MX2011002111A - Gen de transaminasa de fenilpiruvato de glutamina de plantas y plantas transgeenicas que son portadoras del mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a plantas transgénicas que exhiben rangos de crecimiento, rendimientos de semilla y frutos y rendimientos de biomasa mejorados, así como a métodos para generar plantas transgénicas con crecimiento mejorado. En una modalidad, se proporcionan plantas transgénicas construidas para sobre-expresar transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT).

Description

GEN DE TRANSAMINASA DE FENILPIRUVATO DE GLUTAMINA DE PLANTAS Y PLANTAS TRANSGÉ NICAS QUE SON PORTADORAS DEL MISMO MANIFESTACIÓN CON RESPECTO A DERECHOS EN LAS INVENCIONES ELABORADAS BAJO INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADO POR LA FEDERACIÓN La presente invención se elaboró con el apoyo del gobierno bajo el Contrato No. W-7405-ENG-36 otorgado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos para los Regentes de la Universidad de California (United States Department of Energy to The Regents of The University of California), y el Contrato No. DE-AC52-06NA25396, otorgado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos para Los Alamos National Security, LLC (United States Department of Energy to Los Alamos National Security, LLC). El gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención.

SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama la prioridad de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/190,581 presentada el 29 de Agosto de 2008.

Antecedentes de la Invención Conforme la población humana incrementa y las tierras disponibles continúan siendo destruidas o comprometidas de otra forma, es de particular interés para la raza humana, la necesidad de sistemas de agricultura más efectivos y sustentables. El mejorar los rendimientos de las cosechas, el contenido de proteínas y los rangos de crecimiento de las plantas, representa objetivos importantes en el desarrollo de sistemas de agricultura que pueden responder en forma más efectiva a los desafíos presentados.

En años recientes, la importancia de tecnologías de producción de cosechas mejoradas ha incrementado únicamente conforme las producciones de muchas cosechas bien desarrolladas, han tenido tendencia a una meseta. Muchas actividades de la agricultura son sensibles al tiempo, con costos y retornos siendo dependientes del cambio rápido de las cosechas y del tiempo del mercado. Por consiguiente, el rápido crecimiento de las plantas es una meta económicamente importante para muchos negocios agrícolas que implican cosechas de alto valor tales como granos, vegetales, fresas y otras frutas.

La ingeniería genética ha jugado, y continúa jugando un papel aún controversial, cada vez más importante en el desarrollo de tecnologías de agricultura sustentables. Se han desarrollado en los últimos años un gran número de plantas modificadas en forma genética y tecnologías relacionadas, muchas de las cuales actualmente tienen un amplio uso {Resumen de datos principales: Cosechas Modificadas en Forma Genética en los Estados Unidos, Pew Initiative on Food y Biotechnology, Agosto 2004, (pewagbiotech.org/resources/factsheets). La adopción de variedades de plantas transgénicas actualmente es muy sustancial y va en aumento, con aproximadamente 250 millones de acres plantados con plantas transgénicas en el año de 2006.

Aunque la aceptación de tecnologías de plantas transgénicas puede incrementar en forma gradual, particularmente en los Estados Unidos, Canadá y Australia, muchas regiones del mundo permanecen lentos en adoptar en la agricultura plantas modificadas en forma genética, en forma notable Europa.

Por consiguiente, en forma consonante con la búsqueda de los objetivos de una agricultura responsable y sustentable, existe un fuerte interés en el desarrollo de plantas construidas en forma genética que no introduzcan toxinas u otras sustancias potencialmente problemáticas en las plantas y/o el ambiente. También existe un fuerte interés de minimizar el costo para lograr objetivos tales como tolerancia a herbicidas, resistencia a pestes y enfermedades y producciones de cosecha generales. Por consiguiente, permanece la necesidad de plantas transgénicas que puedan cumplir con estos objetivos.

Se le ha dado seguimiento a la meta del rápido crecimiento de plantas, a través de numerosos estudios de diversos sistemas de regulación de plantas, muchos de los cuales permanecen sin ser comprendidos en su totalidad. En particular, los mecanismos reguladores de las plantas que coordinan el metabolismo de carbono y nitrógeno no han sido aclarados completamente. Estos mecanismos de regulación se presume que tienen un impacto fundamental en el crecimiento y desarrollo de plantas.

El metabolismo de carbono y nitrógeno en organismos fotosintéticos debe regularse en una manera coordinada para asegurar el uso eficiente de recursos y energía de plantas. La comprensión actual del metabolismo de carbono y nitrógeno incluye detalles en ciertos pasos y trayectorias metabólicas que son subsistemas de sistemas más grandes. En organismos fotosintéticos, el metabolismo de carbono comienza con la fijación de CO2, que procede a través de dos procesos importantes, denominados metabolismo C-3 y C-4. En plantas con metabolismo C-3, la enzima, carboxilasa de bifosfato de ribulosa (RuBisCo) cataliza la combinación de C02 con bifosfato de ribulosa para producir 3-fosfoglicerato, un compuesto de tres carbonos (C-3) que la planta utiliza para sintetizar los compuestos que contienen carbono. En plantas con un metabolismo C-4, el C02 se combina con piruvato de fosfoenol para formar ácidos que contienen cuatro carbonos (C-4), en una reacción catalizada por la enzima, carboxilasa de piruvato de fosfoenol. Los ácidos son transferidos a manojos de células de forro, en donde son descarboxilados para liberar C02, el cual posteriormente se combina con bifosfato de ribulosa en la misma reacción empleada por las plantas C-3.

Numerosos estudios han descubierto que son importantes diversos metabolitos en la regulación del metabolismo de nitrógeno de la planta. Estos compuestos incluyen el ácido orgánico, malato, y los aminoácidos, glutamato y glutamina. El nitrógeno ha sido asimilado por organismos fotosintéticos a través de la acción de la enzima, sintetasa de glutamina (GS) que cataliza la combinación de amonia con glutamato para formar glutamina. GS desempeña un papel clave en la asimilación de nitrógeno en plantas catalizando la adición de amonio a glutamato, para formar glutamina en una reacción dependiente de ATP (Miflin y Habash, 2002, Journal of Experimental Botany, Vol. 53, No. 370, pp. 979-987). GS también reasimila la amonia liberada como resultado de fosforespiración y el rompimiento de proteínas y de compuestos de transporte de nitrógeno. Las enzimas GS pueden ser divididas en dos clases generales, una que representa la forma citoplásmica (GS1) y la otra que representa la forma plastídica (es decir cloroplástica) (GS2).

El trabajo anterior ha demostrado que los niveles de expresión de GS1 incrementados, dan como resultado niveles incrementados de actividad GS y crecimiento de la planta, aunque los reportes son inconsistentes. Por ejemplo, Fuentes y asociados reportó que el promotor CaMV S35 condujo la sobre-expresión de Alfalfa GS1 (forma citoplásmica) en tabaco dando como resultado niveles incrementados de expresión GS y actividad GS en el tejido de la hoja, un crecimiento incrementado bajo inanición de nitrógeno, pero sin efecto en el crecimiento bajo condiciones de fertilización con nitrógeno óptimas (Fuentes y asociados, 2001, J. Exp. Botany 52: 1071-81). Temple y asociados, reportó que las plantas de tabaco transgénicas que sobre-expresan la secuencia de codificación Alfalfa GS1 de longitud total, contenían niveles bastante elevados de transcripción GS, y polipéptido GS el cual se ensambla en la enzima activa, pero no reportó efectos genotípicos en el crecimiento (Temple y asociados, 1993, Molecular y General Genetics 236: 315-325). Corruzi y asociados ha reportado que el tabaco transgénico que sobre-expresa un transgen GS1 citosólico de chícharo bajo el control del promotor Ca V S35, muestra actividad GS incrementada, proteína en GS citosólica incrementada y características de crecimiento mejorado (Patente Norteamericana No. 6,107,547). Unkefer y asociados ha reportado más recientemente, que las plantas de tabaco transgénicas que sobreexpresan Alfalfa GS 1 en tejidos foliares, que han sido clasificadas por una actividad GS de la hoja a la raíz incrementada después de la segregación genética mediante individualización para lograr un número de copias de transgen GS1 incrementado, se descubrió que producen niveles incrementados de 2-hidroxi-5-oxoprolina en sus partes foliares, lo cual se encontró que conduce a rangos de crecimiento marcadamente incrementados con respecto a las plantas de tabaco silvestres (ver las Patentes Norteamericanas Nos. 6,555,500; 6,593,275; y 6,831,040).

Unkefer y asociados ha descrito en forma adicional el uso de 2-hidroxi-5-oxoprolina (también conocido como 2-oxoglutaramato) para mejorar el crecimiento de las plantas (Patentes Norteamericanas Nos. 6,555,500; 6,593,275; 6,831,040). En particular, Unkefer y asociados describe que las concentraciones incrementadas de 2-hidroxi-5-oxoprolina en tejido foliar (relativo a tejidos de raíz) dispara una cascada de eventos que da como resultado características incrementadas del crecimiento de la planta. Unkefer y asociados describe métodos a través de los cuales se puede incrementar la concentración foliar de 2-hidroxi-5-oxoprolina con el objeto de activar las características incrementadas del crecimiento de la planta, específicamente, aplicando una solución de 2-hidroxi-5-oxoprolina, directamente a las partes foliares de la planta, y sobre-expresando sintetasa de glutamina preferentemente en los tejidos de la hoja.

Se han identificado un número de enzimas de transaminasa y hidroliasa conocidas por estar implicadas en la síntesis de 2-hidroxi-5-oxoprolina en mamíferos, en tejidos de hígado y riñon de animales (Cooper y eister, 1977, CRC Critical Reviews in Biochemistry, páginas 281-303; Meister, 1952, J. Biochem. 197: 304). En plantas, se ha conocido la síntesis bioquímica de 2-hidroxi-5-oxoprolina pero ha sido caracterizada pobremente. Además, se desconoce la función de 2-hidroxi-5-oxoprolina en plantas y la importancia de su tamaño de conjunto (concentración de tejido). Finalmente, la técnica no proporciona una guía específica como para ver porque precisamente la transaminasa(s) o la hidrolasa(s) pueden existir y/o estar activas en la catalización de la síntesis de 2-hidroxi-5-oxoprolina en plantas, y no se han reportado, aislado o caracterizado dichas transaminasas de la planta.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a plantas transgénicas que exhiben rangos de crecimiento, rendimientos de semilla y frutas y rendimientos de biomasa general incrementados, así como métodos para generar plantas transgénicas con un crecimiento mejorado. En una modalidad, se proporcionan plantas transgénicas construidas para sobre-expresar transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT). En general, estas plantas crecieron más que sus contrapartes tipo silvestre en aproximadamente el 50%.

Los solicitantes se han identificado que la enzima, transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT), como un catalizador de la síntesis de 2-hidroxi-5-oxoprolina (2-oxoglutaramato) en plantas. 2-Oxoglutaramato es un metabolito de señal poderoso que regula la función de un gran número de genes implicados en el aparato de fotosíntesis, la fijación de carbono y metabolismo de nitrógeno.

Al incrementar preferentemente la concentración del metabolito de señal, 2-oxoglutaramato (por ejemplo, en tejidos foliares), las plantas transgénicas de la presente invención tienen la capacidad de producir mayores rendimientos generales en períodos de tiempo más cortos, y por consiguiente, pueden proporcionar a las industrias agrícolas una productividad mejorada a través de un amplio rango de cosechas. De manera importante, a diferencia de muchas plantas transgénicas descritas hasta la fecha, la presente invención utiliza genes de plantas naturales que codifican una enzima de planta natural. Las características de crecimiento mejoradas de las plantas transgénicas de la presente invención, se logra esencialmente introduciendo una capacidad GPT adicional en la planta. Por lo tanto, las plantas transgénicas de la presente invención no expresan sustancias tóxicas, hormonas de crecimiento, productos genéticos virales o bacterianos, y por consiguiente están libres de muchos de los aspectos que hasta ahora han impedido la adopción de plantas transgénicas en ciertas partes del mundo.

En una modalidad, la presente invención proporciona una planta transgénica que comprende un transgen GPT, en donde el transgen GPT está enlazado en forma operable a un promotor de planta. En una modalidad específica, el transgen GPT codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en (a) SEC ID NO: 2; SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO 19, SEC ID NO: 25, SEC ID NO:26, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 31, y (b) una secuencia de aminoácido que es al menos el 75% idéntica a cualesquiera de las SEC ID NO: 2; SEC ID NO:4; SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO 19, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 31 y tiene actividad GPT.

En algunas modalidades, el transgen GPT se incorpora dentro del genoma de la planta. La planta transgénica de la presente invención puede ser una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea.

La presente invención también proporciona la progenie de cualquier generación de plantas transgénicas de la presente invención, en donde la progenie comprende un transgen GPT, así como una semilla de cualquier generación de las plantas transgénicas de la presente invención, en donde la semilla comprende el transgen GPT. Las plantas transgénicas de la presente invención pueden mostrar una o más características de crecimiento mejoradas, cuando se comparan con o una planta no transformada o tipo silvestre análoga, incluyendo sin limitación rango incrementado de crecimiento, de rendimiento de biomasa, rendimiento de semilla, rendimiento de flor o botón de la flor, rendimiento de fruta o vaina, hojas más grandes y también puede mostrar niveles implementados de actividad GPT y/o niveles incrementados de 2-oxoglutaramato. En algunas modalidades, las plantas transgénicas de la presente invención muestran una eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno.

También se proporcionan métodos para producir las plantas transgénicas de la presente invención y las semillas de las mismas, incluyendo métodos para producir una planta que tiene propiedades de crecimiento mejoradas, eficiencia incrementada del uso de nitrógeno y tolerancia incrementada a germinado o crecimiento en sal o condiciones salinas, relativas a una planta tipo silvestre o no transformada análoga.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1, es una asimilación de nitrógeno y biosíntesis de 2-oxoglutaramato: esquema de trayectoria metabólica.

La figura 2, es una fotografía que muestra la comparación de plantas de tabaco transgénicas que sobreexpresan GPT, en comparación con plantas de tabaco tipo silvestre. De izquierda a derecha: planta tipo silvestre, transgen Alfalfa GS1, transgen Arabidopsis GPT. Ver Ejemplo 3, infra.

La figura 3, es una fotografía que muestra la comparación de plantas de tomate Micro-Tom transgénicas que sobre-expresan GPT, en comparación con una planta de tomate tipo silvestre. (A) planta tipo silvestre; (B) Arabidopsis transgen GPT. Ver Ejemplo 4, infra.

La figura 4, es una fotografía que muestra comparaciones de tamaños de hojas entre plantas de tabaco tipo Silvestre (hoja superior) y transgénicas GPT (hoja inferior).

Descripción Detallada de la Invención DEFINICIONES A menos que se defina de otra manera, todos los términos, notaciones y otra terminología científica de la técnica aquí utilizada, están proyectados para tener los significados comúnmente comprendidos por los expertos en la técnica, la cual pertenece a la presente invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente comprendidos serán definidos en la presente invención por claridad y/o para una fácil referencia, y la inclusión de dichas definiciones en la presente invención no deberá de ser construida necesariamente para representar una diferencia sustancial sobre lo que generalmente se comprende en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos o aquí referenciados generalmente serán bien comprendidos y serán empleados comúnmente utilizando metodología convencional por parte de los expertos en la técnica, tal como por ejemplo, las metodologías de clonación molecular utilizadas ampliamente descritas en la Publicación de Sambrook y asociados, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3o edición (2001 ) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (Ausbel y asociados, eds., John Wiley & Sons, Inc. 2001; Transgenic Plants: Methods y Protocols (Leandro Pena, ed., Humana Press, 1o edición, 2004); y, Agrobacteríum Protocols (Wan, ed., Humana Press, 2° edición, 2006). Según sea adecuado, se llevan a cabo de manera general procedimientos que implican el uso de equipos y reactivos comercialmente disponibles de acuerdo con protocolos y/o parámetro definidos por el fabricante, a menos que se observe lo contrario.

El término "ácido nucleico" se refiere a desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos ("polinucleótidos") ya sea en su forma de hebra simple o doble. A menos que se limite específicamente, el término "polinucleótido" comprende ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares a las de los ácidos nucleicos de referencia y son metabolizados en una forma similar a los nucleótidos que ocurren naturalmente. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico en particular también puede comprender en forma implícita variantes modificadas en forma conservadora de la misma (por ejemplo, degeneración de sustituciones de codón) y secuencias complementarias, y así como la secuencia indicada en forma explícita. En forma específica, la degeneración de sustituciones de codón puede lograrse generando secuencias en las cuales se sustituye la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos), con residuos de base mezclada y/o desoxinosina (Batzer y asociados, 1991, Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka y asociados, 1985 J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; y Cassol y asociados, 1992; Rossolini y asociados, 1994, Mol. Cell. Probes 8: 91-98). El término ácido nucleico se utiliza de manera intercambiable con el término gen, cADN, y mARN codificado por un gen.

El término "promotor" se refiere a una formación de secuencias de control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido nucleico enlazado en forma operable. Tal como se utiliza en la presente invención, un "promotor de planta" es un promotor que funciona en las plantas. Los promotores incluyen secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de transcripción, tal como, en el caso del promotor de polimerasa tipo II, un elemento TATA. El promotor también incluye opcionalmente elementos represores o aumentadores distales, que se pueden localizar a varios miles de pares base del sitio de inicio de transcripción. A un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo bajo condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo una regulación ambiental o de desarrollo. El término "enlazado en forma operable" se refiere a una ligadura funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor, o una formación de sitios de enlace de factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico que corresponde a la segunda secuencia.

Los términos "polipéptido," "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para referirse a un polímero de los residuos de aminoácido. Los términos aplican a polímeros de aminoácido, en donde uno o más residuos de aminoácido son un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente, que ocurre en forma natural así como a polímeros de aminoácido que ocurren en forma natural y polímeros de aminoácido que no ocurren en forma natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos sintéticos y que ocurren en forma natural, así como análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan en una forma similar a los aminoácidos que ocurren en forma natural. Los aminoácidos que ocurren naturalmente son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que son modificados posteriormente, por ejemplo hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácido se refiere a compuestos que tienen la misma estructura básica que un aminoácido que ocurre naturalmente, es decir un a carbono que está enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfócido de metionina, sulfonio de metilo de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos de péptido modificados, pero retienen la misma estructura química básica como un aminoácido que ocurre naturalmente. Los miméticos de aminoácido se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente a la estructura química generando un aminoácido, pero que funcione en una forma similar a un aminoácido que ocurre en forma natural.

Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente invención, ya sea a través de sus símbolos de tres letras conocidos comúnmente, o a través de los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. De igual manera, los nucleótidos pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

El término "planta" incluye plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, flores, raíces, etc.), semillas y células de planta y la progenie de los mismos. La clase de plantas que se pueden utilizar en el método de la presente invención, generalmente es tan amplia como la clase de plantas superiores adaptables para técnicas de transformación, incluyendo angioespermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), así como a gimnoespermas. Incluye plantas de una variedad de niveles de ploidez, incluyendo poliploide, diploide, haploide y hemicigoso.

Los términos "polinucleótido GPT" y "ácido nucleico GPT" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención, y se refieren a una secuencia de polinucleótido de longitud total o longitud parcial de un gen que codifica un polipéptido implicado en la catalización de la síntesis de 2-oxoglutaramato, e incluye polinucleótidos que contiene secuencias tanto traducidas (codificadas) como no traducidas, así como los complementos de las mismas. El término "secuencia de codificación GPT" se refiere a la parte del gen que es transcrita y codifica una proteína GPT. El término "secuencia de dirección" se refiere a la parte aminoterminal de una proteína, que dirige la proteína en un compartimento subcelular de una célula, tal como un cloroplasto en una célula de planta. Los polinucleótidos GPT son definidos en forma adicional por su capacidad de hibridar bajo condiciones definidas para los nucleótidos GPT descritos en forma específica en la presente invención, o para los productos PCR derivados de los mismos.

Un "transgen GPT" es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido GPT que es exógeno para planta transgénica, o embrión, órgano o semilla de la planta, que alberga la molécula de ácido nucleico o que es exógena para una planta progenitora, o embrión, órgano o semilla de la planta, de una planta transgénica que alberga el polinucleótido GPT.

Los polinucleótidos GPT de la presente invención, se presentan en la misma e incluyen secuencias de codificación GPT para GPTs de Arabidopsis, Arroz, Cebada, Bambú, Frijol Soya, Uva y Pez Cebra.

Los polinucleótidos GPT de longitud parcial incluyen secuencias de polinucleótido que codifican truncaciones N- o C-terminal de GPT, GPT maduro (sin secuencia de dirección), así como dominios de GPT que codifican la secuencia. Los polinucleótidos GPT de ejemplo que codifican las truncaciones N-terminal de GPT incluyen las construcciones -30, -45 y -56 de Arabidopsis, en donde las secuencias de codificación para los primeros 30, 45, y 56 aminoácidos, respectivamente de la estructura GPT de longitud total de la SEC ID NO: 2, son eliminadas.

En el empleo de los polinucleótidos GPT de la presente invención en la generación de células transformadas y plantas transgénicas, un experto en la técnica reconocerá que la secuencia de polinucleótido insertada no tiene que ser idéntica, si no que puede ser únicamente "sustancialmente idéntica" a una secuencia del gen del cual se deriva, tal como se define en forma adicional más adelante. El término "polinucleótido GPT" comprende en forma específica dichas variantes sustancialmente idénticas. En forma similar un experto en la técnica reconocerá que debido a la degeneración de codón, un número de secuencias de polinucleótido codificará al mismo polipéptido, y todas de dichas secuencias de polinucleótido significa que están incluidas en el término polinucleótido GPT. Además, el término incluye en forma específica las secuencias sustancialmente idénticas (determinadas como se describe más adelante) con una secuencia de polinucleótido GPT aquí descrita y que codifica polipéptidos que son ya sea mutantes de polipéptidos GPT tipo silvestre o retienen la función del el polipéptido GPT (por ejemplo, resultando de sustituciones conservadoras de aminoácidos en un polipéptido GPT). El término "polinucleótido GPT" incluye también dichas variantes sustancialmente idénticas.

El término "variantes modificadas en forma conservadora" aplica tanto a secuencias de aminoácido como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, el término variantes modificadas en forma conservadora se refiere a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácido, para las secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácido nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU, todos codifican el aminoácido, alanina. Por lo tanto, en cada posición en donde la alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualesquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silentes", las cuales son una especie de variaciones modificadas en forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente invención en la presente invención que codifica un polipéptido, también describe cada posible variación silente del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, que es ordinariamente el único codón para triptofan) puede ser modificado para producir una modalidad funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silente de un ácido que codifica un ácido nucleico, está implícita en cada secuencia descrita.

Como las secuencias de aminoácido, un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones, eliminaciones, o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido, o proteína, que altera, agrega o elimina un aminoácido simple o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada, es una "variante modificada en forma conservadora", en donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. En la técnica con bien conocidas las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente y similares. Dichas variantes modificadas en forma conservadora son adicionales a, y no excluyen las variantes polimórficas, homólogos, interespecie, y alelos de la presente invención.

Los siguientes ocho grupos, contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras una por otra: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por ejemplo, la Publicación de Creighton, Proteins (1984)).

Las estructuras moleculares, tales como estructura de polipéptido, se pueden describir en términos de diversos niveles de organización. Para una descripción general de esta organización consultar la Publicación de Alberts y asociados, Biología Molecular de la Célula (3o edición, 1994) y de Cantor y Schimmel, Química Biofísica Parte I: La Conformación de Macromoléculas Biológicas (1980). La "estructura primaria" se refiera a la secuencia de aminoácido de un péptido particular. La "estructura secundaria" se refiere a estructuras tridimensionales ordenadas en forma local dentro de un polipéptido. Estas estructuras son comúnmente conocidas como dominios. Los dominios son porciones de polipéptido que forman una unidad compacta del polipéptido y normalmente tienen de 25 hasta aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. Los dominios típicos se elaboran de secciones de menor organización, tal como estiramientos de la hoja-ß y hélices-a. La "estructura terciaria" se refiere a la estructura tridimensional completa de un monómero de polipéptido. La "estructura cuaternaria" se refiere a la estructura tridimensional formada a través de la asociación no covalente no unidades terciarias independientes. Los términos anisotrópicos también son conocidos como términos de energía.

El término "aislado" se refiere al material que es sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al material, tal como se encuentra en su estado nativo o natural. Sin embargo, el término "aislado" no pretende referirse a los componentes presentes en un gel electroforético u otro medio de separación. Un componente aislado está libre de dicho medio de separación, y en una forma fácil de utilizar en otra aplicación o ya sea de utilizarse en la nueva aplicación/medio. Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural, son materiales que pueden interferir con usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se ha purificado (1) a más del 95% en peso del anticuerpo tal como se determina a través del método de Lowry, y más preferentemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de una secuencia de aminoácido interna o N-terminal, a través del uso de un secuenciador de tazón giratorio, o (3) para homogeneización mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y no reducción utilizando azul Coomassie o, preferentemente, manchado de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, ya que no estará presente al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo. Sin embargo, en forma ordinaria el anticuerpo aislado será preparado a través de al menos un paso de purificación.

El término "heterólogo" cuando se utiliza con referencia a partes de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico normalmente es producido en forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados distribuidas para elaborar un ácido nucleico funcional, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína de una fuente y un ácido nucleico que codifica una secuencia de péptido de otra fuente. En forma similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", dentro del contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o aminoácido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas, o que tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos (por ejemplo, aproximadamente 70% de identidad, preferentemente 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad en una región específica, cuando se compara y alinea para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o una región designada como medida, utilizando algoritmos de comparación de secuencia, o a través de alineación manual e inspección visual. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba, que tiene una secuencia o subsecuencia sustancial complementaria cuando la secuencia de prueba tiene identidad sustancial con una secuencia de referencia. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba, que tiene una secuencia sustancial o complementariedades subsecuencia cuando la secuencia de prueba tiene identidad sustancial con la secuencia de referencia.

Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a polipéptidos, se reconoce que las posiciones del residuo que no son idénticas, con frecuencia difieren a través de sustituciones de aminoácido conservadoras, en donde los residuos de aminoácidos son sustituidos por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por consiguiente no cambian las propiedades funcionales del polipéptido. Cuando dichas secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba, para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución.

Para una comparación de secuencia, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, se ingresan secuencias de prueba y de referencia en una computadora, se diseñan coordinados de subsecuencia, si es necesario, y se diseñan parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Se pueden utilizar los parámetros por default del programa, o se pueden diseñar parámetros alternativos. Posteriormente el algoritmo de la comparación de secuencia calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba relativas con la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la presente invención, incluye referencia a un segmento de cualquiera de una del número de la cantidad de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en de 20 a 600, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más normalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en donde una secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias son alineadas en forma óptima. En la técnica con bien conocidos los métodos para alinear las secuencias para comparación.

La alineación óptima de las secuencias para comparación puede ser llevada a cabo, por ejemplo, a través del algoritmo de homología local Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, a través del algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, a través de la búsqueda del método de similitud de Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en la Publicación de The Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o alineación manual e inspección visual (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y asociados, eds. suplemento 1995)).

Un ejemplo preferido de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, las cuales se describen en las Publicaciones de Altschul y asociados, 1977, Nuc. Acids Res. 25:3389- 3402 y Altschul y asociados, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. Se utilizan BLAST y BLAST 2.0, normalmente con los parámetros por default aquí descritos, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención, el software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología (National Center for Biotechnology Information). Este algoritmo implica identificar primero pares con alta calificación de secuencia (HSPs), identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, lo cual ya sea coincide o satisface cierta calificación T de valor de umbral valorada en forma positiva, cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es referido como un valor de umbral de la calificación de la palabra vecina (Altschul y asociados, supra). Estos aciertos de la palabra vecina iniciales, actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que las contienen. Los aciertos de la palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, tanto como se puede incrementar la calificación de alineación acumulativa. Las calificaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótido, los parámetros M (calificación de gratificación para un par de residuos acoplados: siempre > 0) y N (calificación de penalidad para residuos no acoplados; siempre < 0). Para secuencias de aminoácido, se utiliza una matriz de calificación para calcular la calificación acumulativa. La extensión de los aciertos de la palabra en cada dirección, son obstaculizados cuando: la calificación de alineación acumulativa cae por una cantidad X de su valor máximo logrado; la calificación acumulativa va a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineación de residuo de calificación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los algoritmos del parámetro BLAST, W, T, y X determinan la sensibilidad de la velocidad de alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utilizan como default una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácido, el programa BLASTP se utiliza como default una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de calificación BLOSUM62 (ver la Publicación de Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud de entre dos secuencias (ver, por ejemplo, la Publicación de Karlin & Altschul, 1993, Proc. Nati Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad a través de la cual puede ocurrir por oportunidad, un acoplamiento entre las dos secuencias de nucleótido y aminoácido. Por ejemplo, un ácido nucleico, es considerado similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia, es menor aproximadamente el 0.2, más preferentemente menor a aproximadamente 0.01, y lo más preferentemente menor a aproximadamente 0.001.

La frase "condiciones de hibridación estrictas" se refiere a condiciones bajo las cuales hibridará una sonda para su subsecuencia objetivo, normalmente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no para otras secuencias. Las condiciones estrictas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas hibridan en forma específica a mayores temperaturas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en la Publicación de Tijssen, Techniques in Biochemistry y Molecular Biology-Hybridization con Nucleic Probes, "Revisión general de principios de hibridación y la estrategia de ensayos de ácido nucleico" (1993). La forma general, las condiciones altamente estrictas son seleccionadas para tener una temperatura de aproximadamente 5°C a 10°C menos que un punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica, en un pH de fuerza iónica definido. Generalmente las condiciones de baja rigurosidad de seleccionan para tener una temperatura de aproximadamente 15°C a 30°C, debajo de la Tm. Tm es la temperatura (de acuerdo con la fuerza iónica definida, pH, y concentración de ácido nucleico) en donde el 50% de las sondas complementarias para el objetivo hibridan para una secuencia objetivo en equilibrio (ya que las secuencias objetivo están presentes en exceso) en Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en el equilibrio. Las condiciones estrictas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor a aproximadamente a 1.0 M de ión de sodio, normalmente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ión de sodio (u otras sales) en un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente de 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayores a aproximadamente 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones estrictas con la adición de agentes de desestabilización, tales como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces la hibridación de fondo, preferentemente 10 veces la hibridación de fondo.

Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí, bajo condiciones estrictas, aún son sustancialmente idénticos y los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea utilizando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético. En tal caso, los ácidos nucleicos normalmente hibridan bajo condiciones de hibridación moderadamente estrictas.

El ADN genómico o el cADN que comprende los polinucleótidos GPT, puede ser identificado en manchados Southern estándar bajo condiciones estrictas utilizando las secuencias de polinucleótido GPT aquí descritas. Para este propósito, las condiciones estrictas adecuadas para dichas hibridaciones, son las que incluyen una hibridación en un amortiguador de 40% de formamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS a una temperatura de 37°C, y al menos un lavado en 0.2 X SSC a una temperatura de al menos aproximadamente 50°C, normalmente aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C, durante 20 minutos, o condiciones equivalentes. Una hibridación positiva es al menos dos veces el fondo. Los expertos en la técnica reconocerán que las condiciones de hibridación y lavado alternativas pueden ser utilizadas para proporcionar condiciones de rigurosidad similar.

Una indicación adicional de que dos polinucleótidos son sustancialmente idénticos es, si la secuencia de referencia, amplificada por un par de cebadores de oligonucleótido, posteriormente puede ser utilizada como una sonda bajo condiciones de hibridación estrictas para aislar la secuencia de prueba de una biblioteca de cADN o genómica, o para identificar la secuencia de prueba, por ejemplo, en un manchado northern o Southern.

PLANTAS TRANSGÉNICAS La presente invención proporciona plantas transgénicas novedosas que exhiben características agrónomas sustancialmente mejoradas, incluyendo crecimiento más rápido, mayor peso fresco y biomasa total de la planta madura, florecimiento más temprano y más abundante, y mayores rendimientos de fruta y semilla. Las plantas transgénicas de la presente invención, se generan introduciendo en una planta una o más construcciones genéticas expresables con la capacidad de conducir la expresión de uno o más polinucleótidos que codifican la transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT). La presente invención es ejemplificada a través de la generación de plantas de tabaco transgénicas que llevan y expresan el gen heterólogo Arabidopsis GPT (Ejemplo 2, infra). Se espera que todas las especies de plantas también contengan un homólogo GPT que funciona en la misma trayectoria metabólica, es decir la biosíntesis del metabolito de señal 2-hidroxi-5-oxoprolina. Por lo tanto, en la práctica de la presente invención, cualquier gen de planta que codifica un homólogo GPT o variantes funcionales del mismo, puede ser útil en la generación de plantas transgénicas de la presente invención.

En modalidades de transformación estables de la presente invención, una o más copias de la construcción genética expresable quedan integradas en el genoma de la planta receptora, proporcionando de esta forma una capacidad incrementada de enzima GPT en la planta, que sirve para transmitir la síntesis incrementada de 2-oxoglutaramato, lo cual a su vez, señala la expresión del gen metabólico, dando como resultado un crecimiento incrementado de la planta y la mejoría de otras características agrónomas, 2-oxoglutaramato es un metabolito que es un efector extremadamente potente de la expresión del gen, del metabolismo y crecimiento de la planta (Patente Norteamericana No. 6,555,500), y que puede desempeñar un papel importante en la coordinación de los sistemas de metabolismo de (Lancien y asociados, 2000, Redundancia de Enzimas y la Importancia de 2-Oxoglutarato en la Asimilación de Amonio en Plantas Superiores, Plant Physiol. 123: 817-824). También ver el esquema de la trayectoria de 2-oxoglutaramato mostrado en la figura 1.

En un aspecto de la presente invención, los solicitantes han aislado una molécula de ácido nucleico que codifica la enzima de transaminasa de fenilpiruvato de glutamina Arabidopsis (GPT) (ver Ejemplo 1, infra), y han demostrado en la primera vez, que la enzima recombinante expresada es activa y tiene la capacidad de catalizar la síntesis del metabolismo de señal, 2-oxoglutaramato (Ejemplo 2, infra). Además, los solicitantes han demostrado que en la primera vez, dicha sobre-expresión del gen de transaminasa de glutamina Arabidopsis en una planta heteróloga transformada, dará como resultado rangos de fijación CO2 mejorados y características de crecimiento incrementadas (Ejemplo 3, infra).

Tal como se describe en la presente invención, (ver Ejemplo 3, infra), la sobre-expresión de un transgen que comprende una secuencia de codificación GPT de Arabidopsis de longitud total en plantas de tabaco transgénicas, también da como resultado una fijación más rápida de CO2, y niveles incrementados de proteína, glutamina y 2-oxoglutaramato total. Estas plantas transgénicas también crecen más rápido que las plantas silvestres (figura 2). En forma similar, en estudios preliminares llevados a cabo con plantas de tomate (ver Ejemplo 4, infra), las plantas de tomate transformadas con el transgen GPT Arabidopsis, mostraron un aumento significativo del rango de crecimiento, florecimiento y rendimiento de la semilla, en relación con las plantas de control tipo silvestre (figura 3 y Ejemplo 4, infra).

Además de las plantas de tabaco transgénicas referenciadas anteriormente, se han generado otras diversas especies de plantas transgénicas que comprende GPT y que muestran características de crecimiento mejoradas, en dos especies de Tomate, Pimiento, Frijoles, Caupí, Alfalfa, Melón, Calabaza, Arabidopsis y Camilena (ver la solicitud también pendiente, de propiedad común con el número de expediente legal S-1 2,983, presentada el 31 de Agosto del 2009, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia). Las plantas transgénicas anteriores fueron generadas utilizando una variedad de metodología de transformación, incluyendo el callo transmitido por Agrobacteria, baño floral, inoculación de semilla, inoculación de vaina, e inoculación directa de la flor, así como combinaciones de las mismas, o a través de cruces sexuales de plantas de transgen simples, utilizando diversos transgenes GPT.

La presente invención también proporciona métodos para generar una planta transgénica que tiene crecimiento mejorado y otras características agrónomas. En una modalidad, un método para generar una planta transgénica que tiene crecimiento mejorado y otras características agrónomas comprende introducir en una célula de planta, un cartucho de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un transgen GPT, bajo el control de un promotor adecuado con la capacidad de conducir la expresión del transgen, para producir una célula de planta transformada, y obtener una planta transgénica que expresa el GPT codificado. En otra modalidad, un método para generar una planta transgénica que tiene crecimiento mejorado y otras características agrónomas, comprende introducir en una célula de planta y una o más construcciones de ácido nucleico o cartuchos de expresión que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un transgen GPT, bajo el control de uno o más promotores adecuados (y opcionalmente, otros elementos reguladores) con la capacidad de conducir la expresión de los transgenes, para producir de esta forma una célula de planta transformada de esta manera, y obtener una planta transgénica que expresa el transgen GPR.

Se puede utilizar cualquier número de polinucleótidos GPT para generar las plantas transgénicas de la presente invención. Las proteínas GPT son altamente conservadas entre diversas especies de plantas y es evidente a partir de los datos experimentales aquí descritos, que se pueden utilizar también GPT de no planta relacionados en forma cercana (por ejemplo, Danio rerio GPT). Con respecto a GPT, numerosos polinucleótidos GPT derivados de diferentes especies han mostrado ser activos y útiles como transgenes GPT.

En una modalidad específica, el transgen GPT es un polinucleótido GPT que codifica un GPT derivado de Arabidopsis, tal como el GPT de la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 25. El transgen GPT puede ser codificado a través de la secuencia de nucleotido de la SEC ID NO: 1; una secuencia de nucleotido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad con la SEC ID NO: 1, y que codifica un polipéptido que tiene actividad GPT; una secuencia de nucleotido que codifica el polipéptido de la SEC ID NO: 2, o un polipéptido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad de secuencia, el cual tiene actividad GPT; y una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID NO: 2 truncado en su término amino mediante entre 30 a 56 residuos de aminoácido, o un polipéptido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad de secuencia con la misma, que tiene actividad GPT.

En otra modalidad específica, el transgen GPT es un polinucleótido GPT que codifica un derivado de Uva GPT, tal como los GPTs de Uva de la SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 26. El transgen GPT puede ser codificado a través de la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 3; una secuencia de nucleótido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad con la SEC ID NO: 3, y que codifica un polipéptido que tiene actividad GPT; una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 26, o un polipéptido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad de secuencia con la misma, que tiene actividad GPT.

Aún en otra modalidad específica, el transgen GPT es un polinucleótido GPT que codifica un GPT derivado de Arroz, tal como los GPTs de Arroz de la SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 27. El transgen GPT puede ser codificado a través de la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 5; una secuencia de nucleótido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad a SEC ID NO: 5, y que codifica un polipéptido que tiene actividad GPT; una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID NO: 6 o SEC ID NO: 27, o un polipéptido que tiene al menos 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad de secuencia con la misma que tiene actividad GPT.

Aún en otra modalidad específica, el transgen GPT es un polinucleótido GPT que codifica un GPT derivado de Frijol soya, tal como los GPTs de Frijol soya de las SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 28 o SEC ID NO: 28 con una Isoleucina adicional en el N-término de la secuencia. El transgen GPT puede ser codificado por la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 7; una secuencia de nucleótido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad con la SEC ID NO: 7, y que codifica un polipéptido que tiene actividad GPT; una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 28 o SEC ID NO: 28 con una Isoleucina adicional en el N-término de la secuencia, o un polipéptido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad de secuencia con la misma, que tiene actividad GPT.

Aún en otra modalidad específica, el transgen GPT es un polinucleótido GPT que codifica GPT derivado de Barley, tal como GPTs de Barley de la SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 29. El transgen GPT puede ser codificado por la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 9; una secuencia de nucleótido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad con la SEC ID NO: 9, y que codifica un polipéptido que tiene actividad GPT; una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID NO: 10 o SEC ID NO: 29, o un polipéptido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad de secuencia con la misma, que tiene actividad GPT.

Aún en otra modalidad específica, el transgen GPT es un polinucleótido GPT que codifica un GPT derivado de pez Cebra, tal como los GPTs de pez Cebra de la SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 30. El transgen GPT puede ser codificado por la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 11; una secuencia de nucleótido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad a SEC ID NO: 11, y que codifica un polipéptido que tiene actividad GPT; una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID NO: 12 o SEC ID NO: 30, o un polipéptido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad de secuencia con la misma, que tiene actividad GPT.

Aún en otra modalidad específica, el transgen GPT es un polinucleótido GPT que codifica GPT derivado de Bambú, tal como el GPT de Bambú de la SEC ID NO: 31. El transgen GPT puede ser codificado a través de una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID NO: 31, o un polipéptido que tiene al menos el 75% y más preferentemente al menos el 80% de identidad de secuencia con la misma, que tiene actividad GPT.

Otros polinucleótidos de GPT adecuados para utilizarse como transgenes GPT en la práctica de la presente invención, se pueden obtener a través de varios medios, tal como lo puede apreciar un experto en la técnica, probado para la capacidad de dirigir la expresión de un GPT con actividad GPT en un sistema de expresión recombinante (es decir, E. coli (ver Ejemplos 20 a 23), en un sistema de expresión temporal in planta (ver Ejemplo 19), o en una planta transgénica (ver Ejemplos 1 a 18).

VECTORES DE CONSTRUCCIONES/EXPRESIÓN DE TRANSGEN Con el objeto de generar las plantas transgénicas de la presente invención, la secuencia que codifica el gen del transgen(s) deseado debe incorporarse en una construcción de ácido nucleico (también referida en forma intercambiable en la presente invención como un vector de expresión de (transgen), cartucho de expresión, construcción de expresión, construcción de expresión o construcción genética expresable) que puede dirigir la expresión de la secuencia de transgen en células de plantas transformadas. Dichas construcciones de ácido nucleico que llevan el transgen(s) de interés, se pueden introducir en una célula o células de planta utilizando una cantidad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero son limitarse a electroporación, bombardeo de ADN o métodos biolísticos, microinyección y a través del uso de diversos vectores a base de ADN, tal como vectores Agrobactequm tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes. Una vez introducida en la célula de planta transformada, la construcción de ácido nucleico puede dirigir la expresión del transgen(s) incorporado (por ejemplo, GPT), ya sea en un modo temporal o estable. Se prefiere expresión estable, y se logra utilizando vectores de transformación de la planta que tienen la capacidad de dirigir la integración cromosomal de la construcción de transgen. Una vez que la célula de la planta ha sido transformada en forma exitosa, puede ser cultivada para regenerar una planta transgénica.

Se conoce un gran número de vectores de expresión adecuados para conducir la expresión constitutiva o inducida de genes insertados en plantas transformadas. Además, se conocen diversos vectores y sistemas de expresión temporal. Aún mayor grado, se seleccionan vectores de expresión adecuados para utilizarse en un método particular de transformación de gen (ver infra). Hablando de manera más amplia, un vector de expresión de planta típico para generar plantas transgénicas, comprenderá el transgen de interés bajo el control de regulación de expresión de un promotor, un marcador selecciona ble para ayudar en la selección de transformadores, y una secuencia terminadora de transcripción.

En forma más específica, los elementos básicos de una construcción de ácido nucleico para utilizarse en la generación de plantas transgénicas de la presente invención son: un promotor adecuado con la capacidad de dirigir la expresión funcional del transgen(s) en una célula de planta transformada, el transgen(s) (es decir, la secuencia de codificación GPT) enlazada en forma operable al promotor, preferentemente una secuencia de terminación de transcripción adecuada (por ejemplo, terminador del gen de la enzima sintética de nopalina) enlazada en forma operable al transgen, y normalmente a otros elementos útiles para controlar la expresión del transgen, así como uno o más genes marcadores seleccionares adecuados para seleccionar el producto transgénico deseado (es decir genes de resistencia a antibióticos).

Ya que Agrobacterium tumefaciens es el sistema de transformación primario utilizado para generar plantas transgénicas, son numerosos los vectores diseñados para la transformación de Agrobacterium. Para transformación estable, los sistemas de Agrobacterium utilizan vectores "binarios" que permiten la manipulación de plásmido tanto en E. cotí como en Agrobacterium , y contienen normalmente uno o más marcadores seleccionables para recuperar plantas transformadas (Hellens y asociados, 2000, Enfoque técnico: Guia para vectores Ti binarios de Agrobacterium. Trends Plant Sci 5:446-451). Los vectores binarios para utilizarse en sistemas de transformación de Agrobacterium normalmente comprenden los límites de sitios de clonación múltiple, ADN-T, funciones de réplica para Escherichia coli y A. tumefaciens, y genes marcadores y reporteros seleccionables.

Los vectores llamados "súper-binarios" proporcionan mayores eficiencias de transformación, y generalmente comprenden genes de virulencia adicional procedentes de un Ti (Komari y asociados, 2006, ethods Mol. Biol. 343: 15-41). Los vectores súper binarios normalmente se utilizan en plantas que exhiben menores eficiencias de transformación, tal como cereales. Dichos genes de virulencia adicional incluyen sin limitación virB, virE, y virG (Vain y asociados, 2004, Efecto de genes de virulencia adicional en eficiencia de transformación, integración y expresión de transgen en plantas de arroz utilizando el sistema de vector binario doble pGreen/pSoup. Transgenic Res. 13: 593-603; Srivatanakul y asociados, 2000, Expresión de transgen de influenza de genes de virulencia adicional: número de copias, patrón de integración y expresión del transgen, J. Plant Physiol. 157, 685-690; Park y asociados, 2000, Genes de virulencia adicional o de T-ADN más cortos mejoran la transformación transmitida por Agrobacterium. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020; Jin y asociados, 1987, Genes responsables del fenotipo de supervirulencia de Agrobacterium tumefaciens A281. J. Bacteriol. 169: 4417-4425).

En las modalidades aquí ejemplificadas (ver Ejemplos, infra), se emplean los vectores de expresión que colocan el transgen(s) insertado bajo el control del promotor CaMV 35S constitutivo. Se conocen y/o están comercialmente disponibles una cantidad de vectores de expresión que utilizan el promotor CaMV 35S.

PROMOTORES DE PLANTAS El término "promotor" se utiliza para designar una región en la corriente ascendente de la secuencia del genoma de un sitio de inicio de transcripción de gen (TSS), aunque la corriente descendiente de las secuencias de TSS, también pueden afectar el inicio de transcripción. Los elementos promotores seleccionan el punto de inicio de transcripción, la especificidad y rango de la transcripción. Dependiendo de la distancia desde la TSS, los términos de "promotor próximo" varios miles de nucleótidos alrededor de TSS) y "promotor distal" (miles y más nucleótidos de corriente ascendente de TSS) también son utilizados. Tanto los promotores próximos como distales incluyen conjuntos de varios elementos que participan en el proceso complejo de la etapa de desarrollo de célula, tejido, órgano y la regulación de transcripción específica de factores ambientales. La mayoría de los elementos promotores que regulan la selección TSS, se localizan en el promotor próximo.

Un gran número de promotores que son funcionales en plantas son conocidos en la técnica. En la construcción de construcciones de transgen GPT, el promotor(s) seleccionado pueden ser promotores no específicos, constitutivos tales como el promotor ribosomal de Virus de Mosaico de Coliflor 35S (promotor CaMV 35S), el cual es ampliamente empleado para la expresión de transgenes en plantas. Los ejemplos de otros promotores constitutivos fuertes incluyen sin limitación el promotor de actina de arroz 1, el promotor CaMV 19S, el promotor de sintasa de nopalina de plásmido Ti, el promotor de deshidrogenasa de alcohol y el promotor de sintasa de sacarosa.

Como alternativa, en algunas modalidades, puede ser deseable seleccionar un promotor con base en las células de la plata deseada que serán transformadas por la construcción de transgen, nivel de expresión deseado del transgen, el tejido o compartimento subcelular deseado para la expresión de transgen, el desarrollo de la etapa dirigida y similares.

Por ejemplo, cuando se desea la expresión en tejidos y compartimentos fotosintéticos, se puede emplear un promotor del gen de carboxilasa de bifosfato de ribulosa (RuBisCo). Cuando se desea la expresión en semillas, se pueden empelar promotores de diversos genes de proteína de almacenamiento de semilla. Para expresión en frutas, se puede utilizar un promotor específico de frutas tal como tomate 2A11. Los ejemplos de otros promotores específicos de tejido incluyen los promotores que codifican lectina (Vodkin y asociados, 1983, Cell 34:1023-31; Lindstrom y asociados, 1990, Developmental Genetics 11:160-167), deshidrogenasa 1 de alcohol de maíz (Vogel y asociados, 1989, J. Cell. Biochem. (Suppl. 0) 13:Part D; Dennis y asociados, 1984, Nucí. Acids Res., 12(9): 3983-4000), complejo de recolección de maíz claro (Simpson, 1986, Science, 233: 34-38; Bansal y asociados, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 3654-3658), proteína de impacto con calor (Odell y asociados, 1985, Nature, 313: 810-812; Rochester y asociados, 1986, EMBO J., 5: 451-458), carboxilasa RuBP de subunidad de chícharo pequeña (Poulsen y asociados, 1986, Mol. Gen. Genet, 205(2): 193- 200; Cashmore y asociados, 1983, Gen. Eng. Plants, Plenum Press, Nueva York, pp 29- 38); sintasa de manopina de plásmido Ti y sintasa de nopalina de plásmido Ti (Langridge y asociados, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 3219-3223), isomerasa de calcona de petunia (Van Tunen y asociados, 1988, EMBO J. 7(5): 1257-1263), proteína 1 enriquecida con glicina de frijol (Keller y asociados, 1989, EMBO J. 8(5): 1309-1314), CaMV 35s truncado (Odell y asociados, 1985, supra), patatina de papa (Wenzler y asociados, 1989, Plant Mol. Biol. 12: 41-50), célula de raíz (Conkling y asociados, 1990, Plant Physiol. 93: 1203-1211), zeína de maíz (Reina y asociados, 1990, Nucí. Acids Res. 18(21): 6426; Kriz y asociados, 1987, Mol. Gen. Genet. 207(1): 90-98; Wandelt y Feix, 1989, Nuc. Acids Res. 17(6): 2354; Langridge y Feix, 1983, Cell 34: 1015-1022; Reina y asociados, 1990, Nucí. Acids Res. 18(21): 6426), globulina-1 (Belanger y Kriz, 1991, Genetics 129: 863-872), a-tubulina (Carpenter y asociados, 1992, Plant Cell 4(5): 557-571; Uribe y asociados, 1998, Plant Mol. Biol. 37(6): 1069-1078), cab (Sullivan, y asociados, 1989, Mol. Gen. Genet. 215(3): 431-440), PEPCase (Hudspeth y Gruía, 1989, Plant Mol. Biol. 12: 579-589), complejo de gen R (Chandler y asociados, 1989, The Plant Cell 1: 1175-1183), sintasa de calcon (Franken y asociados, 1991, EMBO J. 10(9): 2605-2612) y promotores de sintetasa de glutamina (Patente Norteamericana No. 5,391 ,725; Edwards y asociados, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 3459-3463; Brears y asociados, 1991, Plant J. 1 (2): 235-244).

Además de los promotores constitutivos, se pueden emplear diversas secuencias de promotor inducible en casos en donde es deseable regular la expresión de transgen conforme se regenera, madura, florece, etc, la planta transgénica. Los ejemplos de dichos promotores inducibles incluyen promotores de genes de impacto de calor, genes que responden a la protección (por ejemplo, Masa de amonia de fenilalanina; ver por ejemplo, la Publicación de Bevan y asociados, 1989, EMBO J. 8(7): 899-906), genes que responden a las heridas (por ejemplo, genes de proteína de pared celular), genes inducibles en forma química (por ejemplo, reductasa de nitrato, quítinasa) y genes inducibles en la oscuridad (por ejemplo, sintetasa de asparagina, ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,256,558). Asimismo, también se activan mediante el uso una cantidad de genes nucleares de planta incluyendo familias de gen que codifican las proteínas de enlace a/b de clorofina mayor (cab) así como la subunidad pequeña de carboxilasa de ribulosa-1 ,5-bísfosfato (rbcS) (ver por ejemplo, las Publicaciones de Tobin y Silverthome, 1985, Annu. Rev. Plant Physiol. 36: 569-593; Dean y asociados, 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. 40: 415-439).

Otros promotores inducibles incluyen promotores inducibles mediante ABA- y turgencia, el promotor de gen de proteína de enlace de auxin (Schwob y asociados, 1993, Plant J. 4(3): 423-432), el promotor de gen de glicosil-transferasa de flavonoide de glucosa UDP (Ralston y asociados, 1988, Genetics 119(1): 185-197); el promotor de inhibidor de proteinasa MPI (Cordero y asociados, 1994, Plant J. 6(2): 141-150), el promotor de gen de deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (Kohler y asociados, 1995, Plant Mol. Biol. 29(6): 1293- 1298; Quigley y asociados, 1989, J. Mol. Evol. 29(5): 412-421 ; Martínez y asociados, 1989, J. Mol. Biol. 208(4): 551-565) y el gen de sintetasa de glutamina de plástido inducible con la luz procedente de chícharo (Patente Norteamericana No. 5,391,725; Edwards y asociados, 1990, supra).

Para una revisión de promotores de planta utilizados en tecnología de planta transgénica, ver las Publicación de Potenza y asociados, 2004, In Vitro Cell. Devel. Biol - Plant, 40(1): 1-22. Para una revisión de la ingeniería del promotor de planta sibtérica, ver por ejemplo, la Publicación de Venter, M., 2007, Trends Plant Sci, 12(3): 118-124.

TRANSGEN DE TRANSAMINASA DE FEN I LPI RU VATO DE GLUTAMINA La presente invención describe por primera vez, que las plantas contienen una enzima de transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT) la cual es directamente funcional en la síntesis del metabolito de señal 2-hidroxi-5-oxoprolina. Hasta ahora, no se ha descrito una transaminasa de planta con una función definida. Los solicitantes han aislado y probado las secuencias que codifican el polinucleótido GPT derivadas de diversas especies de plantas y animales, y han incorporado en forma exitosa el gen en las plantas receptoras transgénicas heterólogas que exhiben características de crecimiento marcadamente mejorados, incluyendo crecimiento más rápido, mayor contenido de proteína foliar y rangos más rápidos de fijación C02- Se espera que todas las especies de plantas contengan un GPT que funciona en la misma trayectoria metabólica, implicando la biosíntesis del metabolito de señal, 2-hidroxi-5-oxoprolina. Por lo tanto, en la práctica de la presente invención, cualquier gen de planta que codifique un homólogo GPT o variantes funcionales del mismo, pueden ser útiles en la generación de plantas transgénicas de la presente invención. Además, debido a la similitud estructural entre diversas estructuras de proteína GPT de planta y el homólogo GPT putativo (y biológicamente activo) procedente de Danio rerio (pez Cebra) (ver Ejemplo 22), se pueden utilizar otros homólogos de GPT de no planta en la preparación de transgenes GPT para utilizarse en la generación de las plantas transgénicas de la presente invención. Cuando se compara en forma individual (mediante alineación BLAST) con la secuencia de proteína madura de Arabidopsis proporcionada en la SEC ID NO: 25, se obtiene las siguientes identidades y homologías de secuencia ("positivos" BLAST, incluyendo aminoácidos similares) para las siguientes secuencias de proteína GPT madura: Subcalificando la naturaleza conservada de la estructura de la proteína GPT a través de la mayor parte de las especies de la planta, la conservación observada dentro de las especies de plantas anteriores se extiende a los GPTs putativos no humanos de pez Cebra y Chlamydomonas. En el caso de pez Cebra, el grado de identidad es muy alto (83% de identidad de secuencia de aminoácido con el GPT de Arabidopsis maduro de la SEC ID NO: 25, y el 92% de homología, tomando en cuenta residuos de aminoácido similares). El GPT maduro de pez Cebra fue confirmado expresándolo en E. coli y demostrando la actividad biológica (síntesis de 2-oxoglutaramato).

Con el objeto de determinar si los homólogos GPT putativos pueden ser adecuados para generar las plantas transgénicas con crecimiento mejorado de la presente invención, se necesita expresar inicialmente la secuencia de codificación de los mismos en E. coli u otro receptor adecuado, y determinar si el metabolito de señal 2-oxoglutaramato, es sintetizado en niveles incrementados (ver los Ejemplos 19 a 23). Cuando dicho incremento es demostrado, posteriormente la secuencia de codificación puede ser introducida tanto en receptores de planta homóloga como en receptores de planta heteróloga, y evaluarse las características de crecimiento. Cualquier ensayo que tiene la capacidad de detectar 2-oxoglutaramato con especificidad, se puede utilizar para este propósito, incluyendo sin limitación ensayos RMN y HPLC descritos en el Ejemplo 2, infra. Además, se pueden emplear ensayos que miden directamente la actividad de GPT.

Cualquier GPT de planta con una actividad de síntesis 2-oxoglutaramato, se puede utilizar para transformar células de planta con el objeto de generar plantas transgénicas de la presente invención. Parecen tener un alto nivel de homología estructural entre las especies de plantas, lo cual parece extenderse más allá de las plantas, tal como se puede evidenciar mediante homología cercana entre diversas proteínas GPT de plantas y el homólogo GPT de pez Cebra putativo. Por consiguiente, se pueden utilizar varios genes GPT de planta para generar plantas transgénicas con crecimiento mejorado en una variedad de especies de planta heteróloga. Además, se puede esperar que los transgenes GPT expresados en una planta homologa, den como resultado también las características de crecimiento aumentado deseadas (es decir, transaminasa de glutamina de arroz sobre-expresada en plantas de arroz transgénica), aunque es posible que la regulación dentro de una célula homologa pueda atenuar la expresión del transgen en cierto modo, lo cual no puede ser operable en una célula heteróloga.

TERMINADORES DE TRANSCRIPCION En modalidades preferidas, se incorpora una secuencia de terminación de transcripción 3' en la corriente descendente del transgen, con el objeto de dirigir la terminación de transcripción y permitir la poliadenilación correcta de la transcripción mARN. Los terminadores de transcripción adecuados son aquellos que son conocidos por funcionar en plantas, incluyendo sin limitación, los genes de sintasa de nopalina (NOS) y sintasa de octopina (OCS) de Agrobacterium tumefaciens, la transcripción T7 del gen de sintasa de octopina, el extremo 3' de los genes de inhibidor I o II de proteasa procedentes de papa o tomate, el terminador CaMV 35S, el terminador tml y el terminador rbcS E9 de chícharo. Además, se puede utilizar un terminador de transcripción nativo del gen. En modalidades específicas, descrito a manera de "Ejemplos", infra, se emplea el terminador de transcripción de sintasa de nopalina.

MARCADORES SELECCIONABLES: Los marcadores seleccionables normalmente se incluyen en vectores de expresión de transgen con el objeto de proporcionar un medio para seleccionar transformadores. Aunque están disponibles varios tipos de marcadores, se utilizan normalmente varios marcadores de selección negativa, incluyendo los que confieren resistencia a un agente de selección que inhibe o extermina células no transformadas, tal como genes que imparten resistencia a un antibiótico (tal como canamicina, gentamicina, anamicina, higromicina, e higromicina B) o resistencia a un herbicida (tal como sulfonilurea, gulfosinato, fosfinotricin y glifosato). Los marcadores clasif ¡cables incluyen, por ejemplo, genes que codifican ß-glucuronidasa (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep 5: 387-405), genes que codifican luciferasa (Ow y asociados, 1986, Science 234: 856-859) y diversos genes que codifican proteínas implicadas en la producción o control de pigmentos de antocianina (Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,573,432). El gen de glucuronidasa de E. coli (gus, gusA o uidA) se ha vuelto un marcador de selección ampliamente utilizado en plantas transgénicas, en gran parte debido a la estabilidad, alta sensibilidad y facilidad de detección de la enzima de glucuronidasa (por ejemplo, fluorométrico, espectrofotométrico, varios métodos histoquímicos). Además, no existe esencialmente glucuronidasa detectable en la mayor parte de las especies de plantas superiores.

METODOLOGIAS Y SISTEMAS DE TRANSFORMACIÓN Los expertos en la técnica conocen diversos métodos para introducir las construcciones de vector de expresión de transgen de la presente invención en una planta o célula de planta, y se puede utilizar cualquiera con la capacidad de transformar la planta o célula de planta objetivo.

La transformación transmitida por Agrobacterium posiblemente es el método más común utilizado en plantas transgénicas, y los protocolos para una transformación transmitida por Agrobacterium de un gran número de plantas, ya se han descrito ampliamente en la literatura (ver, por ejemplo, las Publicaciones de Agrobacterium Protocols, Wan, ed., Humana Press, 2o edición, 2006). Agrobacterium tumefaciens es una bacteria de tierra Gram negativo que origina tumores (enfermedad de Crown Gall) en muchas especies dicot, a través de la inserción de un segmento pequeño o ADN que induce tumor ( "T-ADN", "ADN de transferencia") en la célula de la planta, lo cual se incorpora en una ubicación semi-aleatoria en el genoma de la planta, y eventualmente puede quedar ahí incorporada de manera estable. Las secuencias de ADN repetidas en forma directa, llamadas límites de T-ADN, definen los extremos de izquierda y derecha del T-ADN. El T-ADN puede ser separado físicamente del resto del plásmido-Ti, creando un sistema de "vector binario".

Se puede utilizar Agrobacterium para transformar en forma estable dicots, monocots, y células de los mismos (Rogers y asociados, 1986, ethods Enzymol., 118: 627-641; Hemalsteen y asociados, 1984, EMBO J., 3: 3039-3041; Hoykass-Van Slogteren y asociados, 1984, Nature, 311: 763-764; Grimsley y asociados, 1987, Nature 325: 167-1679; Boulton y asociados, 1989, Plant Mol. Biol. 12: 31-40; Gould y asociados, 1991, Plant Physiol. 95: 426-434). Se conocen varios métodos para introducir ADN en Agrobacteria , incluyendo electroporacion, métodos de congelación/descongelación, y correspondencia triparental. El método más eficiente para colocar el ADN extraño en Agrobacterium, es mediante electroporacion (Wise y asociados, 2006, Tres Métodos para la Introducción de ADN Extraño en Agrobacterium , Methods in Molecular Biology, vol. 343: Protocolos de Agrobacterium, 2/e, volumen 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, págs. 43-53). Además, debido a que un gran porcentaje de T-ADN no se integran, se puede utilizar la transformación transmitida por Agrobacterium para obtener la expresión temporal de un transgen a través de la competencia de transcripción de moléculas de construcción de transgen no incorporadas (Helens y asociados, 2005, Plant ethods 1:13).

Se ha descrito un gran número de vectores y métodos de transformación Agrobacterium (Karimi y asociados, 2002, Trends Plant Sci. 7(5): 193-5), y muchos de dichos vectores pueden ser obtenidos comercialmente (por ejemplo, Invitrogen). Además, está disponible un número en crecimiento de vectores de transformación de Agrobacterium "fuente-abierta" (por ejemplo, vectores pCambia; Cambia, Canberra, Australia). También ver la subsección en la presente invención de CONSTRUCCIONES DE TRANSGEN, supra. En una modalidad específica descrita en forma adicional en los Ejemplos, se utiliza un vector a base de p ON316 en el sistema de transformación de discos de hoja de Horsch y asociados (Horsch y asociados, 1995, Science 227:1229-1231) para generar plantas de tabaco y tomate transgénicas con crecimiento mejorado.

Otros métodos de transformación comúnmente utilizados que se pueden emplear en general las plantas transgénicas de la presente invención, incluyen sin limitación un bombardeo de microproyectil, o métodos de transformación biolística, transformación de protoplasto de ADN descubierto mediante calcio, polietilenglicol (PEG) o electroporación (Paszkowski y asociados, 1984, EMBO J. 3: 2727-2722; Potrykus y asociados, 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm y, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; Shimamoto y asociados, 1989, Nature, 338: 274-276.

La transformación biolística implica inyectar millones de partículas de metal recubiertas con ADN en las células o tejidos objetivo, utilizando un dispositivo biolístico (o "pistola genética"), de los cuales están comercialmente disponibles varios tipos; una vez dentro de la célula, el ADN se eluye de las partículas y una parte puede ser incorporada en forma estable en una o más cromosomas de célula (para revisión ver las Publicaciones de Kikkert y asociados, 2005, Transformación Estable de Células de de Planta mediante Bombardeo/Biolisticas de Partícula in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods y Protocols, Ed. L. Pef'ía, Humana Press Inc., Totowa, NJ).

La electroporación es una técnica que utiliza campos eléctricos de alta intensidad, cortos, para permeabilizar en forma reversible las bicapas de lípido de las membranas de célula (ver por ejemplo, las Publicaciones de Fisk y Dandekar, 2005, Introducción y Expresión de transgenes en Protoplastos de Plantas, en: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods y Protocols, Ed. L. Pefia, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 79-90; Fromm y asociados, 1987, Electroporación de ADN y ARN en protoplastos de plantas, en, in Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu y Grossman, eds., Academic Press, London, UKi pp. 351-366; Joersbo y Brunstedt, 1991, Electroporación: mecanismo y expresión temporal, transformación estable y efectos biológicos en protoplastos de plantas. Physiol. Plant. 81, 256-264; Bates, 1994, Transformación genética de plantas mediante electroporación de protoplasto. Mol. Biotech. 2: 135-145; Dillen y asociados, 1998, Transferencia de ADN transmitida por electroporación a protoplastos de plantas y tejidos de planta intactos para ensayos de expresión de gen temporales, en Cell Biology, Vol. 4, ed., CeNs, Academic Press, Londres, UK, pág. 92-99). La técnica opera creando poros acuosos en la membrana bacteriana, los cuales tienen un tamaño lo suficientemente grande para permitir que las moléculas de ADN (y otras macromoléculas) entren a la célula, en donde la construcción de expresión de transgen (como T-ADN) puede ser incorporado en forma estable en el ADN genómico de la planta, conduciendo la generación de células transformadas que pueden ser regeneradas subsecuentemente en plantas transgénicas.

Los métodos de transformación más recientes incluyen los métodos llamados de "baño floral", que ofrecen la promesa de simplicidad, sin requerir cultivo de tejido de la planta, como es el caso con todas las otras metodologías de transformación utilizadas comúnmente (Bent y asociados, 2006, Método de Transformación de Baño floral de Arabidopsis thaliana, Methods Mol Biol, vol. 343: Protocolos de Agrobacterium, 2/e, volumen 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pág. 87-103; Clough y Bent, 1998, Baño floral: un método simplificado para transformación transmitida por Agrobacterium de Arabidopsis thaliana, Plant J. 16: 735-743). Sin embargo, con la excepción de Arabidopsis, estos métodos no han sido utilizados ampliamente a través de un amplio espectro de diferentes especies de planta. En síntesis, se logra la transformación de baño floral bañando o rociando plantas en florecimiento con una cepa adecuada de Agrobacterium tumefaciens. Las semillas recolectadas de estas plantas T0 posteriormente son germinadas bajo selección para identificar individuos T1 transgénicos. El ejemplo 16 demostró la inoculación de baño floral de Arabidopsis para generar plantas de Arabidopsis transgénicas.

Otros métodos de transformación incluyen aquellos en los cuales se transforman las semillas en desarrollo o los sembradíos de plantas, utilizando vectores tales como vectores Agrobacterium. Por ejemplo, dichos vectores pueden ser utilizados para transformar semillas en desarrollo, inyectando una suspensión o mezcla del vector (por ejemplo Agrobacteria) directamente en la cavidad de la semilla de las vainas en desarrollo (Wang y Waterhouse, 1997, Plant Mol. Biol. Repórter 15: 209-215). Los sembradíos pueden ser transformados tal como se describe en la Publicación de Yasseem, 2009, Plant Mol. Biol. Repórter 27: 20-28. La semillas de germinación pueden ser transformadas tal como se describe en la Publicación de Chee y asociados, 1989, Plant Pysiol. 91: 1212-1218. Se pueden utilizar también métodos intra-fruta, en los cuales el vector se inyecta en la fruta o fruta en desarrollo. Aún otros métodos de transformación incluyen aquellos en los cuales la estructura de la flora es dirigida para inoculación de vector, tal como los métodos de inoculación de flor.

Se pueden utilizar las metodologías de transformación de plantas anteriores para introducir transgenes en una cantidad de células y tejidos de diferentes plantas, incluyendo sin limitación, plantas completas, explantas de tejido y órganos incluyendo cloroplastos, tejidos en florecimiento y células, protoplastos, células de meristema, callo, embriones inmaduros y células gaméticas tales como microesporas, polen, células de esperma y huevo, células cultivadas con tejido de cualesquiera de las anteriores, cualesquiera otras células de las cuales se puede generar una planta transgénica regenerada fértil. El callo se inicia a partir de las fuentes de tejido, incluyendo, pero sin limitarse a, embriones inmaduros, sembradío de apicales, microesporas y similares. Las células con la capacidad de proliferar como callos, también son células receptoras para transformación genética.

Los métodos de regeneración de plantas individuales de células, tejidos u órganos de la planta transformada son conocidos y se describen para diversas especies de plantas.

Como una ilustración, las plantitas transformadas, (derivadas de células o tejidos transformados) se cultivan en un medio de crecimiento que permite la raíz suplementado con el agente selectivo utilizado en la estrategia de transformación (es decir, y un antibiótico tal como canamicina). Una vez con raíz, las plantitas transformadas son transferidas posteriormente a la tierra y se permite que crezcan hasta la madurez. Al momento del florecimiento, las plantas maduras son preferentemente individualizadas (auto-fertilizada) y las semillas resultantes son recolectadas y utilizadas para crecer generaciones subsecuentes. Los ejemplos 3 a 6 describen la regeneración de plantas de tabaco y tomate transgénicas.

Se pueden utilizar plantas transgénicas T0 para generar generaciones subsecuentes (por ejemplo, T-i , T2) mediante indivudualización de transformadores primarios o secundarios, o mediante cruce sexual de transformadores primarios o secundarios con otras plantas (transformadas o no transformadas).

SELECCION DE PLANTAS TRANSGÉNICAS CON CRECIMIENTO MEJORADA Se pueden seleccionar, clasificar y caracterizar plantas transgénicas utilizando metodologías estándar. Las plantas transgénicas preferidas de la presente invención exhibirán una o más características fenotípicas indicativas de las propiedades de crecimiento mejorado y/o otras propiedades agrónomas deseables. Las plantas transgénicas normalmente son regeneradas bajo presión selectiva con el objeto de seleccionar transformadores antes de crear generaciones de plantas transgénicas subsecuentes. Además, la presión selectiva utilizada puede ser empleada más allá de generaciones T0, son el objeto de asegurar la presencia de la construcción o cartucho de expresión de transgen deseado.

Las plantas, callos, tejidos o plantas transformadas T0, pueden ser identificadas y aisladas mediante selección o clasificación de la composición genética de y/o las características fenotípicas codificadas por genes marcadores contenidos en la construcción de expresión de transgen utilizado para la transformación. Por ejemplo, la selección se puede llevar a cabo creciendo plantas, tejidos o células transformadas potencialmente en un medio de crecimiento que contiene una cantidad represiva de antibiótico o herbicida, para lo cual la construcción genética de transformación puede impartir resistencia. Además, las células, tejidos y plantas de las plantas transformadas pueden ser identificadas mediante clasificación para la actividad de genes marcadores (tal como ß-glucuronidasa) que puede estar presente en la construcción de expresión de transgen.

Se pueden emplear varios métodos físicos y bioquímicos para identificar plantas que contienen la construcción de expresión de transgen deseada, como es bien sabido. Los ejemplos de dichos métodos incluyen análisis de manchado Southern o diversos métodos de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR) para identificar al transgen, construcción de expresión de transgen o elementos del mismo; manchado Northern, protección de S1 RNase, amplificación PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar y determinar los productos de transcripción de ARN; y electroforesis de de gel de proteína, manchado Western, inmunoprecipitación, inmunoensayo de enzimas y similares para identificar la proteína codificada y expresada por el transgen.

En otro método, los niveles de expresión de genes, proteínas y/o compuestos metabólicos que son conocidos por ser modulados mediante expresión de transgen en la planta objetivo, se pueden utilizar para identificar transformadores. En una modalidad de la presente invención, se pueden utilizar niveles incrementados del metabolito de señal, 2-oxoglutaramato para clasificar los transformadores deseables.

Finalmente, las plantas transformadas de la presente invención, pueden ser clasificadas para características de crecimiento mejorado y/o otras características agrónomas deseadas. De hecho, es generalmente deseable cierto grado de clasificación fenotípica con el objeto de identificar líneas transformadas con los rangos de crecimiento más rápidos, los más altos rendimientos de semilla, etc, particularmente cuando se identifican plantas para individualización, cría-cruce y cruce- posterior subsecuentes. Se pueden utilizar diversos parámetros para este propósito, incluyendo sin limitación, rangos de crecimiento, pesos frescos totales, peso secos, rendimientos de semilla y fruta (número, peso), tamaños de semilla y/o vaina de semilla, rendimientos de vaina de semilla (por ejemplo, número, peso), tamaños de hojas, tamaños de plantas, florecimiento incrementado, tiempo de florecimiento, contenido de proteína general (sin semillas, frutas, tejidos de plantas), contenido de proteína específico (por ejemplo, GS), contenido de nitrógeno, aminoácido libre y niveles de compuesto metabólico específicos (por ejemplo, 2-oxoglutaramato). Generalmente, estas medidas fenotípicas se comparan con las obtenidas de una línea de planta idéntica o análoga parental, una planta idéntica o análoga no transformada o una planta tipo silvestre idéntica o análoga (por ejemplo, una planta normal o parental). Preferentemente, y al menos en forma inicial, se lleva a cabo la medida de la característica(s) fenotípica elegida en la planta transgénica objetivo, en paralelo con la medida de la misma característica(s) en una planta normal o parental. Normalmente, se utilizan múltiples plantas para establecer la conveniencia y/o superioridad fenotípica de la planta transgénica con respecto a cualquier característica fenotípica particular.

Preferentemente, se seleccionan transformadores iniciales y posteriormente se utilizan para generar ?? y generaciones subsecuentes mediante individualización (auto-fertilización), hasta que el genotipo de transgen genere crías reales (por ejemplo, la planta es homocigosa para el transgen). En la práctica, esto se logra mediante individualización durante 3 ó 4 generaciones, clasificando en cada generación para los rasgos deseados e individualización de dichos individuos.

Se pueden cruzar y cruzar-nuevamente líneas transgénicas estables, para crear variedades con cualquier número de rasgos deseados, incluyendo aquellos con transgenes apilados, múltiples copias de un transgen, etc. Además, las plantas transgénicas estables pueden ser modificadas en forma genética, transformando dichas plantas con transgenes adicionales o copias adicionales del transgen parental. También se contemplan plantas transgénicas creadas mediante eventos de transformación simple que introducen múltiples copias de un transgen determinado o múltiples transgenes. Los expertos en la técnica conocen varios métodos de crianza común (ver por ejemplo, la Publicación de Breeding ethods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)).

EJEMPLOS Varios aspectos de la presente invención, serán descritos e ilustrados en forma adicional por medio de los diversos ejemplos que se encuentran a continuación, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1: AISLAMIENTO DEL GEN TRANSAMINASA DE FENILPIRUVATO DE GLUTAMINA (GPT) DE ARABIDOPSIS En un intento de localizar una enzima de la planta que esté directamente implicado en la síntesis del metabolito de señal, 2-oxoglutaramato, los solicitantes hipotetizaron que la enzima de planta putativa debe contener cierto grado de relación estructural con una proteína humana que ha sido caracterizada por estar implicad en la síntesis de 2-oxoglutaramato. La proteína humana, transaminasa de glutamina K (E.C. 2.6.1.64) (también referido en la literatura como conjugado de cisteína de ß-liasa, aminotransferasa de quineurenina, transaminasa de fenilpiruvato de glutamina, y otros nombres), ha mostrado estar implicada en el procesamiento de conjugados de cisteína de xenobióticos halogenados (Perry y asociados, 1995, FEBS Letters 360:277-280). Sin embargo, en lugar de tener una actividad implicada en el metabolismo de nitrógeno, el conjugado de ß-liasa de cisteína humana tiene una actividad desintoxicante en humanos, y en animales (ref). Sin embargo, fue de interés la implicación potencial de esta proteína en la síntesis de 2-oxoglutaramato.

Utilizando la secuencia de proteína del conjugado de ß-liasa de cisteína humana, una búsqueda contra la base de datos de planta TIGR Arabidopsis de secuencias de proteína, identificaron una secuencia potencialmente relacionada, un polipéptido codificado a través de una secuencia parcial en el locus del gen Arabidopsis en At1q77670, que comparte aproximadamente el 36% de homología/identidad de secuencia a través de las regiones alineadas.

La región de codificación completa del gen entonces fue amplificada de una librería de cADN de Arabidopsis (Stratagene) con el siguiente par de cebadores: 5'-CCCATCGATGTACC TGGACATAAATGGTGTG ATG-3' 5'-GATGGTACCTCAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3' Estos cebadores fueron diseñados para incorporar los sitios de restricción Cía I (ATCGAT) y Kpn I (GGTACC) para facilitar la subclonación subsecuente en vectores de expresión para generar plantas transgénicas. La enzima de polimerasa de ADN de Takara ExTaq fue utilizada para un PCR de alta fidelidad utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94°C durante 4 minutos, 30 ciclos a 94°C de 30 segundos, el recocido a una temperatura de 55°C durante 30 segundo, la extensión a una temperatura de 72°C durante 90 segundos, con una extensión final en una temperatura de 72°C durante 7 minutos. El producto de amplificación fue digerido con las enzimas de restricción Cía I y Kpn 1, aisladas de una electroforesis de gel de agarosa y ligadas en el vector pMon316 (Rogers, y asociados, 987 Methods in Enzymology 153: páginas 253 a 277) el cual contiene el virus de mosaico de coliflor (CaMV, también CMV), el promotor constitutivo 35S y el terminador 3' de la sintasa de nopalina (NOS). La ligación se transformó en células DH5a y se elaboraron secuencias de los transformantes para verificar el inserto.

Se aisló y secuenció un cADN de 1.3 kb, y se encontró que codifica una proteína de longitud total de 440 aminoácidos de longitud, incluyendo una secuencia de señal de cloroplasto putativa.

EJEMPLO 2: PRODUCCIÓN DE TRANSAMIN ASA DE FENILPIRUVATO DE GLUTAMINA DE ARABIDOPSIS BIOLÓGICAMENTE ACTIVA Para probar si la proteína codificada por el cADN aislado tal como se describe en el Ejemplo 1, supra, tiene la capacidad de catalizar la síntesis de 2-oxoglutaramato, se expresó el cADN en E. coli, se purificó y ensayó con respecto a su capacidad de sintetizar 2-oxoglutaramato utilizando un método estándar.

Ensayo RMN para 2-oxoqlutaramato En síntesis, se agregó la proteína purificada resultante a una mezcla de reacción que contiene 150 mM de Tris-HCI, pH 8.5, 1 mM de mercaptoetanol beta, 200 mM de glutamina, 100 mM de glioxilato y 200 microM de 5'-fosfato de piridoxal. La mezcla de reacción sin agregar la proteína de prueba, fue utilizada como un control. Se incubaron mezclas de reacción de prueba y control a una temperatura de 37°C durante 20 horas y posteriormente se aclararon mediante centrifugación para eliminar el material precipitado. Los sobrenadantes se probaron para la presencia y cantidad de 2-oxoglutaramato, utilizando, como una referencia, 13C RMN con 2-oxoglutaramato auténtico sintetizado químicamente. Los productos de la reacción son 2-oxoglutaramato y glicina, en tanto que los substratos (glutamina y glioxilato) disminuyen en abundancia. El 2-oxoglutaramato cíclico da surgimiento a una señal distinta que permite que sea más fácilmente distinguida del precursor de glutamina de cadena abierta.

Ensayo HPLC para 2-oxoqlutaramato Un ensayo alternativo para la actividad GPT utiliza HPLC para determinar la producción de 2-oxoglutaramato, siguiendo una modificación de la Publicación de Calderón y asociados, 1985, J Bacteriol 161(2): 807-809. En síntesis, un amortiguador de extracción modificado que consiste en 25 mM de Tris-HCI, pH 8.5, 1 mM de EDTA, 20 µ? de FAD, 10 mM de Cisteína, y -1.5% (v/v) de Mercaptoetanol. Las muestras de tejido del material de prueba (por ejemplo, tejido de planta) se agregan al amortiguador de extracción en una proporción de aproximadamente 1/3 (p/v), incubado durante 30 minutos a una temperatura de 37°C y detenidos con 200 µ? de 20% de TCA. Después de aproximadamente 5 minutos, la mezcla de ensayo se centrifuga y el sobrenadante se utiliza para cuantificar 2-oxoglutaramato mediante HPLC, utilizando una columna ION-300 7.8 mm ID X 30 cm L, con una fase móvil en 0.01 N h2S04, un rango de flujo de aproximadamente 0.2 ml/min, a una temperatura de 40°C. El volumen de inyección es de aproximadamente 20 µ?, y el tiempo de retención entre aproximadamente 38 y 39 minutos. La detección se logró con 210 nm de luz UV.

Resultados Utilizando Ensayo RMN: Este experimento reveló que la proteína de prueba tuvo la capacidad de catalizar la síntesis de 2-oxoglutaramato. Por consiguiente, estos datos indican que el cADN aislado codifica una transaminasa de fenilpiru vato de glutamina que está implicada directamente en la síntesis de 2-oxoglutaramato en plantas. Por consiguiente, la proteína de prueba fue designada como transaminasa de fenilpiruvato de glutamina de Arabidopsis, o "GPT".

La secuencia de nucleótido de la secuencia de codificación Arabidopsis GPT se muestra en la tabla de secuencias, SEC ID NO. 1. La secuencia de aminoácido traducida de la proteína GPT se muestra en la SEC ID NO. 2. EJEMPLO 3: CREACIÓN DE PLANTAS DE TABACO TRANSGÉ NICAS QUE SOBRE-EXPRESAN EL GPT DE ARABIDOPSIS: Generación de Vector de Expresión de Planta pMON-PJU: En síntesis, el vector de expresión de planta pMon316-PJU, se construyó como se indica a continuación: el cADN aislado que codifica Arabidopsis GPT (Ejemplo 1) fue clonado en el sitio de polienlazador Clal-Kpnl del vector pMON316, que coloca al gen GPT bajo el control del promotor 35S del virus de mosaico de coliflor constitutivo (CaMV) y el terminador de transcripción de sintasa de nopalina (NOS). Se incluyó un gen de resistencia a kanamicina para proporcionar un marcador seleccionable.

Transformaciones de Plantas Transmitidas por Agrobacterium: pMON-PJU y un vector de control, pMon316 (sin ADN insertado) fueron transferidos a una cepa de Agrobacterium tumefaciens pTiTT37ASE utilizando un método de electroporación estándar (McCormac y asociados, 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159), seguido de revestimiento en placas LB que contienen antibióticos de espectinomicina (100 micro gm/ml) y kanamicina (50 micro gm/ml). Se revisaron las colonias resistentes a antibióticos de Agrobacterium mediante PCR, para asegurar que contuvieran plásmido.

Se transformaron plantas Nicotiana tabacum cv. Xanthi con Agrobacteria transformada con pMON-PJU utilizando el sistema de transformación de disco de hoja de Horsch y asociados. (Horsch y asociados, 1995, Science 227:1229-1231). En síntesis, los discos de hoja estériles fueron inoculados y cultivados durante 2 días, posteriormente se transfirieron a un medio MS selectivo que contiene 100 pg/ml de kanamicina y 500 Mg/ml de clafaran. Los transformadores se confirmaron a través de su capacidad de formar raíces en el medio selectivo.

Generación de Plantas de Tabaco Transqénicas GPT: Se permitió que los segmentos de hoja estéril desarrollaran callo en un medio Murashige & Skoog (M&S) del cual emergieron plantitas de transformación. Estas plantitas posteriormente fueron transferidas al medio de selección que permite la raíz (medio M&S con kanamicina como el agente de selección). Posteriormente las plantitas de tabaco transformadas, sanas, ahora con raíz se transfirieron a la tierra y se dejaron crecer para madurar y al momento del florecimiento las plantas fueron individualizadas y las semillas resultantes fueron recolectadas. Durante la etapa de crecimiento, las plantas habían sido revisadas con respecto al fenotipo de crecimiento y se midió el rango de fijación C02 de muchas de las plantas transgénicas jóvenes.

Producción de Plantas Transgénicas GPT de Generación T1 v T2: Se germinaron semillas recolectadas de la generación T0 de las plantas de tabaco transgénicas en un medio M&S que contiene kanamicina (100 mg/L) para enriquecer el transgen. Al menos un cuarto de las semillas no germinó en este medio (se espera que la kanamicina inhiba la germinación de semillas en resistencia, que pueda haber sido producida como resultado de segregación genética normal del gen) y se eliminó más de la mitad de las semillas restantes debido a la sensibilidad demostrada (incluso leve) a la kanamicina.

Las plantas sobrevivientes (generación ??) fueron proliferadas y estas plantas posteriormente fueron individualizadas para producir semillas para la generación T2. Las semillas de la generación ?? fueron germinadas en un medio MS suplementado para las líneas de transformación con kanamicina (10 mg/litro). Después de 14 días, se transfirieron a arena, y proporcionaron un cuarto de solución de nutriente de Hoagland de resistencia suplementado con 25 mM de nitrato de potasio. Se dejaron crecer a una temperatura de 24°C con un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad con una intensidad de luz de 900 micromoles por metro cuadrado por segundo. Se recolectaron a los 14 días después de haber sido transferidas al cultivo de arena.

Caracterización de Plantas Transqénicas GPT: Las plantas transgénicas recolectadas (tanto transgenes GPT como transgenes de control de vector) fueron analizadas para actividad de sintetasa de glutamina en raíz y hoja, peso fresco de la planta total, proteína total en raíz y hoja, y rango de fijación C02 (Knight y asociados, 1988, Plant Physiol. 88: 333). Las plantas A. tumefaciens tipo silvestre, no transformadas también fueron analizadas a través de los mismos parámetros con el objeto de establecer un control de línea de base.

Los resultados característicos de crecimiento se tabularon más adelante en la tabla 1. Además, en la figura 2 se muestra una fotografía de la planta transgénica GPT comparada con una planta de control tipo silvestre (junto con la planta de tabaco transgénica GS1). A través de todos los parámetros evaluados, las plantas de tabaco transgénicas GPT mostraron características de crecimiento mejoradas. En particular, las plantas transgénicas GPT exhibieron más del 50% de incremento en el rango de fijación C02, y un incremento mayor al doble en actividad de sintetasa de glutamina en tejido de hoja, en forma relativa a las plantas de control tipo silvestre. Además, la proporción GS de hoja-a-raíz se incrementó en casi tres veces en las plantas transgénicas de transaminasa relativas al control tipo silvestre. También incrementó la cantidad de proteína total y peso fresco en las plantas transgénicas, en aproximadamente el 50% y 80% (hoja), respectivamente, en forma relativa al control tipo silvestre. Estos datos demuestran que las plantas de tabaco que sobre-expresan el transgen GPT Arabidopsis, logran un crecimiento y rangos de fijación CO2 significativamente mejorados.

Tabla I Datos = promedio de tres plantas Tipo silvestre - Plantas de control; no regeneradas o transformadas.

Las líneas PN1 fueron producidas mediante regeneración después de transformación utilizando una construcción sin un gen insertado.

Un control contra los procesos de regeneración y transformación. Las líneas PN 9 fueron producidas mediante regeneración después de la transformación utilizando una construcción con el gen GPT de Arabidopsis.

EJEMPLO 4: GENERACIÓN DE PLANTAS DE TOMATE TRANSGÉNICAS QUE LLEVAN EL TRANSGEN GPT DE ARABIDOPSIS: Las plantas de Lycopersicon esculentum transgénicas (Tomate Micro-Tom) que llevan al transgen GPT de Arabidopsis, fueron generados utilizando los vectores y métodos descritos en el Ejemplo 3. Se generaron plantas de tomate transgénicas T0 y se crecieron hasta la madurez. Los datos de la característica de crecimiento inicial de las plantas de tomate transgénicas GPT se presentan en la tabla II. Las plantas transgénicas mostraron una mejoría significativa del rango de crecimiento, florecimiento y rendimiento de la semilla en relación con las plantas de control tipo silvestre. Además, las plantas transgénicas desarrollaron múltiples tallos principales, mientras que las plantas tipo silvestre se desarrollaron con un solo tallo principal. En la figura 3 se presenta una fotografía de una planta de tomate transgénica GPT comparada con una planta tipo natural.

TABLA II EJEMPLO 5: ACTIVIDAD DE TRANSGEN GPT DE CEBADA EN PLANTAS En este ejemplo, se aisló la secuencia de codificación putativa para el GPT de Cebada y se expresó a partir de una construcción de transgen utilizando un ensayo de expresión temporal in planta. Se produjo el GPT de Cebada recombinante biológicamente activo, y se catalizó la síntesis incrementada de 2-oxoglutaramato, tal como se confirma mediante HPLC.

Se determinó la secuencia de codificación GPT de Cebada (Hordeum vulgare) y se sintetizó. La secuencia de ADN de la secuencia de codificación GPT de Cebada utilizada en este ejemplo, se proporciona en la SEC ID NO: 9, y la secuencia de aminoácido de proteína GPT codificada se presenta en la SEC ID NO: 10.

La secuencia de codificación para GPT de Cebada se insertó en el vector cambia 1305.1, y se transfirió a la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA404 utilizando un método de electroporación estándar (McCormac y asociados, 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159), seguido de plantado en placas LB que contienen higromicina (50 micro gm/ml). Se seleccionaron para análisis colonias resistentes a antibióticos de Agrobacterium .

El ensayo de expresión de hoja de tabaco temporal consistió en inyectar una suspensión de Agrobacterium transformado (1.5-2.0 OD 650) en hojas de tabaco que crecen rápidamente. Se elaboraron inyecciones intradérmicas en una rejilla a través de la superficie de la hoja para asegurar que se pudiera exponer una cantidad significativa de la superficie de la hoja al Agrobacterium. Posteriormente la planta se dejó crecer de 3 a 5 días, en donde el tejido se extrajo tal como se describe para todas las otras extracciones de tejido y se midió la actividad GPT.

La actividad GPT en el tejido de hoja inoculado (1217 nanomoles/gFWt/h) fue tres veces el nivel medido en el tejido de hoja de la planta de control (407 nanomoles/gFWt/h), indicando que la construcción GPT Hordeum puede dirigir la expresión de GPT funcional en una planta transgénica.

EJEMPLO 6: AISLAMIENTO Y EXPRESIÓN DE SECUENCIA DE CODIFICACIÓN DE GEN GPT DE ARROZ RECOMBINANTE Y ANÁLISIS DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA En este ejemplo, se aisló la secuencia de codificación putativa de GPT de arroz y se expresó en E. coli. Se produjo GPT de arroz recombinante biológicamente activo, y se catalizó la síntesis incrementada de 2-oxoglutaramato, tal como se confirma mediante HPLC.

Materiales y Métodos: Secuencia de codificación GPT de arroz y expresión en E. coli: Se determinó y sintetizó la secuencia de codificación GPT de arroz (Oryza sativia), se insertó en un vector PET28 y se expresó en E. coli. En síntesis, las células E. coli fueron transformadas con el vector de expresión y los transformadores crecieron durante la noche en un caldo LB diluido y crecido en OD 0.4, se indujo la expresión con isopropil-B-D-tiogalactosida (0.4 micromolar), se crecieron durante 3 horas y se recolectaron. Posteriormente se ensayaron para actividad biológica un total de 25 X 106 células, utilizando el ensayo RMN que se encuentra más adelante. Se ensayaron como un control células tipo E. coli, no transformadas. Un control adicional utilizó células E. coli transformadas con un vector vacío.

La secuencia de ADN de la secuencia de codificación GPT de arroz utilizada en este ejemplo se proporciona en la SEC ID NO: 5, y la secuencia de GPT de proteína GPT codificada se presenta en la SEC ID NO: 6.

Ensayo HPLC para 2-oxoqlutaramato: Se utilizó HPLC para determinar la producción de 2-oxoglutaramato en células E. coli que sobreexpresan GPT, siguiendo una modificación de Calderón y asociados, 1985, J Bacteriol 161(2): 807-809. En síntesis, se utilizó un amortiguador de extracción modificado que consiste en 25 mM Tris-HCI pH 8.5, 1 mM EDTA, 20 µ? de fosfato de piridoxal, 10 mM de Cisteína, y -1.5% (v/v) de Mercaptoetanol. Se agregaron muestras (lisado de células E coli, 25 X 106 células) al amortiguador de extracción en una proporción de aproximadamente un tercio (p/v), se incubó durante 30 minutos a una temperatura de 37°C, y se detuvo con 200 µ? de 20% de TCA. Después de aproximadamente 5 minutos, la mezcla de ensayo fue centrifugada y el sobrenadante se utilizó para cuantificar 2-oxoglutaramato mediante HPLC, utilizando una columna ION-300 7.8 mm ID X 30 cm L, con una fase móvil en 0.01 N h2S04, un rango de flujo de aproximadamente 0.2 ml/min, a una temperatura de 40°C. El volumen de inyección es de aproximadamente 20 µ?, y el tiempo de retención es de entre 38 y 39 minutos. Se logró la detección con 210 nm de luz UV.

Se utilizó comparación de análisis RMN con 2- oxoglutaramato auténtico, para establecer que la secuencia de longitud total de Arabidopisis expresa un GPT con actividad de síntesis de 2-oxoglutaramato. En síntesis, el 2-oxoglutaramato auténtico (estructura confirmada con RMN) elaborado mediante síntesis química para validar el ensayo HPLC anterior, confirmando que el producto del ensayo (molécula sintetizada en respuesta al GPT expresado) y el 2-oxoglutaramato auténtico, se eluyen en el mismo tiempo de retención. Además, cuando se mezclan juntos el producto de ensayo y el compuesto auténtico, se eluyen como un pico simple. Además, la validación del ensayo HPLC también incluyó monitorear la desaparición de la glutamina de substrato y mostró que hubo una estereoquímica molar de 1:1 entre la glutamina consumida al 2-oxoglutaramato producido. El procedimiento de ensayo siempre incluyó dos controles, uno con la enzima agregada y uno sin la glutamina agregada. El primero muestra que la producción de 2-oxoglutaramato fue dependiente de tener presente la enzima, y el segundo muestra que la producción del 2-oxoglutaramato fue dependiente de la glutamina del substrato.

Resultados: La expresión de la secuencia de codificación de GPT de arroz de la SEC ID NO: 5, dio como resultado la sobre-expresión de la proteína GPT recombinante que tiene bioactividad de catalización de síntesis de 2-oxoglutaramato. En forma específica, se observaron 1.72 nanomoles de actividad de 2-oxoglutaramato en las células E. coli que sobreexpresan el GPT de arroz recombinante, en comparación con únicamente 0.02 nanomoles de actividad 2-oxoglutaramato en células E. coli de control, un incremento en el nivel de actividad de 86 veces con respecto al control.

EJEMPLO 7: AISLAMIENTO Y EXPRESIÓN DE LA SECUENCIA QUE CODIFICA AL GEN GPT DE FRIJOL SOYA RECOMBINANTE Y ANÁLISIS DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA En este ejemplo, la secuencia de codificación putativa para el GPT de frijol soya fue aislada y expresada en E. coli. Se produjo el GPT de frijol soya recombinante biológicamente activo, y se catalizó la síntesis incrementada de 2-oxoglutaramato, tal como se confirma mediante HPLC.

Materiales v Métodos: Secuencia de codificación de GPT de frijol soya y expresión en E. coli: Se determinó y sintetizó la secuencia de codificación de GPT de frijol soya (Glycine max), se insertó en un vector PET28, y se expresó en E. coli. En síntesis, se transformaron las células E. coli con el vector de expresión y los transformadores se crecieron durante la noche en un caldo LB diluido y se crecieron en OD 0.4, la expresión fue inducida con isopropil-B-D-tiogalactosida (0.4 micromolar), se crecieron durante 3 horas y se recolectaron. Posteriormente se ensayaron un total de 25 X 106 células para actividad biológica utilizando el ensayo RMN, que se encuentra más adelante. Se ensayaron como control las células E. coli tipo silvestre, no transformadas. Un control adicional utilizó células E coli transformadas con un vector vacío.

La secuencia de ADN de la secuencia de codificación GPT de frijol soya utilizada en este ejemplo, se proporciona en la SEC ID NO: 7, y la secuencia de aminoácido de proteína GPT codificada se presenta en la SEC ID NO: 8.

Ensayo HPLC para 2-oxoglutaramato: Se utilizó HPLC para determinar la producción de 2-oxoglutaramato en células E. coli que sobreexpresan GPT, tal como se describe en el Ejemplo 20, supra.

Resultados: La expresión de la secuencia de codificación GPT de frijol soya de la SEC ID NO: 7 dio como resultado la sobreexpresión de la proteína GPT recombinante que tiene bioactividad de catalización de la síntesis de 2-oxoglutaramato. En forma específica, se observaron 31.9 nanomoles de actividad de 2-oxoglutaramato en las células E. coli que sobreexpresan el GPT de frijol soya recombinante, en comparación con únicamente 0.02 nanomoles de actividad 2-oxoglutaramato en células E. coli de control, un incremento de nivel de actividad de casi 1,600 veces con respecto al control.

EJEMPLO 8: AISLAMIENTO Y EXPRESIÓN DE LA SECUENCIA DE CODIFICACIÓN DEL GEN GPT DE PEZ CEBRA RECOMBINANTE Y ANÁLISIS DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA En este ejemplo, se aisló la secuencia de codificación putativa de GPT de pez cebra y se expresó en E. coli. Se produjo el GPT de pez cebra recombinante biológicamente activo, y se catalizó la síntesis incrementada de 2-oxoglutaramato, tal como se confirma mediante RMN.

Materiales y métodos: Secuencia de codificación GPT de pez cebra y expresión en E. coli Se determinó la secuencia de codificación GPT de pez cebra {Danio rerio) y se sintetizó, se insertó en un vector PET28 y se expresó en E. coli. En síntesis, se transformaron las células E. coli con el vector de expresión y los transformadores crecidos durante la noche en un caldo LB diluido y crecido en OD 0.4, se indujo la expresión con isopropil-B-D-tiogalactosida (0.4 micromolar), se creció durante 3 horas y se recolectó. Posteriormente se ensayaron un total de 25 X 106 células para actividad biológica, utilizando el ensayo RMN, que se encuentra más adelante. Se ensayaron como control las células E. coli tipo silvestre, no transformadas. Un control adicional utilizó células E. coli transformadas con un vector vacío.

La secuencia de ADN de la secuencia de codificación GTP de pez cebra utilizada en este ejemplo se proporciona en la SEC ID NO: 11, y la secuencia de aminoácido de proteína GPT codificada se presenta en la SEC ID NO: 12.

Ensayo HPLC para 2-oxoqlutaramato: Se utilizó HPLC para determinar la producción de 2-oxoglutaramato en células E. coli que sobreexpresan GPT tal como se describe en el Ejemplo 20, supra.

Resultados: La expresión de la secuencia de codificación GPT de pez cebra de SEC ID NO: 16, dio como resultado la sobre-expresión de proteína GPT recombinante que tiene bioactividad de catalización de síntesis de 2-oxoglutaramato. En forma específica, se observaron 28.6 nanomoles de actividad de 2-oxoglutaramato en células E. coli que sobreexpresan el GPT de pez cebra recombinante, en comparación con únicamente 0.02 nanomoles de actividad 2-oxoglutaramato en células E. coli de control, un incremento en el nivel de actividad mayor a 1,400 veces con respecto al control.

EJEMPLO 9: GENERACIÓN Y EXPRESIÓN DE SECUENCIAS QUE CODIFICAN EL GEN GPT DE ARABIDOPSIS TRUNCADO, RECOMBINANTE Y ANÁLISIS DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA En este ejemplo, se diseñaron dos diferentes truncados de la secuencia de codificación GPT de Arabidopsis y se expresaron en E. coli, con el objeto de evaluar la actividad de proteínas GPT en donde el péptido de señal de cloroplasto putativo está ausente o truncado. Las proteínas GPT truncadas recombinantes que corresponden a la secuencia de aminoácido GPT de Arabidopsis de longitud total SEC ID NO: 2, truncadas para eliminar ya sea los primeros 30 residuos de aminoácido de terminal amino, o los primeros 45 residuos de aminoácido de terminal amino, se expresaron en forma exitosa y mostraron actividad biológica en la catalización de la síntesis incrementada de 2-oxoglutaramato, tal como se confirma mediante RMN.

Materiales y Métodos: Secuencias de codificación GPT de Arabidopsis truncada v expresión en E. coli: La secuencia de codificación de ADN de un truncado de la secuencia de codificación GPT de Arabidopsis thaliana de la SEC ID NO: 1, fue diseñada, sintetizada, insertada en un vector PET28 y expresada en E. coli. La secuencia de ADN de la secuencia de codificación GPT de Arabidopsis truncada utilizada en este ejemplo se proporciona en la SEC ID NO: 15 (construcción -45 AA), y la secuencia de aminoácido de proteína GPT truncada correspondiente se proporciona en la SEC ID NO: 16. En síntesis, se transformaron células E. coli con el vector de expresión y los transformadores se crecieron durante la noche en un caldo LB diluido y crecido en OD 0.4, se indujo la expresión con isopropil-B-D-tiogalactosida (0.4 micromolar), se crecieron durante 3 horas y se recolectaron. Posteriormente se ensayaron para actividad biológica un total de 25 X 106 células utilizando HPLC, tal como se describe en el Ejemplo 20. Las células E. coli tipo silvestre, no transformadas fueron ensayadas como un control. Un control adicional utilizó células E coli transformadas con un vector vacío.

La expresión de la secuencia de codificación GPT de -45 Arabidopsis truncada de SEC ID NO: 15, dio como resultado la sobre-expresión de la proteína GPT recombinante biológicamente activa (actividad de catalización de la síntesis de 2-oxoglutaramato). En forma específica, se observaron 16.1 nanomoles de actividad 2-oxoglutaramato en las células E. coli que sobreexpresan el -45 GPT truncado, en comparación con únicamente 0.02 nanomoles de actividad de 2-oxoglutaramato en células E. coli de control, un incremento en el nivel de actividad mayor a 800 veces con respecto al control. Para comparación, la secuencia de codificación del gen Arabidopsis de longitud total expresada en el mismo ensayo de E. coli, generó 2.8 nanomoles de actividad de 2-oxoglutaramato, o rigurosamente menos de una quinta parte de la actividad observada de la proteína GPT recombinante truncada.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en la presente especificación están incorporadas como referencia, como si cada publicación o solicitud de patente individual, fueran indicadas en forma específica e individual para estar incorporadas como referencia.

La presente invención no será limitada en alcance por las modalidades aquí descritas, las cuales están proyectadas como ilustraciones simples de aspectos individuales de la presente invención, y cualquier equivalente funcional está dentro del alcance de la presente invención. Los expertos en la técnica podrán apreciar diversas modificaciones a los modelos y métodos de la presente invención, además de los aquí descritos, a partir de la descripción y enseñanzas anteriores, y están proyectadas similarmente para estar dentro del alcance de la presente invención. Dichas modificaciones u otras modalidades pueden practicarse sin apartarse del alcance y espíritu real de la presente invención.

TABLA DE SECUENCIAS: SEC ID NO: 1 Secuencia de codificación de ADN transaminasa de fenilpiruvato de glutamina de Arabidopsis: ÁTGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTC TCTTCTCCCATTCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTC CTATCGGAGCCACCATGACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAA ACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACT CAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCT TTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATT AAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACT CTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGA GAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATG TTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGA TTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTT TACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAAC TAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAA GATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAAC GATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGG ATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATG AATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGA TTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCAC ATTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGC ACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAG ACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCG GGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGT TGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACG AGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTT CTGTAAAGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAA GCTTAAGAGAAAAGTCTGA SEC ID NO: 2 Secuencia de aminoácido GPT de Arabidopsis MYLDINGVMIKQFSFKASLLPFSSNFRQSSA IHRPIGATMTTVSTQNESTQKPV QVAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIKDGKNQ YARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLWDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDE VILFAPFYDSYEATLS AGAKVKGITLRPPDFSIPLEELKAAVTNKTRAIL NTPHN PTGKMFTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHISIASLPG YERTVTM NSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALKAPE SYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFWADHTPFGMENDVAFCE YL I E E VGWAl PTSVFYLN PEEGKN LVRFAFCKDEETLRGAI ERM KQKLKRK SEC ID NO: 3 Secuencia de ADN GPT de uva Mostrar Cambia 1305.1 con (el extremo rbcS 3C + Viti s ( U va ). ATG en letras neg rita s es el s itio de i n ici o , l os pa réntesi s son e l i ntró n catl y el actagt su brayad o es el sitio de cl on aci ón spel uti l izado pa ra d ivid i rse en e l gen d e h ord eu m .

AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAA GGACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAA CCACAAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTT TGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACC TCTTAGTMCCAATTATTTCAGCACCAT¡GGTAGATCTGAGG(GTAAATTTCTAG TTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTAI I I I I I I GAGC TTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATA TTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGAT GATGATAGTTACAG)AACCG ACG A C7A G TATGCAGCTCTCTCAATGTACCTG GACATTCCCAGAGTTGCTTAAAAGACCAGCC I I I I I AAGGAGGAGTATTGATA GTATTTCGAGTAGAAGTAGGTCCAGCTCCAAGTATCCATCTTTCATGGCGTC CGCATCAACGGTCTCCGCTCCAAATACGGAGGCTGAGCAGACCCATAACCC CCCTCAACCTCTACAGGTTGCAAAGCGCTTGGAGAAATTCAAAACAACAATC TTTACTCAAATGAGCATGCTTGCCATCAAACATGGAGCAATAAACCTTGGCCA AGGGTTTCCCAACTTTGATGGTCCTGAGTTTGTCAAAGAAGCAGCAATTCAA GCCATTAAGGATGGGAAAAACCAATATGCTCGTGGATATGGAGTTCCTGATC TCAACTCTGCTGTTGCTGATAGATTCAAGAAGGATACAGGACTCGTGGTGGA CCCCGAGAAGGAAGTTACTGTTACTTCTGGATGTACAGAAGCAATTGCTGCT ACTATGCTAGGCTTGATAAATCCTGGTGATGAGGTGATCCTCTTTGCTCCATT TTATGATTCCTATGAAGCCACTCTATCCATGGCTGGTGCCCAAATAAAATCCA TCACTTTACGTCCTCCGGATTTTGCTGTGCCCATGGATGAGCTCAAGTCTGC AATCTCAAAG AATACCCGTGCAATCCTTATAAACACTCCCCATAACCCCACAG GAAAGATGTTCACAAGGGAGGAACTGAATGTGATTGCATCCCTCTGCATTGA GAATGATGTGTTGGTGTTTACTGATGAAGTTTACGACAAGTTGGCTTTCGAAA TGGATCACATTTCCATGGCTTCTCTTCCTGGGATGTACGAGAGGACCGTGAC TATGAATTCCTTAGGGAAAACTTTCTCCCTGACTGGATGGAAGATTGGTTGG ACAGTAGCTCCCCCACACCTGACATGGGGAGTGAGGCAAGCCCACTCATTC CTCACGTTTGCTACCTGCACCCCAATGCAATGGGCAGCTGCAACAGCCCTC CGGGCCCCAGACTCTTACTATGAAGAGCTAAAGAGAGATTACAGTGCAAAGA AGGCAATCCTGGTGGAGGGATTGAAGGCTGTCGGTTTCAGGGTATACCCAT CAAGTGGGACCTATTTTGTGGTGGTGGATCACACCCCATTTGGGTTGAAAGA CGATATTGCGTTTTGTGAGTATCTGATCAAGGAAGTTGGGGTGGTAGCAATT CCGACAAGCGTTTTCTACTTACACCCAGAAGATGGAAAGAACCTTGTGAGGT TTACCTTCTGTAAAGACGAGGGAACTCTGAGAGCTGCAGTTGAAAGGATGAA GGAGAAACTGAAGCCTAAACAATAGGGGCACGTGA S EC I D N O : 4 Secuenci a d e a m i noá cido G PT de uva MVDLRNRRTSMQLSQC7WTFPELLKRPAFLRRSIDSISSRSRSSSKYPSF ASA STVSAPNTEAEQTHNPPQPLQVAKRLEKFKTTIFTQMS LAIKHGAINLGQGFPN FDGPEFVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGVPDLNSAVADRFKKDTGLWDPEKEVT VTSGCTEAIAATMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAQIKSITLRPPDFAVP MDELKSAIS NTRAILINTPHNPTGKMFTREELNVIASLCIENDVLVFTDEVYD LA FEMDHISMASLPGMYERTVT NSLGKTFSLTGWKIGWTVAPPHLTWGVRQAHS FLTFATCTPMQWAAATALRAPDSYYEELKRDYSAKKAILVEGLKAVGFRVYPSS GTYFVWDHTPFGLKDDIAFCEYLIKEVGWAIPTSVFYLHPEDGKNLVRFTFCKD EGTLRAAVER KEKLKPKQ SEC ID NO: 5 Secuencia de ADN GPT de arroz Codón GPT de arroz optimizado para expresión de E. coli; las secuencias no traducidas se muestran en el cuadro inferior atgtggATGAACCTGGCAGGCTTTCTGGCAACCCCGGCAACCGCAACCGCAAC CCGTCATGAAATGCCGCTGAACCCGAGCAGCAGCGCGAGCTTTCTGCTGAG CAGCCTGCGTCGTAGCCTGGTGGCGAGCCTGCGTAAAGCGAGCCCGGCAG CAGCAGCAGCACTGAGCCCGATGGCAAGCGCAAGCACCGTGGCAGCAGAA AACGGTGCAGCAAAAGCAGCAGCAGAAAAACAGCAGCAGCAGCCGGTGCA GGTGGCGAAACGTCTGGAAAMTTTAAMCCACCATTTTTACCCAGATGAGC ATGCTGGCGATTAAACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCC GAACTTTGATGGCCCGGATTTTGTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTAAC GCGGGCAAAAACCAGTATGCGCGTGGCTATGGCGTGCCGGAACTGAACAGC GCGATTGCGGAACGTTTTCTGAAAGATAGCGGCCTGCAGGTGGATCCGGAA AAAGAAGTGACCGTGACCAGCGGCTGCACCGAAGCGATTGCGGCGACCATT CTGGGCCTGATTAACCCGGGCGATGAAGTGATTCTGTTTGCGCCGTTTTATG ATAGCTATGAAGCGACCCTGAGCATGGCGGGCGCGAACGTGAAAGCGATTA CCCTGCGTCCGCCGGATTTTAGCGTGCCGCTGGAAGAACTGAAAGCGGCCG TGAGCAAAAACACCCGTGCGATTATGATTAACACCCCGCATAACCCGACCGG CAAAATGTTTACCCGTGAAGAACTGGAATTTATTGCGACCCTGTGCAAAGAA AACGATGTGCTGCTGTTTGCGGATGAAGTGTATGATAAACTGGCGTTTGAAG CGGATCATATTAGCATGGCGAGCATTCCGGGCATGTATGAACGTACCGTGAC CATGAACAGCCTGGGCAAAACCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCTG GGCGATTGCGCCGCCGCATCTGACCTGGGGCGTGCGTCAGGCACATAGCTT TCTGACCTTTGCAACCTGCACCCCGATGCAGGCAGCCGCCGCAGCAGCACT GCGTGCACCGGATAGCTATTATGAAGAACTGCGTCGTGATTATGGCGCGAAA AAAGCGCTGCTGGTGAACGGCCTGAAAGATGCGGGCTTTATTGTGTATCCG AGCAGCGGCACCTATTTTGTGATGGTGGATCATACCCCGTTTGGCTTTGATA ACGATATTGAATTTTGCGAATATCTGATTCGTGAAGTGGGCGTGGTGGCGAT TCCGCCGAGCGTGTTTTATCTGAACCCGGAAGATGGCAAAAACCTGGTGCG TTTTACCTTTTGCAAAGATGATGAAACCCTGCGTGCGGCGGTGGAACGTATG AAAACCAAACTGCGTAAAAAAAAGCTTgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactg a SEC ID NO: 6 Secuencia de aminoácido GPT de arroz Incluye aminoácidos de terminal amino MW para clonación y secuencias de etiqueta His del vector pet28 en cursivas /WIÍV NLAGFLATPATATATRHEMPLNPSSSASFLLSSLRRSLVASLRKASPAAAA ALSPMASASTVAAENGAAKAAAEKQQQQPVQVAKRLEKFKTTIFTQ SMLAIKH GAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQYARGYGVPELNSAIAERFLKDSG LQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLS AGANVKAI TLRPPDFSVPLEELKAAVSKNTRAI INTPHNPTGK FTREELEFIATLCKENDVL LFADEVYDKLAFEADHIS ASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHL TWGVRQAHSFLTFATCTPMQAAAAAALRAPDSYYEELRRDYGAKKALLVNGLK DAGFIVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDIEFCEYLIREVGWAIPPSVFYLNPEDG KNLVRFTFCKDDETLRAAVER KTKLRKK L A/\LEHHHHHH SEC ID NO: 7 Secuencia de ADN GPT de frijol soya TOPO 151D CON FRIJOL SOYA para expresión de E coli A partir del codón de inicio. Las secuencias de vector están en cursivas AJGCATCATCACCATCACCATGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTC TCGA TTCTA CGGAAAA CCTGTA TTTTCA GGGAA TTGA TCCC TTCA CCGCG AAA CGTCTGGAAAAATTTCAGACCACCATTTTTACCCAGATGAGCCTGCTGGCGA TTAAACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCCGAACTTTGATGGCCC GGAATTTGTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTCGTGATGGCAAAAACCA GTATGCGCGTGGCTATGGCGTGCCGGATCTGAACATTGCGATTGCGGAACG TTTTAAAAAAGATACCGGCCTGGTGGTGGATCCGGAAAAAGAAATTACCGTG ACCAGCGGCTGCACCGAAGCGATTGCGGCGACCATGATTGGCCTGATTAAC CCG G GCG ATGMGTG ATTATGTTTGCGCCGTTTTATGATAGCTATGAAGCG A CCCTGAGCATGGCGGGCGCGAAAGTGAAAGGCATTACCCTGCGTCCGCCG GATTTTGCGGTGCCGCTGGAAGAACTGAAAAGCACCATTAGCAAAAACACCC GTGCGATTCTGATTAACACCCCGCATAACCCGACCGGCAAAATGTTTACCCG TGAAGAACTGAACTGCATTGCGAGCCTGTGCATTGAAAACGATGTGCTGGTG TTTACCGATGAAGTGTATGATAAACTGGCGTTTGATATGGAACATATTAGCAT GGCGAGCCTGCCGGGCATGTTTGAACGTACCGTGACCCTGAACAGCCTGGG CAAAACCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCTGGGCGATTGCGCCGCC GCATCTGAGCTGGGGCGTGCGTCAGGCGCATGCGTTTCTGACCTTTGCAAC CGCACATCCGTTTCAGTGCGCAGCAGCAGCAGCACTGCGTGCACCGGATAG CTATTATGTGGAACTGAAACGTGATTATATGGCGAAACGTGCGATTCTGATTG GGCCTGAAAGCGGTGGGCTTTAAAGTGTTTCCGAGCAGCGGCACCTATTT TGTGGTGGTGGATCATACCCCGTTTGGCCTGGAAAACGATGTGGCGTTTTGC GAATATCTGGTGAAAGAAGTGGGCGTGGTGGCGATTCCGACCAGCGTGTTT TATCTGAACCCGGAAGAAGGCAAAMCCTGGTGCGTTTTACCTTTTGCAAAG ATGAAGAAACCATTCGTAGCGCGGTGGAACGTATGAAAGCGAAACTGCGTAA AGTCGACTAA SEC ID NO: 8 Secuencia de aminoácido GPT de frijol soya Producto de proteína traducido, secuencias de vector en cursivas MHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENL YTOG/DPFTAKRLEKFQTTIF QMSLLAI KHG AINLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAIRDGKNQYARGYGVPDLNIAIAERFKKDTGL WDPEKEITVTSGCTEAIAAT IGLINPGDEVIMFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGIT LRPPDFAVPLEELKSTISKNTRAILINTPHNPTGKMFTREELNCIASLCIENDVLVF TDEVYDKLAFDMEHISMASLPGMFERTVTLNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLS WGVRQAHAFLTFATAHPFQCAAAAALRAPDSYYVELKRDYMAKRAILIEGLKAV GFKVFPSSGTYFWVDHTPFGLENDVAFCEYLVKEVGWAIPTSVFYLNPEEGK NLVRFTFCKDEETIRSAVERMKAKLRKVD SEC ID NO: 9 Secuencia de ADN GPT de Cebada Secuencia de codificación desde el inicio con el intrón eliminado ATGGTAGATCTGAGGAACCGACGAflCWGJATGGCATCCGCCCCCGCCTCC GCCTCCGCGGCCCTCTCCACCGCCGCCCCCGCCGACAACGGGGCCGCCAA GCCCACGGAGCAGCGGCCGGTACAGGTGGCTAAGCGATTGGAGAAGTTCA AAACAACAATTTTCACACAGATGAGCATGCTCGCAGTGAAGCATGGAGCAAT AAACCTTGGACAGGGGTTTCCCMTTTTGATGGCCCTGACTTTGTCAAAGAT GCTGCTATTGAGGCTATCAAAGCTGGAAAGAATCAGTATGCAAGAGGATATG GTGTGCCTGAATTGAACTCAGCTGTTGCTGAGAGATTTCTCAAGGACAGTGG ATTGCACATCGATCCTGATAAGGAAGTTACTGTTACATCTGGGTGCACAGAA GCAATAGCTGCAACGATATTGGGTCTGATCAACCCTGGGGATGAAGTCATAC TGTTTGCTCCATTCTATGATTCTTATGAGGCTACACTGTCCATGGCTGGTGCG AATGTCAAAGCCATTACACTCCGCCCTCCGGACTTTGCAGTCCCTCTTGAAG AGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAAGAATACCAGAGCAATAATGATTAATACACC TCACAACCCTACCGGGAAAATGTTCACAAGGGAGGAACTTGAGTTCATTGCT GATCTCTGCAAGGAAAATGACGTGTTGCTCTTTGCCGATGAGGTCTACGACA AGCTGGCGTTTGAGGCGGATCACATATCAATGGCTTCTATTCCTGGCATGTA TGAGAGGACCGTCACTATGAACTCCCTGGGGAAGACGTTCTCCTTGACCGG ATGGAAGATCGGCTGGGCGATAGCACCACCGCACCTGACATGGGGCGTAAG GCAGGCACACTCCTTCCTCACATTCGCCACCTCCACGCCGATGCAATCAGCA GCGGCGGCGGCCCTGAGAGCACCGGACAGCTACTTTGAGGAGCTGAAGAG GGACTACGGCGCAAAGAAAGCGCTGCTGGTGGACGGGCTCAAGGCGGCGG GCTTCATCGTCTACCCTTCGAGCGGAACCTACTTCATCATGGTCGACCACAC CCCGTTCGGGTTCGACAACGACGTCGAGTTCTGCGAGTACTTGATCCGCGA GGTCGGCGTCGTGGCCATCCCGCCAAGCGTGTTCTACCTGAACCCGGAGGA CGGGAAGAACCTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAAGGACGACGACACGCTAAG GGCGGCGGTGGACAGGATGAAGGCCAAGCTCAGGAAGAAATGA SEC ID NO: 10 Secuencia de aminoácido GPT de Cebada Secuencia traducida desde el sitio de inicio (intrón eliminado) MVDLRNRRTS ASAPASASAALSTAAPADNGAAKPTEQRPVQVAKRLEKFKTTI FTQMSMLAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKDAAIEAIKAGKNQYARGYGVPELN SAVAERFLKDSGLHIDPDKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEA TLSMAGANVKAITLRPPDFAVPLEELKAAVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFTREEL EFIADLCKENDVLLFADEVYDKLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLT GWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATSTPMQSAAAAALRAPDSYFEELKRDY GAKKALLVDGLKAAGFIVYPSSGTYFIMVDHTPFGFDNDVEFCEYLIREVGWAIP PSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVDRMKAKLRKK ' SEC ID NO: 11 Secuencia de ADN GPT de pez cebra Secuencia Danio rerio diseñada para expresión en E coli.

Los nucleótidos con letras negritas, y cursivas se agregaron para clonación o proceden del vector pET28b.

ArGTCCGTGGCGAAACGTCTGGAAAAATTTAAAACCACCATTTTTACCCAGAT GAGCATGCTGGCGATTAAACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCC G CTTTGATGGCCCGGATTTTGTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTCGT GATGGCAACAACCAGTATGCGCGTGGCTATGGCGTGCCGGATCTGAACATT GCGATTAGCGAACGTTATAAAAAAGATACCGGCCTGGCGGTGGATCCGGAA AAAGAAATTACCGTGACCAGCGGCTGCACCGAAGCGATTGCGGCGACCGTG CTGGGCCTGATTAACCCGGGCGATGAAGTGATTGTGTTTGCGCCGTTTTATG ATAGCTATGAAGCGACCCTGAGCATGGCGGGCGCGAAAGTGAAAGGCATTA CCCTGCGTCCGCCGGATTTTGCGCTGCCGATTGAAGAACTGAAAAGCACCA TTAGCAAAAACACCCGTGCGATTCTGCTGAACACCCCGCATAACCCGACCG GCAAAATGTTTACCCCGGAAGAACTGAACACCATTGCGAGCCTGTGCATTGA AAACGATGTGCTGGTGTTTAGCGATGAAGTGTATGATAAACTGGCGTTTGAT ATGGAACATATTAGCATTGCGAGCCTGCCGGGCATGTTTGAACGTACCGTGA CCATGAACAGCCTGGGCAAAACCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCT GGGCGATTGCGCCGCCGCATCTGACCTGGGGCGTGCGTCAGGCGCATGCG TTTCTGACCTTTGCAACCAGCAACCCGATGCAGTGGGCAGCAGCAGTGGCA CTGCGTGCACCGGATAGCTATTATACCGAACTGAAACGTGATTATATGGCGA AACGTAGCATTCTGGTGGAAGGCCTGAAAGCGGTGGGCTTTAAAGTGTTTCC GAGCAGCGGCACCTATTTTGTGGTGGTGGATCATACCCCGTTTGGCCATGAA AACGATATTGCGTTTTGCGAATATCTGGTGAAAGAAGTGGGCGTGGTGGCGA TTCCGACCAGCGTGTTTTATCTGAACCCGGAAGAAGGCAAAAACCTGGTGCG TTTTACCTTTTGCAAAGATGAAGGGACCCTGCGTGCGGCGGTGGATCGTATG AAAGAAAAACTGCGTAAAGrCGACAAGCrTGCGGCCGCACrCGAGCACCAC CACCACCACCACtGA SEC ID NO: 12 Secuencia de aminoácido GPT de pez cebra La secuencia de aminoácido de Danio rerio clonada y expresada en E. coli (aminoácidos en letras negritas y cursivas se agregan a partir del vector/clonación y la etiqueta His en el C-término) AÍSVAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIRDGN NQYARGYGVPDLNIAISERYKKDTGLAVDPEKEimSGCTEAlAATVLGUNPGD EVIVFAPFYDSYEATLS AGAKVKGITLRPPDFALPIEELKSTISKNTRAILLNTPH NPTGKMFTPEELNTIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFDMEHISIASLPGMFERTVT MNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHAFLTFATSNPMQWAAAVALRA PDSYYTELKRDYMAKRSILVEGLKÁVGFKVFPSSGTYFVWDHTPFGHENDIAFC EYLVKEVGWAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVDRMKEKLRKVD KLAAALEHHHHHH- SEC ID NO: 13 Secuencia de ADN de construcción-30 de GPT truncado de Arabidopsis GPT de Arabidopsis con 30 aminoácidos eliminados de la secuencia de dirección.

ATGGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCATGACCACAGTTTCGACTC AGAAGGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTT CAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGA TCMTTTAGGCC GGCTTTCCC TTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAA GCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACG GCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGG TCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAG CCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTC TTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAA AGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAG CTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGC ACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCAT CTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGATAAG CTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGA AAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGG AAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAA GCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCG TTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTA CAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACA GTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTG GAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGT CGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAAT TTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGC GTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA SEC ID NO: 14 Secuencia de Arabidopsis de construcción-30 de GPT truncado de aminoácido MAKIHRPIGATMTTVSTÜNESTQKPVQVÁKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLG QGFPNFDGPDFVKEAAÍQAIKDGKNQYARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLWDPE KEVT SGCTEAlAAAVILGLlNPGDEVILFAPFyDSYEATLSMAGAKVKGlTLRPP DFSIPLEELKAAVTNKTRAIL NTPHNPTGK FTREELETIASLCIENDVLVFSDEV YDKLAFE DHISIASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVR QAHSYLTFATSTPAQWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTV FPSSGTYFWADHTPFGMENDVAFCEYUEEVGWAIPTSVFYLNPEEGKNLVRF AFCKDEETLRGAIERMKQKLKRKV SEC ID NO: 15: Secuencia de ADN de construcción-45 de GPT truncado de Arabidopsis GPT de Arabidopsis con 45 residuos en la secuencia de dirección eliminada ATGGCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGA TTAGAG GTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAA ACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGAT TTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGC TCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGT GAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTG GTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGA TGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTAT GGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATC CCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTA TGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTG AAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAA GTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCC CGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTT TAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGG GAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACA ATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCT GAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAA GTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATC ACACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAA GAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAG AAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGCG TGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA SEC ID NO: 16: Secuencia de aminoácido de construcción-45 de GPT truncada de Arabidopsis MATQNESTQKPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVK EAAIQAIKDGKNQYARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLWDPEKEVTVTSGCTEAIA AAMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFSIPLEELKAAVT NKTRAIL NTPHNPTGKMFTREELETIASLGIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHISI ASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTP AQWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFWADH TPFGMENDVAFCEYLIÉEVGWAIPTSVFYLNPEÉGKNLVRFAFCKDEETLRGAI ER KQKLKRKV SEC ID NO: 17: Promotor de tomate Rubisco Secuencia promotora de TOMATO RuBisCo rbcS3C de Kpnl a Ncol G67/4CCGTTTGAATCCTCCTTAAAGTTTTTCTCTGGAGAAACTGTAGTAATTT TACTTTGTTGTGTTCCCTTCATCTTTTGAATTAATGGCATTTGTTTTAATACTAA TCTGCTTCTGAAACTTGTAATGTATGTATATCAGTTTCTTATAATTTATCCAAG TAATATCTTCCATTCTCTATGCAATTGCCTGCATAAGCTCGACAAAAGAGTAC ATCAACCCCTCCTCCTCTGGACTACTCTAGCTAAACTTGAATTTCCCCTTAAG ATTATGAAATTGATATATCCTTAACAAACGACTCCTTCTGTTGGAAAATGTAGT ACTTGTCTTTCTTCTTTTGGGTATATATAGTTTATATACACCATACTATGTACA ACATCCAAGTAGAGTGAAATGGATACATGTACAAGACTTATTTGATTGATTGA TGACTTGAGTTGCCTTAGGAGTAACAAATTCTTAGGTCAATAAATCGTTGATT TGAAATTAATCTCTCTGTCTTAGACAGATAGGAATTATGACTTCCAATGGTCC AGAAAGCAAAGTTCGCACTGAGGGTATACTTGGAATTGAGACTTGCACAGGT CCAGAAACCAAAGTTCCCATCGAGCTCTAAAATCACATCTTTGGAATGAAATT CAATTAGAGATAAGTTGCTTCATAGCATAGGTAAAATGGAAGATGTGAAGTAA CCTGCAATAATCAGTGAAATGACATTAATACACTAAATACTTCATATGTAATTA TCCTTTCCAGGTTAACAATACTCTATAAAGTAAGAATTATCAGAAATGGGCTC ATCAAACTTTTGTACTATGTATTTCATATAAGGAAGTATAACTATACATAAGTG TATACACAACTTTATTCCTATTTTGTAAAGGTGGAGAGACTGTTTTCGATGGA TCTAAAGCAATATGTCTATAAAATGCATTGATATAATAATTATCTGAGAAAATC CAGAATTGGCGTTGGATTATTTCAGCCAAATAGAAGTTTGTACCATACTTGTT GATTCCTTCTAAGTTAAGGTGAAGTATCATTCATAAACAGTTTTCCCCAAAGT ACTACTCACCAAGTTTCCCTTTGTAGAATTAACAGTTCAAATATATGGCGCAG AAATTACTCTATGCCCAAAACCAAACGAGAAAGAAACAAAATACAGGGGTTG CAGACTTTATTTTCGTGTTAGGGTGTGTTTTTTCATGTAATTAATCAAAAAATA TTATGACAAAAACATTTATACATATTTTTACTCAACACTCTGGGTATCAGGGTG GGTTGTGTTCGACAATCAATATGGAAAGGAAGTATTTTCCTTATTTTTTTAGTT AATATTTTCAGTTATACCAAACATACCTTGTGATATTATTTTTAAAAATGAAAAA CTCGTCAGAAAGAAAAAGCAAAAGCAACAAAAAAATTGCAAGTATTTTTTAAA AAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGA CGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCA CAAAATCCAATGGTTAGCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGT CCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACCTCT TAGTAACCAATTATTTCAGCACCA TGG S EC I D N O : 1 8 : Secuencia de AD N G PT de Ba m b ú I n se rta r secue n ci a 1 pág i n a 59 ATGGCCTCCGCGGCCGTCTCCACCGTCGCCACCGCCGCCGACGGCGTCGC GAAGCCGACGGAGAAGCAGCCGGTACAGGTCGCAAAGCGTTTGGAAAAGTT TAAGACAACAATTTTCACACAGATGAGCATGCTTGCCATCAAGCATGGAGCA ATAAACCTCGGCCAGGGCTTTCCGAATTTTGATGGCCCTGACTTTGTGAAAG AAGCTGCTATTCAAGCTATCAATGCTGGGAAGAATCAGTATGCAAGAGGATA TGGTGTGCCTGAACTGAACTCGGCTGTTGCTGAAAGGTTCCTGAAGGACAGT GGCTTGCAAGTCGATCCCGAGAAGGAAGTTACTGTCACATCTGGGTGCACG GAAGCGATAGCTGCAACGATATTGGGTCTTATCAACCCTGGCGATGAAGTGA TCTTGTTTGCTCCATTCTATGATTCATACGAGGCTACGCTGTCGATGGCTGGT GCCAATGTAAAAGCCATTACTCTCCGTCCTCCAGATTTTGCAGTCCCTCTTGA GGAGCTAAAGGCCACAGTCTCTAAGAACACCAGAGCGATAATGATAAACACA CCACACAATCCTACTGGGAAAATGTTTTCTAGGGAAGAACTTGAATTCATTGC TACTCTCTGCMGAAAAATGATGTGTTGCTTTTTGCTGATGAGGTCTATGACA AGTTGGCATTTGAGGCAGATCATATATCAATGGCTTCTATTCCTGGCATGTAT GAGAGGACTGTGACTATGAACTCTCTGGGGAAGACATTCTCTCTAACAGGAT GGAAGATCGGTTGGGCAATAGCACCACCACACCTGACATGGGGTGTAAGGC AGGCACACTCATTCCTCACATTTGCCACCTGGACACCAATGCAATCGGCGGC GGCGGCGGCTCTTAGAGCACCAGATAGCTACTATGGGGAGCTGAAGAGGGA TTACGGTGCAAAGAAAGCGATACTAGTCGACGGACTCAAGGCTGCAGGTTTT ATTGTTTACCCTTCAAGTGGAACATACTTTGTCATGGTCGATCACACCCCGTT TGGTTTCGACAATGATATTGAGTTCTGCGAGTATTTGATCCGCGAAGTCGGT GTTGTCGCCATACCACCAAGCGTATTTTATCTCAACCCTGAGGATGGGAAGA ACTTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAAGGATGATGATACGCTGAGAGCCGCAGT TGAGAGGATGAAGACAAAGCTCAGGAAAAAATGA S EC I D N O : 1 9 : Secuencia de a mi n oácid o G PT de Ba m bú Insertar secuencia 2 página 59 MASAAVSTVATAADÓVAKPTEKQPVQVAKRLEKFKTTIFTQMS LAIKHGAINLG QGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQYARGYGVPELNSAVAERFLKDSGLQVDF EKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPP DFAVPLEELKATVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFSREELEFIATLCKKNDVLLFADE DKLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGV RQAHSFLTFATCTPMQSÁAAAALRAPDSYYGÉLKRDYGAKKAILVDGLKAAGFIV YPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDIEFCEYLIREVGWAIPPSVFYLNPEDGKNLVRF TFCKDDDTLRAAVERMKTKLRKK SEC ID NO: 20: promotor 1305.1 +rbcS3C + intrón catl con el gen GPT de arroz.

Cambial 305.1 con (extremo 3' de) rbcS3C + arroz GPT. El ATG subrayado es el sitio de inicio, los paréntesis son el intrón catl y el actagt subrayado es el sitio de clonación spel utilizado para dividir el gen de arroz.

AAAAAAGAAAAAAAAMCATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAA GGACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAA CCACAAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTT TGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACC TCTTAGTMCC TTATTTCAGCACCA7¾GTAGATCTGAGG(GTAMTTTCTAG TTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTA I I I I I I IGAGC TTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTAI mi IAATTGATTGGTTATGGTGTAAATA TTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGAT GATGATAGTTACAG) CCGACGAACRAGIATGAATCTGGCCGGCTTTCTCG CCACGCCCGCGACCGCGACCGCGACGCGGCATGAGATGCCGTTAAATCCC TCCTCCTCCGCCTCCTTCCTCCTCTCCTCGCTCCGCCGCTCGCTCGTCGCGT CGCTCCGGAAGGCCTCGCCGGCGGCGGCCGCGGCGCTCTCCCCCATGGC CTCCGCGTCCACCGTCGCCGCCGAGAACGGCGCCGCCAAGGCGGCGGCG GAGAAGCAGCAGCAGCAGCCTGTGCAGGTTGCAAAGCGGTTGGAAAAGTTT AAGACGACCATTTTCACACAGATGAGTATGCTTGCCATCAAGCATGGAGCAA TAAACCTTGGCCAGGGTTTTCCGAATTTCGATGGCCCTGACTTTGTAAAAGA GGCTGCTATTCAAGCTATCAATGCTGGGAAGAATCAGTACGCAAGAGGATAT GGTGTGCCTGAACTGAACTCAGCTATTGCTGAAAGATTCCTGAAGGACAGCG GACTGCAAGTCGATCCGGAGAAGGAAGTTACTGTCACATCTGGATGCACAG AAGCTATAGCTGCAACAATTTTAGGTCTAATTAATCCAGGCGATGAAGTGATA TTGTTTGCTCCATTCTATGATTCATATGAGGCTACCCTGTCAATGGCTGGTGC CAACGTAAAAGCCATTACTCTCCGTCCTCCAGATTTTTCAGTCCCTCTTGAAG AGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAAGAACACCAGAGCTATTATGATAAACACCCC GCACAATCCTACTGGGAAAATGTTTACAAGGGAAGAACTTGAGTTTATTGCC ACTCTCTGCAAGGAAAATGATGTGCTGCTTTTTGCTGATGAGGTCTACGACA AGTTAGCTTTTGAGGCAGATCATATATCAATGGCTTCTATTCCTGGCATGTAT GAGAGGACCGTGACCATGAACTCTCTTGGGAAGACATTCTCTCTTACAGGAT GGAAGATCGGTTGGGCAATCGCACCGCCACACCTGACATGGGGTGTAAGGC AGGCACACTCATTCCTCACGTTTGCGACCTGCACACCAATGCAAGCAGCTGC AGCTGCAGCTCTGAGAGCACCAGATAGCTACTATGAGGAACTGAGGAGGGA TTATGGAGCTAAGAAGGCATTGCTAGTCAACGGACTCAAGGATGCAGGTTTC ATTGTCTATCCTTCAAGTGGAACATACTTCGTCATGGTCGACCACACCCCATT TGGTTTCGACAATGATATTGAGTTCTGCGAGTATTTGATTCGCGAAGTCGGT GTTGTCGCCATACCACCTAGTGTATTTTATCTCAACCCTGAGGATGGGAAGA ACTTGGTGAGGTTCACCTTTTGCAAGGATGATGAGACGCTGAGAGCCGCGG TTGAGAGGATGAAGACAAAGCTCAGGAAAAAATGA SEC ID NO: 21: SECUENCIA GPT DE HORDEUM EN VECTOR Cambial 305.1 CON (extremo 3' de) rbcS3C + hordeum IDI4. El ATG subrayado es el sitio de inicio, los paréntesis son el intrón catl y el actagt subrayado es el sitio de clonación spel utilizado para dividir el gen de hordeum.

AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAA GGACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAA CCACAAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTT TGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACC TCTTAGTAACCAATTATTTCAGCACCATGGTAGATCTGAGG(GTAAATTTCTAG TTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTA I I I I I I IGAGC TTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATA TTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGAT GATGATAGTTACAG)AACCGACGA£C7*GTATGGCATCCGCCCCCGCCTCCG CCTCCGCGGCCCTCTCCACCGCCGCCCCCGCCGACAACGGGGCCGCCAAG CCCACGGAGCAGCGGCCGGTACAGGTGGCTAAGCGATTGGAGAAGTTCAAA ACAACAATTTTCACACAGATGAGCATGCTCGCAGTGAAGCATGGAGCAATAA ACCTTGGACAGGGGTTTCCCAATTTTGATGGCCCTGACTTTGTCAAAGATGC TGCTATTGAGGCTATCAAAGCTGGAAAGAATCAGTATGCAAGAGGATATGGT GTGCCTGAATTGAACTCAGCTGTTGCTGAGAGATTTCTCAAGGACAGTGGAT TGCACATCGATCCTGATAAGGAAGTTACTGTTACATCTGGGTGCACAGAAGC AATAGCTGCAACGATATTGGGTCTGATCAACCCTGGGGATGAAGTCATACTG TTTGCTCCATTCTATGATTCTTATGAGGCTACACTGTCCATGGCTGGTGCGAA TGTCAAAGCCATTACACTCCGCCCTCCGGACTTTGCAGTCCCTCTTGAAGAG CTAAAGGCTGCAGTCTCGAAGAATACCAGAGCAATAATGATTAATACACCTC ACAACCCTACCGGGAAAATGTTCACAAGGGAGGAACTTGAGTTCATTGCTGA TCTCTGCAAGGAAAATGACGTGTTGCTCTTTGCCGATGAGGTCTACGACAAG CTGGCGTTTGAGGCGGATCACATATCAATGGCTTCTATTCCTGGCATGTATG AGAGGACCGTCACTATGAACTCCCTGGGGAAGACGTTCTCCTTGACCGGAT GGAAGATCGGCTGGGCGATAGCACCACCGCACCTGACATGGGGCGTAAGG CAGGCACACTCCTTCCTCACATTCGCCACCTCCACGCCGATGCAATCAGCAG CGGCGGCGGCCCTGAGAGCACCGGACAGCTACTTTGAGGAGCTGAAGAGG GACTACGGCGCAAAGAAAGCGCTGCTGGTGGACGGGCTCAAGGCGGCGGG CTTCATCGTCTACCCTTCGAGCGGAACCTACTTCATCATGGTCGACCACACC CCGTTCGGGTTCGACAACGACGTCGAGTTCTGCGAGTACTTGATCCGCGAG GTCGGCGTCGTGGCCATCCCGCCAAGCGTGTTCTACCTGAACCCGGAGGAC GGGAAGAACCTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAAGGACGACGACACGCTAAGG GCGGCGGTGGACAGGATGAAGGCCAAGCTCAGGAAGAAATGATTGAGGGG 5 CGCACGTGTGA S E C I D N O : 22 C a m b i a 1 20 1 + secu e n ci a G PT de Ara b i d o ps i s ( p ro m oto r 35 S d e C a M V e n cu rsi vas ) CA TGGAGTCAAAGA TTCAAATAGAGGAGCTAACAGAACTCGCCG TAAAGACT GGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCT TCG TCAA CA TG GTGGAG CA CGA CA CA C 7TG TC TA C TCCAAA AA TA TCAAA GA TACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATA 10 TCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAA GA TAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAA TGCCATCA TTGCGA TAAAGGA AAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCC CCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCA AAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAAT CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTG GAGAGA CACGGGGGACrCTTGACCATGTACCTGGACATAAATGGTGTGAT GATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTCTCTTCTCCCATTCTCTTCTAATTTCC GACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCATGACCACAGT TTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTA ? ? GAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACA 1 TGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTT GTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTC GTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGA AGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTT GCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGA AGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGG · CTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCC TTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATG AACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAA 20 ACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGT ATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCG GTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTA ACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGA GTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACAAT GGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGA AAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGT CGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCAC ACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGA AGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAA 9(- GGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGCGTG ¿0 GTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA SEC ID NO: 23 Cambia p1305.1 con (extremo 3' de) rbcS3C+Arabidopsis GPT. ATG es el sitio de inicio, los paréntesis son el intrón catl y el actagt subrayado es el sitio de clonación spel utilizado para dividir el gen de Arabidopsis.

AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAA GGACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAA CCACAAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTT TGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACC TCTTAGTAACCAA1TATTTCAGCACC4TGGTAGATCTGAGG(GTAAATTTCTAG I I 11 I CTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTA I I I I I I IGAGC TTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTA 11 I I I I AATTGATTGGTTATGGTGTAAATA TTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGAT GATGATAGTTACAG)AACCGACGAACr/GTATGTACCTGGACATAAATGGTGT GATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTCTCTTCTCCCATTCTCTTCTAATTT CCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCATGACCACA GTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGAT TAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAA CATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATT TTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCT CGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTG AAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGT TGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGG†GATG AAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATG GCTGGTGCTAAAGTAAÁAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCC CTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTAT GAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGA AACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAG TATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCC GGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTT AACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGG AGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACAA TGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTG AAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAG TCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCA CACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAG AAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGA AGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGCGT GGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA SEC ID NO: 24 Secuencia de codificación GPT Arabidopsis (proteína madura, sin secuencia de dirección) GTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCAT ATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTC GACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTA AAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGC TGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTT ACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAA TAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAA GCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCAC CGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGAC TCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACT AGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTG TGTTCTCGGATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCT ATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGG GAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGC CTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCAC ATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTC TTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTAGAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTA AGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTT TGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGT GAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTT ATCTGMTCCAG G GGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGA CGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAG AAAAGTCTGA SEC ID NO: 25 Secuencia de aminoácido GPT Arabidopsis (proteína madura, sin secuencia de dirección) VAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIKDGKNQY ARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLWDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDEVI LFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFSIPLEÉLKAAVTNKTRAILMNTPHNP TGKMFTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHISIASLPG YERTVTMN SLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALKAPES YFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFWADHTPFGMENDVAFCEY LIEEVGWAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIER KQKLKRKV SEC ID NO: 26 Secuencia de aminoácido GPT de uva (proteína madura, sin secuencia de dirección) VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAIKDGKNQY ARGYGyPDLNSAVADRFKKDTGLWDPEKEVTVTSGCTEAlAATMLGLINPGDE VILFAPFYDSYEATLS AGAQIKSITLRPPDFAVP DELKSAISKNTRAILINTPHN PTGKMFTREELNVIASLCIENDVLVFTDEVYDKLAFEMDHISMASLPG YERTVT NSLGKTFSLTGWKIGWTVAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTPMQWAAATALRA PDSYYEELKRDYSAKKAILVEGLKAVGFRVYPSSGTYFVWDHTPFGLKDDIAFC EYLIKEVGWAIPTSVFYLHPEDGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVERMKEKLKPKQ SEC ID NO: 27 Secuencia de aminoácido GPT de arroz (proteína madura, sin secuencia de dirección) VAKRLEKFKTTIFTQMS LAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQ YARGYGVPELNSAIAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEV ILFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFSVPLEELKAAVSKNTRAIMINTPHN PTGK FTREELEFIATLCKENDVLLFADEVYDKLAFEADHISMASIPGMYERTVT MNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTPMQAAAAAALRAP DSYYEELRRDYGA KALLVNGLKDAGFIVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDIEFC EYLIREVGWAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDETLRAAVERMKTKLRKK SEC ID NO: 28 Secuencia de aminoácido GPT de frijol soya (proteína madura-1, sin secuencia de dirección) AKRLEKFQTTIFTQMSLLAIKHGAINLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAIRDGKNQYA RGYGVPDLNIAIAERFKKDTGLWDPEKEITVTSGCTEAIAATMIGLINPGDEVI F APFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFAVPLEELKSTISKNTRAILINTPHNPTG KMFTREELNCIASLCIENDVLVFTDEVYDKLAFDMEHISMASLPG FERTVTLNS LGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLSWGVRQAHAFLTFATAHPFQCAAAAALRAPDSY YVELKRDYMAKRAILIEGLKAVGFKVFPSSGTYFVWDHTPFGLENDVAFCEYLV KEVGWAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEETIRSAVERMKAKLRKVD SEC ID NO: 29 Secuencia de aminoácido GPT de Cebada (proteína madura, sin secuencia de dirección) VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKDAAIEAIKAGKNQ YARGYGVPELNSAVAERFLKDSGLHIDPDKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEV ILFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFAVPLEELKAAVSKNTRAIMINTPHN PTGKMFTREELEFIADLCKENDVLLFADEVYDKLAFEADHISMASIPGMYERTVT NSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATSTPMQSAAAAALRAP DSYFEELKRDYGAKKALLVDGLKAAGFIVYPSSGTYFIMVDHTPFGFDNDVEFCE YLIREVGWAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVDRMKAKLRKK SEC ID NO: 30 Secuencia de aminoácido GPT de pez cebra (proteína madura, sin secuencia de dirección) VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIRDGNNQ YARGYGVPDLNIAISERYKKDTGLAVDPEKEITVTSGCTEAIAATVLGLINPGDEVI VFAPFYDSYEATLS AGAKVKGITLRPPDFALPIEELKSTISKNTRAILLNTPHNPT GKMFTPEELNTIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFDMEHiSIASLPGMFERTVTMNS LGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHAFLTFATSNPMQWAAAVALRAPDS YYTELKRDY AKRSILVEGLKAVGFKVFPSSGTYFVWDHTPFGHENDIAFCEYL VKEVGWAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVDRMKEKLRK SEC ID NO: 31 Secuencia de aminoácido GPT de bambú (proteína madura, sin secuencia de dirección) VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQ YARGYGVPELNSAVAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDE VILFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFAVPLEELKATVSKNTRAIMINTPH NPTG MFSREELEFIATLCKKNDVLLFADEVYDKLAFEADHISMASIPGMYERTV TMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTPMQSAAAAALRA PDSYYGELKRDYGAKKAILVDGLKAAGFIVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDIEFC EYLIREVGWAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVERMKTKLRKK

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Una planta transgénica que comprende un transgen GPT enlazado en forma operable a un promotor de planta.

2. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el transgen GPT codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en (a) SEC ID NO: 2; SEC ID NO: 9; SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21 , SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34, SEC ID NO: 35 y SEC ID NO: 36, y (b) una secuencia de aminoácido que es al menos el 75% idéntica a cualesquiera de las SEC ID NO: 2; SEC ID NO: 9; SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21 , SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34, SEC ID NO: 35 y SEC ID NO: 36, y tiene actividad GPT.

3. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el transgen GPT se incorpora en el genoma de la planta.

4. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque se define en forma adicional como una planta monocotiledónea.

5. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque se define en forma adicional como una planta dicotiledónea.

6. Una progenie de cualquier generación de las plantas transgénicas tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque la progenie comprende el transgen GPT.

7. Una semilla de cualquier generación de la planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque la semilla comprende un transgen GPT.

8. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque muestra un rango de crecimiento mejorado cuando se compara con una planta no transformada o tipo silvestre análoga.

9. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque muestra un rendimiento de biomasa incrementado cuando se compara con una planta no transformada de tipo silvestre, análoga.

10. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque despliega un rendimiento de semilla incrementado cuando se compara con una planta no transformada o tipo silvestre, análoga.

11. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque muestra un rendimiento de flor o botón de flor incrementado cuando se compara con una planta no transformada o tipo silvestre, análoga.

12. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque muestra un rendimiento de fruto o vaina incrementado, cuando se compara con una planta no transformada o tipo silvestre, análoga.

13. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque muestra hojas más grandes cuando se compara con una planta no transformada o tipo silvestre, análoga.

14. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque muestra actividad GPT incrementada cuando se compara con una planta no transformada o tipo silvestre, análoga.

15. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque muestra actividad GS incrementada cuando se compara con una planta no transformada o tipo silvestre, análoga.

16. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque muestra niveles de 2-oxoglutaramato incrementados cuando se compara con una planta no transformada o tipo silvestre, análoga.

17. La planta transgénica tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque muestra una eficiencia en el uso de nitrógeno incrementada, cuando se compara con una planta no transformada o tipo silvestre, análoga.

18. Un método para producir una planta que tiene propiedades de crecimiento mejoradas relativas a una planta no transformada o tipo silvestre, análoga, en donde el método comprende: (a) introducir y expresar un transgen GPT en la planta; y (b) seleccionar una planta que tiene una característica de crecimiento incrementada relativa a una planta de la misma especie que no comprende un transgen GPT.

19. El método tal como se describe en la reivindicación 18, caracterizado porque la característica de crecimiento incrementada se seleccionada del grupo que consiste en una biomasa incrementada, florecimiento más temprano, generación de botón más temprano, altura de la planta incrementada, florecimiento incrementada, generación de botón incrementada, hojas más grandes, rendimiento de fruta o vaina incrementado y rendimiento de semilla incrementado.

20. Un método para producir una planta que tiene una eficiencia de uso de nitrógeno incrementada, en forma relativa a una planta no transformada o tipo silvestre análoga, en donde el método comprende: (a) introducir y expresar un transgen GPT en la planta; (b) seleccionar una planta que tiene una eficiencia del uso de nitrógeno incrementada en forma relativa a una planta de la misma especie que no comprende un transgen GPT.

21. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones 18, 19 ó 20, caracterizado porque comprende además propagar una planta de la semilla seleccionada, y recolectar una semilla de la misma.