JPS63160588A - 植物プロトプラストの形質転換改良法 - Google Patents

植物プロトプラストの形質転換改良法

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JPS63160588A
JPS63160588A JP62307376A JP30737687A JPS63160588A JP S63160588 A JPS63160588 A JP S63160588A JP 62307376 A JP62307376 A JP 62307376A JP 30737687 A JP30737687 A JP 30737687A JP S63160588 A JPS63160588 A JP S63160588A
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protoplasts
dna
plant
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は簡単で純粋に化学的な工程を使って植物プロト
プラストを形質転換するための改良法およびその方法に
よって得られた植物材料に関する。
新しい遺伝情報を植物材料に導入して新規および/′ま
たけ改良された性質を持つ植物をつくることが可能であ
る。世界の人口の急速な増加とそれに伴う食物および原
材料の増大なる要求という観点から有用植物の生産tを
増加させ、また植物成分からの抽出を増加させること、
特に食物および医薬分野において進歩させることが生物
学的研究において最も急を要する仕事である。したがっ
て、例えば次のような事を本質的な方向として挙げるべ
きである。すなわち、有用植物について、好ましくない
土壌条件または気候条件に対する耐性、病気および害虫
に対する耐性を高め、殺虫剤、除草剤、殺菌剤のような
植物保饅剤に対する耐性を高めて、また植物の栄養成分
または収率を有利なように変えることである。このよう
な望ましい効果は一般に′保護物質、有用タンパク質ま
たは毒素を導入またはその生成を増加させることによっ
て実現できる。植物の遺伝型に目的に応じて影−i!J
lを与えることは、例えば、従来の植物育捌技術を使わ
ずに、外部の遺伝子を制御された条件下において植物細
胞中に導入するCとによって行うことができる。
本発明においては、以下のような定Aを適用する。
植物材料:生きた植物それ自体または培%したものの部
分、中でも、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、胚
、植物器官、芽、種子のような部分、および全植物体 遺伝子二元現信号を側方に持つ構造遺伝子構造遺伝子:
タンパク質をコードしたDNA配列発現信号:プロモー
ター信号およびターミネータ−信号 植物−活性発現信号:植物において機能可能な発現信号 プロモーター信号:転写を開始する信号ターミネータ−
信号:転写を終了する信号エンハンサ−信号:転写を活
発にする信号複製信号: DNA複裏を可能にする信号
インテグレーシ1ノ信号:遺伝子をゲノムDNAに組込
むことを行うDNA配列 雑種DNA :異種のDNAから構築された遺伝子、す
なわち、異った超厚のDNA配列からのもので、それは
天然DNA配列、c−DNA配列または合成DNA配列
のDNA配列であってよい。
支持DNA :遺伝子の側方にある中性DNA、すなわ
ち、遺伝子の機能に関与しないDNA配列 キャリアーDNA :形質転換遺伝子以外の中性DNA
で、ヌクレアーゼから形質転換遺伝子を保護するために
形質転換遺伝子とまじっている。
分離遺伝子:元来のDNAから分離されたDNA配列で
単一タンパク質をコードしている。
NPT−1遺伝子: ネオマイシン−3′−ホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、トランスボノンTn5の[W(
1)ロススタイン、ニス、ジェイ。
及ヒタクリエー、ニス、レズニコフ、セル23巻、19
1−199頁、1981年 Rothstein。
S、J、 and W、S、Reznikoff、 C
e1l 23 、191−199、(1981)) ゲノムDNA :植物ゲノム(すべてまたはそのタンパ
ク質の)のDNA c−DNA:  リバーストランスクリプターゼによっ
てつくられたm−几NAのコピー 遺伝学的に操作した植物細菌を使って植物細胞中にDN
A配列を入れることは、この分野の文献における刊行物
から公知である。例えば、2)ネイチャー305巻、2
(11)−213頁、1983年Nature vol
、 503 、2(11)−213 (1983) :
S)ネイチャー304巻、184−187頁、1983
年Nature vol、304 、184−187(
1983) ;4)サイエンティフィック アメリカン
 248巻6号5O−59Ji、 1985年Scie
ntificAmerican  2土lΩユ、5O−
59(1983);5)イーエムビーオー ジャーナル
2巻6号、987−995頁、19B3年EMBOTo
urnal  2(6)987−995(1983);
 6)サイエンス 222巻、476−482頁198
3年5cience 222 。
476−482(1985): 7)tイエンス223
巻496−498頁1984年5cience 223
.496−498(1984):または8)グロシーデ
ングスオブザ ナショナル アカデミ−オプ 丈イエン
シズ オプ ザ ユナイテッド ステイッオブ アメリ
カ 80巻、480!l−48(37頁、19B5年P
roc、Nat1.Acad、Sci、USA 80 
4803−48(37(1983)である。ここに記載
されている方法においては、これらの細菌の天然の植物
感染性を利用して新しい遺伝材料を植物細胞に挿入して
いる。これまで例えばアグロバクテリウム テユメファ
シエンス Agroba−cterium tumef
aciensまたはそのTi−プラスミドまたはカリフ
ラワー モザイク ウィルスのような植物明原体が特に
この目的のベクターとして使用されてきた。
最近開発された方法によシ、今や生物学的ベクターを使
用せずに遺伝子を植物細胞に百妾挿入することが可能と
なった〔9)ボトリカス、アイ、等プラント モレキュ
ラーバイオロジーレポート 5巻117128頁、19
85年Potrykus、 I、 et al、 Pl
ant Mo1ec、 Biol、 Rep、  s 
117−128(1985): 10)シリト、アール
ディー、等バイオ/テクノロジー5巻 1(11)9−
1103頁、1985年Sh目1ito、 R,0,e
t al、。
Bio/Technology 3.1(11)9−1
103(1985) )。
これらの方法は「直接遺伝子転移」というキャッチフレ
ーズで知られ、例えば植物病原1j4JJ菌、ウィルス
、昆虫またはカビのような植物感染系を使用せずに植物
細胞のベクターなしの形質転換を行うことができる。
したがって、病原体の宿主持具性によるすべての制限は
もはやない。形質転換sm H’rからの植物の発育は
新しい植物細胞形質転換法の使用によシ障害を受けない
遺伝子形質転換を行う際の主な問題のひとつは形質転換
した細胞または組織を同定する時の困難さである。
遺伝子形質転換工程における形質転換頻度が低ければ低
いほど、莫大な数の形質転換されていないクローンの中
から形質転換された細胞に由来する数少い細胞クローン
を見い出すことは一層困難で複雑になる。そのため、も
し遺伝子が選択的マーカー機能(例えば特別な物質への
耐性)を持ったものでなければ、形質転換頻度が低いと
一般のスクリーニング法を使うことはほとんど、まだは
全く不可能である。したがって、選択できるマーカー機
能を持たない遺伝子の場合に低形質転換頻度であると多
大の費用を要する。
マーカー機能を持たない遺伝子の形質転換では、それ故
に、形質転換細胞クローンを選択する従来のスクリーニ
ング法は形質転換頻度が10 乃至10−2オーダーの
場合にかぎって効果的に利用できて成功する。現在の所
、このように高い形質転換率はエレクトロポレーション
、おそらくは微生物研究で使用される遺伝子転換の他の
方法と組合せてのみ実現できる。例えばポリーL−オル
ニチンまたはポリーL−リジン処理、リポリーム融合、
DNA−タンパク複合体化、プロトプラスト膜上の電荷
修飾、微生物プロトプラストとの融合またはリン酸カル
シウム共沈殿、および特にポリエチレングリコール処理
および熱処理法との組合せである〔10)シリト等バイ
オ/テクノロジー3巻1(11)9−1103頁、19
85年8hillito ot al、 Bio/Te
cbnology5.1(11)9−1103(198
5))。比較してみると、純粋に化学的方法を使用した
場合、現在までの所10−sオーダーまでの形質転換率
を再現性よく実現できるのみである。
エレクトロポレーションにおいては(ノイマン、イー、
等  ザ イーエムビーオージャーナル 7巻841−
845頁、1982年、Neuman 。
E、 et al、 TheEMBOJournal 
7.841−845(1982)、’σ)シリト等 バ
イオテクノロジ−5巻、1985年5hillito 
et al、、 Bio/Tech−nology 5
 、 (1985) 〕、 77 = ) −k /カ
ル’/ +:7ムまたはマンニトール/マグネシウム溶
液中のプロトプラストを、懸濁液を挾んで蓄電気を放電
させることにより高強度の電圧パルスに短時間作用させ
る。これによりプロトプラスト膜の分極が起り、膜に可
逆的開孔を生じ、DNAの?eI胞への移入を可能にす
る。しかしながら、この方法には多くの不利な点があり
、使用に制限がある。
第一に、エレクトロポレーションによシ形質転換を行う
には、比較的複雑な装置が必要で、これにはそれ相応の
コストと相応の手間がかかる。第二に、植物プロトプラ
ストの高度の感受性のために、この方法は非常に狭い限
られた範囲でのみ可能である。形質転換細胞の生存率を
確保するだめにも、いくつかのパラメーター、例えば′
直圧、容量および場の強V唾は狭い範囲内でのみ調節可
能である(例えば14(10)乃至17(10)Vの電
圧範囲)(10)シリト、アール。
ディー、等バイオ/テクノロジー3巻、1985年5h
illito、 R,D、 et al、、 Bio/
Technology 5 。
(1985))。
これらの不利な点は驚くべきことに本発明の方法に含ま
れる簡単で純粋に化学的方法の工程により克服できる。
DNAを取り植物m泡中に組み込むことの原理について
の本発明の範囲内で行われた研究により、形質転換過程
はたがいに影響し合う多くのパラメーターに依存してい
ることが明らかになった。これらの研究に基づいて、形
質11こ関係のあるパラメーターを変化させ、最適に調
整することによシ、公知の方法に比較して形質転換頻度
を有意に高め、最初に述べた10 乃至10−2以上の
望ましい形質転換率を容易に実現できるようになった。
純粋に化学的手段に基づく本発明の方法により、形質転
換頻度のみならず、驚くべきことに再現性および処理プ
ロトプラストの生存率を有意に高めることが可能となっ
た。
現在までの所、純粋に化学的方法によって得られる最高
の形質転換頻度は10”の近辺にあったが、本発明の方
法を用い、エレクトロポレーションの場合に比較して数
パーセントまでのオーダーの再現性ある形質転換頻度を
実現できるようになった。
エレクトロポレーションに対し、本発明の改良法は装置
に特別の支出がな〈実施できる方法であり、より有利な
価格となシ、よシ少い労働集約性となる。エレクトロポ
レーションを要求する方法と比較して更に有利な点は、
同時に大量の植物プロトプラストを形質転換し得る新た
な可能性があることである。
本発明の方法を使用すれば、処理細胞の生存率に関して
エレクトロポレーション法でこれまで述べてきた制約に
比較して何等の制約もされない。
本発明の形質転換におけるパラメーターを決定する際に
は広い範囲で変化させることができ、形質転換効率や、
この範囲内における処理プロトプラストの生存率に悪影
響を与えることはない。
その上、本発明の方法を使った形質転換後では、形質転
換をエレクトロポレーションで行った場合より、処理プ
ロトプラストの生存率および分裂性に関してはるかに異
質性が低Aことが証明されている。本発明の方法を使用
した場合、例えば処理プロトプラストの生存率80%以
上を容易に実現でき、同時にその分裂能、したがって新
しいコロニーを形成する能力も保持されてbる。エレク
トロポレーションを使った場合には、これに対して生存
率に関する値は約10壬にすぎない。
期待に反して、プロトプラストへの直接遺伝子組込みに
おける形質転換頻度は多くのパラメーターにより、個々
にまたは組合さって影4#金蔓けることがわかり、これ
らのパラメーターまたは手段の2.3のもののみを正し
く選択するか、組合せることにより技術的にも時間的に
も労力少くして最適の形質転換率を実現できることがわ
かった。下記のパラメーターが本質的であることが証明
されている。
1)DNA−試料:形状、大きさ、濃度、適用時間2)
キャリアーDNA:形状、濃度、大きさ3) MgZ”
     :濃度、適用時間4)原形質膜変性剤:濃度
、適用時間 本発明の方法に不可欠の因子について、形質転換効率を
高めるのに決定的であるMg計濃度と原形質膜変性剤濃
度が特に重要である。これらの2因子間に相乗的相互作
用が与られ、その結果、形質転換効率の顕著な上昇とな
る。
更にMg2+イオン、変性剤および形質転換DNA適用
の時間および順序も重要である。
植物プロトプラストへの直接遺伝子組込み法、究局的に
遺伝学的に変性された植物をつくり出す方法で決定的な
改良と簡略化は本発明に不可欠な下記の工程により実現
できるニ ー 植物材料からのプロトプラストの分離およ。
び、必要に応じて分離したプロトプラストの好適な栄養
培地における培養 −分離プロトプラストの標準塩溶液への再懸濁 −塩溶液からMg 2+イオンを含む形質転換に最適化
した培養培地への分離プロトプラストの移し換え −挿入されるべきDNAと原形質膜変性剤の添加 −原形質膜変性剤存在下にDNAが10ドプラスト中に
侵入するに十分な時間、DNAとプロトプラストを保持 −培地からの処理プロトプラストの分離および、必要に
応じてこれのCaC1,水溶液へノ再懸濁 −CaCl29iからのプロトプラストからの分離 −プロトプラストを成長させるに適した培地中での培゛
養 −望むならば完全な形質転換植物の再生したがって、本
発明は本質的に植物プロト1ラス)!形質転換するため
の改良法に関し、望むならば、その形質転換プロトプラ
ストからの再生による遺伝的に変性された全植物の構造
に関し、その方法は下記の特徴を持つ−植物プロトプラ
ストはいかなる植物組織からでも分離し、望みに応じて
植物プロトプラストを培養するのに一般に使用される栄
養培地のひとつで培養する; −実際の形質転換前に、アルカリ土類および/またはア
ルカリ金属陽イオン、望ましくはCa”、 K+および
/またはNa+イオンおよび好適な炭素源を含む前培養
培地で41乃至10℃の温度、20分間乃至6時間、前
培養するニー 次いでプロトプラストを前培養培地から
分離し、Ca2+イオンの存在下、または非存在下に(
10)乃至60 mM、望ましくは10乃至30mMの
必須成分Mg 2′+イオンを含む実際の形質転換培地
に再懸濁する; −次て、植物において発現信号を活性に調節されたひと
つ以上の遺伝子と支持DNA iも含むDNA試料を形
質転換溶液に直接加える;−数秒乃至20分間、望まし
くは(Ll乃至10分間後に、原形質膜変性剤を加える
; −プロトプラストとDNA試料をこの形質転換溶液中で
DNAがプロトプラスト中にたしかに取シ込まれる時間
保持する; −望むならば、形質転換プロトプラストから全植物体を
再生させる。
本発明の植物細胞への新しい遺伝子の移入は、植物細胞
、植物ウィルスのような天然の植物感染系または昆虫ま
たは植物病原かびによる移入を使用しない直接法によっ
て実施していることは明らかである。これを行うために
、形質転換されるべき植物プロトプラストを組込まれる
べき遺伝子で以下のように直接処理する:先づ最初に、
プロトプラストを適当な溶液中に入れ、そこで一定時間
前培養し、次に外来遺伝子とプロトプラストをいっしょ
に実際の形質転換培地に移して、その中でプロトプラス
トに外米遺伝子が取り込まれるに十分な時間放置する。
使用する植物プロトプラストは単−踵の植物のものまた
は1に準する分類学的単位のものが望ましい。
分離細胞および組織の出発物質として好適な分離された
植物プロトプラストは、例えば葉、苗、茎、花、根、花
粉または胚のような植物のいかなる部分から得てもよい
。望ましくは葉のプロトプラスト’2使用する。分離プ
ロトプラストは細胞培養から得てもよい。プロトプラス
トを分離する方法は、例えば12)ボトリカス、アイ、
アンド シリト、アール、ディー1. メンーズ イン
 エンサイモロシー118巻、449−578頁、19
86年 Potrykus 、 I、 and 5hi
−11ito、 R,D、 、 Methods in
 Engymology  118 。
449−578(1986)で知ることができる。
プロトグラス)を培養するに好適な培地はプロトプラス
ト培養に通常使用されるもののように浸透圧的に安定化
された培地が望ましい。
個々の成分や成分群の異る数多くの培地が既に入手可能
である。しかし、すべての培地は一般に下記の原理に基
いて調合されている:約10W/l乃至数百キ/lの範
囲の濃度の無機イオン(例えば硝酸、リン酸、硫酸、カ
リウム、マグネシウム、鉄のようないわゆるマクロ要素
)、最大数■/lの無機イオンの群(コバルト、唾鉛、
鋼、マンガンのようないわゆるミクロ要素)、および一
連のビタミン(例えばイノシトール、葉酸、チアミン)
、例えば蔗糖またはグルコースのような炭素源、および
更に(16)1乃至10ILI/l!の濃度範囲のオー
キシンおよびサイトキシン類の天然または合成植物ホル
モンの形の生長調節剤を含む。更に、培地は糖アルコー
ル(例えばマンニトール)またはM(例えばグルコース
)または塩イオン(例えばCaC12)を添加して浸透
圧的に安定化され、pH価をα6 乃至&5にalii
l整されている。
最近の培地のより詳細な記、載は例えば13)コア’ 
Uッツ、エイチ0.メトーディシェ アスベクテ デア
 ツェルーウント ゲベーベツェヒトクンクハイクラミ
ネーエン ウンターヘゾンデレル ベリエックジヒティ
グング デアゲトライデ、(アスベクツ ォプ メンー
ズオプ セ” アンド テイツシエー ブロクスイン 
グラミネエウイズ スペシャル レファL/7ス)クー
 シーリアルス)クルチュール ブフランツェ XX1
巻、1974年、93−157頁 Koblitz、 
H,、Methodische ASpOkte de
rZell −und Gewebe zt3chtu
rg bei Gramineen unterbes
orderer Berucksichtigung 
der Getreide 。
(Aspects of methods of ce
ll and tissue growthin Gr
amineae with 5pecial refe
rence to cereals )Kulturp
flanze XX1.1974 、93−157に見
られる。
プロトプラストを実際の形質転換培地に移す前に、次の
形質転換に最適なように準備する培地で1ず前培養する
;こうすることの利点は実現する形質転換および処理プ
ロトプラストの生存率の明らかな増加により明白となる
いくつかの前提条件性で、この前培養培地中で直接形質
転換を行うことも可能である。
上記の培地は、例えばグルコースまたけマンニトールの
ような糖または糖アルコールのような好適な炭素源に加
えて、例えばNaC1、CaC1z。
KC/のような種々の塩f 1 mM乃至2(10) 
mMの濃度で含む標準塩溶液である。この塩溶液は5乃
至8のpH[を持つことが有利である。
目的とする形質転換の短時間以前に、プロトプラストを
前培養溶液から実際の形質転換培地に移す。この溶液は
M g 2+イオンi(11mM、  望ましくは10
mM乃至30mMの濃度で含むマンニトール溶液である
。処理溶液OpH値はpH5,6乃至pH12、特にp
H7乃至pH10である。
処理培地に分離したプロトプラストを入れた直後、DN
A試料を2μgoal乃至20μy/ld・望ましくは
5μ’i/ILt乃至10μ77/rdのa度で加える
構造遺伝子と植物−活性発現信号からなるDNAは植物
細胞のゲノムDNAに遺伝子の組込みを可能にする中性
DNA配列(支持DNA)が側方にあることが有利であ
る。直線状の遺伝子を使うことが有利である。実験を実
施する間に、支持DNA濃度は50μy/ml乃至70
μy/rd、平均の大きさは4 kb乃至40kbが特
に好適であると証明された。
更に、例えば動物または植物DNA 、  ラムダDN
A、プラスミツドDNAまたは本発明の方法を実施する
に好適な他のいかなるDNAのような中性DNAf、、
遺伝子のタクレアーゼによる分解から保護するために、
キャリアーDNAとして過剰に使用することが有利であ
る。
DNAを処理溶液に加えた後、数秒乃至20分、望まし
くは11分乃至10分後に、ポリエチレングリコール終
濃度10慢乃至SO%になるまで加える。PE04度2
0%乃至28%で高形質転換率が実現する。
しかし、ポリエチレングリコール以外に、本発明の方法
において、プロトプラスト膜を変性するような、例えば
細胞融合の分野で使用される他の間数アルコールまたは
アルコール製物質を使用することもできる。これらの例
はポリプロピvyグリ=r−ル(425乃至4(10)
0 g/mol)。
ポリビニルアルコールのような長鎖の多価アルコール、
またはヒドロキシル基のいくつかまたはすべてがエーテ
ル化された多価アルコールや例えば下記の報告に記載さ
れているような農業分野で一般的な植物適合界面活性剤
である:14)  「マツカチャンズ デタージエンツ
 アンド エマルシファイアーズ アニュアル」エムシ
ー パフリッシング コーボレーシトへ リッジウッド
 ニューシャーシー 1981年’ Mc Cutch
eon’s Detergents and Emal
sifiersAnnual ’ Me Publis
hing Corp、、 Ridgewood New
Jersey、 1q a 1ニスターフ ヘ、バー、
「テンシドータッシェンプーク”、カール ハンザ−フ
エアラ−り、ミエニツヒ/ヴイエンナ 19818ta
che、 H,、@Ten5id−Taschenl)
uch Il、 CarlHanser Verlag
、 Munich/Vienna 、 1981もしポ
リエチレングリコールそのものを使用する場合(実施例
1および2におけるように)、1(10)0 g/mo
l乃至1(10)(10)9/mol特に3(10)0
g/mol乃至8(10)0 g/mol (iり分子
量を持つポリエチレングリコールが望ましい。
上記の薬剤の内、ポリエチレングリコールそのもの、特
にCa叶イオンを比較的高比率で持つCMS型のポリエ
チレングリコール溶液が望ましい。(15)ネグルチー
−、アイ、等セオリチ力ルアンド アプライド ジェネ
ティックス72巻、279−86頁 1986年a N
egrutiu、I、 et al、。
Theor、 Appl、 Genet、72 、27
9−86 (1986a))ポリエチレングリコールに
よる処理時間は20分乃至6時間が形質転換実施に特に
有利であることがわかった。
上記のように行った処理の後、有利には細胞濃度12x
10’乃至8X104グロトブラスト/培地dとして、
新鮮な培地にプロトプラストを再懸濁する。
PEGを20慢以上の濃度で使用する場合には、形質転
換終了後に、Ca計イオンを含む溶液2乃至10倍量で
ゆるやかに希釈して沈降法により存在する残存PEGI
洗い落し、新鮮培地に再懸濁することが都合がよい。
(10)M乃至1.0M濃度のCa2′+イオンを持つ
CaC1!2水溶液が形質転換に特に有利であることが
証明された。
本発明の方法は実際上適用する際に制限がない 本発明は、特に、新規で有用な望ましい性質をコードし
、植物細胞内で機能する発現信号と作用できるように連
動するひとつ以上の構造遺伝子を中心成分として持つキ
メラ性遺云的構築に関する。
本発明の方法で吏用するに好適な遺伝子は、植物細胞内
で発現され、例えば病原体(例えば植物病原性昆虫、か
び、細菌、ウィルス等)、除草剤、殺虫剤または他の生
物を殺す薬剤、気候的影響および地方的特異性(例えば
高温、低温、風、乾燥、高湿度、特別に極端な土壌条件
、浸透圧ストレス等)への抵抗性または耐性の上昇、ま
たは葉、種、塊茎、根、茎等における保存および貯蔵物
質生成の増加のような有用および/fたは望筐しい性質
を植物に与えるいかなる遺伝子でもよい。
本発明は、例えばアルカロイド、ステロイド、ホルモン
、免疫調節剤および他の生理学的に活性な物質のよう人
薬剤学的に受け入れられる活性物質をコードした遺伝子
をも含む。
したがって、植物超厚、例えばゼイン遺伝子〔16)ラ
イ−ナンド、ニー(10)等モレキエラーアンド ゼネ
ラル ゼネティックス 182巻、440−44.4.
1981年Wienand、 U、 、 et al、
Mo1.Ger、 Genet、 182.440−4
44(1981)、動物超厚、例えばTPA遺云遺伝組
繊型プラスミノーゲン活性化遺伝子);〔17)ペン二
カ、ディー等ネイチャー5(10)巻、214−221
頁、1983年Penn1ca、 D、 、et al
、、 Nature 5(10) 。
214−221 、(1985))、微生物超厚、 例
えばNP’L”−■遺伝子または合成起原、例えばイン
スリン遺伝子〔18)ステビーン、ピー、等 ジーン2
4巻、2B?−297頁1985年8tepien 。
P、、et at、、GeneJj−,289−297
(1983)3のようないかなる構造遺伝子をも、もし
その構造遺伝子が植物中で活性である発現信号を側方に
持つならば、植物の遺伝型に組込むことができ、その際
、発現信号は植物、動物、微生物または合成起原であっ
てよい。
本発明において、特にプロモーターおよび終止配列が「
発現信号」と理解すべきであるが、更に構造遺伝子配列
の上流または下流に位置する5′−および5′−非翻訳
部分における他の調節配列も含まれる。
プロモーター配列には特にPNAポリメラーゼの認識部
位が含まれ、ここにこの酵素が特異的に結合して転写が
開始する。
原核生物のプロモーターに多く存在するいくつかのDN
A配列は結合親和性に関与している。
これらのいわゆる「コンセンケス」配列は一般に構造遺
伝子のATGiJ始コードンに対して−10乃至−50
の配列部位にみられる。これらは「ブリプノプーシャラ
ーーボックス Pr1bnov−8challer−B
ox Jと呼ばれるふたつのへキサヌクレオチド配列で
あり、これらの配列内のヌクレオチド配列はおたがいの
離れ方と共にプロモーターへのDNAポリメラーゼの親
和性に決定的な影響2持つ。
真核細胞においては、転写開始部位から20乃至30タ
クレオチド上流に位置するアデニンおよびチε/の多い
配列、いわゆるr TATAJボックスがこの関係で特
だ重要である。
本発明の範囲内で使用できる好適な遺伝子は同質性およ
び異質性の遺伝子またはDNA、更に本発明の範囲内で
与えられた定義に合った合成遺伝子またはDNAである
コードするDNA配列はゲノムDNA 、 cDNAま
たは合成DNAのみから構築される。 本うひとつの可
能性#1ci)NAおよびゲノムDNAおよび/筐たは
合成I)NAいずれもからなる雑種DNAの構築である
この場合には、cDNAはゲノムDNAと同じ遺伝子由
来のものでもよいし、または別法としてcDNAとゲノ
ムDNA両方が異った遺伝子から由来してもよい。しか
し、いかなる場合にも、ゲノムDNAおよび/またはc
DNAはそれぞれ同一または異った遺伝子から個々に調
製できる。
DNA配列がひとつ以上の遺伝子の部分を含んでいる場
合には、これらの遺伝子はひとつの同じ遺伝子から、ま
たは同じ族のひとつ以上の株、ひとつ以上の変種または
ひとつ以上の種に属するいくつかの生物から、または同
じまたはもうひとつの分類学的単位(界)のひとつ以上
の族に属する生物から由来してよい。
植物細胞における上記構造遺伝子の発現を確実にするた
めに、コードした遺伝子配列は、植物細胞で機能可能な
発現配列と作用できるように連結させ表ければならカい
。構造遺伝子および側方にある発現信号からなる移入さ
れる遺伝子は天然の遺伝子でも雑種遺伝子でもよい。本
発明の方法に使用される望ましい遺伝子は、発現信号が
動物または、特に植物または合成起源のものである。こ
のような遺伝子の例は:a)構造遺伝子とその天然の発
現信号からなる植物由来の完全な遺伝子: b)合成起源の発現信号を側方にもつ合成起源の構造遺
伝子からなる完全に合成の遺伝子;C)植物−活性発現
信号を明方に持ち、植物の異った種由来の構造遺伝子と
発現信号からなる植物由来の構造遺伝子: d)合成起源の発現信号を側方に持つ植物由来の構造遺
伝子: e)植物起源の発現信号を側方に持つ動物、微生物また
は合成起源の構造遺伝子:またはf)合成起源の発現信
号を側方に持つ動物または做生物起αλの構造遺伝子 である。
したがって本発明の範囲内における雑種遺伝子構築は、
構造遺伝子に加えて、プロモーターおよびクーミネータ
ー配列両者と共にs’−オJ:び5′−非翻訳部分の他
の調節配列を含む。
より一層望ましいものは植物起源の発現信号、特に植物
ウィルス由来のものを側方に持つ細菌起源の構造遺伝子
である。
コードしたDNA配列(構造遺、云子)の発現全誘導可
能ないかなるプロモーターおよびいかなるターミネータ
−も雑種遺伝子配列の成分として使用できる。好適なプ
ロモーターおよびターミネータ−の例はツバリン−シン
ターゼ遺伝子(nos ) 、オクトバインーシンクー
ゼ遺伝子(OCS )およびカリフラワー モザイク 
ウィルス遺伝子(CaMV )のものである。
CaMV/r’ツムから分離したCaMVゲノムの35
8および19.3発現信号で、例えば19)yyアチス
等1982年Maniatis et al、、 19
82に記載されているような分子生物学的方法によりコ
ートされたf)NA配列に連結できるものが本発明の範
囲内で望ましい。
本発明にしたがい、358転写調節配列に使用される出
発物質は、例えば遺伝子地図のタクレオチド680B−
7652(”0)フランク ジー等198o年Fran
k G et al、、 1980 )  (I−含む
CaMV”S5株のSca エフラグメントである。
193プロモーターおよび5′−非翻訳部分はCaMV
遺伝子IVの0PatI部位(5386位)とHind
 璽部位(5850位)の間のゲノムフラグメントに存
在するヒ1)ホーン等1982年Hohn et al
、、 1982 ) 。相当するターミネータ−と3′
−非翻訳部分はCaMVゲノムの7342位と7643
位の間ノEco几V/Bgl 117ラグメントに存在
している。
19Sプロモ一タ一部分は、Ca M V遺伝子■のコ
ード部分の前に位置して遺伝子■生産物(ウィルス コ
ート タンパク質)の発現を司どる典型的な真核生物の
プロモーターである。
植物細胞内で機能し、使用可能なプロモーターのもうひ
とつの効果的な代表例は過剰生産植物プロモーターであ
る。この型のプロモーターは、目的とする遺伝子産物を
コードした遺伝子配列と作用可能な状態で連結した場合
、上記の遺伝子配列の発現を可能にすべきである。
本発明の範囲内で使用できる過剰生産植物プロモーター
には、ダイズのりブロース−1,5−とスーホスフェー
トー力ルポキシラーゼ小サブユニット(ss)のプロモ
ータ(22) ベリーロー等 ジャーナル オプ モレ
キュラー アンド アプライド ゼネティフクス 1巻
483−498頁1982年Berry−Lowe e
t al、 。
J、 Mol、 andAppl、 Genet、、 
1 : 483−498(1982)〕および〕クロロ
フィルーa/b−結合タンパク質のプロモーターが含ま
れる。これらふたつのプロモーターは真核植物細陀にお
いて光によって誘導されるという性質で知られている〔
例えば、  ゼネティック エンジニアリング オプ 
フランク、アン アグリカルチエラルハースベクティプ
、エイ、カシュモア、プレナム、ニューヨーク 198
3年、29−38頁Genetic Engineer
ing of Plants、an Agricult
ur−al Perspective、 A、 Cas
hmove、 Plenum、へew York198
3;24)コルジー ジー等 ザ ジャーナル オブ 
バイオロジカル ケミストリー258巻1399貞、1
985年Coruzzi O,et al、。
The Journal of Biological
 Chemistry 、 258 :1399(19
83)および25)ダンスミュア ピ−等 ジャーナル
 オプ モレキュラー アンドアプライド ゼネティッ
クス、2巻 285頁1983年 Dunsmuir、
 P、 et allJournal of Mo−I
eculav and Applied Geneti
cs 、 2 : 2 : 285(1983))。
カリフラワー モザイク ウィルスの遺伝子■の発現信
号を本発明に使用するのに特に有利であるCとがわかっ
た。
本発明の範囲内で特に望筐しいものはCaMVCM18
41株の発現信号で、その完全なDNA配列は26)カ
ートナー等1981年Gardner etal、、1
981に記載されている。
雑種遺伝子はそれ自体は公知の微生物学的方法により製
造し、植物細胞によって生産されるヘキタンパク質のコ
ードのリーディングフレームは保持しておく。このよう
な方法は公知で、例えば下記の刊行物に記載されている
:27)「モレキュラー クローニング」、マニアテイ
ス、ティー9.ノリッチェ、イー、エフ、およびジェイ
、サングルツク、コールド スプリングバーバー ラボ
ラトロリー、1982年”Mo1e−cular Cl
oning ’、 Maniatis、 T、、 Fr
1tsch、E、F。
and J、 Sambrook、 Co1d 3pr
ing Harbor Laboratory。
1982、および20)「リコンビナントDNA  テ
クニックス」、ロドリゲス、アール、エル、 アント 
 アール、シー、ディト、アジンンーウェズリーハフ゛
す・ンシング アンバエ−。ロンドン。
アムステルダム、トン ミルズ、オンタリオ。
シh”=−、)’)キwつ、 19B5年″″1もec
ombina−nt DNA ’l’echnigne
s ” 、 Rodrignez、 R,L、and几
、C,Ta1t、 Addison−Wesley P
ublishing Comp、 。
London 、 Amsterdam、 Don M
ills、 0ntario、 5yd−ney、 T
okyo 、 1983゜植物細胞のゲノムDNAに外
米遺伝子を組込むには、構造遺伝子と植物−活性発現信
号からなる遺伝子の側方に中性DNA(支持1)NA 
)があれば有利である。この場合、支持DNAは二本の
直線状DNA鎖から々っていてよく、そのため植物細胞
へ挿入されるべき構築は直線状DNA分子である。しか
し、遺伝子移入のためにつくるDNA配列は環状構造(
プラスミド構造)であってもよい。このようなプラスミ
ドは発現信号2持つ外来遺伝子が組込まれた一本のDN
A鎖からなっている。支持DNAは合成起源でもよいし
、天然のDNA配列から適当な制限酵素で処理して得て
もよい。したがって、好適な支持DNAは例えば選択的
制限酵素で開環した天然のプラスミドである。
このようなプラスミドの例は自由に入手できるプラスミ
ドpUC8(28)メッシング、ジエイ。
アンド ジェイ、ビエイラ、ジーン19巻、269−2
76頁1982年Messing 、 J、 and 
J。
Vieira、 Gene 19 、269−276 
、1982に記載されている)である。天然のプラスミ
ドのフラグメントも支持DNAとして使用することもで
きる。例えばカリフラワー モザイク ウィルスの遺伝
子■の欠損変異株を支持DNAとして使用できる。
植物細胞の遺伝子形質転換の確率は種々の因子によって
上昇させ得る。酵母の試験で知られているように、成功
して安定な遺伝子形質転換の数は、 1)細胞当りの新しい遺伝子のコピー数が増加すると共
に、 2)複製信号と祈遺伝子の組合せにより、また3)組込
む配列と新遺伝子の組合せによシ増加する。
したがって、本発明の方法は、移入される遺伝子が植物
細胞内で活性な複製および/まだは組込み配列と組合わ
さった場合に特に有利に使用され得る。
植物細鞄内遺伝子の発現は遺伝子がメツセンジャーRN
A配列に転写される頻度に依存する。
したがって、新しい遺伝子がこの転写を高めるエンハン
サ−信号と組合さった時に同様に有利になる。植物細胞
で活性な複製、組込みおよびエンハンプ−信号と組合さ
った遺伝子を移入する本方法は特に注意を惹く。
また、もし移入される遺伝子が選択的マーカー機能を持
つ場合、プロセッシング手法の点から大いに有利である
。すなわち、形質転換した植物細胞を非形質転換細胞か
ら選択を調節することによって分離できる。植物細胞の
遺伝子型に発現してマーカー特異的選択法を使用できる
ような遺伝子が存在する時にのみ、通常微生物学的方法
によってカルスまだは完全な植物に再生させられるので
、このよう々マーカー機能が効率的操作法を可能にする
プロトプラスト、細胞培養の細胞、植物組織の細胞、花
粉、花粉管、胚珠、胚のうまたは接合子、および発育の
種々の段階の胚が形質転換の出発物質として期用できる
好適な植物細胞の例として挙げられるが、それ以上の前
処理なしで[Iil使用できるのでプロトプラストが望
ましい。
本発明は本発明の方法によって得られた形質転換すれた
プロトプラストにも関し、まだ、それから得られた植物
細胞、細胞凝集物、胚、植物および種にも関し、更にま
た、形質転換の結果として得られた新しい遺伝子を持ち
、それからの有利な性質を持つその子孫にも関する。
また、本発明にしたがって形質転換され、形質転換の結
果として得られた新しい遺伝子を持ち、それから得られ
る有利な性質を持つ植物材料のすべての雑種および融合
生産物も含まれる。
本発明の方法はすべての植物、特に分類群アである。
特に興味が持たれるジムノスベルメQy+nno−sp
ermaeは:に7xしCon1ferae 綱の植物
である。
特に興味が持たれるアンジオスベルメ人ngio−sp
ermaeは、落葉樹木は別として、ソラナシエパルメ
pa1mae 、プロメリア シx Bromel 1
aceae。
サシx Musaceaeまたはグラミネx、 Gra
m 1neae科の植物、およびレグミノセ:[、eg
umiμ見目の植物、特にバピリオナシェPapil 
1onaceae科の植物である。クルナシェ5oln
aceae 、  クルシフェv Crucifera
eおよびグラミネz Gramineae科の代表的な
ものが望ましい。ニコチアナN1cotia−na 、
ベチェニアPetunia 、ヒオシアムスHyosc
y−amns 、プラシカB rass icaおよび
ロリウムLoli−um族の植物、例えばニコチアナ 
タバクムオヨヒロリウム ムルチフロルムLolium
 mul −tiflorumが特に言及する両値があ
る。
トウモロコシ、コメ、コムキ、オオムギ、ライムギ、カ
ラスムギおよびアワのような高収量の栽培植物は特に植
物細胞形質転換の分野での努力の対象になる。
プロトプラストからの再生によりつくることができるす
べての植物は本発明の方法を使って形質転換可能である
。現在までの所、穀類を含まれるグラミネエOramμ
M±(草類)の代表的なものVこ対して遺伝的に操作す
ることができない。しかし、上記の直接遺伝子形質転換
法九よりグラミ社Gramineaeプロトプラスト、
 すなわち穀類の細胞を遺伝的に形質転換することが可
能であることが明らかになった。世界的な総収量や作付
面積は少いが、同様にソラナム5olanurn 、 
= コチアナfij−CQ旦、aha 、プラシカBr
a−ssica 、ベタ13e−ta 、ビスムrすu
m、−、ファゼオラスPhaseolus 、グリシネ
9呼c−i ne 、 、ヘクアンタストリティクム眠
屯四匹、ゼアZea 、ムサNl us3、−r? ル
スMalus 、 7 z ニクスPhoenix 、
 工vイスElaeis 、 A/プスRubus 、
 フラガリアFragaria 。
ブルヌスPrunns 、アラキスArachis 、
パニクムPanicum 、す・ンカルA Sacch
arum 、 =r フェアCoffea 、カメリフ
 Camellia 、アナナスAnanas。
ピティスVitisまたはシトラスC1tras属の栽
培植物の形質転換も可能であり、望ましい。
培養中のプロトプラス)1完全植物体に再生することは
29)エバンス等「プロトプラストアイソレイション 
アンド カルチャー」、ハンドブック オプ プラント
 セル カルチャー 1巻: 124−176貞(マク
ミラン パブリッシング カンパニー、ニューヨーク1
985年Evans et al、、 @Protop
last l5olation andCultnre
 ’ 、 in Handl)ook of Plan
t Ce1l Cu1ture。
1 : t24−176 (MacMillan Pu
blishing Co。
NewYork 1983 ) : 30)エム7−k
  テ4 ヒ+。
「リーセント デベロップメンツ イン ザカルチャー
 アンド リゼネレイシヲン オププラント プロトプ
ラスト」プロトプラスト。
1985−レフチャー ブロシーディングズ。
19−29頁、(ビルクホイザー、パスレ1983年)
  MRDavey 、 ” Recent Deve
lopments  in theCulture  
and llegeneration  of  Pl
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Proto 1asts 、 1983− Lectu
re Proceedings 。
page 19−29 、 (Birkh’auser
 、 Ba5le 1985 ) ;31)ピーシエイ
 ディル、「プロトプラストカルチャー アンド プラ
ント リゼネレイシ冒ン オブ シリアルス アンド 
アザ−リカルシトラント クロッゲス」プロトプラスト
1983−レフチャー プロシーディ/ゲス。
31−41頁(ビルクホイザー、バスレ 1983年)
 PJDale、” Protoplast Cu1t
ure and PlantRegeneration
 of Cereals and 0ther Rec
alcitrantCrops ” 、 in Pro
to 1asts  1985− Lecture P
ro−ceedings 、 page 31−41 
、(Birkh:a’user 、 Hasle198
3):およヒ32)エイチ ビンディング「リゼネレイ
シ薗ン オプ ブラソフ」プラント プロトプラスト 
21−37頁 (シーアールシー グレス、ポカ レイ
トン 1985年)HBinding 、  ” Re
generation of Hants ’ 、 i
n PlantProtoplasta 、 page
 21−37 、 (CRCPress 。
Boca几aton1985)および12)ボトリヵス
アイ アンド シリトアール ディー メノーヅ イン
 エンザイモロジ−118巻 プラント モレキュラー
 バイオロジー エイ、アンド エイチ ワイスパック
編、アカデミツクプレス、オルランド 1986年 P
otrykus 工and 5hillito RD、
 Methods in Enzymology 、 
Vol。
118 、 Plant Mo1ecular Bio
logy 、 eds、 A、 andH9Weiss
l)ach 、 Academic Press 、 
0rlando 。
1986に記載されている。 再生方法は植物の種によ
って異る。しかし、一般に、まず挿入された遺伝子の多
数のコピーを含む形質転換された10ドブラスト、8.
’a i泡またはm@の懸濁液をつくる。次にこのよう
な懸濁液を使って胚形成誘導を行うことが可能である。
この■の生長を天然の胚の場合のように成熟および発芽
の段階に進行させる。しかし、通常、プロトプラストは
公知の培養培地のひとつに入れて刺戟を与えて分裂させ
細胞壁をつくらせる。最終的に、何か活性成分、例えば
オーキシンやサイトキニンの処理によシ根や発芽茎の形
成に誘導することができるカルス培養を得る、培地には
これらの生長物質の外に一般に種々のアミノ酸を含む。
グルタばン酸およびプロリンを培地に入れるこトカ、%
にトウモロコシやアルファルファのような植物種の場合
に有利であることが証明されている。根や発芽茎は一般
に同時に形成される。
このようにして得られた小植物を土壌に移し、普通の苗
と同じ方法で更に培養する。
再生の効率は特に培地、遺伝型および培養の前歴に依存
している。もしこれらの三つの変数が適正に調節されて
いると再生は完全に再現性を持つ。
植物のin vitro培債の分野、特に植物再生の分
野における最近の開発の観点からみて、グラミネx G
ramineae科の代表的なものについテモ植物プロ
トプラストから全植物体を再生させることが可能になっ
てきた。グラミネエGramine−aeについて成功
した再生実験の例は中でも33)アプダラー、アール等
 バイオ/テクノロジー、4巻、1087−1(11)
0頁1986年Abdullah 。
几、et al、、 Bio/Technology 
、 4 :  1087−1(11)0゜1986;”
)フジムラ、ティー、等、プラントティシュ−カルチャ
ー しl!−ス2巻、74−75頁、1985年 1i
”uj imnra %T、et al−、。
Plant Ti5sue Cu Have Lett
、 2 : 7a −75。
1985;35)トリャマ、ケイ等、 セオリテイ力ル
 アンド アプライド ゼネテイツクス83巻、16−
19頁、1986年 Toviyama 、 K。
et at、、 Theor AP I、 Genet
、、 75 : 16−19 。
1986;36)ヤマダ、ライ9等、プラント  セル
 レボーツ 5巻、85−88頁、1986年(コメ)
  Yamada 、 Y、 、 Ct al、、 p
lant Ce1l Pep、。
5 : 85−813.1986に、また「プロトプラ
ストからのゼア メイズ(Zea mays )  M
物の再生」の題名で1987年6月24日に出願された
056.506号のアメリカ特許出願(pending
 USPatert Application 、 5
erial number 056,506)に記載さ
れている。
したがって、下記の植物を本発明の範囲内で使用するこ
とも可能である:ロリウムLolium、8eLari
a 。
形質転換された遺伝子はそれ自体公知の、例えば特にサ
ザーン プロット分析や酵素活性試験を含む雑種分析お
よび分子生物半時研究により検出できる。
雑種分析において、形質転換された植物細胞から成長し
た成熟植物をまず種子を生産する目的でそれ自身と交配
する。種子のいくつかは、新しく望ましい性質をコード
した挿入遺伝子と遺伝の法則に正確に相当する比で含む
。これらの1子を新しい望筐しい性質を持つ植物を生産
するために使用することができる。
ホモ妥合体系統を、繰返しの自家受粉と同系交配系統を
つくることによって得ることができる。次にこれらの同
系交配系統を今度は雑fit一つくるために使用できる
。この目的でひとつの同系交配系統をもうひとつの同系
交配系統と交配する。
本発明は、再生された植物から得ることができる部分、
例えば花、(重子、葉、枝、中でも果実で、これらの部
分が形質転換された細胞を含む場合には、これらの部分
にも関する。再生された植物の子孫(雑種の子孫も含む
)、変種および変異体も本発明の一部を形成している。
サザー/ プロット分析は例えば次のようにして実施で
きる:形質転換細胞またはプロトプラストから取ったD
NAf制限酵素で処理した後、1%アガロース ゲルで
α気泳動を行い、ニトロセルロース膜上に移す(37)
サザーン、イー。
エム0.ジャーナル オプ モレキュラー バイオロジ
ー 98巻、503−517頁、1975年5outh
ern、 EJvi8. J、Mol、 Biol、9
8.503−517 (1975))。そしてニック翻
訳に供しておいた検出のために使用するDNAと分子雑
種形成(・・イブリダイゼイシ曹ン)させる〔38)リ
グビー、ダブり二一、ジェイ1.ディークマン、エム8
、ローデス、シー、アンドピー、バーブ、ジャーナル 
オプ モレキュラー バイオロジー 113許、257
−251頁、1977年Rigby 、W、J、、Di
eckmann 、  M、、  几hodes、 C
and P、 Berg、 、T、 Mol、 Bio
l、 11s 、 237−251(1977))(5
X108乃至10 x 10’ c、p、m/μgのD
NA−比活性)。 次いで、フィルターを65℃で0.
03 Mクエン酸ナトリウムおよび13M塩化ナトリウ
ム水溶液で各回1時間3回洗浄する。雑■橿形成したD
NAは24−48時間X線フィルムを黒色化することに
より目に見えるようになる。
酵素活性は次のようにして、s’4べる〔アミノグリコ
シド ホスホトランスフェラーゼ(カナマイシン特異リ
ン酸化の酵素)の試験により詳細に説明〕:カルスまた
は葉の一部(1(10)乃至2(10)1ag) fニ
ーt ヘント/l、 y (gppendorf )遠
心管内、抽出用緩衝液20μl中で麿砕する。 緩衝液
は5)へレラーエストレラ、エル0.デブロック、エム
1.メーIセンス、イー1.ヘルナルスティーンズ、シ
ェイ、−?”−、、パンモンタキュー、エム、アンド 
ジェイ、シェル、イーエムビーオー ジャーナル 2巻
、987−995頁、1983年Herreva−Es
tvella 、 L、 DeBIock 、 M、。
Messens、 E、 、 Hernalsteen
s、J、−P、、 Van Mon−−tagu、 M
、and J、8che11. EMBOJ、 2.9
87−995(1985)によって使用されたものを一
部変えたもので、オウシ血液アルプミノを除いて0.1
Mシー!糖を加えたものである。  抽出物を12.(
10)0gで5分間遠心分離し、上澄に終濃度が(16
)04%になる筐でプロモロフェノールブルーを加える
。タンパク質を、10%の非変性ポリアクリルアミド 
ゲルによる′1気泳動で上澄35μlから分離する。 
ゲルをカナマイシンとγ−32p標aATPを含むアガ
ロース ゲルで覆ってインキュページ冒ンを行い、リン
酸化すした反応生成物をホワットマン(Whatman
 ) −p81−ホスホセルロース ベーパー[8−t
このベーパーを90℃の脱イオン水で6回洗浄してオー
トラジオグラフィーを行う、 以下実施例により本発明を詳細に示すが、これに限定さ
れるものではない。この実施例には、雑種遺伝子の構築
と環状構造を持つ支持DNA配列へのその組込み、この
雑種遺伝子の植物細胞への移入、形質転換された植物細
胞の選択とその形質転換植物細胞からの全植物体の再生
、更にそれの雑(重−遺伝学的および分子生物学的分析
を記載する。
以下の実施例には次の略号を使用する:培   地 HeNa/F (10mM Hepes、pH7,1,
5mMCaC11,150mM NaC1,α2M?7
=トーヤ;39)り。4.工40等、 1985年F’r orrrn、 M、 e t a 
I 、。
Ks  (cL1++y/12.4D、 1.omg/
l NAA。
α2mp/L  BAP;40) シ リ ト 、 ア
ール、ディー、等、1981年 5hillito、 R,D、et al、 (198
1):41)ナシ、ジエイ、アイ、アンド マリ力、ビー0,197(S年1’lagytJ、1.
and Maliga、 P、、 (1976) )K
A、AU  (42)インスタル、ピー、等。
1985年In5talle、 P、 et al、。
i、s    (45)リンスメイアー、イー、エム、
スクーク、二フ、、フイジオロギア プランタルム 18巻、  1(10)−127頁。
1965年Linsmaier、 EoM、、 5ko
ok。
F、、Physiologia  Plantarum
 18゜1(10)−127.(1965 ))MaCa   ((14)M −v :y 二) 
−A/、  15mM CaCt2x2H,0,pH5
,6) MaMg   ([14乃至α5M−r ンニト−ル、
15mMMgC1z、(10)チMES、pH5,6]
M〔42)インスタル、ピー、等、1985年1nst
alle、 P、、 et al +t (1985)
)MAPIAO〔42)インスタル、ピー、等、19B
5年In5talle、P、、 etal、、 (19
85))MDs   (’リネグルチュー、アイ、等。
1983年Negrutiu、 I、 et al、。
lぜ   〔42)インスタル、ピー、等、1985年
 I’n5talle、P、、  et al、、(1
985))nt 5A(42)インスタル、ピー、等、
 1985年In5talle、P、、 etal、、
 (1985))T〔45)=ツチー、ジーイ、ピー、
アンドシー、ニラチェ、  1969年 N1tsch、J、P、and  C1N1tsch 
Ws     (154mM NaC4125mM C
aC1z X2820.5 mM KCI、、 5mM
グA/ =r −ス。
pH5,6乃至6.0;46)メンツェル等、19B1
年Menczel  etal−。
化学物質 BAP   べ/ジルアミンプリン 2.4D   (2,4−ジクロロフェノキシ)酢酸N
AA   ナフチル酢酸 El)TA  エチレンジアミン−N、 N、 N’、
 N’ −テトラ酢酸 PhX) CM80MS型のポリエチレングリコール〔
15)ネグルチュー、アイ、等、1986年−a Ne
grutiu、 I+et al、。
(1986a)) PI 6几 R型のポリエチレングリコール(10)シ
リト、アール、ディー、等、 1985年5hi11i
to、几、D、etal、、(1985))) リスー
HCtα、α、α−トリス−(ヒドロキシメチル)−メ
チルアミン塩酸 NPT−■遺伝子 ネオマイシン−57−ホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子、■型 表 ATF   形質転換絶対fA度 GPPL   プロトプラストの総数 RTF   形質転換相対頻度 匪  形質転換処理終了後の生存プロトプラスト ZT   形質転換されたものの数 取下の実施例におけるパーセントは重量/容量パーセン
ト(W/V;容量当りの重量)である。
実施例1 自由に人手できるプラスミドpKm 21およびpKm
244 (”)ペック、イー、等、ジーン19巻。
527−556頁、  1982年Beck、 E、、
 et al 、、 Gene19、327−336(
1982))を制限エンドヌクレアーゼPstIで切断
する。組換えに使うプラスミドフラグメントをα8%ア
ガロースゲルにおける電気泳動によって精製する。フラ
グメントを結合させて得たプラスミドpKm 2124
4は47)ペック等Beck etal、Icよシジー
ン19巻、527−556頁、1982年Gene 1
9. 327−556C1982)K記載すnテイル!
 5 K、 N)’T−■遺伝子の5′−および3’−
Bal 31欠損の組合せを含む。
カリフラワーモザイクウィルスのプロモーター信号をプ
ラスミドpKm 21244のHindl17ラグメン
トと結合させるために、カップリングプラスミドpJP
AXf構築する。カップリングプラスミドpJPAXは
プラスミドpUc8とpUc9から得る〔メッシング、
ジェイ、アンド、ジェイ。
ビエイラ、ジー719巻、 269−276頁、 19
82年Messing、 J、 and J、 Vre
ira、 Gene 19 、269−276(198
2))。プラスミドpUC9のカップリング配列の10
塩基対を、HindlllとSal lの部位の所で切
断してポリメラーゼ−1−Klenowフラグメントヲ
使って接着末端をつくりc48)ヤコプセン、エイチ8
等ヨーロツピアンジャーナルオフバイオケミスト174
5巻、625頁、1974年Jacobsen、 Ho
、 et al、、 Eur、J、Biochem、4
5 。
625、 (1974)) 、ポリヌクレオチド鎖を結
合し、−f:の結果としてHindl1部位を再びつく
って、分離する。この分離したカップリング配列の8m
a 1部位に8塩基対の合成カップリング要素(xho
l)t−挿入する。プラスミドpUC8の適当なXor
lおよびHindlllフラグメントの、および変性し
たプラスミドpUC9の組換えにより下記の連らなり次
制限部位を持つ部分的に非対称のカップリング配列を持
つプラスミドp J PAX ’z得る 二 EcoR
l、  8ma l、  13amL−11,Sal 
 l、  Pst  l、  Himd fJJ。
BamHl、 Xho lおよびEcoRl。NPT−
11構造遺伝子に結合されたCaMV遺伝子遺伝子上プ
ロモータ一部分aMV CM 1841株の変種であシ
、その完全なヌクレオチド配列は  カードナー、アー
ル。
シー、等、  1981年C)ardner、几、C,
、et al、。
1981に記載さfL ティb 、 CaMV 0M4
1 B 4株が起源である。
CaMVプロモータ一部分をイー、コリE、coliプ
ラスミドルBa322の誘導体、6Kbコスミドpi−
に7q (49)ホーンズ、ビー、アンドコリンズ。
ジエイ、 1980年Hohns、 B、and Co
11ins J、。
1980)[クローニングする。CaxVNゲノムとコ
スミドpHC79t−Bst nで切断し、得られたフ
ラグメントラ友がいに結合させる。
カリフラワーモザイクウィルス遺伝子■の5′−発現倶
号とNPT−It遺伝子のBindllフラグメントを
プラスミドpJPAXの中で、カリフラワーモザイクウ
ィルス遺伝子■のプロモータ一部分をPst 1部位と
Hind[1部位の間に挿入することによって結合させ
る。得られたプラスミド金信号Hind[[部位で切断
し、プラスミドpKm 212 a 4の)iind 
illフラグメンlt−この切断部位に両方向に挿入し
、プラスミドpJPAX Cakm+とpJPAXCa
km−を得る。NPT−[雑種遺伝子の37−末端信号
の近辺にEcoRV配列をつくるために、プラスミドp
JPAX Cakm十のBamHI 7ラグメントをプ
ラスミドpBR327のHamHI部位に挿入する〔5
0)ソペロン、エックス、等ジーン9巻、 2B7−5
05頁、1980年8oberon、 X、etal、
、 Gene 9 。
287−305(1980))。
プラスミドルBa327 Cakmt−得る。この新し
いDNA構築を含むプラスミドpBR327Cakmの
EcoRvフラグメントを、プラスミドpUC8の5a
llts位でクローニングしておいたカリフラワーモザ
イクウィルス遺伝子■のEcoRV部分と置換するため
に使う。その結果、N)’T−1遺伝子のタンパク質を
コードしたL)NAは、カリフラワーモザイク9イルス
遺伝子Vの57−および3′−発現信号の制御下におか
れる。この得られたプラスミドをpAllD lおよび
pAk3D lと呼ぶ(第1図参照)。
実施例2 ニコチアナタパクムシー、ブイ、プチハハンナN1co
tiana Tabacum C0V、Petit H
avannaのタバコ プロトプラストを公知の方法に
よりタパ・コ。−の懸濁培養からつくる〔12)ボトリ
カスアイ アンドシリト アールディー メソーズイン
エンザイモロジー118巻、プラント モレキュラーバ
イオロジー エイ、アンドエイチ ワイスバック編アカ
デミツク プレス、オルランド。
1986年Potrykus  I  and  5h
illito  几り。
Methods in Enzymology、 uo
l、11 B、 PlartMolecalar Bi
ology、 eds、 A、and H,Weiss
bach。
Academi Pi ress、 0rlando、
 1986 )。6週間の苗木培養から無菌的に完全に
広いた葉を取り、下記の組成を持り酵素溶液で十分にぬ
らす:酵素溶液:)i、0           70
auシ四糖         132 マセロザイムl(,1(10)F セルラーゼ         2f 「オノズカ」几10(ヤクルト株 大会社1日本Yakult Co、Ltd、。
Japan) ドリセラーゼ(ヘミッシェフアプ リフ  シェバイツエルハーレ、ス イ、x、  Chemische F’abrik ゛
:’=パSchweizerhal le、SWi t
gerland)(10)5f フォン酸(MES)       α5m1pH&0 次に葉を1乃至2cr11角の大きさに切り、この角片
を上記の酵素溶液に浮かす。こnl暗黒下。
26℃で一夜放置する。この混合液をゆるやかに振とう
し、消化が完結するまで更に30分間放置する。
次いで、この懸濁液を1(10)μm幅のメツシュを持
つスチールの篩で濾過し、06Mシロ糖(MEz、 p
H5,6)で十分にすすぎ、次に4(10)0乃至5(
10)0μpmで10分間遠心分離する。液の表面にプ
ロトプラストが集υ、液を1例えば殺菌した注射器を使
用してプロトプラストの下の液を除去する。
プロトブラストヲ(14)Mシ!1糖を含むに3A培地
に再懸濁する〔シ四糖(1(10)961’/4):キ
シロース(α259/l):2.4−ジクロロフェノキ
シ酢!((L10fflF/l); 1−す7’F−ル
酢酸(1,0(ly/l);6−ベンジルアミノプリン
(α20 +nI/ t ) *pH5,8)(12)
ポトリカス アイ アンド シリト。
アール、ディー、等、 1981年Potrykus、
 I 。
and 5hillito、 RoD、et al、、
  1981 )。
形質転換を行うために、まずプロトプラストを洗浄し、
計数L ”CWs培地(154mM NaC1。
125mM CaC4t X 2H! 0.5mM N
O45mMグルコ−ス、pH5,6;   メンツエル
、エル、等、1981年Menczel、 L、et 
at、、 (1981) )に1d当#)1乃至2.5
X10’細胞の細胞濃度で再懸濁する。この濃度が分離
し九プロトプラストの生存4′t−高くする。6乃至8
℃で30分分間−た後、プロトプラストを形質転換実験
に使用する。
分離してプロトプラス)1−実際に形質転換する直前に
W5培地を実際の形質転換用培地で置換する。この培地
はマンニトール/マグネシウム溶液(MaMg−溶液:
 Cl3− 0.5mM−r 7 ニトール、111q
I!IMES(モルホリンエタンスルホンi!1り、p
Ha6)で12乃至16rrNiのMg意+濃度を持つ
まず、プロトプラスi 1(10)pで5分間遠心分離
してW11溶液から分離し、MaM?培地((L3at
j)に再懸°濁する。プラスミドpABD l 5乃至
10μgとコウシ胸腺キャリアーLINA50μgt含
むI)NA水水溶液6御 DNAは形質転換挿入をしない中性キャリア7DNAで
,形質転換されるDNA iヌクレアーゼ消化から保護
する比めにこの混液に過剰に加える。
DNA添加後,約(10)乃至10分間経て、終濃度力
2 4 乃至2 8 ’16 (W/V) Kナルまで
40%ポリエチレングリコール水溶液(W/V)’を加
える。
0MS型のPEG=i使用すると特に有利であることが
証明されている。これはCa”十含有04Mマンニトー
ル溶液([LIM Ca(NO3) ’1.4H20)
で、約1(10)0乃至6(10)0の分子量を持つP
EGを終#度4 0 % (W/V) 含ム。C O 
溶液O pH fi pH 7 乃至?である〔15)
ネグルチェー,アイ、等,1986年−a Negru
tiu, I, etal.、 ( 1 986a )
 )。
ニコチアナ タバクム シー、ブイ、ブチハバを使用す
ると望ましい。次いで、形質転換培地のpH値をpH 
7に調整し,この混液を時々振とうしながら26℃で3
0分間放置する。
もし20%以上の高濃度のPEGを使用する場合,α2
 M CaCl2溶液3乃至5倍量でゆりくりと希釈す
るのがよい。このようにして処理したプロトプラストを
つぎに遠心分離しく1(10)fで5分間)、新たに4
培地に再懸濁する(10Mの新しいに3培地にα3ゴブ
ロトブラスト溶液)。
直径10mのペトリ皿に10dを入れて遮光下に240
で更にインキュベイン1ンを行う。
この時の細胞濃度は1d当94乃至8X10’プロトプ
ラストである。3日後に,培地をペトリ皿当シに3培地
α3容量部で希釈し, 3(10)0ルクスの人工光線
を当て24℃で更に4日間インキエベイシ日ンを続ける
。全部で7日経た後,プロトプラストから生じ九クロー
ンf50mg/lのカナマイシンを含み1チアガロース
で固めた栄養培地に埋め.「ビーズ型」培養法〔51)
シ・リド、アール、ティー、等,フラントーτ・セル、
レボーツ 2巻,244−247頁,  1983年5
6i11ito, R9D.etal.、 Plant
 Ce1l Reports。
2、244−247(1985))に従って遮光下に2
4℃で培養する。栄養培地を同じ栄養液の新しいもので
5日毎に取換える。
実施例5 カナマイシン含有栄養培地で3乃至4週間続けて培養し
た後、直径2乃至5rtaの耐性カルスtLs培地(4
3)IJタンスイヤー,イー、エム。
アンドスクーク,ニス、アイジオロジカルプラント 1
8巻,1(10)−127頁,1965年Linsma
ier, EoM.and 8kook, F.、 P
hysiol, Plant上見,1(10)−127
(1965))で寒天で固め,2。
4−ジクロロフェノキシ酢酸(16)51Ttg/4 
1−すフチル酢m2m1/l、6−ベンジルアミツブリ
ンCL1rNI/l、キネチン(10)叩/lおよびカ
ナマイシン150m5+/ L ’に含むものに移植す
る。カナマイシン150 my/ tおよび6−ベンジ
ルアミノプリン(32)F9/Lを含むhs培地で動歯
を誘導し、T培地〔45)ニッチ−、クイ。ビー、ア7
)”C8=ッチュ、サイエンス165巻、85−87頁
、  1969年N目sch、 Y、P、 and C
0Ni tsch 。
5cience 1−63.85−87(1969))
で根を形成させて変種ブチハパンナエスアールI  P
etitHovanna SR1のカナマイシン耐性テ
コチアナタパクA N1cotiana tabacu
m植物を得る。
実施例4 プロトプラストの分離および実際の形質転換実験の友め
に行うプロトプラストの前培養ヲ二コチアナタバクムエ
スアールI Nicotianatabacum 8几
1について記載した方法と全く同じようにして実施する
前に示したようKして前処理したニコチアナプに7パギ
ニフオリアN、 plumbaginifoliaプロ
トプラストの実際の形質転換を、22乃至27mMのM
gM+イオン濃度を持つマンニトール/マグネシウム溶
液(MaMg溶液:0.4乃至α5蘭マンニトール、1
1%MEN(モルホリンエタンスルホン酸)、pH5,
6)中で行う。プラスミドpABIII5乃至10μg
とコック胸腺キャリアーDNA50μgを含むDNA水
溶液(65μt)を加えた後、終濃度が18乃至22%
(W/V )に達するまで40チポリエチレングリコー
ル水溶液(W/V)を加える。L)NA添加とPEG−
1加えるまでの時間は、一般に約[Ll乃至10分間に
すぎない。PEG CMS 4(10)0を使用すると
ニコチアナプルンバギニフォリア N1cotiaua
 plnmbaginifoliaの場合にも高形質転
換率を得るのに特に有利であることが証明さtした。次
に形質転換培地のpHf:pH7に調整する。形質転換
溶液を26℃で約50分間、液を時々振とうしながらイ
ンキ瓢ペイジョンを行う。
最初に分離したプロトプラストを細胞濃度2乃至3X1
0’プロトプラスト/−で、高ホルモ7aK(D培地(
CKA、AO培地、42)インスタル。
ピー、等、ジャーナルオププラレト アイジオロジー1
19巻、443−454頁、1985年1nstall
e、 P、et al、、 J、Plant Phys
iol、 119 。
445−454.(1985))中、4乃至12日間培
養する。
細胞凝集的ができ次後に、生存コロニーを選択し、計数
して、20乃至40W9/を硫酸カナマイシンを含む低
ホルモン#度のMDs培地(44)ネグルチェ、アイ、
等セオリティ力ルアンドアプライドゼネティックス66
巻、 341−347頁、19℃3年Negrutiu
、 1.etal、、Theov。
Appl、Genet、66.541−547.(19
83))またはMAP 、 AO培地〔42)インスタ
ル、ビー、等。
1985年1nstalle、 P、etal、、 (
1985) )中で大希釈して(α5乃至2X10”コ
ロニー/ml)して懸濁する。次にコロニーを寒天(1
%アガロース)に埋め、「ビーズ型」培養法〔51)シ
リト。
アール、ディー、等、  1985年5hillito
、 R1,D。
etal、、 (1983) )に従って遮光下に24
℃の温度で培養する。栄養培地を同じ培養溶液の新しい
もので5日毎に取換える。
実施例5 5乃至4週間培養した後、直径2乃至5W+に達した耐
性カルス全選択し、カナマイシン50曙/lを含む固体
培地で更に5乃至5週間培養する。
耐性カルスt−fLP培地から几’SAおよび/または
M培地に移植することによす42)インスタル。
ビー、等、1985年 In5talle、 P、 e
t al、。
(1985)の詳細にしたがって全植物体1’)生ずる
実施例6 形質転換された細胞培養からのカルスまたはそれから再
生した植物からの葉組織α5tを。
エチレンジアミンN、 N、 N’、 N’−テトラ酢
酸(EDTA ) 50 rrmol/l 、塩化ナト
リウムα25mol/lおよびα、α、α−トリスー(
ヒドロキシメチル)−メチルアミン塩1!#(トリス−
1−1ct ) 50mmoシt1f!:含む15%シ
、糖溶液、pHao中、O℃で磨砕する。ホモジネート
を丁(10)0p、5分間遠心分離して核をほぼ分離す
る。この細胞核をEDTA 5mmol/lとトリス−
HCL 50 mmot/ Lを含む15%イヨ糖溶液
pHaOに再懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度
が0.2%になるまで加え、全体を70℃で10分間加
熱する。
混液を20乃至25℃に冷却し、酢酸カリウムを濃度が
0.5 mot/ tになるまで加える。この混合液を
0℃で1時間置く。生じた沈liを遠心分111[i(
微量遠心分離機で4℃、15分間)する。
DNAt−2,5倍量のエタノールを加えて2o乃至2
5℃で上澄液から沈殿させる。分離したDNAをリボヌ
クレアーゼ10μg/xi 含ム) IJスーHCL 
10 mmoL/Lの溶液に溶解し、67℃で10分間
反応させた後、ブロティナーゼKt−250μg/a+
jの濃度になるまで加え、全体を37℃で更に1時間イ
ンキエベイシ■ンを行う。ブロティナーゼKiフェノー
ルおよびクロロホルム/イソアミルアルコール抽出処理
で除去する。
DNAf:(L 6 M酢酸ナトリウムのイソプロピル
溶液CL6容量部を加えて水相から沈殿させ、トリ、x
、 −HCL 10 mmot/ lとEDTA 5 
mmot/lヲ含む溶液p H7,5の50μを甲に溶
解する。この調製により、はとんどがso、ooo以上
の塩基対を含むDNA配列を得る。h:coRVエンド
ヌクレアーゼによるこのDNAの制限分解、放射線標識
したNPT−n遺伝子のHind[lフラグメントとこ
のフラグメントのハイプリダイゼイシヲン、サザンプロ
ット分析におけるプラスミドpAt3D lとの比較か
ら、形質転換されたニフチアナタバク細胞の細胞核DN
A中にNPT−n遺伝子が存在することが明かとなる。
結果の部 以下に実施した形質転換の結果全種々の形質転換パラメ
ータとの関係で考察する。
得らnた形質転換率は「相対形質転換頻度」(RTF’
)と「絶対形質転換頻度J (ATF)の形で示す。
「相対形質転換頻度」は形質転換されたものの数と非選
択的に培養されたプロトプラスト数の生存画分(コロニ
ーを形成できる)との比を表わす。一方、「絶対形質転
換頻度」は同じ形質転換されたものの数と、形質転換前
に生きていたプロトプラストの最初の数との比として定
義される。
AT壬゛と几TFの比較は個々の形質転換と選択段階が
実施さ扛た後のプロトプラストの生存率について良好な
指標となる。
対する影響 第1表:ニコチアナブルンバギニ7オリアN1coti
ana plumbaginifoliaプロトプラス
トの場合の形質転換率(RTFおよびA’l’F)に対
するDNA構造とキャリアーDNAに対するプラスミド
DNA(pABD I )濃度の比の影響形質転換実験
はMaCa溶液中、 PEG 0M84 d1度13チ
で行った。
形質転換率に対する1)NA槽構造影響をニコチアナブ
ルンバギニフォリア N1cot ianaplumb
aginifolia f例として示す(第1表)。
実施し次形質転換実験において、環状JJNAよシ直線
状DNAを用いた方が明らかに高い形質転換率が冥現す
ることは明らかである。直線状1)NAの場合に得らn
た形質転換率は環状DNAを使って得られた値よシ10
の2乗近く高い。
第1表では、DNA構造のみならず加えたキャリアーD
NAに対するプラスミド1)NAの比も得られる形質転
換頻度に影響を持つことが明らかに示されている。
キャリアーDNAがプラスミドL)NAに対して明らか
に過剰の時に最良の結果が得られ。
1[1:50(プラスミドL)NA :キャリアーDN
A)の比が特に有利である。
ここに得られた結果にタバコの葉ですでに得られていた
結果を確認している〔10)シリト。
アール、尋バイオ/テクノロジー5巻、 1985年5
hillito、几、D、etal、、 Bio/I’
echnology5、(1985))。
第2表:ニコチアナプルンバギニフオリアN1cotj
ana plumbaginifo目aおよびニコチア
ナ タバクム シー、ブイ、プチハバンナエの形質転換
1()l、TF’およびATF )に対するP EG 
4度の影響。
形質転換実験はWS塩溶液中、プラスミドDNAのキャ
リアーDNAに対する濃度比に5で実施した。
第2表はニコチアナ タパクム ニスアールいて得られ
る形質転換頻度に対する異ったPEG濃風の影響を明確
に示している。いずれの場合にも、ふたつのパラメータ
ー間の明らかな関連を見分けることが可能である。ニコ
チアナブブルンバギニフオリアエメユ plumbaginifol ia Q) @合、 P
E(11)度を8チから27%に高めると、そしてニコ
チアナ タ13%から26%に高めると、形質転換率は
それぞれCLO3X10’からα28x10 ’および
(14)6X10 ’から1.2X10’に上昇する。
第5宍:ニコチアナ タバクム ニスアールI N−t
abacum S几1プロトプラストの形質転換率に対
するMgCt!濃度、適用時期、使用するPEG溶液、
および高PEG濃度(〉25%)便用時の洗浄条件の影
響。
終濃度20チのPE(10)MS4およびPEG CM
S 6溶液を形質転換率実験に使用した(例外は表中で
別に示している)。
米MaMg==−mbAf1MaMg溶液中のM g 
CL!濃1ft示す。
a)適用の時期:第5表かられかるように最高の結果、
形質転換率4.lX10−3はMgct。
を実際の形質転換の直前に形質転換培地に加えることに
よって得ることができる。
これに対し、 MgC2!を適用して2時間後まで形質
転換を行わない場合には、形質転換率は1.2X10−
’にとどまる。
また、 マyニトール/MgC7z溶液(MaMg溶液
)をWs塩溶液と1:1の比率で組合せた時にも、 M
gC1mのそル濃度に依存して多かれ少なかれ形質転換
頻度の低下がおこる。例えばMaMg溶液のMget、
濃度を半分にした場合、形質転換率の低下は約20%で
ある。
一方、適当な緩衝液(Ws浴溶液たはHeNa/Fag
)(”)クロム、エム、等プロシーディングズオプナシ
四ナルアカデミーオブ サイエンシズオブユナイテッドステイッオブアメリカ 
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8゜(1985))のみを存在させ、Mg2+を存在さ
せないで行った対照実験の結果と比較すると、この場合
にはその形質転換類itは10の1乗以上低くなってい
るのがわかる。上記で考察したように高い形質転換率は
エレクトロボレイションを伴っても実現することはでき
ない。
PEG/Mg”十相乗作用:Mg”+イオンとPEGを
同時に使用した場合の相乗作用は、MgCt、の存在下
(6mM)でPEGを添加せずに行りた対照の形質転換
結果とMgC6,およびPEGをいっしょに使用した実
際の実施例のものを比較すれば非常に明白に示さnてい
る(第5表)。
MgCt、、は6mMの濃度で存在するがPEGを加え
ない対照実験では形質転換の例を全く検出できない。
、−nK対し 、 PEGt−(最i! 20 %W/
V テ)MgC1,含有形質転換培地にDNA添加直後
に(C1乃至10分後)加えることによシ上記の4.l
X103という高い形質転換率を実現できる。
この形質転換率はMgC2,を添加せずにPEGのみを
使用した比較例(第2表参照)に比較しても10の1乗
以上高い。
12乃至15mMの濃度範囲のMgCt2と同時に28
チの濃度のPEG CMSを使って最高の形質転換率が
得られるタバコの場合(第2B図)K対し、ニコナアナ
ブルンバギニフォリアN、plumbaginifol
iaの場合の最適範囲はよシ高いMg04価の傾向にあ
る(第2A図参照)。
C(7)場合、20乃至50 mM (D 1iA囲の
MgCLz濃度と20チのPEG濃度で最高形質転換率
が得られている。こ、れらによりA9X10 ’の形質
転換率が得られる。
PEG組成:前述したパラメーターの外に、使用するP
EG1液の組成も得られる形質転換率に影響する。pg
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)、et al +#(1985)を他の条件は同じに
して使用し次場合(P)!:G濃度24%、 MgC4
濃度12mM)、前者の場合に明らかに高い形質転換率
が得られ、これは1.4倍高い。
もし24%にコチアナプルンパギニフォリ7  N、p
lumbaginifoliaの場合は20%)の高い
)’EGfi度の場合、α2M Ca C14x 2H
20含有溶液で処理プロトプラストを洗浄することが有
利であることが証明された。
このようにする結果として、形質転換率は単に塩m液(
Ws浴溶液のみによる処理に比較して17倍上昇する。
達の検出 遺伝的変性を受けた植物(第一世代および子孫)の詳し
い遺伝学的雑種分析と詳細な分子生物学的研究(例えば
植物ゲノムのDNAのサザンプロット分析;アミノグリ
コシドデホスホトランスフェラーゼ、すなわちカナマイ
シン−特異リン酸化の酵素の酵素活性の検討)から次の
ような結果が得られた: 1、 細菌の遺伝子は植物ゲノムに安定して組込まれて
いる; 2一般に、雑攬子孫に変化せず規則的に移入さnている
; 五 七の遺伝子型は天然の単純で優性の植物遺伝子のも
のに相当する; 4、  DNAハイプリタ゛イゼイションと酵素試験に
よる分子的分析は遺伝学的雑種分析の結果を確認; i 遺伝的に変性された植物は処理中にその正常な天然
の表現型を保持し;その結果。
望ましくない変性は確認されなかった。
以上の結果から、植物材料の調節された遺伝的変性の最
良の方法は本発明によるプロトプラストへの直接遺伝子
移入法によることがわかった。その遺伝的変性は安定し
ており。
植物の遺伝型の望ましくない変化は起らない。
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lant Ce1l几eports。
2 244−247.(1983)
【図面の簡単な説明】
第1図はNPT−■構造遺伝子を含むプラスミドベクタ
ーpABI) IとpABD llの構築を表わす図、
第2図はニコチアナ タバクム シー、ブイ。 プチハパンナエスアール1 (Nicofianata
bacum C0V、Petit Havanna 8
几りにおける(AおよびB)、およびニコチアナプルン
バギニ7.す7 (Nicotjana plumba
ginifolia)における(5)形質転換率に対す
るMgC4,濃度(5)およびMgCLs/PEG相互
作用(B)の影響を表わすグラフである。 グラフA中1曲線aはN、tabacum 8)tl 
。 曲線すはN、plumbaginifol iaである
。 MgCtz a Wは片対数スケール(横軸)で示す(
PEo濃y 20%(W/V))。 グラフB中、曲線aは15 mM MgC15。 曲線すは30 mM MgC1zである。 ニMツ クz2多乙2イz2: NPTII   1% 五Ae
+ウリ肋クーを寸゛イアウィルスの1イ*+VItl?
力J1@ : 7°う1+)’pABD1cpABDI
[ei1%東二T翫C2

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 (1)植物プロトプラストをいかなるものでもより植物
    組織から分離し、植物プロトプラストを培養するために
    通常使用される栄養培地のひとつで培養し; 実際の形質転換前に、前記プロトプラストを、Ca^2
    ^+、K^+およびNa^+イオンおよび適当な炭素源
    をも含む前培養培地で4°乃至10℃の温度で、20分
    乃至6時間前培養し; 次いで該プロトプラストをこの前培養培地から分離し、
    Ca^2^+イオンの存在下または非存在下に0.1乃
    至60mMMg^2^+イオンを必須成分として含む実
    際の形質転換培地に再懸濁し; その後すぐに、植物中で活性な発現信号の制御下のひと
    つ以上の遺伝子および支持DNAをも含むDNA試料を
    形質転換溶液に加え;0.1乃至10分後、原形質膜変
    性剤を加え;プロトプラストとDNA試料を上記の形質
    転換溶液中で、DNAのプロトプラストへの取込みが十
    分である時間、インキュベイションを行う、 植物遺伝型の形質転換法。 (2)形質転換溶液がMg^2^+イオンを10乃至3
    0mMの濃度で含む特許請求の範囲第(1)項記載の方
    法。 (3)原形質膜変性剤がポリエチレングリコールである
    特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 (4)インキュベイション培地におけるポリエチレング
    リコールの終濃度が10%乃至30%である特許請求の
    範囲第(3)項記載の方法。 (5)ポリエチレングリコールの終濃度が20%乃至2
    8%である特許請求の範囲第(4)項記載の方法。 (6)インキュベイション溶液のpH値がpH5.6乃
    至pH12である特許請求の範囲第(1)項記載の方法
    。 (7)インキュベイション溶液のpH値がpH7乃至p
    H10である特許請求の範囲第(6)項記載の方法。 (8)植物で活性である発現信号の制御下にあるいかな
    る起源でもよいもののうち、ひとつ以上の遺伝子および
    支持DNAを含むDNA試料の濃度が2乃至20μg/
    mlある特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 (9)DNA試料の濃度が5乃至10μg/mlである
    特許請求の範囲第(8)項記載の方法。 (10)形質転換遺伝子を持たない中性のDNAをキャ
    リァーDNAとして過剰に形質転換溶液に更に加える特
    許請求の範囲第(1)項記載の方法。 (11)中性のDNAが動物DNA、植物DNA、λ−
    DNA、プラスミドDNAまたは本法を実施するに好適
    なすべてのDNAである特許請求の範囲第(10)項記
    載の方法。 (12)中性のDNAがコウシ胸腺キャリァーDNAで
    ある特許請求の範囲第(10)項または第(11)項記
    載の方法。 (13)キャリァーDNAの濃度が50乃至70μg/
    mlである特許請求の範囲第(10)項記載の方法。 (14)プロトプラストの前培養を20分乃至1時間に
    わたって行う特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 (15)Ca^2^+計の存在下または非存在下で0.
    1乃至60mM Mg^2^+イオンを必須成分として
    含む実際の形質転換培地において原形質膜変性剤の存在
    下に10乃至6時間、プロトプラストとDNAをいっし
    ょにインキュベイションを行う特許請求の範囲第(1)
    項記載の方法。 (16)使用する形質転換遺伝子が、その構造遺伝子部
    分が植物、動物、微生物、ウィルスまたは合成起源であ
    り、発現信号が植物、動物または合成起源である遺伝子
    である特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 (17)形質転換遺伝子がゲノムDNA、cDNAまた
    は合成DNAからなる特許請求の範囲第(16)項記載
    の方法。 (18)形質転換遺伝子がゲノムDNAおよびcCNA
    および/または合成DNAの両者からなる特許請求の範
    囲第(16)項記載の方法。 (19)形質転換遺伝子が異なった属に属するいくつか
    の生物起源の遺伝子フラグメントからなる特許請求の範
    囲第(16)項記載の方法。 (20)形質転換遺伝子が同じ生物のひとつ以上の株、
    変種または種起源の遺伝子フラグメントからなる特許請
    求の範囲第(16)項記載の方法。 (21)形質転換遺伝子が同じ生物起源のひとつ以上の
    遺伝子の部分からなる特許請求の範囲第(16)項記載
    の方法。 (22)形質転換遺伝子が形質転換された植物に有用で
    望ましい性質を付与する構造遺伝子を持つ特許請求の範
    囲第(16)項記載の方法。 (23)構造遺伝子が植物に、病原体、除草剤、殺虫剤
    および他の殺生物剤に対する高められた抵抗性または耐
    性を付与する特許請求の範囲第四項記載の方法。 (24)構造遺伝子が葉、種子、塊茎、根および茎にお
    いて保存および貯蔵される物質の形成および品質を改良
    する特許請求の範囲第(22)項記載の方法。 (25)構造遺伝子が薬学的に受け入れられる活性物質
    をコードしている特許請求の範囲第(22)項記載の方
    法。 (26)発現信号が植物または植物ウィルスの遺伝子起
    源である特許請求の範囲第(16)項記載の方法。 (27)発現信号がリブロースビスホスフェートカルボ
    キシキラーゼまたはクロロフィルa/b結合タンパク質
    の小さなサブユニットをコードしている植物遺伝子起源
    である特許請求の範囲第(16)項記載の方法。 (28)発現信号が植物ウィルスの遺伝子起源である特
    許請求の範囲第(16)項記載の方法。 (29)植物ウィルスがカリフラワーモザイクウィルス
    (CaMV)である特許請求の範囲第(28)項記載の
    方法。 (30)発現信号がCaMVゲノムの35S発現信号で
    ある特許請求の範囲第(29)項記載の方法。 (31)発現信号がCaMVゲノムの19S発現信号で
    ある特許請求の範囲第(29)項記載の方法。 (32)使用する植物プロトプラストが単一の種または
    種の下部に置かれる分類学的単位からのものである特許
    請求の範囲第(1)項記載の方法。 (33)前記プロトプラストは葉、幼苗、茎、花、根、
    花粉または胚から得る特許請求の範囲第(32)項記載
    の方法。 (34)プロトプラストが葉のプロトプラストである特
    許請求の範囲第(33)項記載の方法。 (35)プロトプラストは細胞培養から得られる特許請
    求の範囲第(32)項記載の方法。 (36)プロトプラストがソラナシエ、クルシフェレ、
    コンポジテ、リリアシエ、ビタシエ、ケノポディアシエ
    、ルタシエ、アリアシエ、アマリリダシエ、アスパラガ
    シエ、オルキダシエ、パルメ、プロメリアシエ、ルビア
    シエ、テアシエ、ムサシエまたはグラミネエ科またはレ
    グミノセ目の植物からのものである特許請求の範囲第(
    1)項記載の方法。 (37)プロトプラストがソラナシエ、クリシフェレお
    よびグラミネエ科のものである特許請求の範囲第(1)
    記載の方法。 (38)プロトプラストがトウモロコシ、コメ、コムギ
    、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、またはキビのもの
    である特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 1)プロトプラストがソラナム、ニコチアナ、プラシカ
    、ベタ、ピサム、ファゼオラス、グリシネ、ヘリアンタ
    ス、アリウム、アベナ、ホルデウム、オリゼ、セタリア
    、セカレ、ソルガム、トリティカム、ゼア、ムサ、ココ
    ス、シドニア、ピラス、マラス、フェンタス、エレイス
    、ルパス、フラガリア、プルナス、アラキス、ハニカム
    、サッカラム、コフェア、カメリア、アナナス、ピティ
    スまたはシトラス属のものである特許請求の範囲第(1
    )項記載の方法。 (40)プロトプラストから再生することができる植物
    の形質転換のための特許請求の範囲第(1)項記載の方
    法。 (41)NPT−II遺伝子はCaMV遺伝子IVのプロモ
    ーターと終止信号を持っており、これはpCU8プラス
    ミドに挿入され、得られたキメラプラスミドは下記の群
    からの植物の分離されたプロトプラスト中にMg^2^
    +/ポリエチレングリコール処理により移入されること
    を特徴とするNPT−II遺伝子の移入によるニコチアナ
    タバクム、ニコチアナ ブルンバギニフォリア、ペチュ
    ニア ヒプリダ、ヒオシアマスムティカスおよびプラシ
    カ ナパスの群からの植物の形質転換のための特許請求
    の範囲第(1)項記載の方法。 (42)形質転換の結果として得られた新しい遺伝子を
    持ち、それから得られる有利な性質を持つ、 植物プロトプラストをいかなるものでもより植物組織か
    ら分離し、植物プロトプラストを培養するために通常使
    用される栄養培地のひとつで培養し; 実際の形質転換前に、前記プロトプラストを、Ca^2
    ^+、K^+およびNa^+イオンおよび適当な炭素源
    をも含む前培養培地で4°乃至10℃の温度で、20分
    乃至6時間前培養し; 次いで該プロトプラストをこの前培養培地から分離し、
    Ca^2^+イオンわ存在下または非存在下に0.1乃
    至60mMMg^2^+イオンを必須成分として含む実
    際の形質転換培地に再懸濁し;その後すぐに、植物中で
    活性な発現信号の制御下のひとつ以上の遺伝子および支
    持DNAをも含むDNA試料を形質転換溶液に加え;0
    .1乃至10分後、原形質膜変性剤を加え;プロトプラ
    ストとDNA試料を上記の形質転換溶液中で、DNAの
    プロトプラストへの取込みが十分である時間、インキュ
    ベイションを行う、 植物遺伝子の形質転換法により得られる形質転換された
    プロトプラスト、およびまた植物細胞、細胞凝集物、胚
    、これらから得られる植物および種子、および変異体、
    変種子孫を含むそれらの子孫。
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