特异表达，特别是在须根种特异表达的基因。

<实施例3>基于干燥处理及激素处理的IbTIP1基因的表达分析

为了分析本发明的IbTIP1基因根据干燥处理反应的程度，对甘薯的叶和须根组织用不同时间(0、1、2、4、8、16、24小时)进行干燥处理后利用在所述实施例2中的方法分离RNA，再分别合成cDNA。使用AccelTaq Premix试剂盒(Genedocs社)，用所述实施例2中所使用的IbTIP1基因特异引物进行了RT—PCR。

其结果，IbTIP1基因在叶组织中在干燥处理开始后1小时之后开始渐增加，并且在4—8小时时显示表达顶点，之后显示出减少的状态(图4a)。相反，在须根组织中未观测到基于干燥处理的IbTIP1表达量的增减。这可能是由于在正常状态下IbTIP1基因的表达量高的缘故。

已知通常在干燥应激下作为植物激素的脱落酸(ABA)的量会增加，脱落酸可以对应于干燥而控制植物气孔的开闭。因此，为了观察对干燥处理进行反应的IbTIP1基因是否也会根据脱落酸处理而其表达量有增加，对甘薯的叶和须根组织用不同时间(0、12、24、36、48小时)进行脱落酸(100μM)处理后，通过与所述相同的方法抽出RNA并合成cDNA，进行RT—PCR。

其结果，对叶组织开始进行脱落酸处理起12小时之后开始有增加而在36小时显示表达顶点，之后显示出减少的状态。相反，在须根组织中未看到这样的表达量的变化(图4b)。这可能也是由于在正常状态下IbTIP1基因的表达量高的缘故。

<实施例4>IbTIP1基因的萨慎印迹分析

为了观察本发明的IbTIP1基因在甘薯基因组内的存在及其他相同性基因的存在与否，实施了萨慎印迹分析(Southern blot analysis)。利用CTAB方法，从甘薯叶分离基因组DNA，精制，之后用EcoRI、HindII、HindIII、XbaI切割。对切割的DNA进行电泳后，使用用32p放射性同位素标记的探针对IbTIP1 cDNA的C—末端的HindII切片(463bp)进行萨慎印迹。

其结果，在各切片中，与IbTIP1探针结合的DNA带显示为2个以上，由此可见本发明的IbTIP1基因以多数群(family)存在于甘薯基因组相中。

<实施例5>IbTIP1基因的上端5’控制启动子区域分离及碱基序列分子

根据制造商的指南，利用基因组步查(GenomeWalker)试剂盒(Clontech社)，分离作为甘薯水分传输通道蛋白质(water channel)基因的属于水通道蛋白系的IbTIP1基因的启动子区域。用限制酶EcoRV、DraI、PvuII、StuI切割利用通常的方法分离的甘薯基因组DNA2.5μg，之后利用苯酚/氯仿和乙醇精制经切割的基因组DNA。利用DNA连接酶(ligase)使由所述试剂盒提供的衔接头与所述精制的基因组DNA结合，从而制作用于基因组步查的基因文库。

利用它们的文库，通过基因组PCR方法确保了IbTIP1基因组DNA，利用以预先分离的水分传输通道蛋白质基因IbTIP1 cDNA的5’—末端的碱基序列信息为背景制作的以序列号6记载的GSP1引物(gTlP1-r1：5’-CGAGGTAGCCTCACCCACGCTTCCAAT-3’)及试剂盒提供的序列号7的衔接头引物AP1(5’—GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)，作为模板

使用所述基因文库DNA，进行了基因组PCR。PCR反应中，在94℃下25秒钟、在72℃下3分钟的反应进行7次，在94℃下25秒钟、在67℃下3分钟的反应重复进行32次。然后最终在67℃下反应7分钟。进行PCR反应后，通过电泳确认了反应物的一部分(图6)，将1次PCR反应物稀释至50倍后，利用以水分传输通道蛋白质基因IbTIP1c DNA的5’一末端的碱基序列信息为背景制作的序列号8的GSP2引物(gTlP1-Bgl-r2：5’-AGATCTGCGATTCTCGGAACTGCCATTTTACAA-3’)及试剂盒提供的序列号9的衔接头引物AP2(5’一ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’)，重复进行PCR。此时的PCR条件如下。在94℃下25秒钟、在72℃下3分钟的反应进行5次，在94℃下25秒钟、在67℃下3分钟的反应重复进行20次，然后最终在67℃下反应7分钟。对反应物的一部分进行电泳而确认了反应产物(图6)。由Dral和Stul基因文库，将大小不同的两种PCR产物复制在PCR2.1—TOPO载体(Invitrogen社)及pGEM—T Easy载体(Promega社)，并分析碱基序列。

如此确定碱基序列，从而确保IbTIP1基因的5’—上游(upstream)的碱基序列，将基因组基因序列分别命名为“IbTIP1p_3.4”启动子及“IbTIP1p_1.0”启动子。从甘薯基因文库分离得到的IbTIP1启动子的总长度从起始翻译区至上端分别为3,400bp和914bp。通过对碱基序列的分析，可判断这两个启动子的碱基序列为同一种类。可以确认这些启动子的碱基序列与IbTIP1 cDNA的5’—非翻译区(UTR)的碱基序列完全一致。其中，利用SpeI—BglII限制酶，对总长度相当于3,400bp的IbTIP1p_3.4克隆进行亚克隆，将其命名为IbTIP1p_1.6(1,597bp大小)(图7)。

<实施例6>IbTIP1基因启动子内顺式作用要素(cis—acting element)分析

本发明的IbTIP1基因启动子包括与从IbTIP1p_1.6的翻译起点的上端至—1,597bp的区域相对应的碱基序列(图7)。利用作为顺式作用要素(cis—acting element)分析程序的PLACE数据库(www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)，对IbTIP1p_1.6启动子的碱基序列相的特性进行分析。

对启动子的碱基序列进行分析的结果，确认了IbTIP1p_1.6启动子具有各种真核生物启动子控制因子部位。用于引发转录的TATA—盒存在于—115～—106位，另外CAAT—盒存在于—155～—152位。作为转录控制蛋白质的结合区，被公认为对脱落酸(ABA)反应的重要因子的ABRE的共同序列(consensus sequence)ACGTG序列反复存在于—208～—204及—196～—191两个位置，还存在于

—196～—191位置。对脱落酸(ABA)的信号传递过程及干燥应激反应的MYB蛋白质要结合的多个MYB—识别部位共同序列(CNGTTR或者C/TAACG/TG)存在于—1577～—1572、—1406～—1401

—1398～—1393、—470～—465、—468～—462

位。还有，对干燥反应的MYC蛋白质要结合的MYC—识别部位共同序列(CANNTG)在—926～—921及—149～—144位被发现。作为对干燥应激及低温反应的DREB1/CBF蛋白质要结合的位置的DRE/CRT(dehydration—responsive element/C—repeat)因子的共同碱基序列(G/ACCGAC)在—332～—327位被发现。还有，对抗病性有重要作用的WRKY蛋白质要结合的多个W—盒(TTGAC)的碱基序列存在于—1236～—1232、—738～—734

—672～—668、—648～—644位。根据植物体内的信号传递物质即赤霉素(gibberellin，GA)而控制表达的GARE—因子的共同碱基序列(TAACAGA)在—431～—425及—371～—365位被发现。还有，与根部表达相关的ACGT—基序(motif)GCCACGTGGC序列也在—198～—189位被发现。除此之外，还发现多个作为对光反应的因子而已知的GT1—盒(GGTTAA)(图7)。

如上所述，在本发明的IbTIP1p_1.6启动子中存在很多对脱落酸及干燥应激反应的各种顺式作用要素，而且，还存在很多与植物抗病性有关的因子。此外，从与根部表达相关的因子的存在来看，可适用于根部特异表达启动子的研究。特别是由于包含很多干燥应激反应因子，因此可适用于对干燥应激具有耐性的植物体的开发。

<110>Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

<120>IbTIP1 gene derived from a root of Ipomoea batatas and a promoterthereof

<130>7P-10-28

<160>9

<170>Kopatentln 1.71

<210>1

<211>1065

<212>DNA

<213>IbTIP1 gene derived from a root of Ipomoea batatas

<400>1

gagggcagta gtgcaactga actacgacta aattagtgtt aattatctgt ttagagttta 60

agagattttg taaatttgta aaatggcagt tccgagaatc gctattggaa gcgtgggtga 120

ggctacctcg ccggatgctc tcaaagccgc cgtggcggag ttcatttcta tgcttatatt 180

cgtcttcgcc ggctccggct ccggcatggc tttcaataag ctgacggata atggagcggc 240

cacccccgcc ggactcattt ctgcggcaat agcccacgct tttgcactct tcgtcgcagt 300

ttccgtcggc gccgacattt ccggcggtca cgtaaaccct gctgtcacat ttggcgcctt 360

cgtcggaggt cacatcaccc tcctcagaag tgttgtttat tggattgccc aattgctcgg 420

ctctgtcgtt gcttgcttgc tcctcaagtt tgccaccggt ggattggaaa caccagcatt 480

tggtctgtcg ggagtggggc cgtggaacgc ggtggttttc gagatagtga tgacattcgg 540

gctggtttac acggtgtatg ccaccgcggt tgacccgaag aagggcaaca ttgggatcat 600

tgccccgatc gccattggtt tcatagtggg tgccaacatt ctagccggcg gggccttcga 660

cggtgcatcg atgaaccccg cagtgtcctt cgggcctgcc gtggtgagct ggagctggga 720

gtgccactgg gtttactggc tcggcccgtt cttgggtgcc gccatcgccg ccttggtcta 780

ccaagtcatc ttcatttgcc agaacactca cgaacagctc cccaccacag attactaagg 840

atttccatct ctgtctgtat cattgtgcgc cggatcctaa ggggttcgag gatgttcgtt 900

ggtctttcgt tgtcttttcg atcttttgat tccccaatgt ttgtttcaag cttcttgctg 960

gctttgcctc ctccactgta aaagcatgta aaattattgt gtcttcttcc tgtttggaat 1020

caattgttga ctttcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1065

<210>2

<211>251

<212>PRT

<213>IbTIP1 protein derived from a root of Ipomoea batatas

<400>2

Met Ala Val Pro Arg Ile Ala Ile Gly Ser Val Gly Glu Ala Thr Ser

1 5 10 15

Pro Asp Ala Leu Lys Ala Ala Val Ala Glu Phe Ile Ser Met Leu Ile

20 25 30

Phe Val Phe Ala Gly Ser Gly Ser Gly Met Ala Phe Asn Lys Leu Thr

35 40 45

Asp Asn Gly Ala Ala Thr Pro Ala Gly Leu Ile Ser Ala Ala Ile Ala

50 55 60

His Ala Phe Ala Leu Phe Val Ala Val Ser Val Gly Ala Asp Ile Ser

65 70 75 80

Gly Gly His Val Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Ala Phe Val Gly Gly

85 90 95

His Ile Thr Leu Leu Arg Ser Val Val Tyr Trp Ile Ala Gln Leu Leu

100 105 110

Gly Ser Val Val Ala Cys Leu Leu Leu Lys Phe Ala Thr Gly Gly Leu

115 120 125

Glu Thr Pro Ala Phe Gly Leu Ser Gly Val Gly Pro Trp Asn Ala Val

130 135 140

Val Phe Glu Ile Val Met Thr Phe Gly Leu Val Tyr Thr Val Tyr Ala

145 150 155 160

Thr Ala Val Asp Pro Lys Lys Gly Asn Ile Gly Ile Ile Ala Pro Ile

165 170 175

Ala Ile Gly Phe Ile Val Gly Ala Asn Ile Leu Ala Gly Gly Ala Phe

180 185 190

Asp Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Val Ser Phe Gly Pro Ala Val Val

195 200 205

Ser Trp Ser Trp Glu Cys His Trp Val Tyr Trp Leu Gly Pro Phe Leu

210 215 220

Gly Ala Ala Ile Ala Ala Leu Val Tyr Gln Val Ile Phe Ile Cys Gln

225 230 235 240

Asn Thr His Glu Gln Leu Pro Thr Thr Asp Tyr

245 250

<210>3

<211>1600

<212>DNA

<213>Promoter of IbTIP1 gene derived from a root of Ipomoea batatas

<400>3

actagtatat attactcaac ccgttaccat ccccacaccc aattatccat acatgaattc 60

acaattaagg ttttcacatt tcaattcttt ccaaaactgg aaattttggt tggttagttt 120

gtaaaatgga taagctgaaa cgtagggata ttctcatatt ctctgtagaa aaagtctaag 180

caaggagaac acaactgatc tgttatctgt acattgcaaa caaaaaggaa atttgtccct 240

ttagccgtcc aaagcaattt aattagtaaa catataacat aaacaaagca tgtccaacta 300

ctgagctgat taaaatttaa ttaatggtac tctaaaacaa tataaataat tcccttaaat 360

tttgacatat ttgcttcttg ggcaaaaagt gcattggatt attattgagg gattagtttg 420

ctaatcactt tttaaatttt taaataaatt tgtgtatatt tattagtggt gtagcaccaa 480

gtccactacc tgccacggtg cactctcaat attttatttg gcactaacaa ctcaattatc 540

gttgttaaat tgtgattaag taatgacaca tcaccaccta gattatttta aagttttgat 600

tagccaccat cttccctctc tcttttaaac aaacaaaaat tttgtggcta tggttttctt 660

gcctgcacct acatttgttc tttactttaa ataaacattt agagttacat aggaattgat 720

gtatagttaa attactgaat tgtcttgtag atctaacaac attcagaata atttctacca 780

tgggaattga tttggcaata ttgattttgt aaccatgcaa aacagcaaaa gattctaaat 840

ttgactcctc atgaaaactg tcaattggcc ttttagtttg aactggttaa ttagttatat 900

gggcactatg cacagaattc taagtttgac tcctcatgaa aactgccaat tgaccttttt 960

agtttgaacc ggttaactag ctatggacaa acttggctgg ttcgactcat cattagttac 1020

attgtagccc acccataatg atttttatgg gtggactacg atgattttta tgagggcatg 1080

caaaatttgc aattgggtgg aaaaaaaagt ttatattttt gtttaatcgg ttagtttcac 1140

tgaaaacatg tttctaatat catttttaac agacctgttt ttatggctct tcaattcttc 1200

atgtacgtaa gataaaacag taactgtaac agaagtctct attagacata cctcaccata 1260

aggtggtcgg tcgattaaat taaatttgtg agcaatgatt gagaggatgg gccccataat 1320

tttcctactt tatgttttac cggtttcact tttcatatat catcgcatcc atggtggatg 1380

cctatcatca cgttcattgc cacgtggccg tgtcgtagaa aattggaggc tagccaacca 1440

ggcaattaca agtggctcct tcatcatccg ctccttcggg tactataaat acgtgcccgt 1500

gaatacgagg aagaacaggg cagtagtgca actgaactac gactaaatta gtgttaatta 1560

tctgtttaga gtttaagaga ttttgtaaat ttgtaaaatg 1600

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Forward primer fo rIbTIP1

<400>4

gtcacgtaaa ccctgctgtc ac 22

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reverse primer fo rIbTIP1

<400>5

gctagaatgt tggcacccac ta 22

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>GSP1 primer

<400>6

cgaggt agcct cacccacgc ttccaat 27

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>AP1 prime r

<400>7

gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>GSP2 primer

<400>8

agatctgcga ttctcggaac tgccatttta caa 33

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>AP2 primer

<400>9

actatagggc acgcgtggt 19

Claims

1.一种来源于甘薯的IbTIP1蛋白质，其特征在于，

具有以序列号2记载的氨基酸序列。

2.一种多核苷酸，其对权利要求1所述的IbTIP1蛋白质进行编码。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，

具有以序列号1记载的碱基序列。

4.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，

在根部被高表达。

5.一种载体，其包含权利要求2所述的多核苷酸。

6.一种转型体，其被权利要求5所述的载体所转型。

7.一种多核苷酸，其中包含以序列号3记载的碱基序列的全部或一部分，显示出能诱导须根特异基因表达的启动子活性。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中，

所述启动子活性被干燥、脱落酸、低温、光或植物病所诱导。

9.根据权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于，

包括：TATA盒、CAAT盒、作为ABRE的共同序列的ACGTG、作为MYB识别部位共同序列的CNGTTR或者C/TAACG/TG、作为MYC识别部位共同序列的CANNTG、作为DRE/CRT因子的共同序列的G/ACCGAC、W—盒、作为GARE因子的共同碱基序列的TAACAGA、作为ACGT—基序的GCCACGTGGC及作为GT1—盒的GGTTAA序列。

10.一种载体，其包含权利要求7所述的多核苷酸。

11.一种转型体，其被权利要求10所述的载体所转型。

12.一种转型体的制造方法，所述转型体在应激下可诱导外来蛋白质的生产，该方法包括：

1)制造表达载体的步骤，该载体包含如下的基因组成，所述基因组成包含权利要求7所述的多核苷酸以及以能与所述多核苷酸作用的方式连结的对外来蛋白质编码的多核苷酸，

2)向宿主细胞导入所述表达载体的步骤，

3)挑选导入了所述表达载体的转型体的步骤。

13.根据权利要求12所述的转型体的制造方法，其特征在于，

所述应激被干燥、脱落酸、低温、光或植物病所诱导。

14.根据权利要求12所述的转型体的制造方法，其特征在于，

所述外来蛋白质为发挥药理效果的蛋白质或向转型体赋予对应激的耐性的蛋白质。

15.根据权利要求12所述的转型体的制造方法，其特征在于，

所述步骤2)的宿主细胞选自由植物细胞、动物细胞及微生物构成的组中。

16.根据权利要求12所述的转型体的制造方法，其特征在于，

所述转型体选自由微生物、植物细胞、植物体及来源于它们的胼胝体构成的组中。

17.一种使外来蛋白质在根部高表达的方法，

该方法包括：

2)向宿主植物细胞导入所述表达载体的步骤，

3)挑选导入了所述表达载体的转型植物细胞的步骤，

4)诱导所述转型植物细胞的发芽而制造胼胝体的步骤，

5)诱导所述胼胝体的分化而制造转型植物体的步骤，

6)栽培所述转型植物体的步骤。

18.根据权利要求17所述的使外来蛋白质在根部高表达的方法，其特征在于，

所述植物细胞来源于从由属于十字花科、茄科、蔷薇科及旋花科的植物构成的组中选择的植物。

19.根据权利要求17所述的使外来蛋白质在根高表达的方法，其特征在于，