CN113980981A

CN113980981A - 一种调控番茄果实芳香物质合成的基因SlECT2及其应用

Info

Publication number: CN113980981A
Application number: CN202111498187.9A
Authority: CN
Inventors: 张波; 高颖
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-12-09
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2022-01-28
Anticipated expiration: 2041-12-09
Also published as: CN113980981B

Abstract

本发明提供一种调控番茄果实芳香物质合成的基因SlECT2及其应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术突变了番茄中的SlECT2基因，得到了SlECT2基因突变的纯合突变体slect2#17和slect2#22，二者成熟果实中芳香物质含量与野生型相比分别降低了29.13％和26.84％，说明SlECT2基因能够促进番茄果实芳香物质合成。本发明所述SlECT2基因能够有效调控番茄果实芳香物质含量，对通过农业育种改善番茄果实芳香品质具有重要的指导意义，可为培育风味优良的优质番茄新品种提供新的候选基因资源。

Description

一种调控番茄果实芳香物质合成的基因SlECT2及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种调控番茄果实芳香物质合成的基因SlECT2及其应用。

背景技术

果实是人类重要的食物，其品质主要包括色、香、味、质地和营养等。由于果实芳香品质与消费者喜好密切相关，有关果实芳香物质的形成与调控备受关注。番茄是研究果实芳香物质形成的模式材料，具有清晰的遗传背景，成熟的遗传转化体系和芳香物质物质分析方法。因此，深入研究番茄果实芳香物质形成及其调控机制对果实芳香品质改善和维持具有重要的理论价值和实践意义。

随着番茄果实的成熟，芳香物质含量增加。已鉴别出参与番茄重要芳香物质合成的基因，包括脂肪酸途径的SlLOXC、SlHPL、SlADH2和SlAAT1，类胡萝卜素途径SlCCD1以及支链氨基酸途径SlBCAT1等。目前番茄果实芳香物质合成的调控机制研究主要集中在转录因子和DNA甲基化层面，是否存在其他层面的调控有待进一步探索。

表观遗传学是指基于非基因序列改变所致的基因表达水平的变化。在组蛋白修饰和DNA甲基化基础上，RNA甲基化修饰是目前表观遗传学研究领域的热点。RNA修饰是一种转录后水平的调控方式，N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m⁶A)是含量最丰富的RNA甲基化修饰。有关RNA甲基化m⁶A识别蛋白SlECTs的功能尚不清楚，在果实芳香物质合成中的作用也不明确。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控番茄果实芳香物质合成的基因SlECT2，SlECT2能够有效促进番茄果实芳香物质的合成。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一个有效调控番茄果实芳香物质合成的基因SlECT2。所述SlECT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；SlECT2基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种用于SlECT2基因突变的CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述载体为pYLCRISPR/Cas9-SlECT2。所述载体可以表达靶向SEQ ID NO.1序列核酸分子的sgRNA。所述sgRNA的序列可为T1、T2、T3，所述T1序列为SEQ ID NO.1的第2001-2020位核苷酸，所述T2序列为SEQ ID NO.1的第1242-1261位核苷酸，所述T3序列为SEQ ID NO.1的第2022-2041位核苷酸。所述pYLCRISPR/Cas9-SlECT2基因编辑载体为利用Bsa I限制性内切酶在pYLCRISPR/Cas9-P_ubi-H的多克隆位点间依次插入AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA和AtU6-1-T3-gRNA得到的重组载体。

本发明提供了一种包含pYLCRISPR/Cas9-SlECT2重组载体的微生物，所述微生物为农杆菌GV3101。

本发明提供的一个目的是提供所述基因SlECT2在有效调控番茄果实芳香物质含量中的应用，包括突变番茄中SlECT2基因可以显著降低番茄果实中芳香物质含量。

本发明的另一个目的是提供所述基因SlECT2作为番茄果实开展基因工程的重要候选基因在番茄育种以及改善番茄果实芳香品质中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了SlECT2基因在调控番茄果实芳香物质合成中的应用。突变SlECT2基因能够显著降低番茄果实芳香物质含量，说明SlECT2能够有效调控番茄果实芳香物质含量，可为培育芳香品质改善的优质番茄新品种提供新的候选基因资源。

附图说明

图1为SlECT2的3个靶序列(T1,T2,T3)及其在SlECT2基因上的具体位置。

图2为SlECT2基因纯合突变体slect2#17和slect2#22的基因编辑方式。

图3为SlECT2基因纯合突变体slect2#17和slect2#22的蛋白质突变结果。

图4为野生型和SlECT2基因纯合突变体成熟果实电子鼻分析结果。

图5为野生型和SlECT2基因纯合突变体成熟果实芳香物质含量分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细说明，实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三个生物学重复，结果取三者的平均值。

下述实施例中的野生型番茄品种Solanum lycopersicum cv Ailsa Craig，简称AC(Marian Bemer et al.,The Tomato FRUITFULL Homologs TDR4/FUL1 and MBP7/FUL2Regulate Ethylene-Independent Aspects of Fruit Ripening[J].The Plant Cell,2012,24(11):4437-4451)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例：SlECT2基因突变导致番茄果实芳香物质含量降低

本实施例通过CRISPR/Cas9技术突变番茄中SlECT2基因，发现该基因突变后成熟番茄果实中芳香物质含量与野生型相比显著降低。SlECT2基因DNA序列为序列表中SEQ IDNO.1，编码序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质。具体步骤如下：

(一)pYLCRISPR/Cas9-SlECT2基因编辑载体的构建

靶序列的选择：所选靶位点序列为T1(SEQ ID NO.1的第2001-2020位核苷酸)、T2(SEQ ID NO.1的第1242-1261位核苷酸)、T3(SEQ ID NO.1的第2022-2041位核苷酸)，T1、T2和T3在SEQ ID NO.1中的位置如图1所示。

启动子的选择：使用拟南芥来源的AtU3d启动T1靶位点，AtU3b启动T2靶位点，AtU6-1启动T3靶位点。

含有靶位点的sgRNA表达盒的制备：经过2轮PCR，分别获得AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA和AtU6-1-T3-gRNA3个DNA片段。AtU3d-T1-gRNA为包含靶向T1位点的sgRNA的表达盒，其表达由AtU3d启动子驱动；AtU3b-T2-gRNA为包含靶向T2位点的sgRNA的表达盒，其表达由AtU3b启动子驱动，AtU6-1-T3-gRNA为包含靶向T3位点的sgRNA的表达盒，其表达由AtU6-1启动子驱动。制备方法如下：第一轮PCR反应体系为25μL，包含KOD酶(TOYOBO)0.5μL、10×KOD Plus Buffer(TOYOBO)2.5μL、dNTP 2.5μL、MgSO₄1.5μL、pYLgRNA-LacZ-AtU3d/AtU3b/AtU6-1质粒1μL、U-F引物(5μmol/L)1μL、gR-R引物(5μmol/L)1.0μL、gR-SlECT2-T1/T2/T3引物2.5μL、AtU-SlECT2-T1/T2/T3引物2.5μL、ddH₂O 10μL。pYLgRNA-LacZ-AtU3d质粒、PYLgRNA-AtU3b质粒、PYLgRNA-AtU6-1质粒均记载在文献(Ma et al.,A RobustCRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing inMonocot and Dicot Plants[J].Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284)中。第一轮PCR反应程序为：94℃60s；94℃10s，58℃15s，68℃20s，28个循环；68℃7min。PCR反应结束后，获得3种PCR产物。第二轮PCR反应体系为20μL，包含KOD酶(TOYOBO)0.5μL、10×KOD PlusBuffer(TOYOBO)2.0μL、dNTP 2.0μL、MgSO₄ 1.2μL、第一轮PCR反应产物(稀释10倍)1.0μL、特异性引物对(Pps-GGL、Pgs-GG2或Pps-GG2、Pgs-GG3或Pps-GG3、Pgs-GGR，1.5μmol/L)2.0μL、ddH₂O 11.3μL。第二轮PCR反应程序为：94℃60s；94℃10s，58℃15s，68℃20s，25个循环；68℃7min。第二轮PCR反应结束后，将3种PCR产物等量混合后进行纯化。两轮PCR反应中所用引物序列如表1所示。

表1、载体构建引物序列

pYLCRISPR/Cas9-SlECT2重组载体的制备：采用Golden Gate cloning方法(Ma etal.,Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex GenomeEditing in Monocot and Dicot Plants[J].Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284)完成目的sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-P_ubi-H载体的酶切连接反应。反应体系为：10×CutSmart Buffer(NEB)1.5μL、pYLCRISPR/Cas9-P_ubi-H载体2.0μL、经过纯化的AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA和AtU6-1-T3-gRNA三个DNA片段的混合物1.0μL、BsaI-HF(NEB)0.5μL、T4 DNA ligase(Promaga)1.0μL、10×T4 DNA ligase Buffer(Promaga)1.5μL、ddH₂O 7.5μL。反应条件为：37℃10min，10℃5min，20℃5min，3个循环；37℃3min，10℃5min，20℃5min，10个循环；37℃5min。将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落提取质粒，测序正确后转入农杆菌GV3101感受态细胞。

(二)番茄的遗传转化

采用农杆菌介导的叶盘转化法将pYLCRISPR/Cas9-SlECT2基因编辑载体转化野生型AC番茄。所有操作均在无菌工作台中进行，具体操作步骤如下：

(1)播种：取适量AC番茄种子于无菌培养皿中，分别用75％的乙醇和4％次氯酸钠溶液消毒5min和8min，用无菌水清洗数次后将种子播种于种子萌发培养基T0。

种子萌发：将种子置于暗室培养直至出芽后置于光下培养，待子叶完全展开后用于下一步操作。

预培养：将番茄子叶剪成5×5mm的方块，背面向上放置于铺有一层滤纸的T1预培养基上。

制备侵染液：挑取转入pYLCRISPR/Cas9-SlECT2基因编辑载体的农杆菌单菌落于3mL含有相应抗生素的LB培养基中，28℃过夜震荡培养。次日吸取300μL菌液于20mL含有相应抗生素的LB培养基中，28℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.5-0.6。5000rpm离心10min收集菌体，用无菌水将菌液稀释至0D₆₀₀＝0.1-0.2。

共培养：将预培养2d的外植体置于侵染液中侵染5min后倒掉侵染液，将外植体重新放回预培养培养基T1中，于暗室中共培养2d。

芽诱导培养：将外植体从暗室取出，背面向下置于芽诱导培养基T21中，25℃16h光照/8h黑暗条件下培养7d之后转入新鲜的T21培养基继代培养，直至外植体长出愈伤组织并长出小叶。

芽伸长培养：待外植体长出小叶后转入芽伸长培养基T22中直至茎伸长至4-5cm。

生根培养：茎伸长后剪去愈伤组织，转入生根培养基T3中直至根系发达。

土培：将小苗从T3培养基中移出，洗净培养基后将小苗转入湿润的土盆中土培，注意保湿。

培养基配方如下：

T0：MS盐1.77g，蔗糖12g，调节pH至5.8，琼脂5.33g；

T1：MS盐3.55g，蔗糖24g，调节pH至5.8，琼脂5.33g，灭菌后加6-BA 至浓度为1mg/L、IAA至浓度为0.1mg/L；

T21：MS盐3.55g，蔗糖24g，调节pH至5.8，琼脂5.33g，灭菌后加入潮霉素至浓度为10mg/L、特美汀至浓度为200mg/L、玉米素至浓度为1mg/L、IAA至浓度为0.1mg/L；

T22：MS盐3.55g，蔗糖24g，调节pH至5.8，琼脂5.33g，灭菌后加入潮霉素至浓度为10mg/L、特美汀至浓度为200mg/L、玉米素至浓度为0.5mg/L、GA至浓度为1mg/L；

T3：MS盐1.77g，蔗糖24g，调节pH至5.8，琼脂5.33g，灭菌后加入潮霉素至浓度为5mg/L、特美汀至浓度为150mg/L、IBA至浓度为2mg/L。

(三)SlECT2基因突变纯合体的筛选

以步骤(二)所得的SlECT2基因编辑植株的基因组DNA为模板，分别利用每个靶序列上下游约300bp附近设计的PCR引物扩增靶序列附近的600bp左右的DNA序列，并进行测序以检测SlECT2基因编辑方式，靶点PCR引物及测序引物见表2。

表2、靶点检测引物序列

测序成功后通过CRISPR靶点编辑方式分析网站DSDecode(http://dsdecode.scgene.com/)并结合人工读峰图的方式与基因标准序列进行比对，对各个靶序列及其上下游序列的编辑方式进行分析。

通过上述方式筛选到的SlECT2基因纯合突变体slect2#17和slect2#22的基因编辑方式如图2所示。在slect2#17突变体中，T1位点发生14个核苷酸的缺失，即SEQ ID NO.1的第2004-2017位核苷酸GCTGAAGCTGTTGC缺失。在slect2#22突变体中，T1位点发生1个核苷酸的缺失，即SEQ ID NO.1的第2017位核苷酸C缺失。上述核苷酸缺失均导致SlECT2基因发生移码突变，蛋白翻译提前终止，YTH结构域缺失，slect2#17获得剩余12个氨基酸的截短蛋白；slect2#22获得剩余23个氨基酸的截短蛋白，如图3所示。

(四)基于电子鼻的番茄果实感官评价分析

选取野生型、slect2#17和slect2#22突变体成熟果实(破色后7天)，每种样品各3个生物学重复，每个生物学重复为随机6个果实的混合物，用液氮研磨成粉末，称取1g粉末于10mL离心管中，加入5mL饱和NaCl溶液，充分涡旋混匀。吸取2mL于进样瓶中(每个生物学重复设置2个技术重复)，置于冰上备用。每个进样瓶于40℃加热30min后，抽取2mL顶空气体用电子鼻(αFOX4000，Alpha-MOS，法国)检测样品间的香味差异，载气为空气(杭州今工特种气体有限公司)，采集时间：120s，采集周期：1s，延滞时间：240s，(载气)流速：150mL/min，注射体积：500μL，注射速度：500μL/min。采用系统自带的判别函数分析(DiscriminantFunction Analysis，DFA)方法进行数据分析。

如图4的DFA分析结果可以看出：在DF1维度，slect2#17和slect2#22突变体聚在一起，能够与野生型(WT)明显区分开来，说明slect2#17和slect2#22突变体和野生型成熟果实在香气方面存在显著差异。

(五)番茄果实挥发性芳香物质含量分析

选取野生型、slect2#17和slect2#22突变体成熟果实(破色后7天)，每种样品各3个生物学重复，每个生物学重复为随机6个果实的混合物，用液氮研磨成粉末，称取5g粉末于20mL液相色谱进样瓶，加入5mL饱和NaCl溶液和20μL内标2-辛醇(0.8mg/ml)，涡旋混匀后放入样品盘。利用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱质谱联用(GC-MS)技术测定芳香物质的成分与含量。样品经40℃恒温平衡30min后，用萃取头50/30μmDVB/CAR/PDMS进行30min固相微萃取。萃取头在GC-MS(Agilent 7890-5975)进样口解吸附15min后用DB-WAX毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，J&W Scientific)进行分离。升温程序为从40℃以4℃·min^-1速率升至230℃，然后再以100℃·min^-1速率升至260℃，保持11.7min。以1.0mL·min^-1氦气(杭州今工特种气体有限公司)为载气，MS离子源温度230℃，采用电子轰击电离方式，电子能量为70eV。芳香物质的定性通过与NIST-8(NIST/EPA/NIH，美国)标准谱库比对确定，定量计算以内标的峰面积作为参考。

野生型和slect2突变体成熟果实芳香物质含量见图5，slect2#17和slect2#22突变体成熟果实芳香物质含量均显著低于野生型，具体为与野生型相比降低了29.13％和26.84％。说明SlECT2基因突变可以显著降低番茄果实中芳香物质含量，SlECT2基因可以促进番茄果实中芳香物质的合成。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种调控番茄果实芳香物质合成的基因SlECT2及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6007

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

cacgcagtcc tctttacatt cttcctcttt cgtttccctc aaaaaccttc gctacaggga 60

aaccgcttct ctgtttcata gcggttttcc ggttatctgg atcggtggtt ttgtttattt 120

gcttatataa ggtgagtttt tctttgtttt cttgattttt ttcttgtttg atataaagat 180

ctataacgtt tgtttatttg ttgaaagatt tatctggggt gtttagtttc atgtgatttt 240

gagcgggaaa agggtgtttt tggatttttt tttacgcgac atacataaaa acatgataaa 300

gaaagatctg aacttttttt cctggaaaga tttttctggg tttcactgca aaaggttttt 360

ttttttatct ttattggggt tttgttagtt ttgcttttta ggtgaaattt gagatgggtt 420

tctattttta ttgagatttt ggtaattttc tttatgtata agtatgaaaa agtttgtggt 480

gtcttttcct atgtgcacga atgatgaagt gaagcttttg ggttgtgttc agtttttcat 540

ttacgacaaa ggatacctgt aaaacccaca gtagagttgt tttcagttta ttttttttag 600

gtgattaatt ttcaacccta gtttagtcta ttttattgct ttgatgtttt tccaggaaat 660

aaccattata tgtggtgtga ttttattggg aatctattgt cctttatttg tttgctgcta 720

ttctgcgttg ttgtgaagca gaaacacaag tatagattga ggggctatat tctctttttc 780

cttgttttat gggataatca tttgaaacta ggtccaccct tttttgttgg tcaattatta 840

ggataataaa gtgagggaaa ccagtttttt ctctctacat tacaggctat cttttacttc 900

cttgtatcta ggcatgaatt cttgtttttg aatttttttt tggtatgttc tgttatctac 960

aagtcaatgg cttggaatgt ttttcttgtc tgtctttgtc tacatatgat tgtaaggcat 1020

gtgtttaatt caaagctcct ggaagggtat tcatgtctgt gtggttgttc gggttgtttt 1080

cttcttttct agtagatttt cccccttaat gtcatgattt tggagctctc aattatgttt 1140

ttaaatcatt aagaatttgc ttatgattat ttgttctcaa aagtttctgt ttccttttta 1200

ccttatgcat tccgtcaact gtttgcaggt caggaattgg cttttgaagc ttgataatgg 1260

ctggtgagaa gattatagaa aaacgtatcc tgttaatatt tgactgcaat tttcgtgggt 1320

cctttggtag attctctaga tgctttatta catgtttgaa atttttggaa catggttttt 1380

aaaatgcgaa tgatgtctca atcttttatt tggcattgat gactggattg ctccacagta 1440

tgattttctt gctgatgagc atatttcaga atgttagggg ggtgattggg tataatatat 1500

gaattttcga attctcaaag aagtgtttcc atacatgaat ctatgaaatc caaactctac 1560

caaatgtctt tacaggaaac agcttttatc cctgattaag ataaaaggat gtttcagtaa 1620

acagctttga tatcttatcc cctgcctctc ctcaagccct catgtggaga tggaaattgc 1680

aaaggaacat gctaaatctt tatagcacca ttgcaaacat ttatcgccct agtctatgtg 1740

cttatgctag cttctgatgt gcgatgagcc aatgaatact gtgtataaga ttatgccact 1800

tgattataag aagactatta atgcttgaat tagcccaccc tgtgtataat ctggattttt 1860

atttcgaaaa agtcttctgt ttgatggtac tagttgtttt atcaagtctt gagctcggtc 1920

ttattatact tattgctcta tcaaatcttg aactcggtct tattatactt attgcaattt 1980

cgtcatgact taactttttt caagctgaag ctgttgctcc gggactgaaa tctgatccct 2040

ctaacaaact gattgagaag gatttggtat gctactattc atttctctct tattgtacat 2100

gatatatttg tgttgggagt gttaaattta taaatatgtt actataccgg aaaataaaat 2160

aatgcttgct ttttgtgact aatttttgcg aaaatagcac gtaggttccc catatgtcta 2220

aggagagggg aggtaggcgg gaaagagttg gatagaggtg attatacaag gaccacatct 2280

tcaactcacc cgcaagtact tgaccctaga tattgaagta tgaactatcc aggtcgagga 2340

tagagaacat ggttaatagt taatcaagtg cttctcttat ttttagatga agtaatgaga 2400

gtagtatcgt atatctcgag ctaattctct tttcccacta atcttttctg tcataagcat 2460

ttgtttggtt agaagaatac tgtttagtct ttgtcttgag ctacgaatgt tctctgtgct 2520

tctgcatttg tttggttcat ataaatcatg ctcatcactt cgttttatgt acttcagaca 2580

tttttatatt ttttttcgta tctgtttttt tgtaaactca atatgtatag gtttcaaaaa 2640

aagatggaaa agctgctgac tcggtggctt ctttgggagc tgtgaccagc atcaagtgtg 2700

aaaatgatca accacctgct gcagagcaag gtgcttatta tccacctact agctattgcg 2760

attactacta tccaggttag atactgactt gggtttgtca tagttccttt aattttcgga 2820

cctgctccta tttaatggtc acagaccagt tatgaccact tcatgattct attccctata 2880

taaatgcatt ggaaaatctt ggttggaact tgttaacttt atgagtagtg tgtttttgtg 2940

tatcatatac acagagttat caaagatgca gaagaacaca tatcaaccaa gtttttatat 3000

tctactaggg ctgacttatg ataagctaca tcttaagtac atattttatt aatactccta 3060

ggtggagatt gctgcatcct ttgatgcttg tttatgaatt gtggcacatt ttattatttc 3120

aagttatgtt tcttctattc attgtaaata taaggtgcaa aaaagaagag aaatgtagca 3180

atttttatgg aaatgaaaat cgaactgaca cactggaata gaaaaagctt atggaagtag 3240

aaatatgaag caagtaattg aaccctgctt tggtggtttt tttttggggc tctttttact 3300

gggtagtgaa ttaggtagtt ctcaatgctg ctaggagggt tcggcagaag tatatggaac 3360

cattactggt agaggtttga tatagttttg atgcttaact attttattat atcttcaggt 3420

ctttactcct ctccattgaa gtttgatctg tggacttgta tgtgtttgcc ttttgcaatt 3480

aaatataata acccgttgga tgatagtgta atttgaattt gctttttgca ggatataatg 3540

ggacttataa tcagttagat gagcaggctt actttaatgc ggtaggtttt acttcaataa 3600

gggttgtgtc atcttaattt gttttgttgt cttatataag cttaaacaca atctggtgat 3660

tgtcagggtg ttcaatcaga caatggttcc cttctctact atatgcctgg ctataatcct 3720

tacagtgctg gatttgtggg aggcgatggg aagcagccct atccttcgtc cggatatctc 3780

cagcaacctg tctcatatgg ttcagattcc atgccatgtt atacatgggg ctcgccatac 3840

tgtgctgata tcaccaatag tgctgctcca aaatccggga acgttaaatc aacttttgga 3900

cgaaatggtt cagtcaagtc gaatggtttt aattccacaa aaacaaatag ttctttctca 3960

agcaaaaact cgaccgtact ctttaaccca aagagtcgac cagctactgc catgtcaaat 4020

cctccaaagt ctttccatca agctcagcct tttaatccag tgaacaaggt ctgtttaaat 4080

ttcctctgat taactaacta tatgatggct ttctttgcta atgttgaatg ggaaaatcta 4140

tgctgaaatg tctctttcat tcctttcaga gggaaaatgt ctctttaagt ttttattttc 4200

tatgtttttc cttgtgtttg aaagtgtata tcttcctctt gttttctttt gacgagtttt 4260

atacccctgt ctttgcagtt tcagtccgat gtccagtctg gaggcctgat gaaggggttt 4320

catctggttg gggactaccc atcatacacg agtcagaatc aaggtttttt catgccttat 4380

gatcccatca actgtcaaac aaacagtaga atgtggaatg gaaactacag agctaaacca 4440

cggggaaatt tcaccagaaa tggtgtgttt gaggcaacta atgagttacc tcgtggtccc 4500

cgtgccaacg gtagaagtgt cccttcaaaa ccatctgctg aggaggatca gcttgtgcca 4560

gctgttcaga gggagaagta taacaaggag gattttaaga ctcagtatga caatgcaaaa 4620

ttttacatta tcaagtcata cagtgaagat gatatccaca agtgtgtcaa atatgatgtg 4680

tggtcaagta ctccaaatgg aaacaagaaa ttggacactg cctttgttga atctgaggct 4740

aaagcaagtg gaactggttc aagctgtcca gtgttcctct tcttttctgt aagttatcat 4800

gtttctgttt tttattcttc gattacatct gaacgttttt tttcatttgt gtgcatggac 4860

gtgtctttga aaggatggtc ataaaaatct aagttttttt ctcttgaatt tttaggtaaa 4920

tggaagtgga cagtttttag gtgtagctga gatggttggg caggttgact tcaacagaaa 4980

catggacttt tggcagcttg ataagtggag tgggttcttc ccactgaagt ggcacatagt 5040

taaagatgta ccaaatacac agttcaggca catcatcctt gaaaacaatg ataatagacc 5100

tgtaacctat agcagagata cacaggaggt gtatctcagt ttttgcttct ccatttttgg 5160

ctatttttgt cgaagatgtt taatttttag ttcagtctgc ctgtgtcaat tcttaatttt 5220

aaaattagag atctaacaag tatgctgtca ttccagattg gattgaagga aggtttggaa 5280

atgcttaaca tacttaagaa ttactcagag aagacatcta tattggatga tttcaatttc 5340

tatgagaagc gtgagaaagt gctcaaggct aaaaggagtt caaaaccagt tattcaagct 5400

gatgcatacg agaaagctga ttctcttgtg agtttctact ccttgtgcat ttctataaat 5460

attcaacaag tagtgccact ctgcatttta gctataagat acctcatgtt tctctttaaa 5520

ctgtggacac tttgtaccag acacattgta tgaaattcgt atgtttcctg tgttgcagaa 5580

gcaattcaaa ggaggagaca aggtactcga ggaggagctg aagaccaact ctactgatcc 5640

aactgcacct ttggtttctc tcaccaaaaa cctatcgatt aattcaaggc cattcaaaag 5700

tagtgtctga atcataggtt gcctccaaga ggcattttat gactaggtag acctgaagct 5760

tcaaaagggg tccttgtttc ttctttttgt gtttaattag ctttataggc atacactcgt 5820

cccgctgtgc ccggcttttg ggatggcatt tacttactag tctctattag ttttgcttca 5880

tctttaaagg gttctgtttc ttttcttttg actttgcaat gtttgtttac tttcaaaaga 5940

tctctacttt tgttttagat tattgcagta ttgataatgt taaaagaaaa agttgccccc 6000

atctccc 6007

<210> 2

<211> 555

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

Met Ala Gly Glu Lys Ile Ile Glu Lys Pro Glu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Leu Lys Ser Asp Pro Ser Asn Lys Leu Ile Glu Lys Asp Leu Val Ser

20 25 30

Lys Lys Asp Gly Lys Ala Ala Asp Ser Val Ala Ser Leu Gly Ala Val

35 40 45

Thr Ser Ile Lys Cys Glu Asn Asp Gln Pro Pro Ala Ala Glu Gln Gly

50 55 60

Tyr Asn Gly Thr Tyr Asn Gln Leu Asp Glu Gln Ala Tyr Phe Asn Ala

65 70 75 80

Gly Val Gln Ser Asp Asn Gly Ser Leu Leu Tyr Tyr Met Pro Gly Tyr

85 90 95

Asn Pro Tyr Ser Ala Gly Phe Val Gly Gly Asp Gly Lys Gln Pro Tyr

100 105 110

Pro Ser Ser Gly Tyr Leu Gln Gln Pro Val Ser Tyr Gly Ser Asp Ser

115 120 125

Met Pro Cys Tyr Thr Trp Gly Ser Pro Tyr Cys Ala Asp Ile Thr Asn

130 135 140

Ser Ala Ala Pro Lys Ser Gly Asn Val Lys Ser Thr Phe Gly Arg Asn

145 150 155 160

Gly Ser Val Lys Ser Asn Gly Phe Asn Ser Thr Lys Thr Asn Ser Ser

165 170 175

Phe Ser Ser Lys Asn Ser Thr Val Leu Phe Asn Pro Lys Ser Arg Pro

180 185 190

Ala Thr Ala Met Ser Asn Pro Pro Lys Ser Phe His Gln Ala Gln Pro

195 200 205

Phe Asn Pro Val Asn Lys Phe Gln Ser Asp Val Gln Ser Gly Gly Leu

210 215 220

Met Lys Gly Phe His Leu Val Gly Asp Tyr Pro Ser Tyr Thr Ser Gln

225 230 235 240

Asn Gln Gly Phe Phe Met Pro Tyr Asp Pro Ile Asn Cys Gln Thr Asn

245 250 255

Ser Arg Met Trp Asn Gly Asn Tyr Arg Ala Lys Pro Arg Gly Asn Phe

260 265 270

Thr Arg Asn Gly Val Phe Glu Ala Thr Asn Glu Leu Pro Arg Gly Pro

275 280 285

Arg Ala Asn Gly Arg Ser Val Pro Ser Lys Pro Ser Ala Glu Glu Asp

290 295 300

Gln Leu Val Pro Ala Val Gln Arg Glu Lys Tyr Asn Lys Glu Asp Phe

305 310 315 320

Lys Thr Gln Tyr Asp Asn Ala Lys Phe Tyr Ile Ile Lys Ser Tyr Ser

325 330 335

Glu Asp Asp Ile His Lys Cys Val Lys Tyr Asp Val Trp Ser Ser Thr

340 345 350

Pro Asn Gly Asn Lys Lys Leu Asp Thr Ala Phe Val Glu Ser Glu Ala

355 360 365

Lys Ala Ser Gly Thr Gly Ser Ser Cys Pro Val Phe Leu Phe Phe Ser

370 375 380

Val Asn Gly Ser Gly Gln Phe Leu Gly Val Ala Glu Met Val Gly Gln

385 390 395 400

Val Asp Phe Asn Arg Asn Met Asp Phe Trp Gln Leu Asp Lys Trp Ser

405 410 415

Gly Phe Phe Pro Leu Lys Trp His Ile Val Lys Asp Val Pro Asn Thr

420 425 430

Gln Phe Arg His Ile Ile Leu Glu Asn Asn Asp Asn Arg Pro Val Thr

435 440 445

Tyr Ser Arg Asp Thr Gln Glu Ile Gly Leu Lys Glu Gly Leu Glu Met

450 455 460

Leu Asn Ile Leu Lys Asn Tyr Ser Glu Lys Thr Ser Ile Leu Asp Asp

465 470 475 480

Phe Asn Phe Tyr Glu Lys Arg Glu Lys Val Leu Lys Ala Lys Arg Ser

485 490 495

Ser Lys Pro Val Ile Gln Ala Asp Ala Tyr Glu Lys Ala Asp Ser Leu

500 505 510

Lys Gln Phe Lys Gly Gly Asp Lys Val Leu Glu Glu Glu Leu Lys Thr

515 520 525

Asn Ser Thr Asp Pro Thr Ala Pro Leu Val Ser Leu Thr Lys Asn Leu

530 535 540

Ser Ile Asn Ser Arg Pro Phe Lys Ser Ser Val

545 550 555

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

ggagcaacag cttcagcttg tgaccaatgg tgctttg 37

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

caagctgaag ctgttgctcc gttttagagc tagaaat 37

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

gccattatca agcttcaaaa tgaccaatgt tgctcc 36

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

ttttgaagct tgataatggc gttttagagc tagaaat 37

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 9

ggactgaaat ctgatccctc caatcactac ttcgtct 37

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 10

gagggatcag atttcagtcc gttttagagc tagaaat 37

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 11

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 12

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 13

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 14

agcgtgggtc tcgtcttcac tccatccact ccaagctc 38

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 15

ttcagaggtc tctaagactt tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 16

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc t 41

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 17

tcttatcccc tgcctctcct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 18

cttgcgggtg agttgaagat 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 19

tgcgatgagc caatgaatac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 20

tcaaagctcc tggaagggta 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 21

aggagaggca ggggataaga 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 22

gtggttgttc gggttgtttt 20

Claims

1.一种调控番茄果实芳香物质合成的基因SlECT2，其特征在于，所述SlECT2基因的核苷酸序列如序列1所示；所述SlECT2编码的蛋白质的氨基酸序列如序列2所示。

2.一种用于基因SlECT2突变的CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述载体为pYLCRISPR/Cas9-SlECT2，所述载体表达靶向SEQ ID NO.1序列核酸分子的sgRNA，所述sgRNA的序列为T1、T2、T3，所述T1序列为SEQ ID NO.1的第2001-2020位核苷酸，所述T2序列为SEQ ID NO.1的第1242-1261位核苷酸，所述T3序列为SEQ ID NO.1的第2022-2041位核苷酸。

3.权利要求1所述基因SlECT2在调控番茄果实芳香物质含量中的应用，其特征在于，包括突变番茄中SlECT2基因显著降低番茄果实中芳香物质含量。

4.权利要求1所述基因SlECT2作为番茄果实开展基因工程的重要候选基因在番茄育种以及改善番茄果实芳香品质中的应用。