KR20030031867A - 곰팡이의 ｍｒｐ-계통 ａｂｃ 수송 단백질을 발현하는형질전환 생물 - Google Patents

곰팡이의 ｍｒｐ-계통 ａｂｃ 수송 단백질을 발현하는형질전환 생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중금속 및 제초제 등의 유해물질에 대한 내성 및 축적성을 나타내며, 곰팡이의 MRP-계통 ATP 결합 카세트 수송 단백질(multidrug resistance-associated protein-like ATP-binding casette transporter protein, MRP-계통 ABC 수송 단백질)을 코딩하는 DNA 분자, 이를 포함하는 벡터, 및 형질전환 생물에 관한 것이다. 본 발명의 MRP-계통 ABC 수송 유전자로 형질전환 생물, 특히 식물을 중금속이나 농약으로 오염된 토양이나 수자원에서 생육시켜, 이들 유독한 중금속이나 제초제를 제거하여 환경을 정화시킬 수 있다.

Description

곰팡이의 ＭＲＰ-계통 ＡＢＣ 수송 단백질을 발현하는 형질전환 생물 {Transgenic organism expressing fungal MRP-like ABC transporters}
[기술 분야]
본 발명은 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 유전자, 및 상기 유전자로 형질전환된 형질전환 생물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 YCF1이나 YHL035C를 비롯한 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 유전자를 발현시켜 납, 카드뮴, 비소, 및 제초제 등 유해물질에 대한 내성 및 축적성을 향상시킨 형질전환 생물에 관한 것이다.
[종래 기술]
납, 카드뮴, 수은, 등의 중금속은 자연계의 먹이사슬을 통해 사람들의 체내에 축적되어, 뇌, 신경, 뼈, 등에 만성적인 피해를 주고, 오염된 환경과 그 피해는 세대를 물려 지속된다. 중금속 독성의 대표적인 예로 일본에서 발생한 미나마따병과 이따이이따이병이 있다. 납은 중금속 중에서 가장 피해를 많이 주고 있는 오염물질로서(Salt, D.E., Smith, R.D., and Raskin, I. Phytoremediation.Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49, 643-668 (1998)), 납을 환경으로부터 제거하는 것은 매우 중요한 일이며, 미국 정부에서는 어린이들이 생장하는 환경으로부터 납을 제거하기 위해 매년 약 500 백만 달러를 지출하고 있다(Lanphear, B. P. The paradox of lead poisoning prevention.Science. 281;1617-1618 (1998)). 비소는 식수에 오염되어 피부병과 암을 일으키므로 큰 문제가 되고 있다.
종래에 알려진 중금속, 및 농약 등 독성물질에 대한 내성이나 축적성에 관련된 유전자로는, 박테리아의 세포막에서 납을 세포 밖으로 배출하는 기능을 하는 박테리아의 P형 ATP에이즈 (P-type ATPase)가 있고(Rensing, C., Sun, Y., Mitra, B., and Rosen, B.P. Pb(ll)-translocating P-type ATPases.J. Biol. Chem. 273: 32614-32617 (1998)), 카드뮴 내성에 관련된 유전자로는 효모의 YCF1유전자, 비소에 대한 내성에 관련된 유전자로서 효모의 YCF1 유전자와 ACR 유전자들, 박테리아의 ArsAB 등이 있다.
한편, 생물은 체내에 들어온 유해물질을 결합하는 생체물질이나 수송 단백질을 이용하여 유해물질의 독성을 완화시키는 기작을 가지고 있다. 이러한 생명체의 유해물질 내성에 기여하는 유전자들을 이용하면 현재 널리 사용되고 있는 물리, 화학, 공학적인 환경정화방법에 비해 훨씬 경제적이고 환경친화적으로, 유해물질로 오염된 환경을 정화할 수 있다 (Mejare and Bulow, Trends in Biotechnology;2001, Raskin I. and Ensley B. D. Phytoremediaton of Toxic Metals., John Wily & Sons, New York;2000). 특히 식물은 외래유전자들을 잘 발현하여 새로운 형질들을나타내며, 관리가 경제적이고, 미관상 좋은 등 여러 장점이 있어서, 식물에 좋은 유전자를 넣어 개량하여 환경정화에 이용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이것은 식물이용환경정화(Phytoremediation)라고 한다.
납, 카드뮴, 비소, 농약 등의 독성물질에 의한 토양 등의 환경오염이 심각한 상황에서 이들 독성물질에 대한 내성 및/또는 축적성을 나타내는 유전자를 이용한 형질전환 생물이 절실히 필요한 실정이다.
카드뮴을 환경으로부터 제거하는데 이용할 수 있는 형질전환 식물들은 여러 가지가 논문으로 보고되었으나(Zhu et al., (1999)Plant Physiol.119: 73-79, Hirschi et al., (2000)Plant Physiol. 124:125-33, Dominguez-Solis et al., (2001)J. Biol. Chem. 276: 9297-9302), 납이나 비소를 제거할 수 있는 식물은 보고된 바 없다. 또한, YCF1을 이용하여 납뿐만 아니라, 카드뮴, 비소, 제초제에 내성이 향상된 생물체들을 개발하여 유해물질의 정화에 이용한 경우는 아직 보고된 바가 없었다.
본 발명은 납에 대한 내성 및 축적성을 나타내며, 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질(multidrug resistance-associated protein-like ATP-binding casette transporter protein, MRP-계통 ABC 수송 단백질)을 코딩하는 DNA 분자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 MRP-계통 ABC 수송 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 MRP-계통 ABC 수송 유전자로 형질전환되어 유해물질에 대한 내성 및/또는 축적성이 향상된 형질전환체를 제공하는 것이다.
도 1은YCF1돌연변이 효모의 납 및 카드뮴에 대한 민감성을 효모의 성장정도로 확인한 사진이고,
도 2는ycf1-pESC 효모, wt-pESC 효모 및ycf1-YCF1효모의 납 또는 카드뮴 내성을 성장정도로 확인한 사진(A), 및 노던블롯 결과(B)이고,
도 3은ycf1-pESC 효모, wt-pESC 효모 및ycf1-YCF1효모의 납 또는 카드뮴 축적량을 비교한 그래프이고,
도 4는YHL035C돌연변이 효모의 납에 대한 민감성을 효모의 성장정도로 확인한 사진이고,
도 5는YCF1형질전환 애기장대식물에서YCF1의 발현을 RT-PCR로 확인한 사진이고,
도 6은YCF1형질전환 애기장대식물의 납 및 카드뮴 내성을 성장정도로 확인한 사진이고,
도 7은YCF1형질전환 애기장대식물의 비소에 대한 내성을 성장정도로 확인한 사진이고,
도 8은YCF1형질전환 애기장대식물의 제초제에 대한 내성을 성장정도로 확인한 사진이고,
도 9는YCF1형질전환 애기장대식물의 납 및 카드뮴 축적성을 분석한 그래프이다.
도 10은YCF1형질전환 포플러 식물의 납 내성을 성장정도로 확인한 사진이고,
도 11는YHL035C형질전환 포플러 식물의 납 내성을 성장정도로 확인한 사진이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 납에 대한 내성 및 축적성을 나타내며, 곰팡이의 MRP-계통 ATP 결합 카세트 수송 단백질(multidrug resistance-associated protein-like ATP-binding casette transporter protein, MRP-계통 ABC 수송 단백질)을 코딩하는 DNA 분자에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질을 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 형질전환 생물에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 유해물질 내성 및/또는 유해물질 축적성을 나타내는 유전자, 이를 포함하는 벡터, 형질전환 세포, 및 형질전환 생물에 관한 것이다.
본 발명에서 유해물질 내성 및/또는 축적성을 나타내는 유전자로는 곰팡이의 다종약품 저항성 관련 단백질(Multidrug resistance associated protein, MRP)-계통 ATP-결합 카세트 수송 단백질(이하, MRP-계통 ABC 수송 단백질)을 암호화하는 유전자이다.
상기 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질은 ABC 수송 단백질의 일종으로서, 세포질에 있는 여러 가지 유기물질을 세포질 밖으로 수송하는 역할을 한다. ABC수송 단백질은 원핵생물로부터 사람의 간세포에 이르기까지 여러 가지 생명체에 존재하며, 매우 다양한 물질을 수송한다. ABC 수송 단백질이 수송하는 유기물질에는 글루타티오닌에 결합된 중금속이나 담즙산 등이 포함된다. 곰팡이의 MRP-계통 ATP-결합 카세트 수송 단백질에 속하는 YCF1은 카드뮴, 비소, 농약을 액포에 집어넣어 이들 유해물질에 내성을 부여한다는 것이 알려져 있다 (Liet al., (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94: 42-47, Ghoshet al., (1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :5001-5006). 그러나 YCF1을 이용하여 카드뮴, 비소, 농약에 공통적으로 내성이 향상된 생물체들을 개발하여 유해물질의 정화에 이용한 경우는 아직 보고된 바가 없다. 더욱이 YCF1이 납 저항성에 기여하는지는 아직 알려져 있지 않으며, YHL035C 단백질의 기능 및 이를 발현하는 형질전환체에 대해서 보고된 바 없다.
상기 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 유전자의 예로는YCF1(Yeast cadmium factor1) 및YHL035C유전자, 그리고 YCF1 단백질 및 YHL035C 단백질의 아미노산 서열과 서열 상동성이 28% 이상인 MRP-계통 ABC 수송 유전자를 포함한다. 상기 YCF1과 YHL035C 유전자 또는 이들 단백질은 28% 서열 동질성을 지닌다. 또한,YCF1이나YHL035C단백질의 아미노산 서열과 28% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 40% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 50% 이상의 상동성을 가지며 곰팡이의 MRP계통 ABC 수송 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 의도이다. 그 예로는 GenBank의 아미노산 서열 자료를 CLUSTRALW 프로그램을 이용하여 비교하였을 때,YCF1 이나YHL035C단백질과 아미노산 서열상 28% 이상의 상동성을 가지는 BPT1유전자, YBT1 유전자, 및 YOR1 유전자를 포함할 수 있다. 상기 BPT1 단백질은 YCF1와 아미노산 서열에서 40%의 상동성을 가지며, YBT1 단백질은 YHL035C와 아미노산 서열에서 51%의 상동성을 가지며, YOR1 단백질은 YCF1와 아미노산 서열에서 28%의 상동성을 가진다. 상기 YBT1과 BPT1은 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질로서, 담즙산을 수송할 수 있는 것으로 알려져 있고 (Ortiz et al., (1997)Journal of Biological Chemistry272: 15358-15365, Petrovic et al., (2000)Yeast16: 561-571), 상기 YOR1 단백질은 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질로서, 여러 가지 약물을 수송할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Decottignies et al., (1998)Journal of Biological Chemistry273: 12612-12622).
본 발명에 따른 MRP-계통 ABC 수송 단백질은 공통의 도메인 구조를 가지는 것으로 알려져 있으며, 이는 N-말단에 상당히 긴 도메인인 N-말단 연장 도메인(N-terminal extension domain), 6개의 막관통 도메인(transmembrane domain)으로 이루어진 "첫번째 막관통 도메인(first transmembrane spanning domain)", 세포질 도메인인(cytoplasmic domain) "첫번째 뉴클레오타이드 결합 도메인(first nucleotide binding fold domain), 6개의 막관통 도메인으로 이루어진 "두 번째 막관통 도메인(second transmembrane spanning domain)", 및 c-말단에 위치한 세포질 도메인인 "두 번째 뉴클레오타이드 결합 도메인(second nucleotide binding fold domain)"으로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 일례에서, 상기 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질은 서열번호 2의 YCF1 단백질 또는 서열번호 4의 YHL035C 단백질의 아미노산 서열과28% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상의 서열 상동성을 가지며, 상기 YCF1 단백질 또는 YHL035C 단백질은 각각 N-말단 연장 도메인(N-terminal extension domain), 첫번째 막관통 도메인(first transmembrane spanning domain), 첫번째 뉴클레오타이드 결합 도메인(first nucleotide binding fold domain), 두번째 막관통 도메인(second transmembrane spanning domain), 및 두번째 뉴클레오타이드 결합 도메인(second nucleotide binding fold domain)의 도메인으로 이루어지고, 상기 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질의 각 도메인은 서열번호 2의 YCF1 단백질 또는 서열번호 4의 YHL035C 단백질에 대응하는 각 도메인의 아미노산 서열과 28% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 유해물질에 대한 내성 및 축적성을 동시에 부여하는 유전자로는 YCF1 단백질의 폴리펩티드를 코드하는 서열을 포함하는YCF1유전자이며, 이의 예로는 유해물질 내성 및 유해물질 축적성을 나타내는 서열번호 2의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열, 바람직하게는, 납에 대한 내성 및 축적성이외에, 카드뮴, 비소 및 제초제로 이루어진 군에서 1종 이상 선택된 유해물질에 대한 내성이나 축적성을 나타내며, 서열번호 2의 YCF1 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는YCF1 유전자이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는YCF1 유전자이다.YCF1유전자는 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 6번 염색체에 존재한다.YCF1유전자는 단백질로 발현되었을 때 기능을 가지므로, YCF1단백질의 아미노산 서열과 28% 이상 상동성, 바람직하게는 40% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 50% 이상의 상동성을 가지며, 유해물질에 대한 내성 및 축적성에 기여하는 단백질 및 이를 암호화하는 DNA 분자를 모두 포함하는 의도이다.
YCF1 단백질은 ABC 수송 단백질의 하나로서 효모의 액포막에 존재하며, 세포질내의 글루타티오닌(glutathione)과 결합된 카드뮴을 MgATP의 에너지를 사용하여 액포내부로 이동시켜 카드뮴의 독성을 완화하는 것으로 알려져 있다 (Li, Z.S.et al. A new pathway for vacuolar cadmium sequestration inSaccharomyces cerevisiae: YCF1-catalyzed transport of bis(glutathionato)cadmium.Proc. Natl. Acad. Sci. USA94, 42-47 (1997)).
또다른 유해물질에 내성 및/또는 축적성을 나타내는 유전자의 예로는YHL035C유전자를 들 수 있으며, 이의 바람직한 예로는 납에 대한 내성을 나타내며 서열번호 4의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는YHL035C유전자를 제공한다.YHL035C유전자는 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 8번 염색체에 존재하며, YHL035C 단백질은 MRP-계통 ABC 수송 단백질의 하나이다.YHL035C유전자는 단백질로 발현되었을 때 기능을 가지므로, YHL035C 단백질의 아미노산 서열과 28% 이상 상동성, 바람직하게는 40% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 50% 이상의 상동성을 가지며, 유해물질에 대한 내성 및 축적성에 기여하는 단백질 및 이를 암호화하는 DNA 분자를 모두 포함하는 의도이다.
본 발명은 또한 본 발명은 또한 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 바람직하게는 상기YCF1 유전자 또는 YHL035C 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터의 구체적인 예로는 pESC-YCF1,ENpCambia-YCF1,또는 PBI121-YCF1재조합 벡터, 또는 pESC-YHL035C재조합 벡터, 및 pPBI121-YHL035C를 포함한다. 상기 재조합 벡터의 제조는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 제조방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명에서 유해물질은 납, 카드뮴, 비소 등을 포함하는 중금속, 또는 농약, 및 제초제 등을 포함할 수 있다. 상기 제초제는 일반적으로 저분자량의 친지성 화합물로서 식물 세포벽을 용이하게 통과하여, 식물 특이적 공정, 예컨대 광합성 전자 수송이나 필수 아미노산의 생합성 대사등을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 그 예로는 클로로술푸론, 액시도플루오르펜, 노르플루라존, 클로로-디니트로벤젠(chloro-dinitrobenzene, CDNB)을 들 수 있다.
따라서, 본 발명의 YCF1 단백질과 YHL035C 단백질의 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 DNA분자들이나 이와 상동성이 28%이상인 DNA분자들을 사용하여 유해물질에 내성을 나타내면서 유해물질을 축적할 수 있는 형질전환 생물을 제조할 수 있고, 제조된 형질전환 생물을 이용하여 유해물질 오염지를 경제적이고 간편하게 정화할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 곰팡이의 MRP-계통 ATP 결합 카세트 수송 단백질을 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 형질전환 생물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 곰팡이의 MRP-계통 ATP 결합 카세트 수송 단백질을 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 형질전환 세포, 바람직하게는 식물세포에 관한 것이다. 상기 ABC 유전자는 전술한 유전자를 모두 포함하며, 바람직한 예로는YCF1 유전자,및YHL035C유전자를 들 수 있다.
상기 형질전환 생물은 원핵생물 또는 진핵생물이 바람직하며, 그 예로는 식물, 동물, 효모, 대장균, 및 곰팡이 등을 들 수 있다. 형질전환 식물은 유전공학적인 방법으로 이종 DNA 서열을 포함하며, 식물세포, 식물조직 또는 식물체에서 발현가능하도록 제작되어 이종 DNA 서열을 발현한다. 식물 형질전환체는 공지된 기술로 제조할 수 있으며, 아그로박테리움 튜메팩신스-매개 DNA 전이(Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transfer)가 대표적이다. 더욱 바람직하게는 전기충격(electroporation), 미세 입자 주입 방법(micro-particle injection) 또는 유전자 총(gene gun)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법으로 제조된 재조합 아그로박테리움을 침지방법으로 식물에 도입하는 것이다. 본 발명의 구체적 예에서, 형질전환식물의 제조방법은 전사 및 번역이 가능하도록 연결된 MRP-계통 ABC 수송 단백질을 암호하는 서열을 포함하는 발현카세트를 제조하고, 상기 발현카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하여 형질전환 식물을 제조할 수 있다.
상기 식물로는 애기장대, 유채, 갓, 담배, 양파, 당근, 오이, 유채, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 담배, 브로콜리, 페튜니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대 등의 초본 식물, 그리고, 버드나무, 자작나무, 포플러 및 박달나무를 포함하는 목본식물을 포함하며, 바람직하게는 포플러 및 애기장대이다.
본 발명의 바람직한 예에서, 상기 형질전환 생물은YCF1애기장대(기탁 번호 KCTC10064BP), YCF1 포플러, 또는YHL035C포플러일 수 있다. 본 발명의YCF1애기장대 식물은 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 생명공학연구소유전자은행에 2001년 9월 5일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC10064BP를 부여받았다. 상기YCF1애기장대 식물은 조직배양으로 무성번식할 수 있으며, 통상적인 식물세포 배양방법 및 분화방법으로 식물로 성장시킬 수 있다. 상기YCF1애기장대 식물은 야생형에 비하여 중금속 및 다른 유해물질에 대한 내성(도 6,7,8) 및 축적성(도 9)이 우수하고, 특히 납, 카드뮴, 비소 및 농약에 대하여 내성 및 축적성을 나타낸다.
본 발명의YCF1포플러와YHL035C포플러 식물은 조직배양으로 무성번식할 수 있으며, 통상적인 식물세포 배양방법 및 분화방법으로 식물로 성장시킬 수 있다. 상기YCF1포플러와YHL035C포플러 식물은 야생형에 비하여 납에 대한 내성(도 10, 도 11)이 우수하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: YCF1 돌연변이 효모의 납 및 카드뮴에 대한 민감성
천연형 효모(DTY 165)와 ycf1 돌연변이 효모(DTY 167, MATa ura3 leu2 his3 trp3 lys2 suc2 ycf::hisG)를 YPD 액체 배지(1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 덱스트로즈)에 OD600이 1-2로 도달할 때까지 30 ℃에서 배양한 후, 같은 수의 효모 세포 (1 x 102, 1 x 103, 1 x 104 or 1 x 105)를 3 mM 납이 첨가된 1/2로 희석된 YPD 고체 배지에서 3일 동안 30 ℃에서 배양하였다. 또한 0.1 mM의 카드뮴이 첨가된 1/2로 희석된 YPD 고체배지에서 동일하게 배양하였다. 상기 실험결과를 도 1에 나타냈다.
도 1에 나타난 바와 같이,ycf1돌연변이 효모는 천연형 효모에 비해 3 mM의 납을 포함하는 배지에서 성장이 감소되었고, 0.1 mM의 카드뮴을 포함하는 배지에서는ycf1돌연변이 효모가 거의 성장하지 않았다. 따라서,YCF1이 납 또는 카드뮴에 내성 갖게 하는 유전자임을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 클로닝 벡터의 제조
2-1: 클로닝 벡터(PESC-YCF1)
YCF1유전자 분리를 위해서, 천연형 효모를 3 ml YPD 액체배지, 30 ℃에서 12시간 키운 다음, 원심분리(12,000 rpm, 20-60 초)하였다. 펠렛은 400 ㎕의 효모 용해 완충액 (yeast lysis buffer: 1 M sobitol, 0.l M EDTA, 50 mM DTT (pH 7.5))에 현탁하고, 자이몰레이즈(zymolase, 5 mg/1 ml, 0.9 M sobitol) 40 ㎕를 첨가한 다음 37 ℃ 에서 15-30분 동안 두었다. 여기에 유레아 완충액(7 M 유레아, 0.3125 M NaCl, 0.05 M Tris-HCl(pH 8.0), 0.02 M EDTA(pH 8.0), 1 % Sarcosine) 400 ㎖을 혼합하고, 페놀/클로로포름을 혼합한 다음 상등액을 분리하였다. 상등액에 1 ml의 100 % 에탄올을 혼합하고, 원심분리하여 (12,000 rpm, 10분) 침전된 DNA를 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8.0)에 용해시켰다. 상기 분리한 DNA를 주형으로 하고, YCFa 프라이머(서열번호 3), YCFb 프라이머(서열번호 4), 및 LA taq 중합효소 키트(LA taq polymerase kit, Takara)로 PCR을 실시하여YCF1유전자를 분리하였다.
효모에서YCF1유전자가 납에 대한 저항성에 관여하는 것을 입증하기 위해, 상기 (1)에서 분리한YCF1유전자를 pESC-URA(yeast shuttle 벡터, stratagene) 벡터에 클로닝하였다. 즉,YCF1PCR 산물을 XhoI과 ScaI 제한효소로 절단하여YCF1(Xho I/ Sca I)를 준비했고, pESC-URA 벡터는 Hind III로 자른 다음, 클레나우(Klenow fragment)와 dNTPs를 처리하여 벡터 끝을 블런트로 만들고, Xho I 제한효소로 절단하였다. 상기YCF1(Xho I/ Sca I)와 잘린 pESC-URA 벡터(Xho I/ blunt-end)를 T4 DNA 라이게이즈로 연결하여 재조합 벡터 pESC-YCF1를 제조하였다.
2-2: 클로닝 벡터(PESC-YHL035C)
효모에서 실시예 2-1에서 사용한 효모의 게놈 DNA를 주형으로 하고,YHL035Ca 프라이머(서열번호 9),YHL035Cb 프라이머(서열번호 10), 및 LA taq 중합합효소 키트(LA taq polymerase kit, Takara)로 PCR을 실시하여YHL035C 유전자를 분리한 것을 제외하고는 상기 실시예 2-1과 실질적으로 동일하게 수행하였다.
YHL035Ca: 5'-cgacgcggccgcatgggaacggatccccttattatc-3'
YHL035Cb: 5'-cgacgcggccgccatcatcttacttgattgcttgg-3'
효모에서YHL035C 유전자를 발현시키기 위해YHL035C유전자를 pESC-URA(yeast shuttle 벡터, stratagene) 벡터에 클로닝하였다. YHL035C PCR 산물을 Notl으로 절단하여 pESC-URA 벡터에 T4 DNA 라이게이즈로 연결하여 재조합 벡터 pESC-YHL035C를 제조하였다.
실시예 3: YCF1 재조합 효모의 납 및 카드뮴 내성
ycf1돌연변이 효모에 빈 벡터를 도입한 재조합 효모(ycf1-pESC 효모), 천연형 효모에 빈 벡터를 도입한 재조합 효모(wt-pESC 효모), 및ycf1돌연변이 효모에YCF1을 과발현시킨 재조합 효모(ycf1-YCF1효모)를 각각 제조하고, 납 또는 카드뮴 내성을 실험하였다.
3-1: YCF1 재조합 효모의 제조
3 ml 액체 YPD 배지에 효모를 접종한 후 30 ℃에서 12시간 배양한 다음, 10 ml 액체 YPD 배지에 0.5 ml의 배양액을 넣고, 30 ℃에서 OD6000.5-0.8이 될 때까지 6-8시간 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여(1,500 rpm, 5분) 효모를 수득하고, 효모를 5 ml의 완충액 (0.1 M LiOAc, TE, pH 7.5)로 현탁한 후 원심분리하였다. 원심분리한 효모를 완충액(0.1 M LiOAc, TE(pH 7.5))으로 현탁하여 30 ℃ 교반배양기에서 1시간 배양하였고, pESC, pESC-YCF1 또는 pESC-YCF1 플라스미드와 연어 DNA(salmon tested DNA)를 첨가하여 30 ℃에서 30분간 배양하였다. 배양한 효모에 0.7 ml의 완충액(40 % PEG 3300, 0.1 M LiOAc, TE (pH 7.5))을 혼합하고, 30 ℃에서 1시간 동안 진탕하였다. 이후 상기 혼합물은 42-45 ℃에 5분간 두어 열충격을 가한 다음, 원심분리(2500 rpm, 5분)하여 효모를 수득하였다. 1 ml의 TE 완충액(pH 7.5)으로 효모를 세척하고, 0.2 ml의 물 또는 TE 완충액(pH 7.5)으로 현탁한 다음 선별배지(CM Ura-)에서 2-3일 동안 배양하여 형질전환 효모들(ycf1-pESC 효모, wt-pESC 효모,ycf1-YCF1효모)을 선별하였다.
3-2: 재조합 효모의 납 및 카드뮴에 대한 내성
상기에서 제조된ycf1-pESC 효모, wt-pESC 효모, 및ycf1-YCF1효모를 각각 납이 1.8 mM이 첨가된 갈락토스 배지(2 % galactose, 1 % 0.17 %의 YNB, 0.13 % dropout powder, 0.5 % amonium sulfate), 또는 50 uM의 카드뮴이 첨가된 갈락토스 배지에서 5일 배양하였다. 대조군(Control)은 중금속이 첨가되지 않은 갈락토스 배지를 사용하여 배양하였다. 납 또는 카드뮴이 첨가된 배지에서 각 재조합ycf1-pESC 효모, wt-pESC 효모,ycf1-YCF1효모의 성장정도는 도 2에 사진으로 나타내었다.
도 2에서ycf1돌연변이 효모에YCF1을과발현시킨ycf1-YCF1효모는 카드뮴 뿐만 아니라 납을 함유한 배지에서ycf1-pESC 효모 또는 wt-pESC 효모보다 잘 성장하는 것으로 나타나,YCF1유전자가 카드뮴 내성에 중요한 역할을 한다는 이전의 결과를 확인하였고, 또한 이 유전자가 납 내성에도 중요하다는 것을 새로이 확인하였다.
3-3: 재조합 효모의 YCF1 발현
실시예 3에서 제조한ycf1-pESC 효모, wt-pESC 효모, 및ycf1-YCF1효모에서YCF1의 발현을 확인하기 위한 노던블롯을 실시하였다.
각각의 재조합 효모들은 액체질소를 넣어 분쇄하였고, 전체 RNA 추출 완충액(0.25 M Tris HCl pH 9.0, 0.25 M NaCl, 0.05 M EDTA, 0.345 M p-Aminosalicylic acid, 0.027 M triisopropyl naphthalene sulfonic acid, 0.02 %β-mercaptoethanol, 0.024 % phenol)과 페놀/클로로포름을 동량으로 혼합하였다. 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 새로운 튜브에 옮기고, 이소프로판올 400 ㎕를 첨가하였다. 다시 1,2000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 RNA를 침전시킨 다음 DEPC로 처리된 물에 녹여 냉동실에 보관하였다.
노던블롯을 실시하기 위하여, 30 ㎍의 RNA를 RNA용 아가로즈 젤에 전기영동하고, 나일론 막에 RNA를 전이시켰다. 나일론 막은 혼성화 반응액 (6×SSPE, 0.5 % SDS, 10 % PEG, 1 % nonfat milk, 50 % formamide)상에서 42 ℃, 2시간 교반하여 반응시켰다. 그리고32P dCTP로 표지된YCF1를 넣고 42 ℃, 12 시간 반응시켰다. 혼성화 반응이 끝난 나일론 막은 완충액(2×SSPE 및 0.5 % SDS)으로 2회 세척하고, 완충액(0.2×SSPE, 0.5 % SDS)으로 세척 후 건조시킨 다음 X-레이 필름에 감광하였다. 상기 실험결과를 도 2의 B에 나타냈다.
도 2의 B는 3종의 재조합 효모들의 노던블롯사진으로,ycf1-YCF1효모가YCF1mRNA를 과다 발현하고 있음을 확인할 수 있다. 즉, 실시예 3-2에서 나타난,ycf1-YCF1효모의 납 및 카드뮴 내성은YCF1의 과발현에 의한 것임을 입증하였다.
3-4: 납 및 카드뮴 내성 기작
YCF1 유전자에 의한 납 및 카드뮴 내성이 중금속의 세포내 축적에 의한 것인지 세포외 배출에 의한 것이지를 확인하기 위한 실험을 실시하였다.
1.5 mM 납 또는 15 uM 카드뮴이 첨가된 1/2 갈락토스 고체 배지에 3종의 효모들(ycf1-pESC 효모, wt-pESC 효모, 및ycf1-YCF1효모)을 각각 하루동안 배양하고, 배양된 효모를 긁어 수득하였다. 수득한 효모는 농질산 1 ml에 넣고 200 ℃에서 약 6시간 동안 녹인 다음, 0.5 N 질산 10 ml로 희석하고, 원자흡광분석기(atomic absorption spectrometer: AAS)로 효모가 포함하는 중금속량을 측정하였다.ycf1-pESC 효모, wt-pESC 효모, 및ycf1-YCF1효모에 대한 측정결과는 도 3에 그래프로 나타내었다.
그 결과, wt-pESC 효모와ycf1-YCF1효모는ycf1-pESC 효모에 비하여 납 및 카드뮴의 축적정도가 높았으며, 특히 wt-pESC 효모와ycf1-YCF1효모가ycf1-pESC 효모보다 약 2배 가량 높은 납 축적성을 나타내었다. 따라서,YCF1유전자에 의한 납 및 카드뮴 내성은 상기 중금속의 세포내 축적에 의한 것임을 확인할 수 있었다.
실시예 4: YLH035C 재조합 효모의 납 내성
4-1: 재조합 효모의 제조
상기 실시예 3-1과 실질적으로 동일한 방법으로 상기 실시예 2에서 제조한 pESC-YHL035C를 이용하여,yhl035c돌연변이 효모에 빈 벡터를 도입한 재조합 효모(yhl035c-v 효모), 천연형 효모에 빈 벡터를 도입한 재조합 효모(wt-v 효모), 그리고 yhl035c돌연변이 효모에YHL035C를과발현시킨 재조합 효모(YHL035C효모)를 각각 제조하고, 형질전환 효모들(wt-v 효모, yhl035c-v 효모, YHL035C 효모)을 선별하였다. 상기 재조합 효모를 이용하여 납 대한 내성 실험을 수행하였다.
4-2: 재조합 효모의 납 내성 실험
상기 실시예 3-2과 실질적으로 동일한 방법으로 wt-v 효모, yhl035c-v 효모및 YHL035C 효모에 대해 납 내성실험을 수행하였다. 납이 첨가된 배지에서 각 재조합 wt-v 효모, yhl035c-v 효모 및 YHL035C 효모의 성장정도는 도 4에 사진으로 나타내었다.
도 4에서 나타낸 바와 같이, yhl035c 돌연변이 효모인 yhl035c- v는 1.8 mM 납을 함유된 배지에서 wt-v 효모보다 민감했다. 그러나 yhl035c 돌연변이 효모에 YHL035C를 발현시킨 YHL035C 효모는 다시 납에 대한 내성을 회복해서, 1.8 mM 납을 함유된 배지에서 wt-v 효모와 비슷한 생장을 보였다. 따라서YHL035C유전자는 납 내성에 중요한 역할을 한다는 것을 새로이 알 수 있었다.
실시예 5: 형질전환 식물의 제조
5-1: 식물형질전환용 YCF1 벡터 및 YHL035C 벡터의 제조
식물에YCF1유전자를 도입하기 위해서, pESC-YCF1 플라스미드의 BamH I/SnaB I 단편인 4.6 kb의YCF1을 PBI121(BamH I/Sma I)에 삽입하여 PBI121-YCF1 벡터를 제조하였다. 식물에서YCF1유전자의 발현을 향상시키기 위해 EnPCAMBIA1302-YCF1 벡터를 만들었다. PCAMBIA1302 벡터를 Sal I제한효소로 자른 뒤 클레나우(Klenow fragment)와 dNTPs를 처리하여 벡터 끝을 블런트로 만들고 BamH I으로 잘린 벡터에 35S enhancer (BamH I/blunt-end)를 삽입해서 EnPCAMBIA1302 벡터를 제조했다. EnPCAMBIA1302-YCF1 벡터는 EnPCAMBIA1302 벡터의 BglII/PmlI 자리에 YCF1 유전자 (BamHI/ blunt-end)를 삽입해서 만들었다.
PBI121-YCF1 벡터 및 EnPCAMBIA1302-YCF1는 대장균에일렉트로포레이터(electroporator, BIO-RAD)로 도입하고, LB 고체배지에 배양하였다. 단일 콜로니는 3 ㎖ LB(Amp) 액체배지에서 접종하고, 12-16시간 배양한 다음 원심분리하여 형질전환된 대장균을 수득하였다. 대장균에 100 ul의 용액I(50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA)을 첨가하여 현탁시키고, 여기에 200 ul의 용액II(1 % SDS, 0.2 N NaOH)을 첨가하여 가볍게 혼합하고, 얼음물 속에 넣어 5분간 반응시켰다. 상기 혼합물에 150 ul의 용액III (5 M Potassium acetate)을 첨가하여 3-5회 천천히 혼합하고, 원심분리 (12,000 rpm, 10분)하여 상층액을 수득하였다. 상층액에 100 % 에탄올을 혼합하여 DNA를 침전시키고, 분리, 건조시켰다. 수득된 PBI121-YCF1 플라스미드 DNA를 TE 완충액에 용해시키고, BamHI과 EcoRI 제한 효소로 잘라YCF1유전자가 방향이 맞게 삽입되었음을 확인하였다.
식물에 YHL035C 유전자를 도입하기 위해서 상기 식물형질전환용 YCF1 벡터와 실질적으로 동일한 방법으로 pBI121-YHL035C 벡터를 제조하였으나, 다만 실시예 2에서 제조한 pESC-YHL035C 벡터로부터 YHL035C 유전자를 잘라내어, 양 끝에 SacI과 EcoICR1 제한효소 자리를 만들고, 이것을 SacI과 SmaI 제한효소로 자른 pBI121 벡터에 넣어 pBI121-YHL035C 벡터를 제조하였다.
5-2: 형질전환 애기장대 식물 제조
상기 실시예 5-1에서 제조한 PBI121-YCF1 및 EnPCAMBIA1302-YCF1 벡터를 일렉트로포레이터(BIO-RAD)로 아그로박테리움 (Agrobacterium LBA4404)에 도입하였다. 형질전환된 아그로박테리움은 가나마이신이 함유된 MS(Murashige-Skoog) 배지에서 선별하였고, 침지(dipping method; Clough, S.J., and Bent, A.F., Floral dip: a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J. 16, 735-743 (1988))로 애기장대식물(Arabidopsis thaliana)의 꽃에 감염시켜YCF1유전자를 식물에 도입하였다. 그리고 4-5주 후 애기장대의 씨를 수확하여 PBI121-YCF1 벡터로 형질전환된 식물은 가나마이신으로, EnPCAMBIA1302-YCF1 벡터로 형질전환된 식물은 하이그로마이신으로YCF1애기장대 식물을 선별하였다.
총 5종의YCF1애기장대식물을 수득하였고,YCF1mRNA의 발현정도와 발현된 mRNA의 길이가 천연형의 700 bp인지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 먼저, 5종의YCF1애기장대식물에서 mRNA를 추출하여 서열번호 5/서열번호 6의 프라이머로 RT-PCR하였으며, RT-PCR 결과를 도 5의 A에 나타냈다. 도 5의 A에 나타낸 바와 같이, 1, 3, 4 및 5번 식물에서 700 bp의YCF1의 발현을 확인했으며, 특히 4번과 5번의 식물에서YCF1의 발현이 높게 나타났다.
상기 RT-PCR 산물에 대해 서든블롯을 실시하였으며 그 결과를 도 5의 B에 나타냈다. 도 5의 B에서 나타난 바와 같이, 도 5의 A의 결과와 동일하게 1, 3, 4, 및 5번 식물에서YCF1가 발현되고 있으며, 천연형의YCF1mRNA가 완전히 전사되고 있음을 확인할 수 있었다. 상기YCF1발현이 높은YCF1애기장대식물은 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 생명공학연구소 유전자은행에 2001년 9월 5일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC10064BP를 부여받았다.
5-3: 형질전환 포플러의 제조
형질전환용 식물로는 야외에서 선발한 개화가 되지 않는 돌연변이 현사시 (Populus alba x P. glandulosa)클론인 봉화1을 증식하여 사용하였다. 포플러의 기내 무균재료 확보를 위해 임목육종연구소 구내포지에 보존중인 채수포에서 줄기를 절단 70% ethanol (5분), 2% NaCl (20분)로 표면살균 후 MS 배지에서 4주 배양으로 발생된 줄기를 형질전환 시료로 이용하였다.
목적 유전자가 포함된 아그로박테리움을 이용하여 형질전환과 캘러스 유도, 줄기유도 등의 과정은 Noh 등의 방법(포플러의 유전공학(2002), 노은운 등 지음, ISBN #89-8176-098-5 93520)을 이용하였다. 상기 실시예 5-2에서 제조한 PBI121-YCF1 및 EnPCAMBIA1302-YCF1 벡터가 도입된Agrobacterium tumefaciens를 LB 배지에 접종한 후 30 ℃에서 하룻밤 배양하고, 1,000g에서 10분간 원심분리한 후 배지를 쏟아버리고 펠렛을 0.85% NaCl 용액에 현탁시켰다. 이 현탁액을 페트리 디쉬에 부은 후, 기내 배양된 포플러의 절간 조직을 20분간 침지시켰다. 그 다음 소독된 흡습여과지 2장 사이에 넣고 가볍게 눌러주어 과도한 아그로박테리아를 제거하고, 항생제가 첨가되지 않은 캘러스 유도배지(MS＋2.4-D 1.0㎎/L, BA 0.1mg/L, NAA 0.01㎎/L)(Murashige and Skoog. 1962)에서 2일간 공조배양한 다음. 50㎎/L kanamycin과 500㎎/L cefotaxime이 첨가된 선발 배지를 사용하여 형질전환 세포를 선발하였다.
형성된 캘러스는 줄기유도배지(WPM＋zeatin 1.0㎎/L, BA 0.1㎎/L, NAA 0.01㎎/L)(Lloyd and McCown, 1981) 에 50㎎/L 가나마이신을 첨가하여 줄기를 유도하였다. 일단 줄기가 유도되면 50㎎/L 가나마이신을 첨가한 MS 기본배지에 계대배양하여 줄기를 신장시켰으며, 뿌리는 같은 배지에 IBA 0.2 ㎎/L을 첨가하여 식물체를 유도하였다.
실시예 6: 유해물질 존재하에서 형질전환 애기장대 식물의 성장
실시예 5의YCF1애기장대식물을 납(0.9,1, 1.1 mM), 카드뮴 (50, 60,70 μM), 제초제인 클로로-디니트로벤젠(chloro-dinitrobenzene, CDNB) (60 μM), 오가 비소 (50 μM)가 들어있는 1/2 MS 배지에서 배양하여 성장정도를 확인하였다. 또한 애기장대 식물에 빈 벡터를 형질전환시킨 식물 (PBI) 및 야생형 (wt)를 대조군으로 하여 비교하였다. 상기 실험결과를 도 6 내지 도 8에 나타냈다.
도 6는YCF1형질전환 애기장대 식물의 성장정도를 나타낸 사진과 그래프이다. 도 6에 나타낸 바와 같이,YCF1애기장대와 대조구 식물을 납이 함유된 배지에서 3주 동안 키웠을 때,YCF1애기장대 (1,3,4,5)의 잎과 뿌리는 PBI 빈 벡터 형질전환 식물 및 야생형 (wt)보다 황백화현상도 적었고, 뿌리 생장도 좋았다 (A,B,D). 그리고, 다양한 농도의 카드뮴배지에서YCF1과 야생형 (wt) 애기장대 식물을 키웠을 때, 야생형 (wt) 애기장대 식물은YCF1형질전환체보다 잎이 황백화었고, 뿌리는 잘 자라지 못하고 짧았다(C,E).
도 7은 비소에 대한YCF1형질전환 애기장대 식물의 내성을 나타낸 사진이다. 60 μM 5가 비소가 들어있는 배지에서 3주동안 자란 야생형 애기장대(wt)는 거의 생장을 못했으나,YCF1형질전환체(1,2,3,4)는 야생형보다 생육이 매우 좋았다.
도 8은 CDNB에 대한YCF1형질전환 애기장대 식물의 내성을 나타낸 사진이다.YCF1애기장대와 대조구 식물을 CDNB 60 μM이 들어 있는 배지에서 2달 동안 키웠을 때,야생형 식물은 발아도 잘되지 않고 거의 죽었으나,YCF1애기장대 식물은 거의 정상 식물처럼 잘 자랐다.
따라서, 실시예 5의YCF1형질전환 애기장대 식물은 납 및 카드뮴, 비소, 제초제에 대한 내성이 있음이 확인되었다.
실시예 7: 형질전환 애기장대 식물의 중금속 축적성
상기 실시예 5에서 얻어진YCF1애기장대 식물과 천연형 애기장대인 PBI를 납(0.75 mM)과 카드뮴(70 μM)이 함유된 1/2 MS 배지에서 3주간 배양하여 중금속 축적성을 확인하였다. 납 또는 카드뮴의 축적양은 상기 실시예 6과 실질적으로 동일한 실험방법으로 확인하였고, 그 결과는 도 9에 나타내었으며, 도 9의 A는 납의 축적량을 나타낸 것이고 B는 납 및 카드뮴의 축적량을 나타낸 것이다.
상기 실험결과, 도 9의 A에 나타낸 바와 같이,YCF1애기장대 식물은 천연형 애기장대 및 PBI에 비하여 2배 내지 1.4배의 높은 납 축적성을 나타내었다. 또한, 도 9의 B에 나타낸 바와 같이,YCF1애기장대 식물은 PBI에 비하여 2 배 내지 3배의 축적성을 나타내었다.
따라서,YCF1애기장대 식물은 천연형 애기장대에 비하여 높은 납 및 카드뮴 축적성을 가짐을 확인하였다.
실시예 8: YCF1 형질전환 식물의 유해물질 내성 기작
YCF1 형질전환 식물이 납, 카드뮴, 비소와 제초제에 대한 내성을 보였고, 납 과 카드뮴에 축적성을 보였다. 이 현상이 액포에 존재하는 YCF1 단백질이 중금속을 액포에 넣어서 일어난 것인지 확인하기 위해, YCF1 형질전환 식물과 야생형 식물 (wt)에서 액포를 분리하여 카드뮴 및 제초제에 대한 수송실험을 수행했다. 상기 YCF1 형질전환 식물 및 천연형 식물의 액포에서 카드뮴 (Cd+GSH) 및 제초제 (DNB-GS)에 대한 수송실험 결과를 하기 표 1에 나타냈다.
GS-관련 화합물의 섭취 (단위: pmol/1 μl vacuole/20min)
화합물 천연형 식물(wt) YCF1 형질전환 식물
-MgATP +MgATP -MgATP +MgATP
DNB-GS 21 ± 1.1 28 ± 1.3 24 ± 0.9 33 ± 1.2
Cd+GSH 75 ± 3.3 104 ± 4.9 71 ± 3.4 177 ± 9.8
GSH - 70 ± 2.2 - 69 ± 1.1
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, YCF1은 물질을 수송할 때 MgATP를 에너지로 사용하기 때문에, -MgATP 그룹에서는 카드뮴 (Cd+GSH) 및 제초제 (DNB-GS)의 량이 YCF1 형질전환체와 천연형 식물은 차이가 없었다. 그러나, MgATP를 넣었을 때 카드뮴 (Cd+GSH)의 경우, YCF1 형질전환체 액포가 wt 액포보다 약 1.7배 함량이 높았다. 제초제 (DNB-GS)의 경우, YCF1 형질전환체가 천연형보다 약간 더 함량이 높았다.
YCF1형질전환 애기장대 식물이 천연형보다 납, 카드뮴, 비소와 제초제에 대해 내성과 축적성을 갖는 것을 확인했었다. 이러한 현상은YCF1형질전환 애기장대 식물의 액포에 발현하는 YCF1 단백질이 납, 카드뮴, 비소와 제초제를 액포에 넣어 안정화시켜서 이들 유해물질 대한 내성과 축적성을 가지게 하는 것을 확인했다.
실시예 9: 형질전환 포플러 식물의 성장
9-1: YCF1 형질전환 포플러 식물
실시예 5의YCF1포플러 식물의 잎과 줄기 조각을 납 500 ppm이 함유된 캘러스 유도배지 위에 올려놓고, 2주 동안 배양하여 성장정도를 확인하였다. 형질전환시키지 않은 야생형 포플러(wt) 식물을 같은 방법으로 처리하여 대조군으로 비교하였으며, 실험결과를 도 10에 나타냈다. 도 10은YCF1형질전환 포플러 식물의 성장정도를 나타낸 사진과 그래프이다.
도 10에 나타낸 바와 같이,YCF1포플러와 대조구 식물을 납이 함유된 배지에서 2주 동안 키웠을 때,YCF1포플러 (1,2,3,4)의 줄기 조각들은 야생형 (wt)보다 생장이 약 2배 정도 높았으며 (A,C), 과YCF1포플러 (1,2,3)의 잎 조각들은 야생형 (wt)보다 갈변이 덜 되고, 푸른 엽록소의 색을 유지하였다(B).
9-2: YHL035C 형질전환 포플러 식물
실시예 5의 YHL035C 형질전환 포플러 식물을 화분에 옮겨서 포트 묘로 육성하였다. 내성실험을 위해 Pb(NO)3500ppm 용액에 침지시킨 토양에 상기 포트 묘를 옮겨 심었다. 상기 실험결과를 도 11에 나타냈다.
도 11은 납이 포함된 토양에서 4주 동안 자란 야생형 포플러(wt)는 거의 생장을 못했으나,YHL035C형질전환체는 야생형보다 생육이 매우 좋다는 것을 보여주는 사진이다. 따라서, 실시예 5의YCF1형질전환 포플러 식물과 YHL035C 포플러 식물은 납에 대한 내성이 있음이 확인되었다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의YCF1유전자는 생물체내의 중금속 및 다른 유해물질에 대한 내성 및 축적성을 향상시키는 것이며,YHL035C유전자는 납에 대한 내성을 향상시키는 것으로, 상기 유전자를 발현하는 형질전환체를 제조하여 유해물질로 오염된 환경을 정화하는 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 형질전환체를 이용하여 환경친화적이고, 경제적인 환경정화를 실시할 수 있다.

Claims (21)

  1. 납에 대한 내성 및 축적성을 나타내며, 곰팡이의 MRP-계통 ATP 결합 카세트 수송 단백질(multidrug resistance-associated protein-like ATP-binding casette transporter protein, MRP-계통 ABC 수송 단백질)을 코딩하는 DNA 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질은 YCF1 단백질, YHL035C 단백질, BPT1 단백질, YBT1 단백질, 및 YOR1 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 것인, DNA 분자.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 YCF1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 분자.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 YCF1 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것인 DNA 분자.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 YCF1 단백질은 납에 대한 내성 및 축적성 이외에, 카드뮴, 비소 및 제초제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유해물질에 대한 내성 및 축적성을 추가로 나타내는 것인 DNA 분자.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 제초제는 클로로디니트로벤젠 (chloro-dinitrobenzene)인 DNA 분자.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 YHL035C 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지며, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 분자.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 YHL035C 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것인 DNA 분자.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질은 서열번호 2의 YCF1 단백질의 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 YHL035C 단백질의 아미노산 서열과 28% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질인, DNA 분자.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질은 서열번호 2의 YCF1 단백질 또는 서열번호 4의 YHL035C 단백질의 아미노산 서열과 28% 이상의 서열 상동성을 가지며,
    상기 YCF1 단백질 또는 YHL035C 단백질은 각각 N-말단 연장 도메인(N-terminal extension domain), 첫번째 막관통 도메인(first transmembrane spanning domain), 첫번째 뉴클레오타이드 결합 도메인(first nucleotide binding folddomain), 두번째 막관통 도메인(second transmembrane spanning domain), 및 두번째 뉴클레오타이드 결합 도메인(second nucleotide binding fold domain)의 도메인으로 이루어지고, 상기 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질의 각 도메인은 서열번호 2의 YCF1 단백질 또는 서열번호 4의 YHL035C 단백질에 대응하는 각 도메인의 아미노산 서열과 28% 이상의 서열 상동성을 갖는 것인 DNA 분자.
  11. 제 1항 내지 10항중 어느 한 항에 따른 곰팡이의 MRP-계통 ATP 결합 카세트 수송 단백질(multidrug resistance-associated protein-like ATP-binding casette transporter gene, MRP-계통 ABC 수송 유전자)을 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pESC-YCF1,ENpCambia-YCF1, 또는 PBI121-YCF1인 재조합 벡터.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pESC-YHL035C재조합 벡터, 또는 pPBI121-YHL035C인 재조합 벡터.
  14. 제 1항 내지 10항중 어느 한항에 따른 곰팡이의 MRP-계통 ATP 결합 카세트 수송 단백질(multidrug resistance-associated protein-like ATP-binding casette transporter gene, MRP-계통 ABC 수송 유전자)을 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된형질전환 생물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 형질전환 생물은 원핵생물 또는 진핵생물인 형질전환 생물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 진핵생물은 동물, 식물, 또는 효모인 형질전환 생물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 식물은 애기장대, 유채, 갓, 담배, 양파, 당근, 오
    이, 유채, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 담배, 브로콜리, 페츄니아, 해
    바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 자작나무, 포플러, 버드나무, 및 박달나무로 이루
    어진 군에서 선택되는 것인 형질전환 생물.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 형질전환 생물은YCF1애기장대(기탁 번호 KCTC 10064BP), 또는 YCF1 포플러인 형질전환 생물.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 형질전환 생물은YHL035C포플러인 형질전환 생물.
  20. 제 1항 내지 10항중 어느 한 항에 따른 곰팡이의 MRP-계통 ABC 수송 단백질(multidrug resistance-associated protein-like ATP-binding casettetransporter gene, MRP-계통 ABC 수송 유전자)을 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 식물세포.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 식물은 애기장대, 유채, 갓, 담배, 양파, 당근, 오이, 유채, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 담배, 브로콜리, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 자작나무, 포플러, 버드나무, 및 박달나무로 이루어진 군에서 선택되는 것인 식물세포.
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