KR100515520B1

KR100515520B1 - 중금속 내성이 향상되고 흡수가 저하된 형질전환체 제조방법

Info

Publication number: KR100515520B1
Application number: KR10-2002-0018369A
Authority: KR
Inventors: 이영숙; 양영열; 황인환; 배현주; 이주현
Original assignee: 주식회사 포스코; 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2001-04-04
Filing date: 2002-04-04
Publication date: 2005-09-16
Also published as: DE60233209D1; KR20020077832A; ATE438725T1

Abstract

본 발명은 중금속 내성이 향상되고 흡수가 저하된 형질전환체 제조방법에 관한 것으로서, 중금속을 세포외로 펌프하는 P 타입 ATPase 유전자로 형질전환된 식물에 관한 것이다. 본 발명에서는 중금속으로 오염된 환경에서 성장할 수 있으며, 납과 카드뮴의 흡수가 저하된 안전한 작물을 개발할 수 있다.

Description

중금속 내성이 향상되고 흡수가 저하된 형질전환체 제조방법{GENETIC MODIFICATION OF PLANTS FOR ENHANCED RESISTANCE AND DECREASED UPTAKE OF HEAVY METALS}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 중금속 내성이 향상된 형질전환체 제조방법 및 그로부터 제조된 형질전환 식물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 중금속에 대하여 내성을 가지고, 이들 중금속에 대한 함량이 낮아져, 오염된 환경에서 성장할 수 있는 형질전환 식물 및 상기 식물을 이용한 환경정화방법 및 안전한 작물 개발에 관한 것이다.

[종래기술]

중금속은 주된 환경오염 인자로 반응성 산소종(reactive Oxidation Species)의 생성, DNA 손상 및 세포내 효소의 활성부위에 결합하여 효소의 비활성화를 야기한다.

과거 수십년간 산업화가 진행됨에 따라 중금속에 의한 환경오염이 급격히 증가하였다. 1990년초에는, 연평균 방출량이 카드뮴 22,000톤, 구리 954,000 톤, 납 796,000톤, 아연 1,372,000톤에 이르렀다(Alloway BJ & Ayres DC (1993) Principles of environmental pollution. Chapman and Hall, London). 또한 중금속에 오염된 토양은 식물의 정상적인 성장을 저해하고, 곡물의 오염을 야기하여 인간이 건강을 위협하고 있는 실정이다.

전세계적으로 중금속을 토양으로부터 제거하기 위한 연구들이 진행되었다. 일반적인 방법은 물리적 또는 화학적인 방법으로, 오염된 부위를 직접 제거 또는 묻어버리거나, 알카리용액을 이용하여 고정하거나 여과하는 방법들이 이에 속한다(Salt DE, Blaylock M, Kumar NPBA, Viatcheslav D, Ensley BD, et al. (1995). Phytoremediation : a novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants. Bio-Technology 13,468-74; Raskin I, Smith RD, Salt DE. (1997) Phytoremediation of metals: using plants to remove pollutants from the environment. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 221-6). 그러나 이러한 방법들은 비용이 많이 들고, 막대한 에너지가 소요된다는 문제점이 있다.

반면에 식물환경정화기술(Phytoremediation)은 식물을 이용한 환경정화법으로 중금속을 제거하는데 매우 효율적이며 환경친화적인 방법으로, 식물 추출(phytoextraction), 뿌리 여과 (rhizofiltration) 및 식물 안정화(phytostabilization)의 세 가지 방법으로 나뉘어진다. 식물추출은 중금속을 축적할 수 있는 능력을 갖고 있는 식물을 이용하여 토양으로부터 중금속을 제거하는 방법이고, 뿌리여과는 식물의 뿌리를 이용하여 오염된 수질로부터 오염 물질을 제거하는 방법이며, 식물안정화는 식물을 이용하여 토양에 있는 독성 물질을 비활성화시키는 방법이다(Salt DE et al., Biotechnology 13(5):468-474, 1995).

식물환경정화기술의 일례로써 라레아 트리덴타타(Larrea tridentata) 식물을 사용하여 구리, 니켈 및 카드뮴을 정화하는 방법(미국 특허 제 5,927,005호), 브라시카세애 과(Brassicaceae family)의 식물을 이용한 방법(Baker et al., New Phytol. 127:61-68, 1994) 등이 보고되었다.

또다른 방법으로 중금속에 저항성을 갖게 할 수 있는 유용한 유전자를 식물체에 도입하여 형질전환된 식물을 이용한 식물환경정화기술이 시도되고 있다. 중금속에 저항성을 가지는 유전자로는 CAX2(Calcium exchanger 2), 사이토크롬 P450 2E1, NtCBP4(Nicotiana tabacum calmodulin-binding protein), GSHII(glutathione synthetase), merB(organomercurial lyase) 또는 MRT 폴리펩타이드(metal-regulated transporter polypeptide)가 알려져 있다. CAX2는 카드뮴, 망간과 같은 중금속을 식물체 내에 축적하며(Hirschi KD et al., Plant Physiol. 124:125-134, 2000), 사이토크롬 P450 2E1은 트리클로로에틸렌(TCE)등의 유기물질을 식물내에 받아들여 분해하는 것으로 보고되어 있다(Doty SL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6287-6291, 2000). NtCBP4는 형질전환 식물체에서 니켈에 대하여 저항성을 나타내고(Arazi T et al., Plant J. 20:171-182, 1999), GSHII는 카드뮴을 식물체 내에 축적하며(Liang Zhu Y et al., Plant Physiol. 119:73-80, 1999), merB는 유기 수은 물질을 분해하며(Bizily SP et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6808-6813, 1999), MRT 폴리펩타이드는 철, 카드뮴, 망간 및 아연과 같은 중금속을 토양으로부터 제거하는 것으로(미국 특허 제 5,846,821호) 알려져 있다.

그러나 위에 열거한 중금속 저항성을 나타내는 유전자로 형질전환된 식물체는 중금속으로 오염된 토양에서의 성장이 야생종에 비해 개선되었지만, 중금속을 계속 세포질 내에 축적해야 하는 경우 성장에 한계가 있을 수 있으며, 식용 작물의 경우는 중금속으로 오염된 농작물이나 과실수가 생산될 수 있다는 문제점이 있다. 따라서, 중금속 등의 오염 물질을 덜 흡수하면서 성장을 계속적으로 유지할 수 있는 식물의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명은 중금속에 대하여 내성을 가지며, 식물내 중금속 축적을 저해할 수 있는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 중금속에 대하여 내성을 가지는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 중금속에 대하여 내성을 가지며, 중금속에 대한 축적성이 낮은 형질전환체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 중금속에 대하여 내성을 가지며, 중금속에 대한 축적성이 낮은 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 중금속 오염지를 환경친화적인 공간으로 조성할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 식물에서 발현가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있고, 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질을 암호하는 서열을 포함하는 재조합벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 일부를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 각각 형질전환된 식물세포를 제공한다.

본 발명은 (a) 식물에서 발현가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있고, 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질을 암호하는 서열을 포함하는 발현카세트를 제조하고, (b) 상기 발현카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, (c) 상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하는 것을 포함하는 중금속 저항성 식물의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 언급하는 "P 타입 ATPase"는 ATP를 분해하여 나온 에너지를 써서 물질을 운반하는 수송체이며, 자체가 인산화되는 과정을 거치는 특징을 가지며, 특히 중금속을 운반하는 수송체를 의미한다. 상기 중금속은 비중이 4이상인 금속원소로, 비소, 안티몬, 납, 수은, 카드뮴, 크롬, 주석, 아연, 바륨, 비스무트, 니켈, 코발트, 망간, 철, 구리 또는 바나듐 등이 있다.

본 발명에서 언급하는 "상동성(homology)은 DNA 또는 단백질 간의 서열 유사성(similarity)을 의미한다. 생물학적 활성을 가지는 ZntA-유사 중금속 수송 ATPase(ZntA-like heavy metal pumping ATPases)는 ZntA와 염기서열상 50 % 이상의 상동성을 가지고, 중금속을 펌프한다. 상기 생물학적 활성을 가지는 ZntA-유사 중금속 수송 ATPase로는 아연-수송 ATPase (NC_000913), 아연-수송 ATPase (NC_002655), 중금속-수송 ATPase (NC_003198), P-type ATPase계 (NC_003197), Mycobacterium lepraed 의 양이온 수송 P 타입 ATPase (GenBank #Z46257) 및 그밖의 공지의 것들이 있다.

본 발명에서 언급하는 "중금속 저항성 단백질"은 납, 카드뮴 및 아연의 존재하에서 성장이 억제되지 않도록 매개하는 단백질을 의미한다. 일예로 서열번호 2의 ZntA 단백질이다. zntA 유전자는 대장균(Escherichia coli)으로부터 분리된 Pb(II)/Cd(II)/Zn(II)-전달 ATPase로써 납, 카드뮴 및 아연과 같은 중금속을 세포막 외부로 이동시키는 기능을 갖고 있다(Bharati M et al., J. Biol. Chem. 275:3873-3878, 2000).

본 발명에서 언급하는 "식물에서 발현가능한"은 암호하는 서열이 식물세포, 식물조직 및 식물체에서 효율적으로 발현됨을 의미한다.

본 발명에서 언급하는 "식물에서 전사 및 번역가능한"은 식물, 식물세포 및 식물조직에서 목적유전자가 발현될 수 있도록 결합되어있음을 의미한다. 목적유전자의 5'말단부분에 유전자의 발현을 조절할 수 있는 서열 또는 정량적으로 조절할 수 있는 서열을 포함한다. 번역조절 서열로는 라이보솜 결합서열이 있으며, 전사조절 서열로는 폴리아데닐레이션 신호가 있다. 이러한 서열은 당업자에 공지된 것이다.

본 발명에서 언급되는 "형질전환 식물"은 유전공학적으로 조작된 것으로 이종 DNA 서열을 포함, 발현하는 것을 의미한다. 형질전환 식물은 유전공학적인 방법으로 이종 DNA 서열을 포함하며, 식물세포, 식물조직 또는 식물체에서 발현가능하도록 제작되어 이종 DNA 서열을 발현한다.

본 발명은 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질을 암호하는 서열을 포함하는 식물에서 발현가능한 발현카세트를 제공한다. 상기 암호하는 서열은 식물에서 발현가능한 전사 및 번역 조절인자에 연결되어 있으며, 상기 인자들에 의해 조절된다. 상기 중금속으로는 비소, 안티몬, 납, 수은, 카드뮴, 크롬, 주석, 아연, 바륨, 비스무트, 니켈, 코발트, 망간, 철, 구리 또는 바나듐 등이 있다.

본 발명의 발현카세트는 프로모터, P 타입 ATPase 단백질을 암호하는 유전자 및 전사종결자를 포함한다. 상기 프로모터로는 식물 발현용 프로모터로, CMV(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터, CMV 19S 프로모터, 아그로박테리움 튜메팩시엔스 Ti 플라스미드(Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid)의 nos(nopaline synthase)프로모터, ocs(octopine synthase) 프로모터 및 mas(mannopine synthase) 프로모터, 및 공지된 프로모터가 있다.

상기 P 타입 ATPase 단백질은 서열번호 2의 ZntA 단백질이 바람직하고, P 타입 ATPase 단백질을 암호하는 유전자로는 서열번호 2의 ZntA 단백질을 암호하는 서열이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 암호하는 유전자는 서열번호 1의 서열이다.

또한 상기 P 타입 ATPase 단백질은 약 100개의 아미노산 잔기를 가진 아미노기 말단, 첫 번째 생체막 통과 도메인, 양이온 통로 모티프인 가진 CPX(Cys-Pro-X, X: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln 중 어느 하나) 모티프를 가진 두 번째 생체막 통과 도메인, 세 번째 생체막 통과 도메인, 첫 번째 세포질 도메인, 두 번째 세포질 도메인, 및 카르복실기 말단을 포함하는 ZntA로 사용할 수 있으며, P 타입 ATPase 단백질을 암호하는 서열은 ZntA를 암호하는 서열인 서열번호 1의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열을 사용할 수 있다. 또한 상기 각각의 도메인을 암호하는 서열은 zntA를 암호하는 서열인 서열번호 1의 서열과 50% 이상의 상동성을 가진 서열로 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 발현카세트는 P 타입 ATPase 단백질을 암호하는 유전자의 발현을 확인하거나 형질전환체를 선별할 수 있는 마커를 더욱 포함할 수 있다. 표지 유전자로는 카나마이신, 히그로마이신, 젠타마니신 및 블레오마이신 등의 항생제에 대하여 내성을 나타내는 유전자나 GUS(β-glucuronidase), CAT(chloramphenicol acetyltransferase), 루시퍼레이즈(luciferase) 및 GFP(green fluorescent protein) 등을 코딩하는 유전자가 있다. 상기 마커는 발현카세트와 함께 식물에 전달되어, 특정한 항생제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 형질전환체의 선별을 가능케 한다.

또한 본 발명은 상기의 발현카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 재조합 벡터는 공지된 벡터의 벡본(backbone) 및 발현카세트를 포함하고 있다. 공지된 벡터로는 pROKII, pBI76, pET21, pSK(+), pLSAGPT, pUC 및 pGEM가 있다. 본 발명에서 일예로 제조한 재조합 벡터는 PBI121/zntA 및 pEZG이다. PBI121/zntA는 PBI121에 35S 프로모터, zntA 유전자 및 노팔린 합성효소 전사종결자를 포함하며, pEZG는 pUC에 35S 프로모터, zntA 유전자, 푸른 형광 단백질(GFP) 및 노팔린 합성효소 전사종결자를 포함한다.

또한 본 발명은 상기 발현카세트를 포함하는 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 중금속을 전달하는 P 타입 ATPase 단백질을 암호하는 서열을 포함하며, 상기 서열은 전사 및 번역 조절인자에 연결되어 있으며, 상기 인자들에 의해 조절되도록 고안되어 있다.

본 발명의 형질전환체는 식물이며, 바람직하게는 식물, 식물세포 및 식물조직으로, 식물조직은 식물 종자를 포함한다. 상기 식물로는 초본(herbaceous plant) 및 목본식물로, 화훼작물(flowering plants), 원예작물(garden plants), 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채(Brassica campestris, B. napus), 갓(Brassica juncea), 담배(Nicotiana tabacum), 자작나무(Betula platyphylla), 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무(Betula schmidtii)가 대표적이다.

형질전환체는 공지된 기술로 제조할 수 있으며, 아그로박테리움 튜메팩신스-매개 DNA 전이(Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transfer)가 대표적이다. 더욱 바람직하게는 전기충격(electroporation), 미세 입자 주입 방법(micro-particle injection) 또는 유전자 총(gene gun)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법으로 제조된 재조합 아그로박테리움을 침지방법으로 식물에 도입하는 것이다.

또한 본 발명은 (a) 전사 및 번역이 가능하도록 연결된 중금속을 전달하는 P 타입 ATPase 단백질을 암호하는 서열을 포함하는 발현카세트를 제조하고, (b) 상기 발현카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, (c) 상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하는 것을 포함하는 중금속 저항성 식물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 식물 제조방법은 상기 (c)단계의 형질전환된 식물세포 또는 식물조직으로부터 형질전환 식물을 생산하는 것을 더욱 포함한다.

본 발명의 pZEG 벡터를 식물 원형질체에 도입하여 zntA 유전자 발현부위를 확인한 결과 ZntA 단백질은 식물의 세포막에서 발현되었다(도 2,3). 이후 애기장대에 pBI121-zntA를 아그로박테리움을 이용하여 형질도입하여 제조된 형질전환체의 중금속 내성 및 중금속 축적성을 확인하였다. 그 결과 ZntA 단백질을 발현하는 형질전환주는 납과 카드뮴에 대하여 내성을 가지며, 야생형에 비하여 납과 카드뮴 축적정도가 현저히 낮게 관찰되었다. 따라서, 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 유전자로 형질전환된 형질전환체는 중금속으로 오염된 환경에서도 원활히 성장할 수 있어, 중금속을 흡수량이 낮고, 인체에 해롭지 않은 안전한 작물을 제조할 수 있다. 황사나 자연재해 등에 의해 중금속이 원격지로부터 농경지로 유입되는 경우도 있으므로, 이러한 성질을 가진 작물이 필요하다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: zntA 유전자 분리

대장균 K-12 균주를 생명 공학 연구소의 유전자 은행으로부터 구입하였고, 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하였다. 서열번호 2 및 3의 프라이머로 PCR하였고, 약 2.2 kb의 z ntA 유전자(서열번호 1)를 분리하였다. z ntA 유전자의 염기서열을 확인하고, pGEM-T Easy 벡터(Promega)에 클로닝하여 pGEM-T/zntA 를 제조하였다.

실시예 2: ZntA 단백질의 발현

zntA 유전자를 원형질체(protoplast)에 발현시켜 ZntA 단백질의 발현위치를 확인하였다.

(2-1) 애기장대의 원형질체 준비

애기장대의 씨를 소독액(이차증류수 : 락스 : 0.05% triton X-100 = 3:2:2)에 넣고, 20-30초간 흔들어준 다음 5-10분간 상온에 방치하였다. 이후 증류수로 5회 세척하였다.

애기장대의 씨를 비타민, Duchefa 4.4 g/L, 슈크로즈 20 g/L, MES (2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic acid, Sigma) 0.5 g/L를 포함하는 액체 배지(Murashige & Skoog medium; MSMO, pH 5.7-5.8) 100 ml에 넣고, 120 rpm으로 교반배양하였고, 22 ℃에서 16/8(낮/밤)주기로 2-3주간 키웠다. 성장한 애기장대를 5-10 mm²의 크기로 자른 후 30 ml의 효소용액(1% 셀루라제 R-10, 0.25% 멀세로자임 R-10, 0.5 M 만니톨, 10 mM MES, 1 mM CaCl, 5 mM β-머캅토에탄올, 0.1% BSA, pH 5.7-5.8)에 옮기고, 10분 동안 150 mmHG로 진공여과(vacuum infiltration)한 다음 50-75 rpm으로 교반하면서 22℃, 암상태에서 5시간동안 배양하였다. 100 ㎛ 크기의 메쉬(MESH, SIGMA S0770)를 사용하여 원형질체를 걸러내고, 원형질체를 730 rpm에서 10분간 농도 구배 원심분리(21 % 슈크로즈)를 수행하여 완전한 원형질체를 분리하였다. 원형질체를 20 ml의 W5 용액(154 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl, 5 mM 포도당, 1.5 mM MES, pH 5.6)에 현탁하고, 530 rpm에서 6분 동안 원심분리한 후 침전된 원형질체를 W5 용액으로 재현탁하여 얼음에서 30분간 방치하였다.

(2-2) 플라스미드 벡터 준비

pGEM-T/zntA를 BamHI 제한효소로 절단한 후 전기영동하였고, zntA 유전자에 해당하는 크기의 밴드를 오려 DNA를 추출하였다(QIAGEN Gel extraction kit). 분리한 유전자를 CMV 35S 프로모터, 인핸서(enhancer), 녹색형광단백질(Green Fluorescent Protein) 및 NOS(노팔린 합성효소) 전사종결자를 발현카세트로 하는 도 1의 pUC-GFP에 클로닝하여 pEZG를 제조하였다.

(2-3) 수소이온 펌프 유전자 발현용 벡터의 준비

애기장대 세포막의 수소이온 펌프 유전자인 AHA2 cDNA(Gene Bank : P19456)는 PCR을 통해 증폭하였다. PCR은 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머세트로 다음의 PCR을 실시하였다: 94 ℃, 30초 -> 45 ℃, 30초 -> 72 ℃, 1분, 50회 반복. PCR 산물인 AHA2 cDNA를 수득하였다.

DsRed 벡터(Clontech, Inc.)를 BglII/NotI 제한효소로 절단하여 DsRed를 수득하고, BamHI/Ecl136II 제한효소로 절단된 smGFP 벡터에 삽입하여 326RFP 벡터를 제조하였다. 326RFP의 XmaI에 AHA2 CDNA 단편을 삽입하여 326RFP/AHA2를 제조하였다.

(2-4) pEZG 및 326RFP/AHA2의 원형질체로의 도입

실시예 (2-1)의 원형질체에 pEZG 및 326RFP/AHA2을 각각 도입하였고, 발현위치를 확인하였다.

원형질체를 500 rpm에서 5분동안 원심분리하여 침전시킨 후, MaMg 용액(400 mM 만니톨, 15 mM MgCl₂, 5 mM MES-KOH, pH 5.6)에 5 X 10⁶개/ml로 현탁하였다. 현탁액 300 ㎕에 pEZG 및 326RFP/AHA2를 각각 10 ㎍ 첨가하였고, PEG 용액(400 mM 만니톨, 100 mM Ca(NO₃)₂, 40% PEG 6000) 300 ㎕를 다시 첨가하여 혼합한 후 상온에서 30분간 방치하였다. 상기 혼합물을 W5 용액 5 ml로 희석하고 500 rpm에서 3분간 원심분리하였고, 여기서 얻어진 침전물을 다시 2 ml의 W5 용액으로 현탁하여 22-25℃, 암상태에서 배양하였다. 24시간 후 원형질체의 형광 단백질 발현 양상을 형광 현미경으로 관찰하였다.

도 2는 pEZG 및 326RFP/AHA2가 각각 형질도입된 원형질체에서 형광 단백질이 연결된 ZntA 및 AHA2의 발현위치를 확인한 사진이다. a는 대조구이고, b는 326RFP/AHA2에서 발현된 AHA2 단백질의 세포내 위치를 나타낸 것이고, c는 pEZG에서 발현된 ZntA 단백질의 세포내 위치를 나타낸 것이고, d는 b와 c의 사진을 겹친 것이다. pEZG에서 발현된 ZntA 단백질은 푸른 형광단백질에 의해 푸른빛을 나타내고, 326RFP/AHA2에서 발현된 AHA2 단백질은 적색 형광단백질에 의해 적색을 나타내었다.

도 2c에서 ZntA는 세포막에 위치하는 것으로 확인되었으며, 특히 도 2c와 2b를 겹친 도 2d에서 형광이 동일 위치에서 확인되었으므로, zntA가 발현되어 세포막에 위치함을 확인할 수 있었다.

또한 원형질체에서 세포질, 세포막을 분리하여 GFP 항체로 웨스턴 블롯을 실시하였다. 도 3은 웨스턴 블롯사진으로, WT-C는 야생형 애기장대 원형질체의 세포질이고, WT-M은 야생형 애기장대 원형질체의 세포막이고, ZntA-C는 pEZG가 형질도입된 애기장대 원형질체의 세포질이고, ZntA-M은 pEZG가 형질도입된 애기장대 원형질체의 세포막을 나타낸 것이다. 도 3에서 GFP 항체가 pEZG가 형질도입된 애기장대 원형질체의 세포막에서 추출한 단백질에만 반응하여, ZntA-GFP 단백질이 세포막에 위치하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: zntA 유전자를 발현하는 형질전환 식물제조

(3-1) 애기장대 식물

형질전환에 사용할 애기장대는 4℃에서 이틀 동안 저온처리를 한 후 16/8시간(낮/밤)의 광주기로 22℃/18℃로 온도를 바꾸어 주면서 3-4주 동안 꽃대가 올라올 때까지 키웠다. 1차 꽃대가 올라오면 잘라주었고, 4-5일 후 형성된 2차 꽃대를 사용하여 형질전환시켰다.

(3-2) pBI121/zntA 벡터제조

zntA 유전자를 식물 발현 벡터인 pBI121에 도입하여 pBI121/zntA 벡터를 제조하였다.

SmaI과 Ecl136II 제한효소를 사용하여 pBI121 벡터의 GUS 유전자를 제거한 후 pGEM-T Easy 벡터상에 클로닝되어 있는 zntA 유전자를 BamHI 제한효소로 절단하여 pBI121 벡터에 삽입하여 pBI121/zntA 벡터를 제조하였다(도 4).

(3-3) 형질전환 식물 제조

pBI121/zntA 벡터를 플라스미드 키트(Qiagen)를 사용하여 대량 분리하였고, 전기 충격 방법(electroporation)으로 아그로박테리움에 도입하였다. 아그로박테리움(KCTC 10270BP)을 YEP 배지(효모 추출물 10 g, NaCl 5 g, 펩톤 10 g, pH 7.5) 1ℓ에서 O.D. 값이 0.8-1.0이 될 때까지 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 세포를 수확한 뒤, 5 % 수크로즈가 포함된 MS 배지(Murashige & Skoog medium, 4.3 g/L, Duchefa) 1ℓ에 현탁하였고, 형질전환 직전 Silwet L-77(LEHLE SEEDS, USA)을 0.01% 농도가 되도록 첨가해 주었다. 아그로박테리움이 포함된 용액에 지상 부위의 애기장대만 잠기도록 하여 1-2분간 담구어 형질전환시켰다.

실시예 4: 형질전환 식물의 선별

zntA 유전자가 도입된 개체만을 선별하기 위하여 형질전환한 식물체의 종자를 카나마이신(50 mg/l)이 포함된 배지에서 성장시켰다.

또한 pBI121 벡터만을 애기장대에 형질전환시켜 형질전환된 식물체를 선별하였다. 야생형 애기장대, pBI121 식물체 및 pBI121/zntA 식물체에서 각각 종자를 수득하여, 5% 수크로즈가 포함된 1/2MS 배지(Murashige & Skoog medium, 2.15 g/L, Duchefa)에서 21일 동안 키운 다음 전체 RNA를 각각 분리하였다. 동일양의 RNA를 포름알데하이드가 함유된 아가로즈젤에 전기영동하고, ZntA에 대한 프로브를 이용하여 노던블롯을 실시하였다.

도 5는 ZntA 유전자의 발현을 확인한 노던블롯사진이다. 야생형 애기장대 및 pBI121 식물체에서는 zntA RNA의 발현이 관찰되지 않았으나, 6번을 제외한 모든 pBI121/zntA 식물체에서는 ZntA RNA 발현이 관찰되었다. EF1-a는 식물체에서 항상 발현되는 유전자로서, 동일량의 RNA를 분리하여 사용하였음을 나타내는 것이다.

실시예 5: ZntA 식물체의 중금속 저항성 확인

야생형 애기장대 식물 및 pBI121/zntA 식물체를 1/2MS 아가배지에서 2주일 동안 키운 후, 카드뮴 70 μM 또는 납 0.7 mM이 포함되어있는 수용액 상태의 1/2MS 배지에서 2주동안 키워 식물의 성장정도, 중량 및 중금속 축적성을 관찰하였다.

(5-1) 식물의 성장정도

도 6은 납을 포함하는 배지에서 야생형 애기장대 및 pBI121/zntA 식물의 성장정도를 관찰한 것이고, 도 7은 카드뮴을 포함하는 배지에서 야생형 애기장대 및 pBI121/zntA 식물의 성장정도를 관찰한 것이다. WT는 야생형 애기장대이고, 1 내지 4는 pBI121/zntA 식물이다. 도 6 및 7에서, 야생형 애기장대는 납과 카드뮴이 존재하는 조건에서 잎이 검게 타고 성장이 느리게 진행되었고, pBI121/zntA 식물은 그에 비하여 잎이 정상적으로 푸르고 잎면적도 넓게 관찰되어, 납과 카드뮴에 저항성을 가짐을 알 수 있었다.

(5-2) 식물의 중량 측정

상기 조건에서 키운 야생형 애기장대 및 pBI121/zntA 식물을 4℃ 1 mM 타르타레이트 용액에 씻고, 물기를 없앤 후 중량을 측정하였다.

도 8a는 납이 함유된 배지에서 키운 야생형 애기장대 및 pBI121/zntA 식물의 중량을 나타낸 것이고, 도 8b는 카드뮴이 함유된 배지에서 키운 야생형 애기장대 및 pBI121/zntA 식물의 중량을 나타낸 것이다. 그 결과 야생형 애기장대에 비해 pBI121/zntA 식물의 중량이 높게 측정되어, pBI121/zntA 식물이 중금속 조건에서도 우수한 성장을 나타냄을 알 수 있었다.

(5-3) 엽록소 함량 측정

PBI121/zntA 식물의 엽록소 함량을 측정하기 위하여, 잎을 수득하여 95 % 에탄올로 20분간 80℃에서 추출하였다. 추출물은 664 nm와 648 nm에서 흡광도를 측정하여 엽록소 A 및 엽록소 B의 함량을 계산하였다.(Oh SA, Park JH, Lee GI, Paek KH, Park SK, Nam HG (1997) Identification of three genetic loci controlling leaf senescence in Arabidopsis thaliana. Plant J. 12, 527-35).

도 9a는 납이 함유된 배지에서 키운 야생형 애기장대 및 pBI121/zntA 식물의 엽록소 함량을 나타낸 것이고, 도 9b는 카드뮴이 함유된 배지에서 키운 야생형 애기장대 및 pBI121/zntA 식물의 엽록소 함량을 나타낸 것이다. pBI121/zntA 식물들의 엽록소 함량이 야생형 애기장대에 비하여 높게 관찰되었다.

(5-4) 중금속 축적성 측정

야생형 애기장대 및 pBI121/zntA 식물 각각을 200 도의 65% 질산용액에서 16시간 정도 열을 가하였고, AAS(Atomic Absorption Spectroscopy)를 이용하여 중금속의 함량을 측정하였다.

도 10a는 납이 함유된 배지에서 키운 야생형 애기장대 및 pBI121/zntA 식물의 중금속 함량을 나타낸 것이고, 도 10b는 카드뮴이 함유된 배지에서 키운 야생형 애기장대 및 pBI121/zntA 식물의 중금속 함량을 나타낸 것이다. 그 결과 pBI121/zntA 식물이 야생형 애기장대에 비하여 단위무게당 중금속 함량이 낮게 나타났다. 따라서 zntA 유전자를 식물에 형질전환시키므로써 중금속으로 오염된 토양에서 식물의 성장을 가능하게 할 뿐만 아니라, 식물에 중금속 축적을 감소시켜 식용 식물의 안전성을 증가시킨다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 중금속을 전달하는 P 타입 ATPase 유전자는 생물체의 중금속 내성을 향상시키고, 중금속 축적을 저해한다. 따라서, 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 유전자로 제조된 형질전환체는 중금속으로 오염된 환경에서 성장할 수 있어, 오염지에 환경친화적인 공원을 조성할 수 있을 뿐만 아니라, 토양유실에 의한 이차오염을 방지할 수 있고, 중금속을 야생종에 비해 덜 흡수하는 안전한 작물을 개발할 수 있다.

도 1은 pEZG 벡터의 지도를 나타낸 것이고

도 2는 식물 원형질체에서 발현된 ZntA 단백질의 발현 위치를 나타낸 사진이고,

도 3은 식물 원형질체에서 발현된 ZntA 단백질의 발현 국지성을 전기영동으로 확인한 것이고,

도 4는 PBI121/zntA 벡터의 구조도를 나타낸 것이고,

도 5는 zntA 유전자로 형질전환된 애기장대에서 zntA mRNA의 발현을 확인한 노던블롯 사진이고,

도 6은 zntA 유전자로 형질전환된 애기장대를 납을 포함하는 배지에서 성장시킨 사진이고,

도 7은 zntA 유전자로 형질전환된 애기장대를 카드뮴을 포함하는 배지에서 성장시킨 사진이고,

도 8은 zntA 유전자로 형질전환된 애기장대를 중금속을 포함하는 배지에서 성장시켰을 때 애기장대의 중량을 나타낸 그래프이고,

도 9는 zntA 유전자로 형질전환된 애기장대를 중금속을 포함하는 배지에서 성장시켰을 때 애기장대의 엽록소 함량을 나타낸 그래프이고,

도 10은 zntA 유전자로 형질전환된 애기장대를 중금속을 포함하는 배지에서 성장시켰을 때 중금속 축적 함량을 나타낸 그래프이다.

<110> POHANG IRON & STEEL CO., LTD. Pohang University of Science and Technology <120> GENETIC MODIFICATION OF PLANTS FOR ENHANCED RESISTANCE AND DECREASED UPTAKE OF HEAVY METALS <130> DPP011615 <150> KR 10-2001-17837 <151> 2001-04-04 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2199 <212> DNA <213> ZntA gene of Escherichia coli <400> 1 atgtcgactc ctgacaatca cggcaagaaa gcccctcaat ttgctgcgtt caaaccgcta 60 accacggtac agaacgccaa cgactgttgc tgcgacggcg catgttccag cacgccaact 120 ctctctgaaa acgtctccgg cacccgctat agctggaaag tcagcggcat ggactgcgcc 180 gcctgtgcgc gcaaggtaga aaatgccgtg cgccagcttg caggcgtgaa tcaggtgcag 240 gtgttgttcg ccaccgaaaa actggtggtc gatgccgaca atgacattcg tgcacaagtt 300 gaatctgcgc tgcaaaaagc aggctattcc ctgcgcgatg aacaggccgc cgaagaaccg 360 caagcatcac gcctgaaaga gaatctgccg ctgattacgc taatcgtgat gatggcaatc 420 agctggggtc tggagcagtt caatcatccg ttcgggcaac tggcgtttat cgcgaccacg 480 ctggttgggc tgtacccgat tgctcgtcag gcattacggt tgatcaaatc cggcagctac 540 ttcgccattg aaaccttaat gagcgtagcc gctattggtg cactgtttat tggcgcaacg 600 gctgaagctg cgatggtgtt gctgctgttt ttgattggtg aacgactgga aggctgggcc 660 gccagccgcg cgcgtcaggg cgttagcgcg ttaatggcgc tgaaaccaga aaccgccacg 720 cgcctgcgta agggtgagcg ggaagaggtg gcgattaaca gcctgcgccc tggcgatgtg 780 attgaagtcg ccgcaggtgg gcgtttgcct gccgacggta aactgctctc accgtttgcc 840 agttttgatg aaagcgccct gaccggcgaa tccattccgg tggagcgcgc aacgggcgat 900 aaagtccctg ctggtgccac cagcgtagac cgtctggtga cgttggaagt gctgtcagaa 960 ccgggagcca gcgccattga ccggattctg aaactgatcg aagaagccga agagcgtcgc 1020 gctcccattg agcggtttat cgaccgtttc agccgtatct atacgcccgc gattatggcc 1080 gtcgctctgc tggtgacgct ggtgccaccg ctgctgtttg ccgccagctg gcaggagtgg 1140 atttataaag ggctgacgct gctgctgatt ggctgcccgt gtgcgttagt tatctcaacg 1200 cctgcggcga ttacctccgg gctggcggcg gcagcgcgtc gtggggcgtt gattaaaggc 1260 ggagcggcgc tggaacagct gggtcgtgtt actcaggtgg cgtttgataa aaccggtacg 1320 ctgaccgtcg gtaaaccgcg cgttaccgcg attcatccgg caacgggtat tagtgaatct 1380 gaactgctga cactggcggc ggcggtcgag caaggcgcga cgcatccact ggcgcaagcc 1440 atcgtacgcg aagcacaggt tgctgaactc gccattccca ccgccgaatc acagcgggcg 1500 ctggtcgggt ctggcattga agcgcaggtt aacggtgagc gcgtattgat ttgcgctgcc 1560 gggaaacatc ccgctgatgc atttactggt ttaattaacg aactggaaag cgccgggcaa 1620 acggtagtgc tggtagtacg taacgatgac gtgcttggtg tcattgcgtt acaggatacc 1680 ctgcgcgccg atgctgcaac tgccatcagt gaactgaacg cgctgggcgt caaaggggtg 1740 atcctcaccg gcgataatcc acgcgcagcg gcggcaattg ccggggagct ggggctggag 1800 tttaaagcgg gcctgttgcc ggaagataaa gtcaaagcgg tgaccgagct gaatcaacat 1860 gcgccgctgg cgatggtcgg tgacggtatt aacgacgcgc cagcgatgaa agctgccgcc 1920 atcgggattg caatgggtag cggcacagac gtggcgctgg aaaccgccga cgcagcatta 1980 acccataacc acctgcgcgg cctggtgcaa atgattgaac tggcacgcgc cactcacgcc 2040 aatatccgcc agaacatcac tattgcgctg gggctgaaag ggatcttcct cgtcaccacg 2100 ctgttaggga tgaccgggtt gtggctggca gtgctggcag atacgggggc gacggtgctg 2160 gtgacagcga atgcgttaag attgttgcgc aggagataa 2199 <210> 2 <211> 732 <212> PRT <213> ZntA protein of Escherichia coli <400> 2 Met Ser Thr Pro Asp Asn His Gly Lys Lys Ala Pro Gln Phe Ala Ala 1 5 10 15 Phe Lys Pro Leu Thr Thr Val Gln Asn Ala Asn Asp Cys Cys Cys Asp 20 25 30 Gly Ala Cys Ser Ser Thr Pro Thr Leu Ser Glu Asn Val Ser Gly Thr 35 40 45 Arg Tyr Ser Trp Lys Val Ser Gly Met Asp Cys Ala Ala Cys Ala Arg 50 55 60 Lys Val Glu Asn Ala Val Arg Gln Leu Ala Gly Val Asn Gln Val Gln 65 70 75 80 Val Leu Phe Ala Thr Glu Lys Leu Val Val Asp Ala Asp Asn Asp Ile 85 90 95 Arg Ala Gln Val Glu Ser Ala Leu Gln Lys Ala Gly Tyr Ser Leu Arg 100 105 110 Asp Glu Gln Ala Ala Glu Glu Pro Gln Ala Ser Arg Leu Lys Glu Asn 115 120 125 Leu Pro Leu Ile Thr Leu Ile Val Met Met Ala Ile Ser Trp Gly Leu 130 135 140 Glu Gln Phe Asn His Pro Phe Gly Gln Leu Ala Phe Ile Ala Thr Thr 145 150 155 160 Leu Val Gly Leu Tyr Pro Ile Ala Arg Gln Ala Leu Arg Leu Ile Lys 165 170 175 Ser Gly Ser Tyr Phe Ala Ile Glu Thr Leu Met Ser Val Ala Ala Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Phe Ile Gly Ala Thr Ala Glu Ala Ala Met Val Leu Leu 195 200 205 Leu Phe Leu Ile Gly Glu Arg Leu Glu Gly Trp Ala Ala Ser Arg Ala 210 215 220 Arg Gln Gly Val Ser Ala Leu Met Ala Leu Lys Pro Glu Thr Ala Thr 225 230 235 240 Arg Leu Arg Lys Gly Glu Arg Glu Glu Val Ala Ile Asn Ser Leu Arg 245 250 255 Pro Gly Asp Val Ile Glu Val Ala Ala Gly Gly Arg Leu Pro Ala Asp 260 265 270 Gly Lys Leu Leu Ser Pro Phe Ala Ser Phe Asp Glu Ser Ala Leu Thr 275 280 285 Gly Glu Ser Ile Pro Val Glu Arg Ala Thr Gly Asp Lys Val Pro Ala 290 295 300 Gly Ala Thr Ser Val Asp Arg Leu Val Thr Leu Glu Val Leu Ser Glu 305 310 315 320 Pro Gly Ala Ser Ala Ile Asp Arg Ile Leu Lys Leu Ile Glu Glu Ala 325 330 335 Glu Glu Arg Arg Ala Pro Ile Glu Arg Phe Ile Asp Arg Phe Ser Arg 340 345 350 Ile Tyr Thr Pro Ala Ile Met Ala Val Ala Leu Leu Val Thr Leu Val 355 360 365 Pro Pro Leu Leu Phe Ala Ala Ser Trp Gln Glu Trp Ile Tyr Lys Gly 370 375 380 Leu Thr Leu Leu Leu Ile Gly Cys Pro Cys Ala Leu Val Ile Ser Thr 385 390 395 400 Pro Ala Ala Ile Thr Ser Gly Leu Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gly Ala 405 410 415 Leu Ile Lys Gly Gly Ala Ala Leu Glu Gln Leu Gly Arg Val Thr Gln 420 425 430 Val Ala Phe Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Val Gly Lys Pro Arg Val 435 440 445 Thr Ala Ile His Pro Ala Thr Gly Ile Ser Glu Ser Glu Leu Leu Thr 450 455 460 Leu Ala Ala Ala Val Glu Gln Gly Ala Thr His Pro Leu Ala Gln Ala 465 470 475 480 Ile Val Arg Glu Ala Gln Val Ala Glu Leu Ala Ile Pro Thr Ala Glu 485 490 495 Ser Gln Arg Ala Leu Val Gly Ser Gly Ile Glu Ala Gln Val Asn Gly 500 505 510 Glu Arg Val Leu Ile Cys Ala Ala Gly Lys His Pro Ala Asp Ala Phe 515 520 525 Thr Gly Leu Ile Asn Glu Leu Glu Ser Ala Gly Gln Thr Val Val Leu 530 535 540 Val Val Arg Asn Asp Asp Val Leu Gly Val Ile Ala Leu Gln Asp Thr 545 550 555 560 Leu Arg Ala Asp Ala Ala Thr Ala Ile Ser Glu Leu Asn Ala Leu Gly 565 570 575 Val Lys Gly Val Ile Leu Thr Gly Asp Asn Pro Arg Ala Ala Ala Ala 580 585 590 Ile Ala Gly Glu Leu Gly Leu Glu Phe Lys Ala Gly Leu Leu Pro Glu 595 600 605 Asp Lys Val Lys Ala Val Thr Glu Leu Asn Gln His Ala Pro Leu Ala 610 615 620 Met Val Gly Asp Gly Ile Asn Asp Ala Pro Ala Met Lys Ala Ala Ala 625 630 635 640 Ile Gly Ile Ala Met Gly Ser Gly Thr Asp Val Ala Leu Glu Thr Ala 645 650 655 Asp Ala Ala Leu Thr His Asn His Leu Arg Gly Leu Val Gln Met Ile 660 665 670 Glu Leu Ala Arg Ala Thr His Ala Asn Ile Arg Gln Asn Ile Thr Ile 675 680 685 Ala Leu Gly Leu Lys Gly Ile Phe Leu Val Thr Thr Leu Leu Gly Met 690 695 700 Thr Gly Leu Trp Leu Ala Val Leu Ala Asp Thr Gly Ala Thr Val Leu 705 710 715 720 Val Thr Ala Asn Ala Leu Arg Leu Leu Arg Arg Arg 725 730 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 3 ggatccaaag agtaaagaag aacaatgtcg actcctgaca at 42 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 4 ggatccctct cctgcgcaac aatct 25 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagatgtcga gtctcgaa 18 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctcgagcaca gtgtagtgac tgg 23

Claims

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식물에서 발현가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있고, 서열번호 1의 zntA 서열을 가지며 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질을 발현하는 재조합벡터 PBI121/zntA (수탁번호: KCTC 10207BP).
식물에서 발현가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있고, 서열번호 1의 zntA 서열과 최소 50%의 상동성을 가지며 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질을 발현하는 재조합벡터로 형질전환된 식물로서,

상기 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질은 아미노기 말단, 첫 번째 생체막 통과 도메인, 양이온 통로 모티프인 CPX(Cys-Pro-X, X: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln 중 어느 하나) 모티프를 가진 두 번째 생체막 통과 도메인, 세 번째 생체막 통과 도메인, 첫 번째 세포질 도메인, 두 번째 세포질 도메인, 및 카르복실기 말단을 포함하며,

상기 식물은 체세포 배아형성법(somatic embryogenesis), 세포조직 배양법(tissue culture) 및 세포주 배양법(cell line culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 무성번식되는 것인 식물.
식물에서 발현가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있고, 서열번호 1의 zntA 서열과 최소 50%의 상동성을 가지며 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질을 발현하는 재조합벡터로 형질전환된 식물의 일부로서,

상기 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질은 아미노기 말단, 첫 번째 생체막 통과 도메인, 양이온 통로 모티프인 CPX(Cys-Pro-X, X: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln 중 어느 하나) 모티프를 가진 두 번째 생체막 통과 도메인, 세 번째 생체막 통과 도메인, 첫 번째 세포질 도메인, 두 번째 세포질 도메인, 및 카르복실기 말단을 포함하며,

상기 식물은 체세포 배아형성법(somatic embryogenesis), 세포조직 배양법(tissue culture) 및 세포주 배양법(cell line culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 무성번식되는 것인 식물의 일부.
식물에서 발현가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있고, 서열번호 1의 zntA 서열과 최소 50%의 상동성을 가지며 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질을 발현하는 재조합벡터로 형질전환된 식물세포로서,

상기 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질은 아미노기 말단, 첫 번째 생체막 통과 도메인, 양이온 통로 모티프인 CPX(Cys-Pro-X, X: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln 중 어느 하나) 모티프를 가진 두 번째 생체막 통과 도메인, 세 번째 생체막 통과 도메인, 첫 번째 세포질 도메인, 두 번째 세포질 도메인, 및 카르복실기 말단을 포함하며,

상기 식물세포는 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래한 세포인 식물세포.
삭제
(a) 식물에서 발현가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있고, 서열번호 1의 zntA 서열과 최소 50 %의 상동성을 가지며 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질을 암호하는 서열을 포함하며, 상기 중금속을 수송하는 P 타입 ATPase 단백질은 아미노기 말단, 첫 번째 생체막 통과 도메인, 양이온 통로 모티프인 CPX(Cys-Pro-X, X: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln 중 어느 하나) 모티프를 가진 두 번째 생체막 통과 도메인, 세 번째 생체막 통과 도메인, 첫 번째 세포질 도메인, 두 번째 세포질 도메인, 및 카르복실기 말단을 포함하는 재조합 벡터를 제조하고;

(b) 상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하는

것을 포함하는 중금속 저항성 식물의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 중금속은 아연, 납, 카드뮴, 구리, 마그네슘, 망간, 니켈, 코발트, 철, 안티몬 또는 비소인 중금속 저항성 식물의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 제조방법은 상기 (b) 단계에서 도입된 식물세포 또는 식물조직으로부터 형질전환 식물을 생산하는 것을 더욱 포함하는 것인 중금속 저항성 식물의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 중금속은 아연, 납, 카드뮴, 구리, 마그네슘, 망간, 니켈, 코발트, 철, 안티몬 또는 비소인 식물.
제 9항에 있어서, 상기 P 타입 ATPase 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ZntA인 식물.
제 9항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 PBI121/zntA인 식물.
제 10항에 있어서, 상기 중금속은 아연, 납, 카드뮴, 구리, 마그네슘, 망간, 니켈, 코발트, 철, 안티몬 또는 비소인 식물의 일부.
제 10항에 있어서, 상기 P 타입 ATPase 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ZntA인 식물의 일부.
제 10항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 PBI121/zntA인 식물의 일부.
제 11항에 있어서, 상기 중금속은 아연, 납, 카드뮴, 구리, 마그네슘, 망간, 니켈, 코발트, 철, 안티몬 또는 비소인 식물세포.
제 11항에 있어서, 상기 P 타입 ATPase 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ZntA인 식물세포.
제 11항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 PBI121/zntA인 식물세포.