JPS63160588A - 植物プロトプラストの形質転換改良法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は簡単で純粋に化学的な工程を使って植物プロト
プラストを形質転換するための改良法およびその方法に
よって得られた植物材料に関する。

新しい遺伝情報を植物材料に導入して新規および／′ま
たけ改良された性質を持つ植物をつくることが可能であ
る。世界の人口の急速な増加とそれに伴う食物および原
材料の増大なる要求という観点から有用植物の生産ｔを
増加させ、また植物成分からの抽出を増加させること、
特に食物および医薬分野において進歩させることが生物
学的研究において最も急を要する仕事である。したがっ
て、例えば次のような事を本質的な方向として挙げるべ
きである。すなわち、有用植物について、好ましくない
土壌条件または気候条件に対する耐性、病気および害虫
に対する耐性を高め、殺虫剤、除草剤、殺菌剤のような
植物保饅剤に対する耐性を高めて、また植物の栄養成分
または収率を有利なように変えることである。このよう
な望ましい効果は一般に′保護物質、有用タンパク質ま
たは毒素を導入またはその生成を増加させることによっ
て実現できる。植物の遺伝型に目的に応じて影−ｉ！Ｊ
ｌを与えることは、例えば、従来の植物育捌技術を使わ
ずに、外部の遺伝子を制御された条件下において植物細
胞中に導入するＣとによって行うことができる。

本発明においては、以下のような定Ａを適用する。

植物材料：生きた植物それ自体または培％したものの部
分、中でも、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、胚
、植物器官、芽、種子のような部分、および全植物体 遺伝子二元現信号を側方に持つ構造遺伝子構造遺伝子：
タンパク質をコードしたＤＮＡ配列発現信号：プロモー
ター信号およびターミネータ−信号 植物−活性発現信号：植物において機能可能な発現信号 プロモーター信号：転写を開始する信号ターミネータ−
信号：転写を終了する信号エンハンサ−信号：転写を活
発にする信号複製信号：　ＤＮＡ複裏を可能にする信号
インテグレーシ１ノ信号：遺伝子をゲノムＤＮＡに組込
むことを行うＤＮＡ配列 雑種ＤＮＡ　：異種のＤＮＡから構築された遺伝子、す
なわち、異った超厚のＤＮＡ配列からのもので、それは
天然ＤＮＡ配列、ｃ−ＤＮＡ配列または合成ＤＮＡ配列
のＤＮＡ配列であってよい。

支持ＤＮＡ　：遺伝子の側方にある中性ＤＮＡ、すなわ
ち、遺伝子の機能に関与しないＤＮＡ配列 キャリアーＤＮＡ　：形質転換遺伝子以外の中性ＤＮＡ
で、ヌクレアーゼから形質転換遺伝子を保護するために
形質転換遺伝子とまじっている。

分離遺伝子：元来のＤＮＡから分離されたＤＮＡ配列で
単一タンパク質をコードしている。

ＮＰＴ−１遺伝子：　ネオマイシン−３′−ホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、トランスボノンＴｎ５の［Ｗ（
１）ロススタイン、ニス、ジェイ。

及ヒタクリエー、ニス、レズニコフ、セル２３巻、１９
１−１９９頁、１９８１年　Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ。

Ｓ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｗ、Ｓ、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ、　Ｃ
ｅ１ｌ　２３　、１９１−１９９、（１９８１）） ゲノムＤＮＡ　：植物ゲノム（すべてまたはそのタンパ
ク質の）のＤＮＡ ｃ−ＤＮＡ：　　リバーストランスクリプターゼによっ
てつくられたｍ−几ＮＡのコピー 遺伝学的に操作した植物細菌を使って植物細胞中にＤＮ
Ａ配列を入れることは、この分野の文献における刊行物
から公知である。例えば、２）ネイチャー３０５巻、２
（１１）−２１３頁、１９８３年Ｎａｔｕｒｅ　ｖｏｌ
、　５０３　、２（１１）−２１３　（１９８３）　：
Ｓ）ネイチャー３０４巻、１８４−１８７頁、１９８３
年Ｎａｔｕｒｅ　ｖｏｌ、３０４　、１８４−１８７（
１９８３）　；４）サイエンティフィック　アメリカン
　２４８巻６号５Ｏ−５９Ｊｉ、　１９８５年Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ　　２土ｌΩユ、５Ｏ−
５９（１９８３）；５）イーエムビーオー　ジャーナル
２巻６号、９８７−９９５頁、１９Ｂ３年ＥＭＢＯＴｏ
ｕｒｎａｌ　　２（６）９８７−９９５（１９８３）；
　６）サイエンス　２２２巻、４７６−４８２頁１９８
３年５ｃｉｅｎｃｅ　２２２　。

４７６−４８２（１９８５）：　７）ｔイエンス２２３
巻４９６−４９８頁１９８４年５ｃｉｅｎｃｅ　２２３
．４９６−４９８（１９８４）：または８）グロシーデ
ングスオブザ　ナショナル　アカデミ−オプ　丈イエン
シズ　オプ　ザ　ユナイテッド　ステイッオブ　アメリ
カ　８０巻、４８０！ｌ−４８（３７頁、１９Ｂ５年Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０　
。

４８０３−４８（３７（１９８３）である。ここに記載
されている方法においては、これらの細菌の天然の植物
感染性を利用して新しい遺伝材料を植物細胞に挿入して
いる。これまで例えばアグロバクテリウム　テユメファ
シエンス　Ａｇｒｏｂａ−ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓまたはそのＴｉ−プラスミドまたはカリフ
ラワー　モザイク　ウィルスのような植物明原体が特に
この目的のベクターとして使用されてきた。

最近開発された方法によシ、今や生物学的ベクターを使
用せずに遺伝子を植物細胞に百妾挿入することが可能と
なった〔９）ボトリカス、アイ、等プラント　モレキュ
ラーバイオロジーレポート　５巻１１７１２８頁、１９
８５年Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、　Ｉ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｌ
ａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐ、　　ｓ　
。

１１７−１２８（１９８５）：　１０）シリト、アール
。

ディー、等バイオ／テクノロジー５巻　１（１１）９−
１１０３頁、１９８５年Ｓｈ目１ｉｔｏ、　Ｒ，０，ｅ
ｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３．１（１１）９−１
１０３（１９８５）　）。

これらの方法は「直接遺伝子転移」というキャッチフレ
ーズで知られ、例えば植物病原１ｊ４ＪＪ菌、ウィルス
、昆虫またはカビのような植物感染系を使用せずに植物
細胞のベクターなしの形質転換を行うことができる。

したがって、病原体の宿主持具性によるすべての制限は
もはやない。形質転換ｓｍ　Ｈ’ｒからの植物の発育は
新しい植物細胞形質転換法の使用によシ障害を受けない
。

遺伝子形質転換を行う際の主な問題のひとつは形質転換
した細胞または組織を同定する時の困難さである。

遺伝子形質転換工程における形質転換頻度が低ければ低
いほど、莫大な数の形質転換されていないクローンの中
から形質転換された細胞に由来する数少い細胞クローン
を見い出すことは一層困難で複雑になる。そのため、も
し遺伝子が選択的マーカー機能（例えば特別な物質への
耐性）を持ったものでなければ、形質転換頻度が低いと
一般のスクリーニング法を使うことはほとんど、まだは
全く不可能である。したがって、選択できるマーカー機
能を持たない遺伝子の場合に低形質転換頻度であると多
大の費用を要する。

マーカー機能を持たない遺伝子の形質転換では、それ故
に、形質転換細胞クローンを選択する従来のスクリーニ
ング法は形質転換頻度が１０　乃至１０−２オーダーの
場合にかぎって効果的に利用できて成功する。現在の所
、このように高い形質転換率はエレクトロポレーション
、おそらくは微生物研究で使用される遺伝子転換の他の
方法と組合せてのみ実現できる。例えばポリーＬ−オル
ニチンまたはポリーＬ−リジン処理、リポリーム融合、
ＤＮＡ−タンパク複合体化、プロトプラスト膜上の電荷
修飾、微生物プロトプラストとの融合またはリン酸カル
シウム共沈殿、および特にポリエチレングリコール処理
および熱処理法との組合せである〔１０）シリト等バイ
オ／テクノロジー３巻１（１１）９−１１０３頁、１９
８５年８ｈｉｌｌｉｔｏ　ｏｔ　ａｌ、　Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｂｎｏｌｏｇｙ５．１（１１）９−１１０３（１９８
５））。比較してみると、純粋に化学的方法を使用した
場合、現在までの所１０−ｓオーダーまでの形質転換率
を再現性よく実現できるのみである。

エレクトロポレーションにおいては（ノイマン、イー、
等　　ザ　イーエムビーオージャーナル　７巻８４１−
８４５頁、１９８２年、Ｎｅｕｍａｎ　。

Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　
７．８４１−８４５（１９８２）、’σ）シリト等　バ
イオテクノロジ−５巻、１９８５年５ｈｉｌｌｉｔｏ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ　５
　、　（１９８５）　〕、　７７　＝　）　−ｋ　／カ
ル’／　＋：７ムまたはマンニトール／マグネシウム溶
液中のプロトプラストを、懸濁液を挾んで蓄電気を放電
させることにより高強度の電圧パルスに短時間作用させ
る。これによりプロトプラスト膜の分極が起り、膜に可
逆的開孔を生じ、ＤＮＡの？ｅＩ胞への移入を可能にす
る。しかしながら、この方法には多くの不利な点があり
、使用に制限がある。

第一に、エレクトロポレーションによシ形質転換を行う
には、比較的複雑な装置が必要で、これにはそれ相応の
コストと相応の手間がかかる。第二に、植物プロトプラ
ストの高度の感受性のために、この方法は非常に狭い限
られた範囲でのみ可能である。形質転換細胞の生存率を
確保するだめにも、いくつかのパラメーター、例えば′
直圧、容量および場の強Ｖ唾は狭い範囲内でのみ調節可
能である（例えば１４（１０）乃至１７（１０）Ｖの電
圧範囲）（１０）シリト、アール。

ディー、等バイオ／テクノロジー３巻、１９８５年５ｈ
ｉｌｌｉｔｏ、　Ｒ，Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５　。

（１９８５））。

これらの不利な点は驚くべきことに本発明の方法に含ま
れる簡単で純粋に化学的方法の工程により克服できる。

ＤＮＡを取り植物ｍ泡中に組み込むことの原理について
の本発明の範囲内で行われた研究により、形質転換過程
はたがいに影響し合う多くのパラメーターに依存してい
ることが明らかになった。これらの研究に基づいて、形
質１１こ関係のあるパラメーターを変化させ、最適に調
整することによシ、公知の方法に比較して形質転換頻度
を有意に高め、最初に述べた１０　乃至１０−２以上の
望ましい形質転換率を容易に実現できるようになった。

純粋に化学的手段に基づく本発明の方法により、形質転
換頻度のみならず、驚くべきことに再現性および処理プ
ロトプラストの生存率を有意に高めることが可能となっ
た。

現在までの所、純粋に化学的方法によって得られる最高
の形質転換頻度は１０”の近辺にあったが、本発明の方
法を用い、エレクトロポレーションの場合に比較して数
パーセントまでのオーダーの再現性ある形質転換頻度を
実現できるようになった。

エレクトロポレーションに対し、本発明の改良法は装置
に特別の支出がな〈実施できる方法であり、より有利な
価格となシ、よシ少い労働集約性となる。エレクトロポ
レーションを要求する方法と比較して更に有利な点は、
同時に大量の植物プロトプラストを形質転換し得る新た
な可能性があることである。

本発明の方法を使用すれば、処理細胞の生存率に関して
エレクトロポレーション法でこれまで述べてきた制約に
比較して何等の制約もされない。

本発明の形質転換におけるパラメーターを決定する際に
は広い範囲で変化させることができ、形質転換効率や、
この範囲内における処理プロトプラストの生存率に悪影
響を与えることはない。

その上、本発明の方法を使った形質転換後では、形質転
換をエレクトロポレーションで行った場合より、処理プ
ロトプラストの生存率および分裂性に関してはるかに異
質性が低Ａことが証明されている。本発明の方法を使用
した場合、例えば処理プロトプラストの生存率８０％以
上を容易に実現でき、同時にその分裂能、したがって新
しいコロニーを形成する能力も保持されてｂる。エレク
トロポレーションを使った場合には、これに対して生存
率に関する値は約１０壬にすぎない。

期待に反して、プロトプラストへの直接遺伝子組込みに
おける形質転換頻度は多くのパラメーターにより、個々
にまたは組合さって影４＃金蔓けることがわかり、これ
らのパラメーターまたは手段の２．３のもののみを正し
く選択するか、組合せることにより技術的にも時間的に
も労力少くして最適の形質転換率を実現できることがわ
かった。下記のパラメーターが本質的であることが証明
されている。

１）ＤＮＡ−試料：形状、大きさ、濃度、適用時間２）
キャリアーＤＮＡ：形状、濃度、大きさ３）　ＭｇＺ”
　　　　　：濃度、適用時間４）原形質膜変性剤：濃度
、適用時間 本発明の方法に不可欠の因子について、形質転換効率を
高めるのに決定的であるＭｇ計濃度と原形質膜変性剤濃
度が特に重要である。これらの２因子間に相乗的相互作
用が与られ、その結果、形質転換効率の顕著な上昇とな
る。

更にＭｇ２＋イオン、変性剤および形質転換ＤＮＡ適用
の時間および順序も重要である。

植物プロトプラストへの直接遺伝子組込み法、究局的に
遺伝学的に変性された植物をつくり出す方法で決定的な
改良と簡略化は本発明に不可欠な下記の工程により実現
できるニ ー　植物材料からのプロトプラストの分離およ。

び、必要に応じて分離したプロトプラストの好適な栄養
培地における培養 −分離プロトプラストの標準塩溶液への再懸濁 −塩溶液からＭｇ　２＋イオンを含む形質転換に最適化
した培養培地への分離プロトプラストの移し換え −挿入されるべきＤＮＡと原形質膜変性剤の添加 −原形質膜変性剤存在下にＤＮＡが１０ドプラスト中に
侵入するに十分な時間、ＤＮＡとプロトプラストを保持 −培地からの処理プロトプラストの分離および、必要に
応じてこれのＣａＣ１，水溶液へノ再懸濁 −ＣａＣｌ２９ｉからのプロトプラストからの分離 −プロトプラストを成長させるに適した培地中での培゛
養 −望むならば完全な形質転換植物の再生したがって、本
発明は本質的に植物プロト１ラス）！形質転換するため
の改良法に関し、望むならば、その形質転換プロトプラ
ストからの再生による遺伝的に変性された全植物の構造
に関し、その方法は下記の特徴を持つ−植物プロトプラ
ストはいかなる植物組織からでも分離し、望みに応じて
植物プロトプラストを培養するのに一般に使用される栄
養培地のひとつで培養する； −実際の形質転換前に、アルカリ土類および／またはア
ルカリ金属陽イオン、望ましくはＣａ”、　Ｋ＋および
／またはＮａ＋イオンおよび好適な炭素源を含む前培養
培地で４１乃至１０℃の温度、２０分間乃至６時間、前
培養するニー　次いでプロトプラストを前培養培地から
分離し、Ｃａ２＋イオンの存在下、または非存在下に（
１０）乃至６０　ｍＭ、望ましくは１０乃至３０ｍＭの
必須成分Ｍｇ　２′＋イオンを含む実際の形質転換培地
に再懸濁する； −次て、植物において発現信号を活性に調節されたひと
つ以上の遺伝子と支持ＤＮＡ　ｉも含むＤＮＡ試料を形
質転換溶液に直接加える；−数秒乃至２０分間、望まし
くは（Ｌｌ乃至１０分間後に、原形質膜変性剤を加える
； −プロトプラストとＤＮＡ試料をこの形質転換溶液中で
ＤＮＡがプロトプラスト中にたしかに取シ込まれる時間
保持する； −望むならば、形質転換プロトプラストから全植物体を
再生させる。

本発明の植物細胞への新しい遺伝子の移入は、植物細胞
、植物ウィルスのような天然の植物感染系または昆虫ま
たは植物病原かびによる移入を使用しない直接法によっ
て実施していることは明らかである。これを行うために
、形質転換されるべき植物プロトプラストを組込まれる
べき遺伝子で以下のように直接処理する：先づ最初に、
プロトプラストを適当な溶液中に入れ、そこで一定時間
前培養し、次に外来遺伝子とプロトプラストをいっしょ
に実際の形質転換培地に移して、その中でプロトプラス
トに外米遺伝子が取り込まれるに十分な時間放置する。

使用する植物プロトプラストは単−踵の植物のものまた
は１に準する分類学的単位のものが望ましい。

分離細胞および組織の出発物質として好適な分離された
植物プロトプラストは、例えば葉、苗、茎、花、根、花
粉または胚のような植物のいかなる部分から得てもよい
。望ましくは葉のプロトプラスト’２使用する。分離プ
ロトプラストは細胞培養から得てもよい。プロトプラス
トを分離する方法は、例えば１２）ボトリカス、アイ、
アンド　シリト、アール、ディー１．　メンーズ　イン
　エンサイモロシー１１８巻、４４９−５７８頁、１９
８６年　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　、　Ｉ、　ａｎｄ　５ｈｉ
−１１ｉｔｏ、　Ｒ，Ｄ、　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｇｙｍｏｌｏｇｙ　　１１８　。

４４９−５７８（１９８６）で知ることができる。

プロトグラス）を培養するに好適な培地はプロトプラス
ト培養に通常使用されるもののように浸透圧的に安定化
された培地が望ましい。

個々の成分や成分群の異る数多くの培地が既に入手可能
である。しかし、すべての培地は一般に下記の原理に基
いて調合されている：約１０Ｗ／ｌ乃至数百キ／ｌの範
囲の濃度の無機イオン（例えば硝酸、リン酸、硫酸、カ
リウム、マグネシウム、鉄のようないわゆるマクロ要素
）、最大数■／ｌの無機イオンの群（コバルト、唾鉛、
鋼、マンガンのようないわゆるミクロ要素）、および一
連のビタミン（例えばイノシトール、葉酸、チアミン）
、例えば蔗糖またはグルコースのような炭素源、および
更に（１６）１乃至１０ＩＬＩ／ｌ！の濃度範囲のオー
キシンおよびサイトキシン類の天然または合成植物ホル
モンの形の生長調節剤を含む。更に、培地は糖アルコー
ル（例えばマンニトール）またはＭ（例えばグルコース
）または塩イオン（例えばＣａＣ１２）を添加して浸透
圧的に安定化され、ｐＨ価をα６　乃至＆５にａｌｉｉ
ｌ整されている。

最近の培地のより詳細な記、載は例えば１３）コア’　
Ｕッツ、エイチ０．メトーディシェ　アスベクテ　デア
　ツェルーウント　ゲベーベツェヒトクンクハイクラミ
ネーエン　ウンターヘゾンデレル　ベリエックジヒティ
グング　デアゲトライデ、（アスベクツ　ォプ　メンー
ズオプ　セ”　アンド　テイツシエー　ブロクスイン　
グラミネエウイズ　スペシャル　レファＬ／７ス）クー
　シーリアルス）クルチュール　ブフランツェ　ＸＸ１
巻、１９７４年、９３−１５７頁　Ｋｏｂｌｉｔｚ、　
Ｈ，、Ｍｅｔｈｏｄｉｓｃｈｅ　ＡＳｐＯｋｔｅ　ｄｅ
ｒＺｅｌｌ　−ｕｎｄ　Ｇｅｗｅｂｅ　ｚｔ３ｃｈｔｕ
ｒｇ　ｂｅｉ　Ｇｒａｍｉｎｅｅｎ　ｕｎｔｅｒｂｅｓ
ｏｒｄｅｒｅｒ　Ｂｅｒｕｃｋｓｉｃｈｔｉｇｕｎｇ　
ｄｅｒ　Ｇｅｔｒｅｉｄｅ　。

（Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｃｅ
ｌｌ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｏｗｔｈｉｎ　Ｇｒ
ａｍｉｎｅａｅ　ｗｉｔｈ　５ｐｅｃｉａｌ　ｒｅｆｅ
ｒｅｎｃｅ　ｔｏ　ｃｅｒｅａｌｓ　）Ｋｕｌｔｕｒｐ
ｆｌａｎｚｅ　ＸＸ１．１９７４　、９３−１５７に見
られる。

プロトプラストを実際の形質転換培地に移す前に、次の
形質転換に最適なように準備する培地で１ず前培養する
；こうすることの利点は実現する形質転換および処理プ
ロトプラストの生存率の明らかな増加により明白となる
。

いくつかの前提条件性で、この前培養培地中で直接形質
転換を行うことも可能である。

上記の培地は、例えばグルコースまたけマンニトールの
ような糖または糖アルコールのような好適な炭素源に加
えて、例えばＮａＣ１、ＣａＣ１ｚ。

ＫＣ／のような種々の塩ｆ　１　ｍＭ乃至２（１０）　
ｍＭの濃度で含む標準塩溶液である。この塩溶液は５乃
至８のｐＨ［を持つことが有利である。

目的とする形質転換の短時間以前に、プロトプラストを
前培養溶液から実際の形質転換培地に移す。この溶液は
Ｍ　ｇ　２＋イオンｉ（１１ｍＭ、　　望ましくは１０
ｍＭ乃至３０ｍＭの濃度で含むマンニトール溶液である
。処理溶液ＯｐＨ値はｐＨ５，６乃至ｐＨ１２、特にｐ
Ｈ７乃至ｐＨ１０である。

処理培地に分離したプロトプラストを入れた直後、ＤＮ
Ａ試料を２μｇｏａｌ乃至２０μｙ／ｌｄ・望ましくは
５μ’ｉ／ＩＬｔ乃至１０μ７７／ｒｄのａ度で加える
。

構造遺伝子と植物−活性発現信号からなるＤＮＡは植物
細胞のゲノムＤＮＡに遺伝子の組込みを可能にする中性
ＤＮＡ配列（支持ＤＮＡ）が側方にあることが有利であ
る。直線状の遺伝子を使うことが有利である。実験を実
施する間に、支持ＤＮＡ濃度は５０μｙ／ｍｌ乃至７０
μｙ／ｒｄ、平均の大きさは４　ｋｂ乃至４０ｋｂが特
に好適であると証明された。

更に、例えば動物または植物ＤＮＡ　、　　ラムダＤＮ
Ａ、プラスミツドＤＮＡまたは本発明の方法を実施する
に好適な他のいかなるＤＮＡのような中性ＤＮＡｆ、、
遺伝子のタクレアーゼによる分解から保護するために、
キャリアーＤＮＡとして過剰に使用することが有利であ
る。

ＤＮＡを処理溶液に加えた後、数秒乃至２０分、望まし
くは１１分乃至１０分後に、ポリエチレングリコール終
濃度１０慢乃至ＳＯ％になるまで加える。ＰＥ０４度２
０％乃至２８％で高形質転換率が実現する。

しかし、ポリエチレングリコール以外に、本発明の方法
において、プロトプラスト膜を変性するような、例えば
細胞融合の分野で使用される他の間数アルコールまたは
アルコール製物質を使用することもできる。これらの例
はポリプロピｖｙグリ＝ｒ−ル（４２５乃至４（１０）
０　ｇ／ｍｏｌ）。

ポリビニルアルコールのような長鎖の多価アルコール、
またはヒドロキシル基のいくつかまたはすべてがエーテ
ル化された多価アルコールや例えば下記の報告に記載さ
れているような農業分野で一般的な植物適合界面活性剤
である：１４）　　「マツカチャンズ　デタージエンツ
　アンド　エマルシファイアーズ　アニュアル」エムシ
ー　パフリッシング　コーボレーシトへ　リッジウッド
　ニューシャーシー　１９８１年’　Ｍｃ　Ｃｕｔｃｈ
ｅｏｎ’ｓ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｅｍａｌ
ｓｉｆｉｅｒｓＡｎｎｕａｌ　’　Ｍｅ　Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、　Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ　Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ、　１ｑ　ａ　１ニスターフ　ヘ、バー、
「テンシドータッシェンプーク”、カール　ハンザ−フ
エアラ−り、ミエニツヒ／ヴイエンナ　１９８１８ｔａ
ｃｈｅ、　Ｈ，、＠Ｔｅｎ５ｉｄ−Ｔａｓｃｈｅｎｌ）
ｕｃｈ　Ｉｌ、　ＣａｒｌＨａｎｓｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ
、　Ｍｕｎｉｃｈ／Ｖｉｅｎｎａ　、　１９８１もしポ
リエチレングリコールそのものを使用する場合（実施例
１および２におけるように）、１（１０）０　ｇ／ｍｏ
ｌ乃至１（１０）（１０）９／ｍｏｌ特に３（１０）０
ｇ／ｍｏｌ乃至８（１０）０　ｇ／ｍｏｌ　（ｉり分子
量を持つポリエチレングリコールが望ましい。

上記の薬剤の内、ポリエチレングリコールそのもの、特
にＣａ叶イオンを比較的高比率で持つＣＭＳ型のポリエ
チレングリコール溶液が望ましい。（１５）ネグルチー
−、アイ、等セオリチ力ルアンド　アプライド　ジェネ
ティックス７２巻、２７９−８６頁　１９８６年ａ　Ｎ
ｅｇｒｕｔｉｕ、Ｉ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、７２　、２７
９−８６　（１９８６ａ））ポリエチレングリコールに
よる処理時間は２０分乃至６時間が形質転換実施に特に
有利であることがわかった。

上記のように行った処理の後、有利には細胞濃度１２ｘ
１０’乃至８Ｘ１０４グロトブラスト／培地ｄとして、
新鮮な培地にプロトプラストを再懸濁する。

ＰＥＧを２０慢以上の濃度で使用する場合には、形質転
換終了後に、Ｃａ計イオンを含む溶液２乃至１０倍量で
ゆるやかに希釈して沈降法により存在する残存ＰＥＧＩ
洗い落し、新鮮培地に再懸濁することが都合がよい。

（１０）Ｍ乃至１．０Ｍ濃度のＣａ２′＋イオンを持つ
ＣａＣ１！２水溶液が形質転換に特に有利であることが
証明された。

本発明の方法は実際上適用する際に制限がない 本発明は、特に、新規で有用な望ましい性質をコードし
、植物細胞内で機能する発現信号と作用できるように連
動するひとつ以上の構造遺伝子を中心成分として持つキ
メラ性遺云的構築に関する。

本発明の方法で吏用するに好適な遺伝子は、植物細胞内
で発現され、例えば病原体（例えば植物病原性昆虫、か
び、細菌、ウィルス等）、除草剤、殺虫剤または他の生
物を殺す薬剤、気候的影響および地方的特異性（例えば
高温、低温、風、乾燥、高湿度、特別に極端な土壌条件
、浸透圧ストレス等）への抵抗性または耐性の上昇、ま
たは葉、種、塊茎、根、茎等における保存および貯蔵物
質生成の増加のような有用および／ｆたは望筐しい性質
を植物に与えるいかなる遺伝子でもよい。

本発明は、例えばアルカロイド、ステロイド、ホルモン
、免疫調節剤および他の生理学的に活性な物質のよう人
薬剤学的に受け入れられる活性物質をコードした遺伝子
をも含む。

したがって、植物超厚、例えばゼイン遺伝子〔１６）ラ
イ−ナンド、ニー（１０）等モレキエラーアンド　ゼネ
ラル　ゼネティックス　１８２巻、４４０−４４．４．
１９８１年Ｗｉｅｎａｎｄ、　Ｕ、　、　ｅｔ　ａｌ、
。

Ｍｏ１．Ｇｅｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８２．４４０−４
４４（１９８１）、動物超厚、例えばＴＰＡ遺云遺伝組
繊型プラスミノーゲン活性化遺伝子）；〔１７）ペン二
カ、ディー等ネイチャー５（１０）巻、２１４−２２１
頁、１９８３年Ｐｅｎｎ１ｃａ、　Ｄ、　、ｅｔ　ａｌ
、、　Ｎａｔｕｒｅ　５（１０）　。

２１４−２２１　、（１９８５））、微生物超厚、　例
えばＮＰ’Ｌ”−■遺伝子または合成起原、例えばイン
スリン遺伝子〔１８）ステビーン、ピー、等　ジーン２
４巻、２Ｂ？−２９７頁１９８５年８ｔｅｐｉｅｎ　。

Ｐ、、ｅｔ　ａｔ、、ＧｅｎｅＪｊ−，２８９−２９７
（１９８３）３のようないかなる構造遺伝子をも、もし
その構造遺伝子が植物中で活性である発現信号を側方に
持つならば、植物の遺伝型に組込むことができ、その際
、発現信号は植物、動物、微生物または合成起原であっ
てよい。

本発明において、特にプロモーターおよび終止配列が「
発現信号」と理解すべきであるが、更に構造遺伝子配列
の上流または下流に位置する５′−および５′−非翻訳
部分における他の調節配列も含まれる。

プロモーター配列には特にＰＮＡポリメラーゼの認識部
位が含まれ、ここにこの酵素が特異的に結合して転写が
開始する。

原核生物のプロモーターに多く存在するいくつかのＤＮ
Ａ配列は結合親和性に関与している。

これらのいわゆる「コンセンケス」配列は一般に構造遺
伝子のＡＴＧｉＪ始コードンに対して−１０乃至−５０
の配列部位にみられる。これらは「ブリプノプーシャラ
ーーボックス　Ｐｒ１ｂｎｏｖ−８ｃｈａｌｌｅｒ−Ｂ
ｏｘ　Ｊと呼ばれるふたつのへキサヌクレオチド配列で
あり、これらの配列内のヌクレオチド配列はおたがいの
離れ方と共にプロモーターへのＤＮＡポリメラーゼの親
和性に決定的な影響２持つ。

真核細胞においては、転写開始部位から２０乃至３０タ
クレオチド上流に位置するアデニンおよびチε／の多い
配列、いわゆるｒ　ＴＡＴＡＪボックスがこの関係で特
だ重要である。

本発明の範囲内で使用できる好適な遺伝子は同質性およ
び異質性の遺伝子またはＤＮＡ、更に本発明の範囲内で
与えられた定義に合った合成遺伝子またはＤＮＡである
。

コードするＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡ　、　ｃＤＮＡま
たは合成ＤＮＡのみから構築される。　本うひとつの可
能性＃１ｃｉ）ＮＡおよびゲノムＤＮＡおよび／筐たは
合成Ｉ）ＮＡいずれもからなる雑種ＤＮＡの構築である
。

この場合には、ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡと同じ遺伝子由
来のものでもよいし、または別法としてｃＤＮＡとゲノ
ムＤＮＡ両方が異った遺伝子から由来してもよい。しか
し、いかなる場合にも、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃ
ＤＮＡはそれぞれ同一または異った遺伝子から個々に調
製できる。

ＤＮＡ配列がひとつ以上の遺伝子の部分を含んでいる場
合には、これらの遺伝子はひとつの同じ遺伝子から、ま
たは同じ族のひとつ以上の株、ひとつ以上の変種または
ひとつ以上の種に属するいくつかの生物から、または同
じまたはもうひとつの分類学的単位（界）のひとつ以上
の族に属する生物から由来してよい。

植物細胞における上記構造遺伝子の発現を確実にするた
めに、コードした遺伝子配列は、植物細胞で機能可能な
発現配列と作用できるように連結させ表ければならカい
。構造遺伝子および側方にある発現信号からなる移入さ
れる遺伝子は天然の遺伝子でも雑種遺伝子でもよい。本
発明の方法に使用される望ましい遺伝子は、発現信号が
動物または、特に植物または合成起源のものである。こ
のような遺伝子の例は：ａ）構造遺伝子とその天然の発
現信号からなる植物由来の完全な遺伝子： ｂ）合成起源の発現信号を側方にもつ合成起源の構造遺
伝子からなる完全に合成の遺伝子；Ｃ）植物−活性発現
信号を明方に持ち、植物の異った種由来の構造遺伝子と
発現信号からなる植物由来の構造遺伝子： ｄ）合成起源の発現信号を側方に持つ植物由来の構造遺
伝子： ｅ）植物起源の発現信号を側方に持つ動物、微生物また
は合成起源の構造遺伝子：またはｆ）合成起源の発現信
号を側方に持つ動物または做生物起αλの構造遺伝子 である。

したがって本発明の範囲内における雑種遺伝子構築は、
構造遺伝子に加えて、プロモーターおよびクーミネータ
ー配列両者と共にｓ’−オＪ：び５′−非翻訳部分の他
の調節配列を含む。

より一層望ましいものは植物起源の発現信号、特に植物
ウィルス由来のものを側方に持つ細菌起源の構造遺伝子
である。

コードしたＤＮＡ配列（構造遺、云子）の発現全誘導可
能ないかなるプロモーターおよびいかなるターミネータ
−も雑種遺伝子配列の成分として使用できる。好適なプ
ロモーターおよびターミネータ−の例はツバリン−シン
ターゼ遺伝子（ｎｏｓ　）　、オクトバインーシンクー
ゼ遺伝子（ＯＣＳ　）およびカリフラワー　モザイク　
ウィルス遺伝子（ＣａＭＶ　）のものである。

ＣａＭＶ／ｒ’ツムから分離したＣａＭＶゲノムの３５
８および１９．３発現信号で、例えば１９）ｙｙアチス
等１９８２年Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９
８２に記載されているような分子生物学的方法によりコ
ートされたｆ）ＮＡ配列に連結できるものが本発明の範
囲内で望ましい。

本発明にしたがい、３５８転写調節配列に使用される出
発物質は、例えば遺伝子地図のタクレオチド６８０Ｂ−
７６５２（”０）フランク　ジー等１９８ｏ年Ｆｒａｎ
ｋ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０　）　　（Ｉ−含む
ＣａＭＶ”Ｓ５株のＳｃａ　エフラグメントである。

１９３プロモーターおよび５′−非翻訳部分はＣａＭＶ
遺伝子ＩＶの０ＰａｔＩ部位（５３８６位）とＨｉｎｄ
　璽部位（５８５０位）の間のゲノムフラグメントに存
在するヒ１）ホーン等１９８２年Ｈｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ
、、　１９８２　）　。相当するターミネータ−と３′
−非翻訳部分はＣａＭＶゲノムの７３４２位と７６４３
位の間ノＥｃｏ几Ｖ／Ｂｇｌ　１１７ラグメントに存在
している。

１９Ｓプロモ一タ一部分は、Ｃａ　Ｍ　Ｖ遺伝子■のコ
ード部分の前に位置して遺伝子■生産物（ウィルス　コ
ート　タンパク質）の発現を司どる典型的な真核生物の
プロモーターである。

植物細胞内で機能し、使用可能なプロモーターのもうひ
とつの効果的な代表例は過剰生産植物プロモーターであ
る。この型のプロモーターは、目的とする遺伝子産物を
コードした遺伝子配列と作用可能な状態で連結した場合
、上記の遺伝子配列の発現を可能にすべきである。

本発明の範囲内で使用できる過剰生産植物プロモーター
には、ダイズのりブロース−１，５−とスーホスフェー
トー力ルポキシラーゼ小サブユニット（ｓｓ）のプロモ
ータ（２２）　ベリーロー等　ジャーナル　オプ　モレ
キュラー　アンド　アプライド　ゼネティフクス　１巻
４８３−４９８頁１９８２年Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ　ｅ
ｔ　ａｌ、　。

Ｊ、　Ｍｏｌ、　ａｎｄＡｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　
１　：　４８３−４９８（１９８２）〕および〕クロロ
フィルーａ／ｂ−結合タンパク質のプロモーターが含ま
れる。これらふたつのプロモーターは真核植物細陀にお
いて光によって誘導されるという性質で知られている〔
例えば、　　ゼネティック　エンジニアリング　オプ　
フランク、アン　アグリカルチエラルハースベクティプ
、エイ、カシュモア、プレナム、ニューヨーク　１９８
３年、２９−３８頁Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ、ａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒ−ａｌ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、　Ａ、　Ｃａｓ
ｈｍｏｖｅ、　Ｐｌｅｎｕｍ、へｅｗ　Ｙｏｒｋ１９８
３；２４）コルジー　ジー等　ザ　ジャーナル　オブ　
バイオロジカル　ケミストリー２５８巻１３９９貞、１
９８５年Ｃｏｒｕｚｚｉ　Ｏ，ｅｔ　ａｌ、。

Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　２５８　：１３９９（１９
８３）および２５）ダンスミュア　ピ−等　ジャーナル
　オプ　モレキュラー　アンドアプライド　ゼネティッ
クス、２巻　２８５頁１９８３年　Ｄｕｎｓｍｕｉｒ、
　Ｐ、　ｅｔ　ａｌｌＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ−Ｉ
ｅｃｕｌａｖ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ　、　２　：　２　：　２８５（１９８３））。

カリフラワー　モザイク　ウィルスの遺伝子■の発現信
号を本発明に使用するのに特に有利であるＣとがわかっ
た。

本発明の範囲内で特に望筐しいものはＣａＭＶＣＭ１８
４１株の発現信号で、その完全なＤＮＡ配列は２６）カ
ートナー等１９８１年Ｇａｒｄｎｅｒ　ｅｔａｌ、、１
９８１に記載されている。

雑種遺伝子はそれ自体は公知の微生物学的方法により製
造し、植物細胞によって生産されるヘキタンパク質のコ
ードのリーディングフレームは保持しておく。このよう
な方法は公知で、例えば下記の刊行物に記載されている
：２７）「モレキュラー　クローニング」、マニアテイ
ス、ティー９．ノリッチェ、イー、エフ、およびジェイ
、サングルツク、コールド　スプリングバーバー　ラボ
ラトロリー、１９８２年”Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　’、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ
１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ。

ａｎｄ　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｃｏ１ｄ　３ｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

１９８２、および２０）「リコンビナントＤＮＡ　　テ
クニックス」、ロドリゲス、アール、エル、　アント　
　アール、シー、ディト、アジンンーウェズリーハフ゛
す・ンシング　アンバエ−。ロンドン。

アムステルダム、トン　ミルズ、オンタリオ。

シｈ”＝−、）’）キｗつ、　１９Ｂ５年″″１もｅｃ
ｏｍｂｉｎａ−ｎｔ　ＤＮＡ　’ｌ’ｅｃｈｎｉｇｎｅ
ｓ　”　、　Ｒｏｄｒｉｇｎｅｚ、　Ｒ，Ｌ、ａｎｄ几
、Ｃ，Ｔａ１ｔ、　Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ　Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐ、　。

Ｌｏｎｄｏｎ　、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　Ｄｏｎ　Ｍ
ｉｌｌｓ、　０ｎｔａｒｉｏ、　５ｙｄ−ｎｅｙ、　Ｔ
ｏｋｙｏ　、　１９８３゜植物細胞のゲノムＤＮＡに外
米遺伝子を組込むには、構造遺伝子と植物−活性発現信
号からなる遺伝子の側方に中性ＤＮＡ（支持１）ＮＡ　
）があれば有利である。この場合、支持ＤＮＡは二本の
直線状ＤＮＡ鎖から々っていてよく、そのため植物細胞
へ挿入されるべき構築は直線状ＤＮＡ分子である。しか
し、遺伝子移入のためにつくるＤＮＡ配列は環状構造（
プラスミド構造）であってもよい。このようなプラスミ
ドは発現信号２持つ外来遺伝子が組込まれた一本のＤＮ
Ａ鎖からなっている。支持ＤＮＡは合成起源でもよいし
、天然のＤＮＡ配列から適当な制限酵素で処理して得て
もよい。したがって、好適な支持ＤＮＡは例えば選択的
制限酵素で開環した天然のプラスミドである。

このようなプラスミドの例は自由に入手できるプラスミ
ドｐＵＣ８（２８）メッシング、ジエイ。

アンド　ジェイ、ビエイラ、ジーン１９巻、２６９−２
７６頁１９８２年Ｍｅｓｓｉｎｇ　、　Ｊ、　ａｎｄ　
Ｊ。

Ｖｉｅｉｒａ、　Ｇｅｎｅ　１９　、２６９−２７６　
、１９８２に記載されている）である。天然のプラスミ
ドのフラグメントも支持ＤＮＡとして使用することもで
きる。例えばカリフラワー　モザイク　ウィルスの遺伝
子■の欠損変異株を支持ＤＮＡとして使用できる。

植物細胞の遺伝子形質転換の確率は種々の因子によって
上昇させ得る。酵母の試験で知られているように、成功
して安定な遺伝子形質転換の数は、 １）細胞当りの新しい遺伝子のコピー数が増加すると共
に、 ２）複製信号と祈遺伝子の組合せにより、また３）組込
む配列と新遺伝子の組合せによシ増加する。

したがって、本発明の方法は、移入される遺伝子が植物
細胞内で活性な複製および／まだは組込み配列と組合わ
さった場合に特に有利に使用され得る。

植物細鞄内遺伝子の発現は遺伝子がメツセンジャーＲＮ
Ａ配列に転写される頻度に依存する。

したがって、新しい遺伝子がこの転写を高めるエンハン
サ−信号と組合さった時に同様に有利になる。植物細胞
で活性な複製、組込みおよびエンハンプ−信号と組合さ
った遺伝子を移入する本方法は特に注意を惹く。

また、もし移入される遺伝子が選択的マーカー機能を持
つ場合、プロセッシング手法の点から大いに有利である
。すなわち、形質転換した植物細胞を非形質転換細胞か
ら選択を調節することによって分離できる。植物細胞の
遺伝子型に発現してマーカー特異的選択法を使用できる
ような遺伝子が存在する時にのみ、通常微生物学的方法
によってカルスまだは完全な植物に再生させられるので
、このよう々マーカー機能が効率的操作法を可能にする
。

プロトプラスト、細胞培養の細胞、植物組織の細胞、花
粉、花粉管、胚珠、胚のうまたは接合子、および発育の
種々の段階の胚が形質転換の出発物質として期用できる
好適な植物細胞の例として挙げられるが、それ以上の前
処理なしで［Ｉｉｌ使用できるのでプロトプラストが望
ましい。

本発明は本発明の方法によって得られた形質転換すれた
プロトプラストにも関し、まだ、それから得られた植物
細胞、細胞凝集物、胚、植物および種にも関し、更にま
た、形質転換の結果として得られた新しい遺伝子を持ち
、それからの有利な性質を持つその子孫にも関する。

また、本発明にしたがって形質転換され、形質転換の結
果として得られた新しい遺伝子を持ち、それから得られ
る有利な性質を持つ植物材料のすべての雑種および融合
生産物も含まれる。

本発明の方法はすべての植物、特に分類群アである。

特に興味が持たれるジムノスベルメＱｙ＋ｎｎｏ−ｓｐ
ｅｒｍａｅは：に７ｘしＣｏｎ１ｆｅｒａｅ　綱の植物
である。

特に興味が持たれるアンジオスベルメ人ｎｇｉｏ−ｓｐ
ｅｒｍａｅは、落葉樹木は別として、ソラナシエパルメ
ｐａ１ｍａｅ　、プロメリア　シｘ　Ｂｒｏｍｅｌ　１
ａｃｅａｅ。

サシｘ　Ｍｕｓａｃｅａｅまたはグラミネｘ、　Ｇｒａ
ｍ　１ｎｅａｅ科の植物、およびレグミノセ：［、ｅｇ
ｕｍｉμ見目の植物、特にバピリオナシェＰａｐｉｌ　
１ｏｎａｃｅａｅ科の植物である。クルナシェ５ｏｌｎ
ａｃｅａｅ　、　　クルシフェｖ　Ｃｒｕｃｉｆｅｒａ
ｅおよびグラミネｚ　Ｇｒａｍｉｎｅａｅ科の代表的な
ものが望ましい。ニコチアナＮ１ｃｏｔｉａ−ｎａ　、
ベチェニアＰｅｔｕｎｉａ　、ヒオシアムスＨｙｏｓｃ
ｙ−ａｍｎｓ　、プラシカＢ　ｒａｓｓ　ｉｃａおよび
ロリウムＬｏｌｉ−ｕｍ族の植物、例えばニコチアナ　
タバクムオヨヒロリウム　ムルチフロルムＬｏｌｉｕｍ
　ｍｕｌ　−ｔｉｆｌｏｒｕｍが特に言及する両値があ
る。

トウモロコシ、コメ、コムキ、オオムギ、ライムギ、カ
ラスムギおよびアワのような高収量の栽培植物は特に植
物細胞形質転換の分野での努力の対象になる。

プロトプラストからの再生によりつくることができるす
べての植物は本発明の方法を使って形質転換可能である
。現在までの所、穀類を含まれるグラミネエＯｒａｍμ
Ｍ±（草類）の代表的なものＶこ対して遺伝的に操作す
ることができない。しかし、上記の直接遺伝子形質転換
法九よりグラミ社Ｇｒａｍｉｎｅａｅプロトプラスト、
　すなわち穀類の細胞を遺伝的に形質転換することが可
能であることが明らかになった。世界的な総収量や作付
面積は少いが、同様にソラナム５ｏｌａｎｕｒｎ　、　
＝　コチアナｆｉｊ−ＣＱ旦、ａｈａ　、プラシカＢｒ
ａ−ｓｓｉｃａ　、ベタ１３ｅ−ｔａ　、ビスムｒすｕ
ｍ、−、ファゼオラスＰｈａｓｅｏｌｕｓ　、グリシネ
９呼ｃ−ｉ　ｎｅ　、　、ヘクアンタストリティクム眠
屯四匹、ゼアＺｅａ　、ムサＮｌ　ｕｓ３、−ｒ？　ル
スＭａｌｕｓ　、　７　ｚ　ニクスＰｈｏｅｎｉｘ　、
　工ｖイスＥｌａｅｉｓ　、　Ａ／プスＲｕｂｕｓ　、
　フラガリアＦｒａｇａｒｉａ　。

ブルヌスＰｒｕｎｎｓ　、アラキスＡｒａｃｈｉｓ　、
パニクムＰａｎｉｃｕｍ　、す・ンカルＡ　Ｓａｃｃｈ
ａｒｕｍ　、　＝ｒ　フェアＣｏｆｆｅａ　、カメリフ
　Ｃａｍｅｌｌｉａ　、アナナスＡｎａｎａｓ。

ピティスＶｉｔｉｓまたはシトラスＣ１ｔｒａｓ属の栽
培植物の形質転換も可能であり、望ましい。

培養中のプロトプラス）１完全植物体に再生することは
２９）エバンス等「プロトプラストアイソレイション　
アンド　カルチャー」、ハンドブック　オプ　プラント
　セル　カルチャー　１巻：　１２４−１７６貞（マク
ミラン　パブリッシング　カンパニー、ニューヨーク１
９８５年Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　＠Ｐｒｏｔｏｐ
ｌａｓｔ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄＣｕｌｔｎｒｅ
　’　、　ｉｎ　Ｈａｎｄｌ）ｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｌａｎ
ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ。

１　：　ｔ２４−１７６　（ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ。

ＮｅｗＹｏｒｋ　１９８３　）　：　３０）エム７−ｋ
　　テ４　ヒ＋。

「リーセント　デベロップメンツ　イン　ザカルチャー
　アンド　リゼネレイシヲン　オププラント　プロトプ
ラスト」プロトプラスト。

１９８５−レフチャー　ブロシーディングズ。

１９−２９頁、（ビルクホイザー、パスレ１９８３年）
　　ＭＲＤａｖｅｙ　、　”　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　ｔｈｅＣｕｌｔｕｒｅ　　
ａｎｄ　ｌｌｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｐｌ
ａｎｔ　　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａ。

Ｐｒｏｔｏ　１ａｓｔｓ　、　１９８３−　Ｌｅｃｔｕ
ｒｅ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　。

ｐａｇｅ　１９−２９　、　（Ｂｉｒｋｈ’ａｕｓｅｒ
　、　Ｂａ５ｌｅ　１９８５　）　；３１）ピーシエイ
　ディル、「プロトプラストカルチャー　アンド　プラ
ント　リゼネレイシ冒ン　オブ　シリアルス　アンド　
アザ−リカルシトラント　クロッゲス」プロトプラスト
。

１９８３−レフチャー　プロシーディ／ゲス。

３１−４１頁（ビルクホイザー、バスレ　１９８３年）
　ＰＪＤａｌｅ、”　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　ａｎｄ　ＰｌａｎｔＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
　ｏｆ　Ｃｅｒｅａｌｓ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ｒｅｃ
ａｌｃｉｔｒａｎｔＣｒｏｐｓ　”　、　ｉｎ　Ｐｒｏ
ｔｏ　１ａｓｔｓ　　１９８５−　Ｌｅｃｔｕｒｅ　Ｐ
ｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇｓ　、　ｐａｇｅ　３１−４１　
、（Ｂｉｒｋｈ：ａ’ｕｓｅｒ　、　Ｈａｓｌｅ１９８
３）：およヒ３２）エイチ　ビンディング「リゼネレイ
シ薗ン　オプ　ブラソフ」プラント　プロトプラスト　
２１−３７頁　（シーアールシー　グレス、ポカ　レイ
トン　１９８５年）ＨＢｉｎｄｉｎｇ　、　　”　Ｒｅ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈａｎｔｓ　’　、　ｉ
ｎ　ＰｌａｎｔＰｒｏｔｏｐｌａｓｔａ　、　ｐａｇｅ
　２１−３７　、　（ＣＲＣＰｒｅｓｓ　。

Ｂｏｃａ几ａｔｏｎ１９８５）および１２）ボトリヵス
アイ　アンド　シリトアール　ディー　メノーヅ　イン
　エンザイモロジ−１１８巻　プラント　モレキュラー
　バイオロジー　エイ、アンド　エイチ　ワイスパック
編、アカデミツクプレス、オルランド　１９８６年　Ｐ
ｏｔｒｙｋｕｓ　工ａｎｄ　５ｈｉｌｌｉｔｏ　ＲＤ、
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　
Ｖｏｌ。

１１８　、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ　、　ｅｄｓ、　Ａ、　ａｎｄＨ９Ｗｅｉｓｓ
ｌ）ａｃｈ　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　、　
０ｒｌａｎｄｏ　。

１９８６に記載されている。　再生方法は植物の種によ
って異る。しかし、一般に、まず挿入された遺伝子の多
数のコピーを含む形質転換された１０ドブラスト、８．
’ａ　ｉ泡またはｍ＠の懸濁液をつくる。次にこのよう
な懸濁液を使って胚形成誘導を行うことが可能である。

この■の生長を天然の胚の場合のように成熟および発芽
の段階に進行させる。しかし、通常、プロトプラストは
公知の培養培地のひとつに入れて刺戟を与えて分裂させ
細胞壁をつくらせる。最終的に、何か活性成分、例えば
オーキシンやサイトキニンの処理によシ根や発芽茎の形
成に誘導することができるカルス培養を得る、培地には
これらの生長物質の外に一般に種々のアミノ酸を含む。

グルタばン酸およびプロリンを培地に入れるこトカ、％
にトウモロコシやアルファルファのような植物種の場合
に有利であることが証明されている。根や発芽茎は一般
に同時に形成される。

このようにして得られた小植物を土壌に移し、普通の苗
と同じ方法で更に培養する。

再生の効率は特に培地、遺伝型および培養の前歴に依存
している。もしこれらの三つの変数が適正に調節されて
いると再生は完全に再現性を持つ。

植物のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培債の分野、特に植物再生の分
野における最近の開発の観点からみて、グラミネｘ　Ｇ
ｒａｍｉｎｅａｅ科の代表的なものについテモ植物プロ
トプラストから全植物体を再生させることが可能になっ
てきた。グラミネエＧｒａｍｉｎｅ−ａｅについて成功
した再生実験の例は中でも３３）アプダラー、アール等
　バイオ／テクノロジー、４巻、１０８７−１（１１）
０頁１９８６年Ａｂｄｕｌｌａｈ　。

几、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　
、　４　：　　１０８７−１（１１）０゜１９８６；”
）フジムラ、ティー、等、プラントティシュ−カルチャ
ー　しｌ！−ス２巻、７４−７５頁、１９８５年　１ｉ
”ｕｊ　ｉｍｎｒａ　％Ｔ、ｅｔ　ａｌ−、。

Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ　Ｈａｖｅ　Ｌｅｔｔ
、　２　：　７ａ　−７５。

１９８５；３５）トリャマ、ケイ等、　セオリテイ力ル
　アンド　アプライド　ゼネテイツクス８３巻、１６−
１９頁、１９８６年　Ｔｏｖｉｙａｍａ　、　Ｋ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｔｈｅｏｒ　ＡＰ　Ｉ、　Ｇｅｎｅｔ
、、　７５　：　１６−１９　。

１９８６；３６）ヤマダ、ライ９等、プラント　　セル
　レボーツ　５巻、８５−８８頁、１９８６年（コメ）
　　Ｙａｍａｄａ　、　Ｙ、　、　Ｃｔ　ａｌ、、　ｐ
ｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｅｐ、。

５　：　８５−８１３．１９８６に、また「プロトプラ
ストからのゼア　メイズ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　）　　Ｍ
物の再生」の題名で１９８７年６月２４日に出願された
０５６．５０６号のアメリカ特許出願（ｐｅｎｄｉｎｇ
　ＵＳＰａｔｅｒｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　、　５
ｅｒｉａｌ　ｎｕｍｂｅｒ　０５６，５０６）に記載さ
れている。

したがって、下記の植物を本発明の範囲内で使用するこ
とも可能である：ロリウムＬｏｌｉｕｍ、８ｅＬａｒｉ
ａ　。

形質転換された遺伝子はそれ自体公知の、例えば特にサ
ザーン　プロット分析や酵素活性試験を含む雑種分析お
よび分子生物半時研究により検出できる。

雑種分析において、形質転換された植物細胞から成長し
た成熟植物をまず種子を生産する目的でそれ自身と交配
する。種子のいくつかは、新しく望ましい性質をコード
した挿入遺伝子と遺伝の法則に正確に相当する比で含む
。これらの１子を新しい望筐しい性質を持つ植物を生産
するために使用することができる。

ホモ妥合体系統を、繰返しの自家受粉と同系交配系統を
つくることによって得ることができる。次にこれらの同
系交配系統を今度は雑ｆｉｔ一つくるために使用できる
。この目的でひとつの同系交配系統をもうひとつの同系
交配系統と交配する。

本発明は、再生された植物から得ることができる部分、
例えば花、（重子、葉、枝、中でも果実で、これらの部
分が形質転換された細胞を含む場合には、これらの部分
にも関する。再生された植物の子孫（雑種の子孫も含む
）、変種および変異体も本発明の一部を形成している。

サザー／　プロット分析は例えば次のようにして実施で
きる：形質転換細胞またはプロトプラストから取ったＤ
ＮＡｆ制限酵素で処理した後、１％アガロース　ゲルで
α気泳動を行い、ニトロセルロース膜上に移す（３７）
サザーン、イー。

エム０．ジャーナル　オプ　モレキュラー　バイオロジ
ー　９８巻、５０３−５１７頁、１９７５年５ｏｕｔｈ
ｅｒｎ、　ＥＪｖｉ８．　Ｊ、Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、９
８．５０３−５１７　（１９７５））。そしてニック翻
訳に供しておいた検出のために使用するＤＮＡと分子雑
種形成（・・イブリダイゼイシ曹ン）させる〔３８）リ
グビー、ダブり二一、ジェイ１．ディークマン、エム８
、ローデス、シー、アンドピー、バーブ、ジャーナル　
オプ　モレキュラー　バイオロジー　１１３許、２５７
−２５１頁、１９７７年Ｒｉｇｂｙ　、Ｗ、Ｊ、、Ｄｉ
ｅｃｋｍａｎｎ　、　　Ｍ、、　　几ｈｏｄｅｓ、　Ｃ
。

ａｎｄ　Ｐ、　Ｂｅｒｇ、　、Ｔ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏ
ｌ、　１１ｓ　、　２３７−２５１（１９７７））（５
Ｘ１０８乃至１０　ｘ　１０’　ｃ、ｐ、ｍ／μｇのＤ
ＮＡ−比活性）。　次いで、フィルターを６５℃で０．
０３　Ｍクエン酸ナトリウムおよび１３Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液で各回１時間３回洗浄する。雑■橿形成したＤ
ＮＡは２４−４８時間Ｘ線フィルムを黒色化することに
より目に見えるようになる。

酵素活性は次のようにして、ｓ’４べる〔アミノグリコ
シド　ホスホトランスフェラーゼ（カナマイシン特異リ
ン酸化の酵素）の試験により詳細に説明〕：カルスまた
は葉の一部（１（１０）乃至２（１０）１ａｇ）　ｆニ
ーｔ　ヘント／ｌ、　ｙ　（ｇｐｐｅｎｄｏｒｆ　）遠
心管内、抽出用緩衝液２０μｌ中で麿砕する。　緩衝液
は５）へレラーエストレラ、エル０．デブロック、エム
１．メーＩセンス、イー１．ヘルナルスティーンズ、シ
ェイ、−？”−、、パンモンタキュー、エム、アンド　
ジェイ、シェル、イーエムビーオー　ジャーナル　２巻
、９８７−９９５頁、１９８３年Ｈｅｒｒｅｖａ−Ｅｓ
ｔｖｅｌｌａ　、　Ｌ、　ＤｅＢＩｏｃｋ　、　Ｍ、。

Ｍｅｓｓｅｎｓ、　Ｅ、　、　Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎ
ｓ、Ｊ、−Ｐ、、　Ｖａｎ　Ｍｏｎ−−ｔａｇｕ、　Ｍ
、ａｎｄ　Ｊ、８ｃｈｅ１１．　ＥＭＢＯＪ、　２．９
８７−９９５（１９８５）によって使用されたものを一
部変えたもので、オウシ血液アルプミノを除いて０．１
Ｍシー！糖を加えたものである。　　抽出物を１２．（
１０）０ｇで５分間遠心分離し、上澄に終濃度が（１６
）０４％になる筐でプロモロフェノールブルーを加える
。タンパク質を、１０％の非変性ポリアクリルアミド　
ゲルによる′１気泳動で上澄３５μｌから分離する。　
ゲルをカナマイシンとγ−３２ｐ標ａＡＴＰを含むアガ
ロース　ゲルで覆ってインキュページ冒ンを行い、リン
酸化すした反応生成物をホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ
　）　−ｐ８１−ホスホセルロース　ベーパー［８−ｔ
。

このベーパーを９０℃の脱イオン水で６回洗浄してオー
トラジオグラフィーを行う、 以下実施例により本発明を詳細に示すが、これに限定さ
れるものではない。この実施例には、雑種遺伝子の構築
と環状構造を持つ支持ＤＮＡ配列へのその組込み、この
雑種遺伝子の植物細胞への移入、形質転換された植物細
胞の選択とその形質転換植物細胞からの全植物体の再生
、更にそれの雑（重−遺伝学的および分子生物学的分析
を記載する。

以下の実施例には次の略号を使用する：培　　　地 ＨｅＮａ／Ｆ　（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７，１，
５ｍＭＣａＣ１１，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，α２Ｍ？７
＝トーヤ；３９）り。４．工４０等、 １９８５年Ｆ’ｒ　ｏｒｒｒｎ、　Ｍ、　ｅ　ｔ　ａ　
Ｉ　、。

Ｋｓ　　（ｃＬ１＋＋ｙ／１２．４Ｄ、　１．ｏｍｇ／
ｌ　ＮＡＡ。

α２ｍｐ／Ｌ　　ＢＡＰ；４０）　シ　リ　ト　、　ア
ール、ディー、等、１９８１年 ５ｈｉｌｌｉｔｏ、　Ｒ，Ｄ、ｅｔ　ａｌ、　（１９８
１）：４１）ナシ、ジエイ、アイ、アンド マリ力、ビー０，１９７（Ｓ年１’ｌａｇｙｔＪ、１．
ａｎｄ　Ｍａｌｉｇａ、　Ｐ、、　（１９７６）　）Ｋ
Ａ、ＡＵ　　（４２）インスタル、ピー、等。

１９８５年Ｉｎ５ｔａｌｌｅ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、。

ｉ、ｓ　　　　（４５）リンスメイアー、イー、エム、
。

スクーク、二フ、、フイジオロギア プランタルム　１８巻、　　１（１０）−１２７頁。

１９６５年Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ、　ＥｏＭ、、　５ｋｏ
ｏｋ。

Ｆ、、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ
　１８゜１（１０）−１２７．（１９６５ ））ＭａＣａ　　　（（１４）Ｍ　−ｖ　：ｙ　二）　
−Ａ／、　　１５ｍＭ　ＣａＣｔ２ｘ２Ｈ，０，ｐＨ５
，６） ＭａＭｇ　　　（［１４乃至α５Ｍ−ｒ　ンニト−ル、
１５ｍＭＭｇＣ１ｚ、（１０）チＭＥＳ、ｐＨ５，６］
Ｍ〔４２）インスタル、ピー、等、１９８５年１ｎｓｔ
ａｌｌｅ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ　＋ｔ　（１９８５）
）ＭＡＰＩＡＯ〔４２）インスタル、ピー、等、１９Ｂ
５年Ｉｎ５ｔａｌｌｅ、Ｐ、、　ｅｔａｌ、、　（１９
８５））ＭＤｓ　　　（’リネグルチュー、アイ、等。

１９８３年Ｎｅｇｒｕｔｉｕ、　Ｉ、　ｅｔ　ａｌ、。

ｌぜ　　　〔４２）インスタル、ピー、等、１９８５年
　Ｉ’ｎ５ｔａｌｌｅ、Ｐ、、　　ｅｔ　ａｌ、、（１
９８５））ｎｔ　５Ａ（４２）インスタル、ピー、等、
　１９８５年Ｉｎ５ｔａｌｌｅ、Ｐ、、　ｅｔａｌ、、
　（１９８５））Ｔ〔４５）＝ツチー、ジーイ、ピー、
アンドシー、ニラチェ、　　１９６９年 Ｎ１ｔｓｃｈ、Ｊ、Ｐ、ａｎｄ　　Ｃ１Ｎ１ｔｓｃｈ　
。

Ｗｓ　　　　　（１５４ｍＭ　ＮａＣ４１２５ｍＭ　Ｃ
ａＣ１ｚ　Ｘ２８２０．５　ｍＭ　ＫＣＩ、、　５ｍＭ
グＡ／　＝ｒ　−ス。

ｐＨ５，６乃至６．０；４６）メンツェル等、１９Ｂ１
年Ｍｅｎｃｚｅｌ　　ｅｔａｌ−。

化学物質 ＢＡＰ　　　べ／ジルアミンプリン ２．４Ｄ　　　（２，４−ジクロロフェノキシ）酢酸Ｎ
ＡＡ　　　ナフチル酢酸 Ｅｌ）ＴＡ　　エチレンジアミン−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、
　Ｎ’　−テトラ酢酸 ＰｈＸ）　ＣＭ８０ＭＳ型のポリエチレングリコール〔
１５）ネグルチュー、アイ、等、１９８６年−ａ　Ｎｅ
ｇｒｕｔｉｕ、　Ｉ＋ｅｔ　ａｌ、。

（１９８６ａ）） ＰＩ　６几　Ｒ型のポリエチレングリコール（１０）シ
リト、アール、ディー、等、　１９８５年５ｈｉ１１ｉ
ｔｏ、几、Ｄ、ｅｔａｌ、、（１９８５）））　リスー
ＨＣｔα、α、α−トリス−（ヒドロキシメチル）−メ
チルアミン塩酸 ＮＰＴ−■遺伝子　ネオマイシン−５７−ホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子、■型 表 ＡＴＦ　　　形質転換絶対ｆＡ度 ＧＰＰＬ　　　プロトプラストの総数 ＲＴＦ　　　形質転換相対頻度 匪　　形質転換処理終了後の生存プロトプラスト ＺＴ　　　形質転換されたものの数 取下の実施例におけるパーセントは重量／容量パーセン
ト（Ｗ／Ｖ；容量当りの重量）である。

実施例１ 自由に人手できるプラスミドｐＫｍ　２１およびｐＫｍ
２４４　（”）ペック、イー、等、ジーン１９巻。

５２７−５５６頁、　　１９８２年Ｂｅｃｋ、　Ｅ、、
　ｅｔ　ａｌ　、、　Ｇｅｎｅ１９、３２７−３３６（
１９８２））を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで切断
する。組換えに使うプラスミドフラグメントをα８％ア
ガロースゲルにおける電気泳動によって精製する。フラ
グメントを結合させて得たプラスミドｐＫｍ　２１２４
４は４７）ペック等Ｂｅｃｋ　ｅｔａｌ、Ｉｃよシジー
ン１９巻、５２７−５５６頁、１９８２年Ｇｅｎｅ　１
９．　３２７−５５６Ｃ１９８２）Ｋ記載すｎテイル！
　５　Ｋ、　Ｎ）’Ｔ−■遺伝子の５′−および３’−
Ｂａｌ　３１欠損の組合せを含む。

カリフラワーモザイクウィルスのプロモーター信号をプ
ラスミドｐＫｍ　２１２４４のＨｉｎｄｌ１７ラグメン
トと結合させるために、カップリングプラスミドｐＪＰ
ＡＸｆ構築する。カップリングプラスミドｐＪＰＡＸは
プラスミドｐＵｃ８とｐＵｃ９から得る〔メッシング、
ジェイ、アンド、ジェイ。

ビエイラ、ジー７１９巻、　２６９−２７６頁、　１９
８２年Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｖｒｅ
ｉｒａ、　Ｇｅｎｅ　１９　、２６９−２７６（１９８
２））。プラスミドｐＵＣ９のカップリング配列の１０
塩基対を、ＨｉｎｄｌｌｌとＳａｌ　ｌの部位の所で切
断してポリメラーゼ−１−Ｋｌｅｎｏｗフラグメントヲ
使って接着末端をつくりｃ４８）ヤコプセン、エイチ８
等ヨーロツピアンジャーナルオフバイオケミスト１７４
５巻、６２５頁、１９７４年Ｊａｃｏｂｓｅｎ、　Ｈｏ
、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、４
５　。

６２５、　（１９７４））　、ポリヌクレオチド鎖を結
合し、−ｆ：の結果としてＨｉｎｄｌ１部位を再びつく
って、分離する。この分離したカップリング配列の８ｍ
ａ　１部位に８塩基対の合成カップリング要素（ｘｈｏ
ｌ）ｔ−挿入する。プラスミドｐＵＣ８の適当なＸｏｒ
ｌおよびＨｉｎｄｌｌｌフラグメントの、および変性し
たプラスミドｐＵＣ９の組換えにより下記の連らなり次
制限部位を持つ部分的に非対称のカップリング配列を持
つプラスミドｐ　Ｊ　ＰＡＸ　’ｚ得る　二　ＥｃｏＲ
ｌ、　　８ｍａ　ｌ、　　１３ａｍＬ−１１，Ｓａｌ　
　ｌ、　　Ｐｓｔ　　ｌ、　　Ｈｉｍｄ　ｆＪＪ。

ＢａｍＨｌ、　Ｘｈｏ　ｌおよびＥｃｏＲｌ。ＮＰＴ−
１１構造遺伝子に結合されたＣａＭＶ遺伝子遺伝子上プ
ロモータ一部分ａＭＶ　ＣＭ　１８４１株の変種であシ
、その完全なヌクレオチド配列は　　カードナー、アー
ル。

シー、等、　　１９８１年Ｃ）ａｒｄｎｅｒ、几、Ｃ，
、ｅｔ　ａｌ、。

１９８１に記載さｆＬ　ティｂ　、　ＣａＭＶ　０Ｍ４
１　Ｂ　４株が起源である。

ＣａＭＶプロモータ一部分をイー、コリＥ、ｃｏｌｉプ
ラスミドルＢａ３２２の誘導体、６Ｋｂコスミドｐｉ−
に７ｑ　（４９）ホーンズ、ビー、アンドコリンズ。

ジエイ、　１９８０年Ｈｏｈｎｓ、　Ｂ、ａｎｄ　Ｃｏ
１１ｉｎｓ　Ｊ、。

１９８０）［クローニングする。ＣａｘＶＮゲノムとコ
スミドｐＨＣ７９ｔ−Ｂｓｔ　ｎで切断し、得られたフ
ラグメントラ友がいに結合させる。

カリフラワーモザイクウィルス遺伝子■の５′−発現倶
号とＮＰＴ−Ｉｔ遺伝子のＢｉｎｄｌｌフラグメントを
プラスミドｐＪＰＡＸの中で、カリフラワーモザイクウ
ィルス遺伝子■のプロモータ一部分をＰｓｔ　１部位と
Ｈｉｎｄ［１部位の間に挿入することによって結合させ
る。得られたプラスミド金信号Ｈｉｎｄ［［部位で切断
し、プラスミドｐＫｍ　２１２　ａ　４の）ｉｉｎｄ　
ｉｌｌフラグメンｌｔ−この切断部位に両方向に挿入し
、プラスミドｐＪＰＡＸ　Ｃａｋｍ＋とｐＪＰＡＸＣａ
ｋｍ−を得る。ＮＰＴ−［雑種遺伝子の３７−末端信号
の近辺にＥｃｏＲＶ配列をつくるために、プラスミドｐ
ＪＰＡＸ　Ｃａｋｍ十のＢａｍＨＩ　７ラグメントをプ
ラスミドｐＢＲ３２７のＨａｍＨＩ部位に挿入する〔５
０）ソペロン、エックス、等ジーン９巻、　２Ｂ７−５
０５頁、１９８０年８ｏｂｅｒｏｎ、　Ｘ、ｅｔａｌ、
、　Ｇｅｎｅ　９　。

２８７−３０５（１９８０））。

プラスミドルＢａ３２７　Ｃａｋｍｔ−得る。この新し
いＤＮＡ構築を含むプラスミドｐＢＲ３２７Ｃａｋｍの
ＥｃｏＲｖフラグメントを、プラスミドｐＵＣ８の５ａ
ｌｌｔｓ位でクローニングしておいたカリフラワーモザ
イクウィルス遺伝子■のＥｃｏＲＶ部分と置換するため
に使う。その結果、Ｎ）’Ｔ−１遺伝子のタンパク質を
コードしたＬ）ＮＡは、カリフラワーモザイク９イルス
遺伝子Ｖの５７−および３′−発現信号の制御下におか
れる。この得られたプラスミドをｐＡｌｌＤ　ｌおよび
ｐＡｋ３Ｄ　ｌと呼ぶ（第１図参照）。

実施例２ ニコチアナタパクムシー、ブイ、プチハハンナＮ１ｃｏ
ｔｉａｎａ　Ｔａｂａｃｕｍ　Ｃ０Ｖ、Ｐｅｔｉｔ　Ｈ
ａｖａｎｎａのタバコ　プロトプラストを公知の方法に
よりタパ・コ。−の懸濁培養からつくる〔１２）ボトリ
カスアイ　アンドシリト　アールディー　メソーズイン
エンザイモロジー１１８巻、プラント　モレキュラーバ
イオロジー　エイ、アンドエイチ　ワイスバック編アカ
デミツク　プレス、オルランド。

１９８６年Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　　Ｉ　　ａｎｄ　　５ｈ
ｉｌｌｉｔｏ　　几り。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｕｏ
ｌ、１１　Ｂ、　ＰｌａｒｔＭｏｌｅｃａｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、　ｅｄｓ、　Ａ、ａｎｄ　Ｈ，Ｗｅｉｓｓ
ｂａｃｈ。

Ａｃａｄｅｍｉ　Ｐｉ　ｒｅｓｓ、　０ｒｌａｎｄｏ、
　１９８６　）。６週間の苗木培養から無菌的に完全に
広いた葉を取り、下記の組成を持り酵素溶液で十分にぬ
らす：酵素溶液：）ｉ、０　　　　　　　　　　　７０
ａｕシ四糖　　　　　　　　　１３２ マセロザイムｌ（，１（１０）Ｆ セルラーゼ　　　　　　　　　２ｆ 「オノズカ」几１０（ヤクルト株 大会社１日本Ｙａｋｕｌｔ　Ｃｏ、Ｌｔｄ、。

Ｊａｐａｎ） ドリセラーゼ（ヘミッシェフアプ リフ　　シェバイツエルハーレ、ス イ、ｘ、　　Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｆ’ａｂｒｉｋ　゛
：’＝パＳｃｈｗｅｉｚｅｒｈａｌ　ｌｅ、ＳＷｉ　ｔ
ｇｅｒｌａｎｄ）（１０）５ｆ フォン酸（ＭＥＳ）　　　　　　　α５ｍ１ｐＨ＆０ 次に葉を１乃至２ｃｒ１１角の大きさに切り、この角片
を上記の酵素溶液に浮かす。こｎｌ暗黒下。

２６℃で一夜放置する。この混合液をゆるやかに振とう
し、消化が完結するまで更に３０分間放置する。

次いで、この懸濁液を１（１０）μｍ幅のメツシュを持
つスチールの篩で濾過し、０６Ｍシロ糖（ＭＥｚ、　ｐ
Ｈ５，６）で十分にすすぎ、次に４（１０）０乃至５（
１０）０μｐｍで１０分間遠心分離する。液の表面にプ
ロトプラストが集υ、液を１例えば殺菌した注射器を使
用してプロトプラストの下の液を除去する。

プロトブラストヲ（１４）Ｍシ！１糖を含むに３Ａ培地
に再懸濁する〔シ四糖（１（１０）９６１’／４）：キ
シロース（α２５９／ｌ）：２．４−ジクロロフェノキ
シ酢！（（Ｌ１０ｆｆｌＦ／ｌ）；　１−す７’Ｆ−ル
酢酸（１，０（ｌｙ／ｌ）；６−ベンジルアミノプリン
（α２０　＋ｎＩ／　ｔ　）　＊ｐＨ５，８）（１２）
ポトリカス　アイ　アンド　シリト。

アール、ディー、等、　１９８１年Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、
　Ｉ　。

ａｎｄ　５ｈｉｌｌｉｔｏ、　ＲｏＤ、ｅｔ　ａｌ、、
　　１９８１　）。

形質転換を行うために、まずプロトプラストを洗浄し、
計数Ｌ　”ＣＷｓ培地（１５４ｍＭ　ＮａＣ１。

１２５ｍＭ　ＣａＣ４ｔ　Ｘ　２Ｈ！　０．５ｍＭ　Ｎ
Ｏ４５ｍＭグルコ−ス、ｐＨ５，６；　　　メンツエル
、エル、等、１９８１年Ｍｅｎｃｚｅｌ、　Ｌ、ｅｔ　
ａｔ、、　（１９８１）　）に１ｄ当＃）１乃至２．５
Ｘ１０’細胞の細胞濃度で再懸濁する。この濃度が分離
し九プロトプラストの生存４′ｔ−高くする。６乃至８
℃で３０分分間−た後、プロトプラストを形質転換実験
に使用する。

分離してプロトプラス）１−実際に形質転換する直前に
Ｗ５培地を実際の形質転換用培地で置換する。この培地
はマンニトール／マグネシウム溶液（ＭａＭｇ−溶液：
　Ｃｌ３−　０．５ｍＭ−ｒ　７　ニトール、１１１ｑ
Ｉ！ＩＭＥＳ（モルホリンエタンスルホンｉ！１り、ｐ
Ｈａ６）で１２乃至１６ｒｒＮｉのＭｇ意＋濃度を持つ
。

まず、プロトプラスｉ　１（１０）ｐで５分間遠心分離
してＷ１１溶液から分離し、ＭａＭ？培地（（Ｌ３ａｔ
ｊ）に再懸°濁する。プラスミドｐＡＢＤ　ｌ　５乃至
１０μｇとコウシ胸腺キャリアーＬＩＮＡ５０μｇｔ含
むＩ）ＮＡ水水溶液６御 ＤＮＡは形質転換挿入をしない中性キャリア７ＤＮＡで
，形質転換されるＤＮＡ　ｉヌクレアーゼ消化から保護
する比めにこの混液に過剰に加える。

ＤＮＡ添加後，約（１０）乃至１０分間経て、終濃度力
２　４　乃至２　８　’１６　（Ｗ／Ｖ）　Ｋナルまで
４０％ポリエチレングリコール水溶液（Ｗ／Ｖ）’を加
える。

０ＭＳ型のＰＥＧ＝ｉ使用すると特に有利であることが
証明されている。これはＣａ”十含有０４Ｍマンニトー
ル溶液（［ＬＩＭ　Ｃａ（ＮＯ３）　’１．４Ｈ２０）
で、約１（１０）０乃至６（１０）０の分子量を持つＰ
ＥＧを終＃度４　０　％　（Ｗ／Ｖ）　含ム。Ｃ　Ｏ　
溶液Ｏ　ｐＨ　ｆｉ　ｐＨ　７　乃至？である〔１５）
ネグルチェー，アイ、等，１９８６年−ａ　Ｎｅｇｒｕ
ｔｉｕ，　Ｉ，　ｅｔａｌ．、　（　１　９８６ａ　）
　）。

ニコチアナ　タバクム　シー、ブイ、ブチハバを使用す
ると望ましい。次いで、形質転換培地のｐＨ値をｐＨ　
７に調整し，この混液を時々振とうしながら２６℃で３
０分間放置する。

もし２０％以上の高濃度のＰＥＧを使用する場合，α２
　Ｍ　ＣａＣｌ２溶液３乃至５倍量でゆりくりと希釈す
るのがよい。このようにして処理したプロトプラストを
つぎに遠心分離しく１（１０）ｆで５分間）、新たに４
培地に再懸濁する（１０Ｍの新しいに３培地にα３ゴブ
ロトブラスト溶液）。

直径１０ｍのペトリ皿に１０ｄを入れて遮光下に２４０
で更にインキュベイン１ンを行う。

この時の細胞濃度は１ｄ当９４乃至８Ｘ１０’プロトプ
ラストである。３日後に，培地をペトリ皿当シに３培地
α３容量部で希釈し，　３（１０）０ルクスの人工光線
を当て２４℃で更に４日間インキエベイシ日ンを続ける
。全部で７日経た後，プロトプラストから生じ九クロー
ンｆ５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含み１チアガロース
で固めた栄養培地に埋め．「ビーズ型」培養法〔５１）
シ・リド、アール、ティー、等，フラントーτ・セル、
レボーツ　２巻，２４４−２４７頁，　　１９８３年５
６ｉ１１ｉｔｏ，　Ｒ９Ｄ．ｅｔａｌ．、　Ｐｌａｎｔ
　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ。

２、２４４−２４７（１９８５））に従って遮光下に２
４℃で培養する。栄養培地を同じ栄養液の新しいもので
５日毎に取換える。

実施例５ カナマイシン含有栄養培地で３乃至４週間続けて培養し
た後、直径２乃至５ｒｔａの耐性カルスｔＬｓ培地（４
３）ＩＪタンスイヤー，イー、エム。

アンドスクーク，ニス、アイジオロジカルプラント　１
８巻，１（１０）−１２７頁，１９６５年Ｌｉｎｓｍａ
ｉｅｒ，　ＥｏＭ．ａｎｄ　８ｋｏｏｋ，　Ｆ．、　Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ，　Ｐｌａｎｔ上見，１（１０）−１２７
（１９６５））で寒天で固め，２。

４−ジクロロフェノキシ酢酸（１６）５１Ｔｔｇ／４　
１−すフチル酢ｍ２ｍ１／ｌ、６−ベンジルアミツブリ
ンＣＬ１ｒＮＩ／ｌ、キネチン（１０）叩／ｌおよびカ
ナマイシン１５０ｍ５＋／　Ｌ　’に含むものに移植す
る。カナマイシン１５０　ｍｙ／　ｔおよび６−ベンジ
ルアミノプリン（３２）Ｆ９／Ｌを含むｈｓ培地で動歯
を誘導し、Ｔ培地〔４５）ニッチ−、クイ。ビー、ア７
）”Ｃ８＝ッチュ、サイエンス１６５巻、８５−８７頁
、　　１９６９年Ｎ目ｓｃｈ、　Ｙ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｃ
０Ｎｉ　ｔｓｃｈ　。

５ｃｉｅｎｃｅ　１−６３．８５−８７（１９６９））
で根を形成させて変種ブチハパンナエスアールＩ　　Ｐ
ｅｔｉｔＨｏｖａｎｎａ　ＳＲ１のカナマイシン耐性テ
コチアナタパクＡ　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ
ｍ植物を得る。

実施例４ プロトプラストの分離および実際の形質転換実験の友め
に行うプロトプラストの前培養ヲ二コチアナタバクムエ
スアールＩ　Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ　８几
１について記載した方法と全く同じようにして実施する
。

前に示したようＫして前処理したニコチアナプに７パギ
ニフオリアＮ、　ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａプロ
トプラストの実際の形質転換を、２２乃至２７ｍＭのＭ
ｇＭ＋イオン濃度を持つマンニトール／マグネシウム溶
液（ＭａＭｇ溶液：０．４乃至α５蘭マンニトール、１
１％ＭＥＮ（モルホリンエタンスルホン酸）、ｐＨ５，
６）中で行う。プラスミドｐＡＢＩＩＩ５乃至１０μｇ
とコック胸腺キャリアーＤＮＡ５０μｇを含むＤＮＡ水
溶液（６５μｔ）を加えた後、終濃度が１８乃至２２％
（Ｗ／Ｖ　）に達するまで４０チポリエチレングリコー
ル水溶液（Ｗ／Ｖ）を加える。Ｌ）ＮＡ添加とＰＥＧ−
１加えるまでの時間は、一般に約［Ｌｌ乃至１０分間に
すぎない。ＰＥＧ　ＣＭＳ　４（１０）０を使用すると
ニコチアナプルンバギニフォリア　Ｎ１ｃｏｔｉａｕａ
　ｐｌｎｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａの場合にも高形質転
換率を得るのに特に有利であることが証明さｔした。次
に形質転換培地のｐＨｆ：ｐＨ７に調整する。形質転換
溶液を２６℃で約５０分間、液を時々振とうしながらイ
ンキ瓢ペイジョンを行う。

最初に分離したプロトプラストを細胞濃度２乃至３Ｘ１
０’プロトプラスト／−で、高ホルモ７ａＫ（Ｄ培地（
ＣＫＡ、ＡＯ培地、４２）インスタル。

ピー、等、ジャーナルオププラレト　アイジオロジー１
１９巻、４４３−４５４頁、１９８５年１ｎｓｔａｌｌ
ｅ、　Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、　１１９　。

４４５−４５４．（１９８５））中、４乃至１２日間培
養する。

細胞凝集的ができ次後に、生存コロニーを選択し、計数
して、２０乃至４０Ｗ９／を硫酸カナマイシンを含む低
ホルモン＃度のＭＤｓ培地（４４）ネグルチェ、アイ、
等セオリティ力ルアンドアプライドゼネティックス６６
巻、　３４１−３４７頁、１９℃３年Ｎｅｇｒｕｔｉｕ
、　１．ｅｔａｌ、、Ｔｈｅｏｖ。

Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、６６．５４１−５４７．（１９
８３））またはＭＡＰ　、　ＡＯ培地〔４２）インスタ
ル、ビー、等。

１９８５年１ｎｓｔａｌｌｅ、　Ｐ、ｅｔａｌ、、　（
１９８５）　）中で大希釈して（α５乃至２Ｘ１０”コ
ロニー／ｍｌ）して懸濁する。次にコロニーを寒天（１
％アガロース）に埋め、「ビーズ型」培養法〔５１）シ
リト。

アール、ディー、等、　　１９８５年５ｈｉｌｌｉｔｏ
、　Ｒ１，Ｄ。

ｅｔａｌ、、　（１９８３）　）に従って遮光下に２４
℃の温度で培養する。栄養培地を同じ培養溶液の新しい
もので５日毎に取換える。

実施例５ ５乃至４週間培養した後、直径２乃至５Ｗ＋に達した耐
性カルス全選択し、カナマイシン５０曙／ｌを含む固体
培地で更に５乃至５週間培養する。

耐性カルスｔ−ｆＬＰ培地から几’ＳＡおよび／または
Ｍ培地に移植することによす４２）インスタル。

ビー、等、１９８５年　Ｉｎ５ｔａｌｌｅ、　Ｐ、　ｅ
ｔ　ａｌ、。

（１９８５）の詳細にしたがって全植物体１’）生ずる
。

実施例６ 形質転換された細胞培養からのカルスまたはそれから再
生した植物からの葉組織α５ｔを。

エチレンジアミンＮ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’−テトラ酢
酸（ＥＤＴＡ　）　５０　ｒｒｍｏｌ／ｌ　、塩化ナト
リウムα２５ｍｏｌ／ｌおよびα、α、α−トリスー（
ヒドロキシメチル）−メチルアミン塩１！＃（トリス−
１−１ｃｔ　）　５０ｍｍｏシｔ１ｆ！：含む１５％シ
、糖溶液、ｐＨａｏ中、Ｏ℃で磨砕する。ホモジネート
を丁（１０）０ｐ、５分間遠心分離して核をほぼ分離す
る。この細胞核をＥＤＴＡ　５ｍｍｏｌ／ｌとトリス−
ＨＣＬ　５０　ｍｍｏｔ／　Ｌを含む１５％イヨ糖溶液
ｐＨａＯに再懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度
が０．２％になるまで加え、全体を７０℃で１０分間加
熱する。

混液を２０乃至２５℃に冷却し、酢酸カリウムを濃度が
０．５　ｍｏｔ／　ｔになるまで加える。この混合液を
０℃で１時間置く。生じた沈ｌｉを遠心分１１１［ｉ（
微量遠心分離機で４℃、１５分間）する。

ＤＮＡｔ−２，５倍量のエタノールを加えて２ｏ乃至２
５℃で上澄液から沈殿させる。分離したＤＮＡをリボヌ
クレアーゼ１０μｇ／ｘｉ　含ム）　ＩＪスーＨＣＬ　
１０　ｍｍｏＬ／Ｌの溶液に溶解し、６７℃で１０分間
反応させた後、ブロティナーゼＫｔ−２５０μｇ／ａ＋
ｊの濃度になるまで加え、全体を３７℃で更に１時間イ
ンキエベイシ■ンを行う。ブロティナーゼＫｉフェノー
ルおよびクロロホルム／イソアミルアルコール抽出処理
で除去する。

ＤＮＡｆ：（Ｌ　６　Ｍ酢酸ナトリウムのイソプロピル
溶液ＣＬ６容量部を加えて水相から沈殿させ、トリ、ｘ
、　−ＨＣＬ　１０　ｍｍｏｔ／　ｌとＥＤＴＡ　５　
ｍｍｏｔ／ｌヲ含む溶液ｐ　Ｈ７，５の５０μを甲に溶
解する。この調製により、はとんどがｓｏ、ｏｏｏ以上
の塩基対を含むＤＮＡ配列を得る。ｈ：ｃｏＲＶエンド
ヌクレアーゼによるこのＤＮＡの制限分解、放射線標識
したＮＰＴ−ｎ遺伝子のＨｉｎｄ［ｌフラグメントとこ
のフラグメントのハイプリダイゼイシヲン、サザンプロ
ット分析におけるプラスミドｐＡｔ３Ｄ　ｌとの比較か
ら、形質転換されたニフチアナタバク細胞の細胞核ＤＮ
Ａ中にＮＰＴ−ｎ遺伝子が存在することが明かとなる。

結果の部 以下に実施した形質転換の結果全種々の形質転換パラメ
ータとの関係で考察する。

得らｎた形質転換率は「相対形質転換頻度」（ＲＴＦ’
）と「絶対形質転換頻度Ｊ　（ＡＴＦ）の形で示す。

「相対形質転換頻度」は形質転換されたものの数と非選
択的に培養されたプロトプラスト数の生存画分（コロニ
ーを形成できる）との比を表わす。一方、「絶対形質転
換頻度」は同じ形質転換されたものの数と、形質転換前
に生きていたプロトプラストの最初の数との比として定
義される。

ＡＴ壬゛と几ＴＦの比較は個々の形質転換と選択段階が
実施さ扛た後のプロトプラストの生存率について良好な
指標となる。

対する影響 第１表：ニコチアナブルンバギニ７オリアＮ１ｃｏｔｉ
ａｎａ　ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａプロトプラス
トの場合の形質転換率（ＲＴＦおよびＡ’ｌ’Ｆ）に対
するＤＮＡ構造とキャリアーＤＮＡに対するプラスミド
ＤＮＡ（ｐＡＢＤ　Ｉ　）濃度の比の影響形質転換実験
はＭａＣａ溶液中、　ＰＥＧ　０Ｍ８４　ｄ１度１３チ
で行った。

形質転換率に対する１）ＮＡ槽構造影響をニコチアナブ
ルンバギニフォリア　Ｎ１ｃｏｔ　ｉａｎａｐｌｕｍｂ
ａｇｉｎｉｆｏｌｉａ　ｆ例として示す（第１表）。

実施し次形質転換実験において、環状ＪＪＮＡよシ直線
状ＤＮＡを用いた方が明らかに高い形質転換率が冥現す
ることは明らかである。直線状１）ＮＡの場合に得らｎ
た形質転換率は環状ＤＮＡを使って得られた値よシ１０
の２乗近く高い。

第１表では、ＤＮＡ構造のみならず加えたキャリアーＤ
ＮＡに対するプラスミド１）ＮＡの比も得られる形質転
換頻度に影響を持つことが明らかに示されている。

キャリアーＤＮＡがプラスミドＬ）ＮＡに対して明らか
に過剰の時に最良の結果が得られ。

１［１：５０（プラスミドＬ）ＮＡ　：キャリアーＤＮ
Ａ）の比が特に有利である。

ここに得られた結果にタバコの葉ですでに得られていた
結果を確認している〔１０）シリト。

アール、尋バイオ／テクノロジー５巻、　１９８５年５
ｈｉｌｌｉｔｏ、几、Ｄ、ｅｔａｌ、、　Ｂｉｏ／Ｉ’
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５、（１９８５））。

第２表：ニコチアナプルンバギニフオリアＮ１ｃｏｔｊ
ａｎａ　ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏ目ａおよびニコチア
ナ　タバクム　シー、ブイ、プチハバンナエの形質転換
１（）ｌ、ＴＦ’およびＡＴＦ　）に対するＰ　ＥＧ　
４度の影響。

形質転換実験はＷＳ塩溶液中、プラスミドＤＮＡのキャ
リアーＤＮＡに対する濃度比に５で実施した。

第２表はニコチアナ　タパクム　ニスアールいて得られ
る形質転換頻度に対する異ったＰＥＧ濃風の影響を明確
に示している。いずれの場合にも、ふたつのパラメータ
ー間の明らかな関連を見分けることが可能である。ニコ
チアナブブルンバギニフオリアエメユ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌ　ｉａ　Ｑ）　＠合、　Ｐ
Ｅ（１１）度を８チから２７％に高めると、そしてニコ
チアナ　タ１３％から２６％に高めると、形質転換率は
それぞれＣＬＯ３Ｘ１０’からα２８ｘ１０　’および
（１４）６Ｘ１０　’から１．２Ｘ１０’に上昇する。

第５宍：ニコチアナ　タバクム　ニスアールＩ　Ｎ−ｔ
ａｂａｃｕｍ　Ｓ几１プロトプラストの形質転換率に対
するＭｇＣｔ！濃度、適用時期、使用するＰＥＧ溶液、
および高ＰＥＧ濃度（〉２５％）便用時の洗浄条件の影
響。

終濃度２０チのＰＥ（１０）ＭＳ４およびＰＥＧ　ＣＭ
Ｓ　６溶液を形質転換率実験に使用した（例外は表中で
別に示している）。

米ＭａＭｇ＝＝−ｍｂＡｆ１ＭａＭｇ溶液中のＭ　ｇ　
ＣＬ！濃１ｆｔ示す。

ａ）適用の時期：第５表かられかるように最高の結果、
形質転換率４．ｌＸ１０−３はＭｇｃｔ。

を実際の形質転換の直前に形質転換培地に加えることに
よって得ることができる。

これに対し、　ＭｇＣ２！を適用して２時間後まで形質
転換を行わない場合には、形質転換率は１．２Ｘ１０−
’にとどまる。

また、　マｙニトール／ＭｇＣ７ｚ溶液（ＭａＭｇ溶液
）をＷｓ塩溶液と１：１の比率で組合せた時にも、　Ｍ
ｇＣ１ｍのそル濃度に依存して多かれ少なかれ形質転換
頻度の低下がおこる。例えばＭａＭｇ溶液のＭｇｅｔ、
濃度を半分にした場合、形質転換率の低下は約２０％で
ある。

一方、適当な緩衝液（Ｗｓ浴溶液たはＨｅＮａ／Ｆａｇ
）（”）クロム、エム、等プロシーディングズオプナシ
四ナルアカデミーオブ サイエンシズオブユナイテッドステイッオブアメリカ　
８２巻、　　５８４２−５８４８頁。

１９８５年Ｆｒｏｍｍ、　Ｍ、　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃｅｄ、８ｃｉ、　Ｕ８Ａ　８２．５８４２−５８４
８゜（１９８５））のみを存在させ、Ｍｇ２＋を存在さ
せないで行った対照実験の結果と比較すると、この場合
にはその形質転換類ｉｔは１０の１乗以上低くなってい
るのがわかる。上記で考察したように高い形質転換率は
エレクトロボレイションを伴っても実現することはでき
ない。

ＰＥＧ／Ｍｇ”十相乗作用：Ｍｇ”＋イオンとＰＥＧを
同時に使用した場合の相乗作用は、ＭｇＣｔ、の存在下
（６ｍＭ）でＰＥＧを添加せずに行りた対照の形質転換
結果とＭｇＣ６，およびＰＥＧをいっしょに使用した実
際の実施例のものを比較すれば非常に明白に示さｎてい
る（第５表）。

ＭｇＣｔ、、は６ｍＭの濃度で存在するがＰＥＧを加え
ない対照実験では形質転換の例を全く検出できない。

、−ｎＫ対し　、　ＰＥＧｔ−（最ｉ！　２０　％Ｗ／
Ｖ　テ）ＭｇＣ１，含有形質転換培地にＤＮＡ添加直後
に（Ｃ１乃至１０分後）加えることによシ上記の４．ｌ
Ｘ１０３という高い形質転換率を実現できる。

この形質転換率はＭｇＣ２，を添加せずにＰＥＧのみを
使用した比較例（第２表参照）に比較しても１０の１乗
以上高い。

１２乃至１５ｍＭの濃度範囲のＭｇＣｔ２と同時に２８
チの濃度のＰＥＧ　ＣＭＳを使って最高の形質転換率が
得られるタバコの場合（第２Ｂ図）Ｋ対し、ニコナアナ
ブルンバギニフォリアＮ、ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌ
ｉａの場合の最適範囲はよシ高いＭｇ０４価の傾向にあ
る（第２Ａ図参照）。

Ｃ（７）場合、２０乃至５０　ｍＭ　（Ｄ　１ｉＡ囲の
ＭｇＣＬｚ濃度と２０チのＰＥＧ濃度で最高形質転換率
が得られている。こ、れらによりＡ９Ｘ１０　’の形質
転換率が得られる。

ＰＥＧ組成：前述したパラメーターの外に、使用するＰ
ＥＧ１液の組成も得られる形質転換率に影響する。ｐｇ
ｏ　０Ｍ８　　　ネグルチェー。

アイ、等、　　１９８６年ａ　　Ｎｅｇｒｕｔｉｕ、　
ｌ、　ｅｔａｌ、。

（１９８６ａ）およびＰｊｌ；Ｇ６１（，１０）シリト
、アール。

ディー、等、１９８５年　５ｈｉｌｌｉｔｏ、　Ｒ，ｉ
）、ｅｔ　ａｌ　＋＃（１９８５）を他の条件は同じに
して使用し次場合（Ｐ）！：Ｇ濃度２４％、　ＭｇＣ４
濃度１２ｍＭ）、前者の場合に明らかに高い形質転換率
が得られ、これは１．４倍高い。

もし２４％にコチアナプルンパギニフォリ７　　Ｎ、ｐ
ｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａの場合は２０％）の高い
）’ＥＧｆｉ度の場合、α２Ｍ　Ｃａ　Ｃ１４ｘ　２Ｈ
２０含有溶液で処理プロトプラストを洗浄することが有
利であることが証明された。

このようにする結果として、形質転換率は単に塩ｍ液（
Ｗｓ浴溶液のみによる処理に比較して１７倍上昇する。

達の検出 遺伝的変性を受けた植物（第一世代および子孫）の詳し
い遺伝学的雑種分析と詳細な分子生物学的研究（例えば
植物ゲノムのＤＮＡのサザンプロット分析；アミノグリ
コシドデホスホトランスフェラーゼ、すなわちカナマイ
シン−特異リン酸化の酵素の酵素活性の検討）から次の
ような結果が得られた： １、　細菌の遺伝子は植物ゲノムに安定して組込まれて
いる； ２一般に、雑攬子孫に変化せず規則的に移入さｎている
； 五　七の遺伝子型は天然の単純で優性の植物遺伝子のも
のに相当する； ４、　　ＤＮＡハイプリタ゛イゼイションと酵素試験に
よる分子的分析は遺伝学的雑種分析の結果を確認； ｉ　遺伝的に変性された植物は処理中にその正常な天然
の表現型を保持し；その結果。

望ましくない変性は確認されなかった。

以上の結果から、植物材料の調節された遺伝的変性の最
良の方法は本発明によるプロトプラストへの直接遺伝子
移入法によることがわかった。その遺伝的変性は安定し
ており。

植物の遺伝型の望ましくない変化は起らない。

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エ、エイチ、、「テンシドータッシェンブーフ」、カル
ルハンザー　フエアラーク、ミ二ニヒ／ヴイエンナ、１
９８１年Ｍｃ　ＣｕｔｃｈｅｏｎｓＬ）ｅｔｅｒｇｅｎ
ｔｏ　　ａｎｄ　　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　　Ａｕｎ
ｎａｌ、ＭｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、　Ｒ
ｉｄｇｅｗｏｏｄ　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ。

１９８１　；　５ｔａｃｈｅ、　Ｈｌ、　−Ｔｅｎｓｉ
ｄ−Ｔａｓｃｈｅｎｋｕｃｈ”。

Ｃａｒｌ　Ｈａｎｓｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｍｕｎｎｉ
ｃｈ／Ｖｉｅｎｎａ、　１９８１１ｉネグルチェー、ア
イ、等、セオリティ力ルアンド　アプライドゼネティッ
クス、７２巻。

２７９−２８６頁、　　１９８６年−ａ　　Ｎｅｇｒｕ
ｔｉｎ、　Ｉ。

（１９８６ａ） １＆　ウィーナント、ニー、等、モレキエラーアンドゼ
ネラルゼネティツクス、１８２巻。

４４０−４４４頁、１９８１年Ｗｉ　ｅｎ　ａｎｄ、　
Ｖ、ｅ　ｔ　ａ　ｌ　、。

Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、　１８２．４４０−４
４４（１９８１）１Ｚ　　ベン力、ディー、等ネイチャ
ー、３（１０）巻。

２１４−２２１頁、　　１９８３／４Ｐｅｎｎｉｃａ、
Ｄ、ｅｔａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、３（１０），２１４−２２１．（１９８
３）１ａ　　ステビーン、ビー、等ジーン、２４巻。

２８９−２９７頁、　１９８３年５ｔｅｐｉｅｎ、　Ｐ
、ｅｔａｌ、。

Ｇｅｎｅ、　２４．２８９−２９７．　（１９８３）１
９、　　マニアティス、ティー、等、モレキュラークロ
ーニング、コールトスプリングツ１−ノ（−ラボラトリ
−（１０）９８２年Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ｅｔ　ａ
ｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ頃ＬＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２ ２［Ｌ　　フランク、ジー、′Ｊ、セル、２１巻、　２
８５−２９４頁、１９８０年Ｆｒａｎｃｋ、　Ｇ、　ｅ
　ｔ　ａ　ｌ　、、　Ｃｅ　ｌ−占旦：２８５−２９４
．１９８０ ２１、　　ホーン等、「モレキュラー　）ぐイオロジー
オププラント　テユーモアズ」アカデミツクプレス、ニ
ューヨーク、５４９−５６０頁、　１９８２ｐａｇｅ　
５４９−５６０　１９８２ ２１へＩＪ−ロー等、ジャーナルオプモレキュラー　ア
ンドアブライドゼネティククス、１巻、４８３−４９８
頁、　１９８２年Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ　ｅｔａｌ、。

ＪｏＭｏｌ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、　１　：４８３
−４９８．１９８２２Ｓ　　ゼネティック　エンジニア
リングオプ　ブランツ、アンアグリカルチエラルパース
ベクティブエイ、カシェモア編、ブレナム。

ニューヨーク、　　１９８３年、２９−３８頁、　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃＹａｒｋ　１９８３．　ｐａｇｅ　２９−３
８２４、　　コルジ、ジー、等ザジャーナルオプパイオ
ロジカルケミストリー、２５８巻、　ｉ３９９２り、　
　ダンスミエア、ビー、等ジャーナルオプモレキュラー
　゛ｒンドアペライドゼネティククス　２巻、２８５頁
、　１９８３年Ｄｕｎｓｍｕｉｒ　Ｐｅｔ　ａｌ、、　
Ｊ９Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、　２　：　２８
５．１９８３２＆　ガードナー　アールシー等、タクレ
イックアシッヅ　リサーチ　９巻１２号、　　２８７１
−２１　　ロドリゲス、アール、エル、アンドティト、
アール、シー、リコンビナント　Ｉ）ＮＡテクニックス
、アジソンータエズリー　パブリッシング　コーボレー
シ璽ン、ロンドンアムステルダム、ド／ミルズ、オンタ
リオ、シトニー、トウキ９９，１９８３年Ｒｏｄｒｉｇ
ｕｅｚ、　ＲｏＣｏｒｐ、、　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ａｍｓ
　ｔｅ　ｒｄａｍ、　Ｄｏｎ　Ｍｉ　ｌ　Ｉ　ｓ、　Ｏ
ｎ　ｔａｒ　ｉｏ。

５ｙｄｎｅｙ、　Ｔｏｋｙｏ、　１９８３２ａ　　メッ
ンング、ジエイ、アンド　ヴイエイラ。

ジェイ、ジーン、１９巻、　　２６９−２７６頁。

１９８２年Ｍｑｓｓｉｎｇ、　Ｊ＋ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒ
ａ、　Ｊ、、　ｇｅｎｅ。

１９．２６９−２７６、（１９８２） ２９　　エバンス等「フロドブラスト　アイソレージ冒
ンアンドカルチャー」、ハンドブック　オブプラント　
セルカルチャー　１巻。

１２４−１７６頁（マクミランパブリッシングカンパニ
ー、ニエーヨーク、１９８３年Ｅｖａｎ。

ｅｔａｌ＋、　”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｌ５ｏｌａｔ
ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ”ｉｎ　Ｈａｎｄｐｏ
ｏｋ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、
　１　：１２４　：　１７６（Ｍａｃ　Ｍｉｌｌａｎ　
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８３　）　：３α　ディビー
　エムアール、「リーセント　ディペロップメンツ　イ
ンザカルチャー　アンドリゼネレイシ四ン　オププラン
ト　プロトプラスト」プロトプラスツ、１９８３−レク
チャーブロシーディングズ　１９−２９頁、（ビルクホ
イザー、バーゼ、１１／、１９８３年）　Ｄａｖｅｙ　
ＭＲ。

”Ｒｅｃｅｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔ
ｈｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　、・Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、
”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、１９８ｓ−Ｌｅｃｔｕｒｅ
　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ。

ｐｅｇｅ　　１９−２９．　　（Ｂｉｒｋｈ’ｊｕｓｅ
ｒ、Ｂａ５ｅｌ、　１９８３）３１、　　ディル　ピー
シエイ、「プロトプラスト　カルチャーアンドプラント
　リゼネレーシ四ンオプシーリアルスアンドアザー　リ
カルシトラント　クロッブス」、プロトプラスト　１９
８５−レフチャー　プロシーディングズ。

５１−４１頁（ビルクホイザー、バーゼル１９８３年）
　　Ｄａｌｅ　ＰＪ、’Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　Ｃｅｒｅａｌｓ　ａｎｄｌ　９８５−Ｌｅｃ
ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、　ｐａｇｅ　３１
−４１（Ｂｉｒｋｈｎｕｓｅｒ、　Ｂａ５ｅｌ　　１９
８３　）３２、　　パインディングエイチ、「リゼネレ
イション　オプブランツ」、プラント　プロトプラスト
　２１−３７頁、（シーアールシープレス。

ホカレイト７１９８５年）　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｈ。

”Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ”、
　ｉｎ　ＰｌａｎｔＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、　５ｅｉ
ｔｅ　２１−３７．　（ＣＲＣＰｒｅｓｓ。

Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　１９８５　）５五　アブダラ
ー　アール等、バイオ／テクノロジー、４巻、１０８７
−１（１１）０頁、１９８６年３４°　フジムラ　ティ
ー等、プラント　ティシェーカルチャー　レターズ、２
巻、７４−７５頁。

３５、トリャマケイ６等、セオリティ力ルアンドアプラ
イド　ゼネティックス、７ｓ巻ｍ　１ｂ−５＆　ヤマダ
　７４０等プラント　セルレボーツ。

５巻、８５−８８頁、　１９ａ６年Ｙａｍａｄａ　Ｙ、
　ｅｔ　ａｌ、。

３７、　　サザーン、イー、エム０．シャーナルオプモ
レキュラーパイオロジー、９８巻、５０３−９８．５０
３−５１７．（１９７５） ５ａ　　リグビー、ダブり二一、ジェイ０等、ジャ−ナ
ルオプモレキュラーバイオロジー。

１１３巻、２３７−２５１．１９７７年几ｉｇｂｙ、Ｗ
、Ｊ。

３９、　　フロム、エム、等、フロシーディングズオプ
ザナシ冒ナルアカデミーオブサイエンシズオプザユナイ
テッドステイッオプアメリカ　８２巻、５８４２−５８
４８頁、１９８５年８２．５８４２−５８４８．（１９
８５）４α　シリト、アール、ディー、等、ミス−ティ
ジョン　リサーチ　８１巻、１６５−１７５頁。

４１、　　ナシ、ジエイ、アイ　アンドビー、マリガ。

ツァイトウングデアブフランツエンアイジオロギー、７
８巻、４５３−４５５頁、１９７６年Ｎａｇｙ、　Ｊ、
Ｉ　ａｎｄ　Ｐ８Ｍａｌｉｇａ、　Ｚ。

Ｐｆ　Ｉａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ、　７８．
４５３−４５５４２、　　インスタレ、ビー等、ジャー
ナルオププラント　アイジオロジー、１１９巻、４４３
−４５４頁、１９８５年Ｉｎ５ｔａｌｌｅ、Ｐ、ｅｔａ
ｌ、、　Ｊ、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、、　１１９．
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、イー、エム、アンドスクーク、工乙、アイジオロジカ
ルプラ／ト。

１８巻、１（１０）−１２７頁、１９６５年Ｌｉｎｓｍ
ａｉｅｒ。

ＥｏＭ、ａｎｄ　５ｋｏｏｋ、　ｋ’、、　Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、Ｐｌａｎｔ、　１　Ｂ。

１（１０）−１２７．（１９６５） ４４　　ネグルチェー、アイ、等、セオリティ力ルアン
ドアプライドゼネティックス、６６巻。

３４１−３４７頁、１９８３年Ｎｅｇｒｕｔｉｕ、　１
．ｅｔａｌ、。

４５、　　ニツチェ、ジエイ、ピー、アンドニッチュシ
ー、ｌ　サイエンス、１６６巻、８５−８７頁。

１９６９年Ｎ１ｔｓｃｈ、　Ｊ、Ｐ、ａｎｄ　Ｎ１ｔｓ
ｃｈ　Ｃ，。

５ｃｉｅｎｃｅ、　１６３．８５−８７．　（１９６９
）４＆　メンツエル、エル、等セオリティ力ルアンド　
アプライドゼネティックス、５９巻。

１９１−１９５頁、　１９８１年Ｍｅｎｃｚｅｌ、　Ｌ
、ｅｔ　ａｌ　、。

Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、５９，１９１−
１９５゜４７、　　ペック、イー等、ジーン、１９巻、
３２７−３６６頁、１９８２年Ｂｅａｋ、　Ｅ、ｅｔ　
ａｌ　、、　Ｇｅｎｅ、　１９　。

３２７−３５６．（１９８２） ４ａ　　セコプセン、エイナ０等　　ヨーロクビアンジ
ャーナルオブバイオケミストＩＪ−４５巻。

６２３頁、１９７４年Ｊａｃｏｂｓｅｎ、　）ｉ、　ｅ
ｔ　ａｌ　、、　　Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４５．６２５．　（１９７４
）４９、　　ホーン　ビーアンドコリンズジエイ、ジー
７１１巻、２９１−２９８頁、１９８０年Ｈｏ　ｈ　ｎ
Ｂ　　　ａｎｄｃｏｌｌｉｎｓ　　Ｊ、、　　Ｇｅｎｅ
、　　　９．　２８７−３０５゜５α　ソベロン、エッ
クスｔ　’４＊　　”−ン、９巻。

２８７−３０５頁、１９８０年５ｏｂｅｒｏｎ、　Ｘ、
　＝ｔ　ａｌ　ｅｔ（）ｅｎｅ、９，２８７−３０５．
（１９８０）５１、　　シリト、アール、ディー、等プ
ラント　セルレボーツ　２巻、２４４−２４７頁、１９
８３年５ｈｉｌＪｉｔｏ、　ＲｏＤ、ｅｔａｌ、、　Ｐ
ｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ几ｅｐｏｒｔｓ。

２　２４４−２４７．（１９８３）

【図面の簡単な説明】

第１図はＮＰＴ−■構造遺伝子を含むプラスミドベクタ
ーｐＡＢＩ）　ＩとｐＡＢＤ　ｌｌの構築を表わす図、
第２図はニコチアナ　タバクム　シー、ブイ。 プチハパンナエスアール１　（Ｎｉｃｏｆｉａｎａｔａ
ｂａｃｕｍ　Ｃ０Ｖ、Ｐｅｔｉｔ　Ｈａｖａｎｎａ　８
几りにおける（ＡおよびＢ）、およびニコチアナプルン
バギニ７．す７　（Ｎｉｃｏｔｊａｎａ　ｐｌｕｍｂａ
ｇｉｎｉｆｏｌｉａ）における（５）形質転換率に対す
るＭｇＣ４，濃度（５）およびＭｇＣＬｓ／ＰＥＧ相互
作用（Ｂ）の影響を表わすグラフである。 グラフＡ中１曲線ａはＮ、ｔａｂａｃｕｍ　８）ｔｌ　
。 曲線すはＮ、ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌ　ｉａである
。 ＭｇＣｔｚ　ａ　Ｗは片対数スケール（横軸）で示す（
ＰＥｏ濃ｙ　２０％（Ｗ／Ｖ））。 グラフＢ中、曲線ａは１５　ｍＭ　ＭｇＣ１５。 曲線すは３０　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚである。 ニＭツ クｚ２多乙２イｚ２：　ＮＰＴＩＩ　　　１％　五Ａｅ
＋ウリ肋クーを寸゛イアウィルスの１イ＊＋ＶＩｔｌ？
力Ｊ１＠　：　７°う１＋）’ｐＡＢＤ１ｃｐＡＢＤＩ
［ｅｉ１％東二Ｔ翫Ｃ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）植物プロトプラストをいかなるものでもより植物
   組織から分離し、植物プロトプラストを培養するために
   通常使用される栄養培地のひとつで培養し； 実際の形質転換前に、前記プロトプラストを、Ｃａ＾２
   ＾＋、Ｋ＾＋およびＮａ＾＋イオンおよび適当な炭素源
   をも含む前培養培地で４°乃至１０℃の温度で、２０分
   乃至６時間前培養し； 次いで該プロトプラストをこの前培養培地から分離し、
   Ｃａ＾２＾＋イオンの存在下または非存在下に０．１乃
   至６０ｍＭＭｇ＾２＾＋イオンを必須成分として含む実
   際の形質転換培地に再懸濁し； その後すぐに、植物中で活性な発現信号の制御下のひと
   つ以上の遺伝子および支持ＤＮＡをも含むＤＮＡ試料を
   形質転換溶液に加え；０．１乃至１０分後、原形質膜変
   性剤を加え；プロトプラストとＤＮＡ試料を上記の形質
   転換溶液中で、ＤＮＡのプロトプラストへの取込みが十
   分である時間、インキュベイションを行う、 植物遺伝型の形質転換法。 （２）形質転換溶液がＭｇ＾２＾＋イオンを１０乃至３
   ０ｍＭの濃度で含む特許請求の範囲第（１）項記載の方
   法。 （３）原形質膜変性剤がポリエチレングリコールである
   特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （４）インキュベイション培地におけるポリエチレング
   リコールの終濃度が１０％乃至３０％である特許請求の
   範囲第（３）項記載の方法。 （５）ポリエチレングリコールの終濃度が２０％乃至２
   ８％である特許請求の範囲第（４）項記載の方法。 （６）インキュベイション溶液のｐＨ値がｐＨ５．６乃
   至ｐＨ１２である特許請求の範囲第（１）項記載の方法
   。 （７）インキュベイション溶液のｐＨ値がｐＨ７乃至ｐ
   Ｈ１０である特許請求の範囲第（６）項記載の方法。 （８）植物で活性である発現信号の制御下にあるいかな
   る起源でもよいもののうち、ひとつ以上の遺伝子および
   支持ＤＮＡを含むＤＮＡ試料の濃度が２乃至２０μｇ／
   ｍｌある特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （９）ＤＮＡ試料の濃度が５乃至１０μｇ／ｍｌである
   特許請求の範囲第（８）項記載の方法。 （１０）形質転換遺伝子を持たない中性のＤＮＡをキャ
   リァーＤＮＡとして過剰に形質転換溶液に更に加える特
   許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （１１）中性のＤＮＡが動物ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、λ−
   ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたは本法を実施するに好適
   なすべてのＤＮＡである特許請求の範囲第（１０）項記
   載の方法。 （１２）中性のＤＮＡがコウシ胸腺キャリァーＤＮＡで
   ある特許請求の範囲第（１０）項または第（１１）項記
   載の方法。 （１３）キャリァーＤＮＡの濃度が５０乃至７０μｇ／
   ｍｌである特許請求の範囲第（１０）項記載の方法。 （１４）プロトプラストの前培養を２０分乃至１時間に
   わたって行う特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （１５）Ｃａ＾２＾＋計の存在下または非存在下で０．
   １乃至６０ｍＭ　Ｍｇ＾２＾＋イオンを必須成分として
   含む実際の形質転換培地において原形質膜変性剤の存在
   下に１０乃至６時間、プロトプラストとＤＮＡをいっし
   ょにインキュベイションを行う特許請求の範囲第（１）
   項記載の方法。 （１６）使用する形質転換遺伝子が、その構造遺伝子部
   分が植物、動物、微生物、ウィルスまたは合成起源であ
   り、発現信号が植物、動物または合成起源である遺伝子
   である特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （１７）形質転換遺伝子がゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまた
   は合成ＤＮＡからなる特許請求の範囲第（１６）項記載
   の方法。 （１８）形質転換遺伝子がゲノムＤＮＡおよびｃＣＮＡ
   および／または合成ＤＮＡの両者からなる特許請求の範
   囲第（１６）項記載の方法。 （１９）形質転換遺伝子が異なった属に属するいくつか
   の生物起源の遺伝子フラグメントからなる特許請求の範
   囲第（１６）項記載の方法。 （２０）形質転換遺伝子が同じ生物のひとつ以上の株、
   変種または種起源の遺伝子フラグメントからなる特許請
   求の範囲第（１６）項記載の方法。 （２１）形質転換遺伝子が同じ生物起源のひとつ以上の
   遺伝子の部分からなる特許請求の範囲第（１６）項記載
   の方法。 （２２）形質転換遺伝子が形質転換された植物に有用で
   望ましい性質を付与する構造遺伝子を持つ特許請求の範
   囲第（１６）項記載の方法。 （２３）構造遺伝子が植物に、病原体、除草剤、殺虫剤
   および他の殺生物剤に対する高められた抵抗性または耐
   性を付与する特許請求の範囲第四項記載の方法。 （２４）構造遺伝子が葉、種子、塊茎、根および茎にお
   いて保存および貯蔵される物質の形成および品質を改良
   する特許請求の範囲第（２２）項記載の方法。 （２５）構造遺伝子が薬学的に受け入れられる活性物質
   をコードしている特許請求の範囲第（２２）項記載の方
   法。 （２６）発現信号が植物または植物ウィルスの遺伝子起
   源である特許請求の範囲第（１６）項記載の方法。 （２７）発現信号がリブロースビスホスフェートカルボ
   キシキラーゼまたはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質
   の小さなサブユニットをコードしている植物遺伝子起源
   である特許請求の範囲第（１６）項記載の方法。 （２８）発現信号が植物ウィルスの遺伝子起源である特
   許請求の範囲第（１６）項記載の方法。 （２９）植物ウィルスがカリフラワーモザイクウィルス
   （ＣａＭＶ）である特許請求の範囲第（２８）項記載の
   方法。 （３０）発現信号がＣａＭＶゲノムの３５Ｓ発現信号で
   ある特許請求の範囲第（２９）項記載の方法。 （３１）発現信号がＣａＭＶゲノムの１９Ｓ発現信号で
   ある特許請求の範囲第（２９）項記載の方法。 （３２）使用する植物プロトプラストが単一の種または
   種の下部に置かれる分類学的単位からのものである特許
   請求の範囲第（１）項記載の方法。 （３３）前記プロトプラストは葉、幼苗、茎、花、根、
   花粉または胚から得る特許請求の範囲第（３２）項記載
   の方法。 （３４）プロトプラストが葉のプロトプラストである特
   許請求の範囲第（３３）項記載の方法。 （３５）プロトプラストは細胞培養から得られる特許請
   求の範囲第（３２）項記載の方法。 （３６）プロトプラストがソラナシエ、クルシフェレ、
   コンポジテ、リリアシエ、ビタシエ、ケノポディアシエ
   、ルタシエ、アリアシエ、アマリリダシエ、アスパラガ
   シエ、オルキダシエ、パルメ、プロメリアシエ、ルビア
   シエ、テアシエ、ムサシエまたはグラミネエ科またはレ
   グミノセ目の植物からのものである特許請求の範囲第（
   １）項記載の方法。 （３７）プロトプラストがソラナシエ、クリシフェレお
   よびグラミネエ科のものである特許請求の範囲第（１）
   記載の方法。 （３８）プロトプラストがトウモロコシ、コメ、コムギ
   、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、またはキビのもの
   である特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 １）プロトプラストがソラナム、ニコチアナ、プラシカ
   、ベタ、ピサム、ファゼオラス、グリシネ、ヘリアンタ
   ス、アリウム、アベナ、ホルデウム、オリゼ、セタリア
   、セカレ、ソルガム、トリティカム、ゼア、ムサ、ココ
   ス、シドニア、ピラス、マラス、フェンタス、エレイス
   、ルパス、フラガリア、プルナス、アラキス、ハニカム
   、サッカラム、コフェア、カメリア、アナナス、ピティ
   スまたはシトラス属のものである特許請求の範囲第（１
   ）項記載の方法。 （４０）プロトプラストから再生することができる植物
   の形質転換のための特許請求の範囲第（１）項記載の方
   法。 （４１）ＮＰＴ−II遺伝子はＣａＭＶ遺伝子IVのプロモ
   ーターと終止信号を持っており、これはｐＣＵ８プラス
   ミドに挿入され、得られたキメラプラスミドは下記の群
   からの植物の分離されたプロトプラスト中にＭｇ＾２＾
   ＋／ポリエチレングリコール処理により移入されること
   を特徴とするＮＰＴ−II遺伝子の移入によるニコチアナ
   タバクム、ニコチアナ　ブルンバギニフォリア、ペチュ
   ニア　ヒプリダ、ヒオシアマスムティカスおよびプラシ
   カ　ナパスの群からの植物の形質転換のための特許請求
   の範囲第（１）項記載の方法。 （４２）形質転換の結果として得られた新しい遺伝子を
   持ち、それから得られる有利な性質を持つ、 植物プロトプラストをいかなるものでもより植物組織か
   ら分離し、植物プロトプラストを培養するために通常使
   用される栄養培地のひとつで培養し； 実際の形質転換前に、前記プロトプラストを、Ｃａ＾２
   ＾＋、Ｋ＾＋およびＮａ＾＋イオンおよび適当な炭素源
   をも含む前培養培地で４°乃至１０℃の温度で、２０分
   乃至６時間前培養し； 次いで該プロトプラストをこの前培養培地から分離し、
   Ｃａ＾２＾＋イオンわ存在下または非存在下に０．１乃
   至６０ｍＭＭｇ＾２＾＋イオンを必須成分として含む実
   際の形質転換培地に再懸濁し；その後すぐに、植物中で
   活性な発現信号の制御下のひとつ以上の遺伝子および支
   持ＤＮＡをも含むＤＮＡ試料を形質転換溶液に加え；０
   ．１乃至１０分後、原形質膜変性剤を加え；プロトプラ
   ストとＤＮＡ試料を上記の形質転換溶液中で、ＤＮＡの
   プロトプラストへの取込みが十分である時間、インキュ
   ベイションを行う、 植物遺伝子の形質転換法により得られる形質転換された
   プロトプラスト、およびまた植物細胞、細胞凝集物、胚
   、これらから得られる植物および種子、および変異体、
   変種子孫を含むそれらの子孫。