CN116284442B - 一种控制叶片颜色的融合蛋白及其在植物转录因子与dna互作研究上的应用 - Google Patents

一种控制叶片颜色的融合蛋白及其在植物转录因子与dna互作研究上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种控制叶片颜色的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还公开了用于鉴定转录因子与启动子DNA之间互作关系的报告系统，包括表达盒A和表达盒B；其中表达盒A包括植物强表达启动子、MCS1和终止子；表达盒B包括Ω增强子、MCS2、SGRED基因和终止子。利用本发明控制叶片颜色的融合蛋白和报告系统鉴定转录因子和启动子DNA之间的互作关系，结果准确、可靠，并且可以在可见光下裸眼直观、实时判断；本发明方法简单，成本低；且可在植株内部进行，不受外界干扰，还避免了假阳性问题，为植物转录因子和启动子DNA之间互作分析提供了一个高效的工具。

Description

一种控制叶片颜色的融合蛋白及其在植物转录因子与DNA互 作研究上的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种控制叶片颜色的融合蛋白；以及编码该融合蛋白的基因；还涉及该融合蛋白和基因作为报告基因在植物转录因子与DNA互作研究上的用途。
背景技术
转录在植物生命过程中发挥至关重要的作用，转录因子是调节功能基因转录的关键因子。转录因子和下游靶基因启动子中顺式作用元件相结合，调控下游基因的时空特异性表达，从而调节植物生长发育、器官分化、环境响应等生物学过程。因此，研究转录因子与下游靶基因启动子DNA的相互作用对于通过基因工程手段调控植物生长发育、器官分化、增强抗逆性和抗病性具有重要的作用。
转录因子和下游靶基因启动子DNA互作分析技术本质上是研究蛋白质与DNA相互作用的技术。目前，用于检测转录因子与DNA之间互作的方法主要有：酵母单杂交(Yeastone hybrid，简称为Y1H)，凝胶阻滞迁移率检测(Electrophoretic Mobility ShiftAssay，简称为EMSA)，依赖于荧光素酶(Luciferase简称为LUC)的烟草瞬时转化系统，以及染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation，简称为ChIP)。然而，上述四种方法都有自己独特的优势和不足。例如，Y1H技术操作相对简单，但是受酵母内源表达激活物的影响,存在假阳性问题，不能准确反映植物体内的真实情况。EMSA技术可以实现定性和定量分析，但是该技术属于体外检测手段，需要纯化的转录因子蛋白，技术难度大且难鉴定低亲和力结合元件。基于LUC的烟草瞬时转化系统操作简便、表达效率高，但可见光下可视化程度差、成本高，依赖荧光成像系统和昂贵的化学试剂。ChIP技术是体内研究系统，真实地反映转录因子和DNA的结合的状况，可以大规模检测已知转录因子和靶基因启动子DNA的动态结合，比体外实验更具说服力，但ChIP技术需要高质量抗体或稳定的转基因植物，存在成本高、周期长和操作繁琐等问题。因此，还需要寻找能克服上述方法缺点的鉴定转录因子和DNA互作的方法。
滞绿基因(Stay-Green，简称为SGR)编码一种叶绿素a脱镁蛋白，催化叶绿素脱镁反应生成的脱镁叶绿素a，是叶绿素降解途径中的关键限速因子。SGR蛋白通过激发NYC、PPH、PAO、RCCR等多个叶绿素降解酶，与捕光复合物II(LHCII)相互作用,形成SGR-CCE-LHCII复合体,促使叶绿素分子从LHCII上解离,构成一个叶绿素快速降解的“代谢通道”，调控叶绿素降解(Shimoda Y等.Plant Cell,2016,28:2147-2160)。SGR家族成员具有较高的保守性，其表达受黑暗诱导，在衰老起始的叶片中表达迅速上升。模式植物拟南芥中过量表达SGR基因，叶绿素含量显著降低，出现黄化。因此，SGR基因是构建可视化植物瞬时表达系统理想的报告基因。SGR基因作为报告基因已用于转录因子与启动子之间的相互作用的分析(DOI：10.21769/BioProtoc.1214，Vol4，Iss 16,August 20，2014)。
GhRED是一种从棉花中克隆的基因，编码MYB113类转录因子。GhRED直接调节类黄酮代谢路径下游ANS和UFGT基因的表达，促进原花色素(PA)与花青素的积累(Wang N等.2022,Doi:org/1093/plphys/kiac118)。利用CaMV35S启动子驱动GhRED基因表达，转基因植物的叶、茎或花等器官中PA和花青素含量升高，导致整株呈现红色表型。而且，棉纤维中特异性表达GhRED可以创造出紫色的纤维，表明GhRED在植物中的功能具有保守性。
经检索，没有发现将GhRED基因作为报告基因用于转录因子与启动子DNA之间互作分析的报道。
发明内容
针对目前检测转录因子与启动子DNA之间互作研究方法中存在的技术复杂难度大、假阳性、成本高等问题，本发明目的在于提供一种控制叶片颜色的融合蛋白。该融合蛋白可作为鉴定植物转录因子与启动子DNA之间互作分析的报告基因，具有简单、裸眼直观、准确、实时和高效等优点。
本发明另一目的在于提供编码上述融合蛋白的基因。
本发明第三目的在于提供上述融合蛋白和基因的用途。
本发明第四目的在于提供一种用于鉴定转录因子与启动子DNA之间互作关系的报告系统。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种控制叶片颜色的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了编码上述融合蛋白的基因，命名为SGRED基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了含有上述基因的表达载体。
本发明还提供了含有上述基因的表达盒。
本发明还提供了上述融合蛋白、基因或表达载体在鉴定植物转录因子与启动子DNA之间互作关系上的应用。
上述融合蛋白由SGR蛋白、2A肽和GhRED蛋白依次连接组成；所述的SGR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述GhRED蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了GhRED基因作为报告基因在鉴定植物转录因子与启动子DNA之间互作关系上的应用。
所述GhRED基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述GhRED基因编码的GhRED蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种用于鉴定转录因子与启动子DNA之间互作关系的报告系统，所述的报告系统包括表达盒A和表达盒B；其中所述的表达盒A包括植物强表达启动子、MCS1(多克隆位点1)和终止子；所述的表达盒B包括Ω增强子、MCS2(多克隆位点2)、SGRED基因和终止子。
上述报告系统，所述的表达盒A自上游至下游依次包括如下元件：植物强表达启动子、MCS1和终止子。
上述报告系统，其表达盒A中所述的启动子是指能在植物中强表达的启动子。
优选的，所述的启动子是指能在双子叶或单子叶植物中强表达的启动子。
进一步优选的，所述的启动子是指CaMV35S启动子、Actin启动子、ubiquitin启动子或GAL启动子等。
上述报告系统，其所述MCS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
上述报告系统，其所述的表达盒B自上游至下游依次包括如下元件：Ω增强子、MCS2、SGRED基因和终止子。
上述报告系统，其表达盒B中所述Ω增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
上述报告系统，其表达盒B中所述MCS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
上述报告系统，其表达盒B中所述SGRED基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
进一步的，所述SGRED基因中含有SGR基因和GhRED基因。
上述报告系统，所述的SGR基因是叶绿素降解途径中的重要基因，所编码的SGR蛋白是叶绿素降解途径中的限速酶。所述SGR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。所述的SGR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
上述报告系统，所述的GhRED基因是棉花黄酮代谢途径中的关键基因，其所编码的GhRED蛋白促进原花色素(PA)与花青素的积累。所述GhRED基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。所述GhRED蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示
进一步的，所述SGRED基因的SGR基因和GhRED基因之间通过DNA连接单元以任意顺序连接。如在某个特定的实施例中，以SGR基因-GhRED基因的顺序，通过DNA连接单元依次连接。SGRED基因结构为：SGR基因-DNA连接单元-GhRED基因。
进一步的，所述的DNA连接单元为能够转录和翻译成一种带有自切割功能多肽的DNA序列。
优选的，所述DNA连接单元是指2A肽；所述2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述编码2A肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在2A肽作为DNA连接单元的情况下，SGRED基因的依次连接顺序可以是SGR基因-2A基因-GhRED基因。
所述SGRED基因为转录因子和DNA互作的报告系统的报告基因，其作用在于，SGRED基因表达的融合蛋白可以让植物叶片呈现由绿色到黄色，再到棕色或褐色的变化，在可见光下可以直接通过裸眼观察，从而使本发明的报告系统能够在可见光下可裸眼可视地鉴定植物转录因子与DNA之间的互作。其中植物中表达SGR基因可以催化叶绿素脱镁反应，促进叶绿素快速降解，使叶片呈现黄色(Park等.2007)。植物中表达GhRED基因促进原花色素(PA)与花青素的积累，使植物组织呈现红色(Wang等2022)。
上述报告系统，其报告基因载体的骨架质粒为植物载体。
优选的，植物载体为植物瞬时表达载体和植物稳定表达载体，如pCAMBIA2300。
优选的，所述终止子为能在植物中发挥功能的终止子。
进一步优选的，所述终止子是指在双子叶类植物或单子叶植物中能发挥功能的终止子。
更进一步优选的，所述的终止子是指OCS终止子；所述OCS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明还提供了上述鉴定转录因子和DNA之间互作关系的报告系统的构建方法
(1)提供过表达载体的骨架质粒pCAMBIA2300，构建含上述表达盒A的植物表达载体质粒；将原始过表达载体pCAMBIA2300质粒中多克隆位点的部分酶切位点变更，其余不做改变，得到如SEQ ID NO.5所示的新的多克隆位点1(MCS1)，构建得到含有表达盒A的载体pKT；
(2)提供包含表达盒A的植物表达载体质粒pKT，将SGRED片段连接到所述骨架质粒中，构建得到含有表达盒A和表达盒B(包含CaMV35S、多克隆位点和终止子)的植物表达载体pKT-SGRED；
(3)将待鉴定转录因子基因连入步骤(2)得到的pKT-SGRED载体表达盒ACaMV35S后面，构建含有CaMV35S-转录因子基因-终止子的表达盒A的表达载体pKTF-SGRED；
(4)将待鉴定下游靶基因启动子DNA连入步骤(3)得到的pKTF-SGRED表达载体,构建同时含有表达盒A和表达盒B(靶基因启动子-SGRED-终止子)的验证载体，获得所述系统报告载体pKTF-ProSGRED；
进一步的，所述步骤(1)具体操作为：通过搭桥引物设计将重新设计的多克隆位点嵌入到OCS终止子序列5’端，扩增OCS终止子序列，替换原始过表达载体骨架中的多克隆位点和终止序列。构建得到载体pKT；
进一步的，所述步骤(2)的具体操作为，分别获得SGR基因和GhRED基因片段；使用体外重叠延伸PCR的方法将SGR基因，GhRED基因两种DNA分子通过DNA连接单元以任意顺序组合为SGRED基因，获取SGRED基因片段；将SGRED基因片段连接到载体pKT中，构建成转录因子和下游靶基因启动子DNA互作的验证系统pKT-SGRED；在某一个特定的实施例中，当SGRED基因结构为：SGR基因-DNA连接单元-GhRED基因；
所述步骤(2)的具体操作为：
(a)通过体外全基因合成的方式分别获得SGR基因和GhRED基因；
(b)使用体外重叠延伸PCR的方法，将获得的SGR基因和GhRED片段之间通过DNA连接单元顺次连接，获得SGRED片段；
(c)将SGRED基因片段连接到所述载体pKT中，构建成转录因子和下游靶基因启动子DNA互作的验证系统pKT-SGRED。
进一步的，利用PCR扩增待验证的靶基因启动子DNA和转录因子基因，将待验证启动子DNA片段连入步骤(2)得到的pKT-SGRED载体表达盒A中的SGRED片段之前，得到含有待验证DNA序列的表达载体pKT-ProSGRED。将待验证转录因子基因连入pKT-ProSGRED载体表达盒B中的Ω增强子和NOS片段之间，得到含有待验证转录因子的表达载体pKTF-ProSGRED。含有完整表达盒A和表达盒B的载体即为所述可视化的转录因子和下游基因启动子DNA互作验证系统。
进一步的，本发明的转录因子与DNA之间互作关系的报告系统的结果判定方式为：采用所述转录因子与DNA之间互作关系的报告系统瞬时转化植物后，直接通过裸眼观察植物叶片颜色的变化，即由绿色变为黄色，再变为棕色或褐色，从而确定待测植物转录因子和启动子DNA之间在植物中存在直接的互作。
进一步的，所述转录因子和启动子DNA之间的互作可以发生在各类植物整体或部分组织或者器官，优选的，所述植物为双子叶类植物和/或单子叶类植物。进一步优选的，所述植物为烟草。
本发明使用单个启动子驱动SGRED基因表达。所述SGRED基因采用2A肽为DNA连接单元，以SGR基因-2A肽-GhRED基因的顺序依次连接。其中，SGR基因去除终止密码子，将两者通过能编码2A肽的核苷酸序列顺次连接，组成一个人造基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，命名为SGRED。
黄化是叶片最显著的颜色变化之一，是大多数植物中均存在的现象。SGR催化叶绿素脱镁反应，是叶绿素降解途径中的关键限速因子，表达SGR基因加快叶绿素降解，呈现黄化表型。GhRED调节棉花类黄酮代谢途径，促进原花色素(PA)与花青素的积累，使表达部位呈现红色。二者所调控的结果都可以让植物出现明显的颜色变化。本发明人通过试验证明，注射SGR基因24小时后即可以呈现黄色，36小时达到峰值；注射GhRED基因72小时开始呈现红色，大约96小时达到峰值。
将这SGR和GhRED两个基因融合成一个开放阅读框，可以使用单个启动子和终止子表达该开放阅读框。
在两个基因之间插入了编码2A肽的序列，2A肽是由22个氨基酸组成的短肽，蛋白质翻译时，核糖体遇到新翻译产生的2A肽时导致核糖体发生“跳跃”，继而导致肽链在2A肽的末尾处发生自我切割(Sharma P等.Nucleic Acids Res，2012，40(7)：3143-3151)，因此利用2A肽能在单个启动子的控制下同时表达多种蛋白质(Liu Z等.Sci Rep，2017，7(1)：2193)。SGRED基因转录后，能产生两种独立的蛋白：SGR蛋白和GhRED蛋白；SGR蛋白催化叶绿素降解显示黄色，GhRED蛋白黄酮类物质合成显示红色。被鉴定靶基因启动子DNA序列可以放置在SGRED之前驱动SGRED基因的表达，随后通过观察注射叶片颜色的变化判断转录因子和DNA序列之间是否在植物中存在互作。
将构建的pKTFavrBS3-ProBS3SGRED瞬时转化烟草，在烟草叶片中显示出绿色到黄色再到棕色的颜色变化模式，因此，本发明鉴定植物转录因子和DNA互作的系统具有很好的稳定性。
与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明首创的SGRED融合蛋白和基因，通过叶片颜色由绿色到黄色，再到棕色或褐色的变化，在可见光下裸眼直观、实时判定转录因子和启动子DNA互作分析的结果，为鉴定转录因子和下游启动子DNA之间的互作关系分析提供了一种裸眼直观、实时、高效的鉴定工具。(2)利用本发明报告系统鉴定结果准确、可靠。本发明作为报告基因的融合蛋白中通过两个单基因控制的两种独立的叶片颜色基因，其表达不受环境影响，肉眼观测结果准确、可靠；同时通过2个基因控制的叶片颜色变化的双鉴定也避免了假阳性的问题。(3)本发明可视化的报告系统不需要专门的设备或昂贵的基材，操作简便、成本低廉。(4)本发明可视化的报告系统可以实现在植物体内鉴定转录因子和启动子DNA之间的互作关系，而且对于很多物种，比如烟草、生菜、西红柿等，可以直接在本物种中进行转录因子和启动子DNA互作；而且不用对植物进行取样，避免因为取样时的机械外力刺激导致转录因子和DNA互作模式受到干扰。(5)本发明融合蛋白或报告系统适用范围广泛，可用于各种植物的转录因子和下游启动子之间互作关系的分析。(6)本发明首次将GhRED基因作为转录因子与下游靶基因启动子DNA互作关系分析的报告基因，GhRED基因控制的叶片颜色变化明显，可通过裸眼直观、实时判断转录因子与启动子DNA之间是否存在互作关系，判断结果可靠性强，为转录因子和下游靶基因启动子之间互作关系的研究分析提供了一个很好的报告基因。
附图说明
图1为SGRED基因的构建示意图。
图2为基于SGRED报告系统的载体pKTF-proSGRED的构建示意图。
图3为利用本发明SGRED融合蛋白和报告系统鉴定转录因子FAR1和FHY1基因启动子DNA之间互作关系的烟草叶片照片。
图4为利用本发明SGRED融合蛋白和报告系统鉴定转录因子avrBS3和BS3基因启动子DNA之间互作关系的烟草叶片照片。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案便于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。如无特殊说明，以下实施例中所用方法均为本领域常规方法，所用试剂均为于常规生化试剂。
实施例1.包含表达盒A的植物表达载体质粒pKT的构建
本实施例中由于MCS1片段较短仅有18bp，故通过引物搭桥PCR将酶切位点与终止子序列进行融合。具体方法如下：
(1)以原始过表达载体质粒pCAMBIA2300为模板DNA，以MCS1+OCS-F和MCS1+OCS-R为引物进行PCR扩增；其中MCS1的序列包括在引物MCS1+OCS-F1中；所述的引物序列为：
MCS1+OCS-F:
5’-TTTGGAGAGGACAGGGTACCGTCGACCTGCAGGGCATGCCAGGGCTCTCA-3’(SEQIDNO.17)，
MCS1+OCS-R:
5’-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCAATCAGTAAATTGAACGGAGAATATTA-3’(SEQ IDNO.18)；其中PCR扩增的反应体系：2×buffer 25μl，10μM MCS1+OCS-F1μl，10μM MCS1+OCS-R 1μl，模板DNA 1μl，TKS聚合酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序：94℃1min；98℃10s，60℃10s，68℃15s，循环32次；68℃5min。
结果获得的PCR扩增产物为MCS1+OCS终止子的融合序列；其中MCS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；OCS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
(2)构建pKT载体：用KpnⅠ和HindⅢ酶切pCAMBIA2300质粒，将步骤(1)获得的MCS1+OCS的PCR产物通过Infusion连接的方式，连到pCAMBIA2300过表达质粒的KpnⅠ和HindⅢ处，获得包含表达盒A的植物表达载体质粒，命名为：pKT质粒。
实施例2含有表达盒A和表达盒B的报告系统(pKTF-SGRED)载体的构建
本实施例中SGRED基因采用能编码2A肽的核苷酸序列2A为DNA连接单元，以SGR基因-2A-GhRED基因的顺序依次连接(图1)，其中，2A核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示，2A编码的2A肽氨基酸序列为SEQ ID NO.10。Ω序列为SEQ ID NO.6所示。MCS2序列为SEQ ID NO.7所示。OCS序列为SEQ ID NO.12所示。
按照如下步骤进行构建：
(1)通过全基因组人工合成的方式分别合成：
(a)无终止密码子的SGR基因(SEQ ID NO.8),
(b)包含2个终止密码子的GhRED基因(SEQ ID NO.3)，
(c)Ω+MCS2序列(SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.7)。
(2)先将SGR基因与GhRED基因通过2A肽(其核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示)以融合PCR进行连接，获得SGRED片段，再将Ω+MCS2序列，SGRED基因和OCS终止子序列融合，进而最终构建转录因子与DNA互作报告系统的pKTF-SGRED载体。
具体构建步骤：
(a)PCR1扩增获得SGR+2A肽前半部分DNA序列，此处2A前半部分序列为：5’-GGAAGCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAG-3’(SEQ ID NO.19)。以能表达2A肽的DNA(如SEQ IDNO.11所示)作为DNA连接单元，2A肽对应的DNA部分序列加在用于PCR扩增GhRED基因的引物的5’端作为接头序列，通过体外重叠延伸PCR的方法组装成完整的2A肽的DNA，并将SGR基因(SEQ ID NO.8)-2A(SEQ ID NO.11)-GhRED(SEQ IDNO.3)依次首尾相连接组合到一起，获得SGRED的DNA，进而最终构建出pKT-SGRED基因表达盒(见图1)。
(b)以合成的SEQ ID NO.8所示的SGR基因为模板DNA，以SGR-F和SGR+2AQ-R1为引物进行PCR扩增。其中在反向引物中删除了SGR基因的终止密码子，所述的引物为：
SGR-F：5’-TCATTTGGAGAGGACAGGGTACCATGTGTAGTTTGTCGGCGATTATGTTGTTACC-3’
(SEQ ID NO.20),
SGR+2AQ-R1：5’-CTTTAACAGAGAGAAGTTCGTGGCTCCGCTTCCGAGTTTCTCCGGATTTGGAG-3’(SEQ ID NO.21)。
其中PCR反应体系：2ⅩPCR Buffer 25μl，10μl 2AH+GhRED-F 1μl，10μl GhRED-R11μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序：94℃1min；98℃10s，60℃10s，68℃15s，循环32次；68℃5min。
结果获得的PCR扩增产物为SGR+2A肽前半部分DNA序列，命名为：PCR1。
(c)以PCR1产物为模板，以SGR-F(见SEQ ID NO.20)和SGR+2AQ-R2为引物进行PCR扩增。其中所述的引物SGR+2AQ-R2为：
SGR+2AQ-R2：5’-CTTTAACAGAGAGAAGTTCGTGGCTCCGCTTCCGAGTTTCTCCGGATTTGGAG-3’(SEQ ID NO.22)。
其中PCR反应体系：2ⅩPCR Buffer 25μl，10μl 2AH+GhRED-F 1μl，10μl GhRED-R21μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR扩增程序：94℃1min；98℃10s，60℃10s，68℃15s，循环32次；68℃5min。
结果所得PCR扩增产物为SGR+2A前半部分(共837bp)，命名为：PCR2。其中包括SGR基因序列(如SEQ ID NO.8所示)和2A(如SEQ IDNO.11所示)前半部分序列，此处2A序列提供了PCR所用反向引物上额外的用于overlap PCR的接头序列；PCR所用的引物还加上了额外的用于最后Infusion连接的接头序列。
(d)以GhRED基因DNA(其核苷酸序列见SEQ ID NO.3)为模板，以2AH+GhRED-F1和GhRED-R为引物进行PCR扩增。其中所述引物为：
2AH+GhRED-F1：5’-CAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATGGAAGGCTCATCTTTAAG-3’(SEQ ID NO.24)
GhRED-R：5’-CTGGCATGCCTGCAGGTCGACCTATGGGTTGAACACATTCCACAGTTCCTC-3’(SEQIDNO.25)
其中PCR反应体系：2ⅩPCR Buffer 25μl，10μl 2AH+GhRED-F1 1μl，10μl GhRED-R1μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序:95℃5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min，循环35次；68℃10min；10℃5min。
结果PCR扩增所得产物为2AH(2A肽的后半部分序列)+GhRED基因序列，命名为：PCR3；其中此处2A肽后半部分序列为5’
-CAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT-3’(SEQ ID NO.23)。
(e)以PCR3为模板，以2AH+GhRED-F2和GhRED-R(见SEQ ID NO.25)为引物进行PCR扩增。其中所述的引物2AH+GhRED-F2为：2AH+GhRED-F2：5’-GAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCC
-3’(SEQ ID NO.26)。
其中PCR反应体系：2ⅩPCR Buffer 25μl，10μl 2AH+GhRED-F2 1μl，10μl GhRED-R2 1μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序:94℃1min；98℃10s，60℃10s，68℃15s，循环32次；68℃5min。
PCR4扩增获得2A+GhRED DNA肽前半部分并且含有重叠区DNA序列，
结果所得PCR产物为2A的后部分+GhRED基因(共777bp)，命名为：PCR4；其中包括含有两个终止密码子的GhRED基因(如SEQ ID NO.3所示)和的2A后部分序列(如SEQ ID NO.23所示)，此处2A序列提供了PCR所用正向引物上和反向引物上额外的用于重叠PCR的接头序列。
(f)SGRED基因的扩增。将上述两种PCR产物PCR2((SGR+2A前半部分)和PCR4(2A后部分+GhRED)混合作为模板，以SGR-F(见SEQ IDNO.20)和GhRED-R(见SEQ ID NO.25)为引物进行PCR扩增。
其中PCR反应体系：2ⅩPCR Buffer 25μl，10μl SGR-F 1μl，10μlGhRED-R 1μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序为:94℃1min；98℃10s，60℃10s，68℃15s，循环32次；68℃5min。
结果所得PCR扩增产物(命名为：PCR5)为SGRED基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。即SGR基因(核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示)+2A肽核苷酸(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)+GhRED基因(核苷酸序列如SEQID NO.3所示)。
(3)扩增获得含有infusion接头和重叠区的Ω+MCS2和OCS序列。按照如下方法进行：
(a)以合成的Ω+MCS2融合序列为模板DNA，以Ω+MCS2-F和Ω
+MCS2-R为引物进行PCR扩增。其中Ω序列如SEQ ID NO.6所示；MCS2序列如SEQ IDNO.7所示。所述引物为：
Ω+MCS2-F:5’-TTACTGATTGAAGCTTACGTAAGGGATGACGCACAATCCCA-3’
(SEQ ID NO.27)，
Ω+MCS2-R:5’-TAATCGCCGA CAAACTACAC ATTACGTATC TAGAGGATCC-3’(SEQ IDNO.28)。
其中PCR反应体系：2ⅩPCR Buffer 25μl，10μMΩ+MCS2-F 1μl，10ΜmΩ+MCS2-R 1μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序：94℃1min；98℃10s，60℃10s，68℃15s，循环32次；68℃5min。
结果PCR扩增产物(命名为：PCR6)为含有infusion接头和重叠区的Ω+MCS2和OCS序列。
(b)以实施例1所得pKT质粒为模板DNA，以OCS-F和OCS-R为引物进行PCR扩增。所述引物为：
OCS-F:5’-GGAATGTGTTCAACCCATAGGGCATGCCAGGGCTCTCAATGGA-3’(SEQ IDNO.29)，
OCS-R:5’-TTACTGATTGAAGCTTTATTTTTACAACAATTACCAACAAC-3’(SEQ IDNO.30)。
其中PCR反应体系：2ⅩPCR Buffer 25μl，10μM OCS-F 1μl，10ΜmOCS-R 1μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序：94℃1min；98℃10s，60℃10s，68℃15s，循环32次；68℃5min。
结果所得PCR产物(命名为：PCR7)为OCS终止子序列(其核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示)。此处OCS序列提供了PCR所用正向引物上额外的用于重叠PCR的接头序列且由于PCR反向引物上还额外加入了用于infusion连接的接头序列。
(4)PCR扩增获得Ω+MCS2+SGRED+OCS序列。将PCR5,PCR6,PCR7三种PCR扩增产物SGRED、Ω+MCS2和OCS混合作为模板DNA,以Ω+MCS2-F(见SEQ ID NO.27)和OCS-R(见SEQ IDNO.30)为引物进行PCR扩增。
其中PCR反应体系为：2ⅩPCR Buffer 25μl，10μM OCS-F 1μl，10Μm OCS-R 1μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序为：94℃1min；98℃10s，60℃10s，68℃15s，循环32次；68℃5min。
结果所得PCR产物大小为1939bp；包括Ω(SEQ ID NO.6)+MCS2(SEQ ID NO.7)+SGRED(SEQ ID NO.2)+OCS(SEQ ID NO.12)，即构建了表达盒B。
(5)构建转录因子与DNA互作验证系统的pKTF-SGRED载体:用HindⅢ酶切实施例1所得的pKTF质粒(PCAMBIA2300质粒添加表达盒A后的质粒载体)，将步骤(4)获得的Ω+MCS2+SGRED+OCS(表达盒B)的PCR产物通过Infusion连接的方式，连到pKTF质粒的HindⅢ处，获得同时包含表达盒A和表达盒B的植物表达载体质粒，命名为：pKTF-SGRED质粒(见图2)。
实施例3利用本发明的融合蛋白构建转录因子FAR1与下游调控基因FHY1启动子互作分析的报告系统
本试验将FAR1(其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)作为待验证的转录因子连入实施例2的表达盒A中的MCS1内，将FHY1启动子(其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)作为待验证的启动子连入表达盒B中的MCS2内，构建pKTFFAR1-ProFHY1SGRED载体。按照如下方法进行：
(1)转录因子FAR1的PCR扩增。以拟南芥叶片cDNA为模板，以FAR1-F和FAR1-R为引物进行PCR扩增。所述的引物为：
FAR1-F:5’-TTTGGAGAGGACAGGGTACCATGGATTTGCAAGAGAATCTGGTT
-3’(SEQ ID NO.31)
FAR1-R:5’-ATGCCTGCAGGTCGACCTATAGCTGCCTTGATGAACTACCA-3’(SEQ ID NO.32)
其中PCR反应体系：2ⅩBuffer 25μl，10μM FAR1-F 1μl，10ΜmM FAR1-R 1μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序：94℃1min；98℃10s，60℃150s，68℃15s，循环32次；68℃5min。
结果所得PCR产物为转录因子FAR1(如SEQ ID NO.13所示)；另外，因所用引物加上了额外用于infusion连接的接头序列，因而PCR产物还包括用于infusion连接的接头序列。
(2)启动子FHY1序列的PCR扩增。以拟南芥叶片DNA为模板，以FHY1-F和FHY1-R为引物进行PCR扩增。所述的引物为：
FHY1-F:5’-AGCTTCCCGGGGATCCTGTCACAGGAGGGAAGATG-3’(SEQ IDNO.33)
FHY1-R:5’-TGTGCGT CATCCCTTAC GTTAGATCGCAGAGAGAGAGAGAGAG-3’(SEQ IDNO.34)
其中PCR反应体系：2ⅩBuffer 25μl，10μM FHY1-F 1μl，10μMFHY1-R 1μl，模板DNA1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序：94℃1min；98℃10s，60℃10s，68℃90s，循环32次；68℃5min。
结果所得PCR产物为启动子FHY1(其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)序列；另外，由于PCR所用引物加上了额外用于infusion连接的接头序列，所以PCR产物中还包括用于infusion连接的接头序列。
(3)含有转录因子FAR1的质粒载体的构建。用KpnⅠ和SalⅠ酶切实施例2所得的pKTF-SGRED表达质粒，将步骤(1)获得的FAR1的PCR产物通过Infusion连接的方式，连到pKTF-SGRED表达质粒的KpnⅠ和SalⅠ处，获得过表达转录因子FAR1的质粒载体，命名为：pKTFFAR1-SGRED质粒。
(4)构建pKTFFAR1-proFHY1SGRED载体。用BamHⅠ和XbaⅠ酶切步骤(3)获得的pKTFFAR1-SGRED表达质粒，将步骤(2)获得的FHY1的PCR产物通过Infusion连接的方式，连到pCAMBIA2300过表达质粒的BamHⅠ和XbaⅠ处，获得过表达转录因子FAR1且由FHY1启动子驱动报告基因SGRED表达的双表达盒(表达盒A和表达盒B)的质粒载体，命名为：pKTFFAR1-proFHY1SGRED质粒(其结构示意图见图2)。
实施例4：利用本发明融合蛋白和报告系统对拟南芥转录因子FAR1与下游调控基因FHY1启动子互作关系的验证试验
将实施例3获得的测序后的阳性质粒pKTFFAR1-proFHY1SGRED化学转化到农杆菌(GV3101)中，然后使用烟草叶片瞬时转化法，将带有质粒的农杆菌注射到烟草叶片中。
具体操作方法如下：按1：100体积比的比例接菌，一般摇10ml或者5ml即可。然后在28℃，220rpm过夜摇12h左右(菌液OD0.6-0.8)。将过夜摇好的菌液在2800xg下10min，弃上清，收集菌体。用3ml重悬液清洗菌体，在2800xg下10min，弃上清，收集菌体。用重悬液调节菌液的OD，0.8左右最佳。室温静置3-4h。用1ml注射器吸取菌液注射烟草背部，大概5角硬币大小。将注射后的烟草黑暗处理约24h，并浇足水，置于22-25℃的环境中继续培养。
结果注射后大概36h之后观察到明显的黄化表型，在36h-72h时间段内，注射部位叶片一直呈现黄色，72h后GhRED基因开始表达，黄色渐渐变淡，直到96h变为棕色或灰色(见图3)。该结果与文献((Lin R等.Science.2007November 23；318(5854)：1302–1305))中转录因子FAR1与下游调控基因FHY1启动子具有互作关系的结论一致，说明利用本发明控制叶片颜色的融合蛋白或报告系统鉴定转录因子和启动子DNA之间互作关系准确、可靠，其避免了假阳性的出现；其次，不用对植物进行取样，避免因为取样时的机械外力刺激导致转录因子和DNA互作模式受到干扰，本发明方法简单、成本低、尤其可以实时得到结果。
实施例5利用本发明融合蛋白构建转录因子avrBS3和BS3启动子互作分析的报告系统
本试验以avrBS3(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)为待验证的转录因子连入表达盒A中MCS1内，以BS3启动子(核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示)为待验证的启动子连入表达盒B中MCS2内，构建含有表达盒A和表达盒B的报告系统(pKTFavrBS3-ProBS3SGRED载体)。
按照如下方法进行：
(1)通过全基因组人工合成的方式分别合成：
(a)avrBS3基因(SEQ ID NO.15),
(b)BS3基因启动子(SEQ ID NO.16)，
(2)转录因子avrBS3的PCR扩增。以合成的avrBS3基因为模板DNA，以avrBS3-F和avrBS3-R为引物进行PCR扩增。所述引物为：avrBS3-F:5’-TTTGGAGAGGACAGGGTACCATGGATCCTATTCGTCCGCGC
-3’(SEQ ID NO.35)，
avrBS3-R:5’-ATGCCTGCAGGTCGACTCACTGAGGAAATAGCTCCATCAAC
-3’(SEQ ID NO.36)。
其中PCR反应体系：2ⅩBuffer 25μl，10μM avrBS3-F 1μl，10μMavrBS3-R 1μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序：94℃1min；98℃10s，60℃150s，68℃15s，循环32次；68℃5min。
结果所得PCR产物大小为3495bp，具体为添加了用于infusion连接的接头序列的转录因子avrBS3(见SEQ ID NO.15)。
(3)带有同源臂的BS3启动子序列的获得。以人工合成的BS3基因为模板DNA，以BS3-F和BS3-R为引物进行PCR扩增。所述的引物为：BS3-F:5’-CCGGGGATCCTCTAGACTACGGAATAGCAGCATTAAGG-3’(SEQ IDNO.37)，
BS3-R:5’-TTACGTAGTATCTAGAGAAATATATGTGCAACTAGGACTAC-3’(SEQ ID NO.38)。
其中PCR反应体系：2ⅩBuffer 25μl，10μM BS3-F 1μl，10μM BS3-R1μl，模板DNA 1μl，TKS高保真酶1μl，补充双蒸水至50μl。PCR反应程序：94℃1min；98℃10s，60℃10s，68℃90s，循环32次；68℃5min。
结果所得PCR产物为带有同源臂的BS3启动子序列(其核苷酸序列如SEQ IDNO.16)所示)。
(3)构建pKTFavrBS3-SGRED载体。用KpnⅠ和SalⅠ酶切上述所得的pKTF-SGRED表达质粒，将步骤(1)获得的avrBS3的PCR产物通过Infusion连接的方式，连到pCAMBIA2300过表达质粒的KpnⅠ和SalⅠ处，获得过表达效应子avrBS3的质粒载体，命名为：pKTFavrBS3-SGRED质粒。
(4)构建pKTFavrBS3-proBS3SGRED载体：使用XbaⅠ酶切步骤(3)获得的pKTFavrBS3-SGRED表达质粒，将步骤(2)获得的BS3的PCR产物通过Infusion连接的方式，连到pCAMBIA2300过表达质粒的XbaⅠ处，获得过表达效应子avrBS3且由BS3启动子驱动的融合报告基因SGRED表达的双表达盒(表达盒A和表达盒B)质粒载体，命名为：pKTFavrBS3-proBS3SGRED质粒。
实施例6：利用本发明融合蛋白SGRED和报告系统对效应子avrBS3与抗性基因BS3启动子互作关系的验证实验
将实施例5获得的测序结果正确的阳性质粒
pKTFavrBS3-proBS3SGRED通过化学转化法转到农杆菌(GV3101)中，然后使用烟草叶片瞬时转化法，将带有质粒的农杆菌注射烟草叶片。具体实施步骤同实施例4。
结果注射后36h开始观察到明显的黄化表型，在36h-72h时间段内，注射部位叶片一直呈现黄色，72h后GhRED基因开始表达，黄色渐渐变暗，直到96h变为棕色或灰色(见图4)。该结果与文献(Karin H等.Nature.March1992 356(6365))中效应子avrBS3与抗性基因BS3启动子具有互作的结论一致。说明利用本发明控制叶片颜色的融合蛋白或报告系统鉴定转录因子和启动子DNA之间互作关系准确、可靠，其避免了假阳性的出现；其次，不用对植物进行取样，避免因为取样时的机械外力刺激导致转录因子和DNA互作模式受到干扰，本发明方法简单、成本低、尤其可以实时得到结果。

Claims (10)

1.一种控制叶片颜色的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的表达载体。
4.含有权利要求2所述基因的表达盒。
5.权利要求1所述融合蛋白、权利要求2所述基因或权利要求3所述表达载体在鉴定植物转录因子与启动子DNA之间互作关系上的应用。
6.一种用于鉴定转录因子与启动子DNA之间互作关系的报告系统载体，其特征在于，所述的报告系统载体包括表达盒A和表达盒B；其中所述的表达盒A包括植物强表达启动子、MCS1和终止子；所述的表达盒B包括Ω增强子、MCS2、SGRED基因和终止子；所述的表达盒A自上游至下游依次包括如下元件：植物强表达启动子、MCS1和终止子；所述MCS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述的表达盒B自上游至下游依次包括如下元件：Ω增强子、MCS2、SGRED基因和终止子；所述Ω增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述MCS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SGRED基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求6所述的报告系统载体，其特征在于，其所述的启动子是指能在双子叶或单子叶植物中强表达的启动子。
8.根据权利要求7所述的报告系统载体，其特征在于，所述的启动子是指CaMV35S启动子、Actin启动子、ubiquitin启动子或GAL启动子。
9.根据权利要求6所述的报告系统载体，其特征在于，其所述终止子是指在双子叶类植物或单子叶植物中能发挥功能的终止子。
10.根据权利要求9所述的报告系统载体，其特征在于，所述的终止子是指OCS终止子；所述OCS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
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