CN114752608A

CN114752608A - 一种高含量油菜素内酯番茄植株的培育方法

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Publication number: CN114752608A
Application number: CN202210456566.XA
Authority: CN
Inventors: 胡璋健; 朱常安; 吴鑫怡; 张敏; 敬北宇; 马洪雪; 喻景权
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Shandong Linyi Institute of Modern Agriculture of Zhejiang University
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Shandong Linyi Institute of Modern Agriculture of Zhejiang University
Priority date: 2022-04-24
Filing date: 2022-04-24
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2042-04-24
Also published as: CN114752608B

Abstract

本发明公开了一种高含量油菜素内酯番茄植株的培育方法，属于生物技术领域。本发明提供了CPK27基因作为负调控因子在提高植物油菜素内酯含量中的应用，所述CPK27基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。本发明首次公开CPK27基因在提高植物油菜素内酯类物质中的新用途，通过基因编辑技术缺失CPK27基因功能，可显著提高植物油菜素内酯类物质含量。本发明为培育高含量油菜素内酯类物质和具备广谱逆境抗性的番茄品种提供了重要的基因资源。

Description

一种高含量油菜素内酯番茄植株的培育方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及CPK27基因作为负调控因子在提高植物尤其是番茄内源油菜素内酯含量中的应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)，茄科番茄属植物，作为食用蔬果被全球性广泛种植。油菜素内酯类物质(Brassinosteroids，BRs)是一类天然存在于植物体内的甾醇类激素，其中油菜素甾酮(Castasterone,CS)和芸薹甾内酯(Brassinolide,BL)是最具生物活性的两类物质。研究表明油菜素内酯类物质能促进番茄生长发育和品质形成。

研究表明，外源喷施BL可显著提高番茄等作物的光合效率(Li等，DWARFoverexpression induces alteration in phytohormone homeostasis,development,architecture and carotenoid accumulation in tomato.Plant BiotechnologyJournal 2016,14,1021-1033)。外源喷施BL还能提高番茄果实中的番茄红素含量，并延缓采后番茄果实的低温损伤(Aghdam等，Enhancement of chilling stress tolerance oftomato fruit by postharvest brassinolidetreatment.Food and BioprocessTechnology 2014,7,909-914)。

值得注意的是，油菜素内酯类及其信号途径同样在番茄应答逆境胁迫过程中起着关键的作用。番茄过表达油菜素甾酮合成基因CYP85A1能有效降低因低温产生的氧化胁迫程度，增强低温抗性(Fang等，Brassinosteroids Act as a Positive Regulator ofPhotoprotection in Response to Chilling Stress.Plant Physiology 2019,180,2061-2076.)。外源喷施BL还增强了植物对尖孢镰刀菌的抗性(Ali等，Brassinosteroidenhances resistance to Fusarium diseases of barley.Phytopathology 103,1260–1267)。

由以上可看出，油菜素内酯类物质在促进番茄生长发育、品质形成和抗病抗逆中均发挥了积极的作用。因此，通过基因编辑技术提高番茄油菜素内酯类物质可创制高抗优质的番茄种质，改良现有番茄品种，达到番茄生产提质增效的目的。

油菜素内酯类物质的生物合成途径复杂多样，由早期和晚期C-22氧化途径、早期和晚期C-6氧化途径、早期C-22氧化途径与晚期C-6氧化途径之间的捷径组成。油菜甾醇(Campestrol)是芸薹甾内酯生物合成的前体。在这一系列的反应过程中，编码关键酶的DWF4和CYP85A1等基因发挥了关键的作用。通过影响合成酶的基因表达可进一步实现对植株内源油菜素内酯类物质含量的调控。有研究表明，过表达番茄CYP85A1基因可显著增加番茄内源油菜素内酯类物质含量(Li等，DWARF overexpression induces alteration inphytohormone homeostasis,development,architecture and carotenoid accumulationin tomato.Plant Biotechnology Journal 2016,14,1021-1033)。拟南芥中的bHLH型转录因子TCP1可结合在DWF4的启动子上促进其基因表达进而提高油菜素内酯类物质含量(Guo等，TCP1modulates brassinosteroid biosynthesis by regulating the expression ofthe key biosynthetic gene DWARF4 in Arabidopsis thaliana.Plant Cell2010，22:1161–1173)。

植物体内油菜素内酯类物质的合成受到多种因素的影响，调控合成的其他元件急需深入挖掘。CPK是植物一种钙离子依赖型蛋白激酶，其在调控油菜素内酯合成过程中的作用鲜有报道，因此，基于番茄CPK27基因进而创制高含量油菜素内酯类物质的番茄植株具有理论和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种可调控植物内源油菜素内酯类物质合成的基因，通过基因改造达到提高植物内源油菜素内酯类物质合成的目的，为培育高含量油菜素内酯类物质作物种质提供依据。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了CPK27基因作为负调控因子在提高植物油菜素内酯含量中的应用，所述CPK27基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。

核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CPK27基因位于番茄的第11染色体上，编码一种钙离子依赖型蛋白激酶，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由N段可变结构域、蛋白激酶域、自我抑制结构域和Ca²⁺结合域组成，当与钙离子结合时，该蛋白被激活。

所述应用包括：利用生物学技术使得所述CPK27基因功能缺失，进而提高植物内源油菜素内酯类物质的含量。

具体的，利用基因突变、基因敲除、基因干扰或基因沉默技术导致所述CPK27基因的表达降低或缺失，从而获得高含量油菜素内酯的突变体植株。

进一步的，所述油菜素内酯包括油菜素甾酮(Castasterone,CS)和芸薹甾内酯(Brassinolide,BL)。

进一步的，所述CPK27基因编码的蛋白质负调控油菜素甾酮合成基因CYP85A1(基因登录号为：Solyc02g089160)的表达。

本发明通过基因编辑技术制备得到定点编辑CPK27基因的番茄cpk27缺失突变体植株。研究发现，番茄CPK27基因突变后，CYP85A1基因表达量显著提高，番茄油菜素甾酮和芸薹甾内酯含量显著提高；因此，敲除番茄CPK27基因有利于提高番茄内源油菜素内酯类物质含量，可用于创制高含量油菜素内酯类物质的番茄种质。

进一步的，所述植物为番茄。

番茄CPK27基因编码的蛋白质由533个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种提高番茄植株内源油菜素内酯含量的培育方法，包括以下步骤：

(1)在番茄CPK27基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以靶标片段PAM结构前20个碱基为依据，进行引物设计，构建CRISPR/Cas9载体；所述番茄CPK27基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)构建含步骤(1)所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；

(3)将步骤(2)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得不含外源Cas9蛋白且靶标序列发生变异的稳定遗传的纯合突变体株系。

进一步的，所述靶标片段PAM结构前20个碱基如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

进一步的，构建CRISPR/Cas9载体的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示，或者如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

本发明具有的有益效果：

(1)本发明首次公开CPK27基因在提高植物油菜素内酯类物质中的新用途，通过基因编辑技术缺失CPK27基因功能，可显著提高植物油菜素内酯类物质含量。本发明为培育高含量油菜素内酯类物质和具备广谱逆境抗性的番茄品种提供了重要的基因资源。

(2)本发明利用基因编辑技术提供了一种高含量油菜素内酯类物质番茄种质的培育方法，与转基因技术相比，不会引入外源基因，并得到了高含量油菜素内酯类物质番茄纯合植株。

附图说明

图1为油菜素内酯类物质合成途径中最后两个步骤反应式，其中6-deoxocastasterone(6-deoxoCS)在CYP85A1基因编码的酶作用下，转化为有生物活性的油菜素甾酮(Castasterone，CS)，并进一步合成芸薹甾内酯(Brassinolide，BL)。

图2为番茄cpk27缺失突变体T2代(纯合、不含外源Cas9片段)的核酸序列和蛋白序列与野生型番茄的比较，其中，番茄cpk27有两种突变类型，在sgRNA的位置分别插入了碱基A和T，导致编码的蛋白质提前终止于第140位氨基酸位置；对照代表野生型番茄，cpk27#2、cpk27#6分别代表突变体植株的两种株系。

图3为野生型番茄和cpk27缺失突变体正常环境下的生长表型，其中(A)为植株照片，从左到右依次为对照、cpk27#2、cpk27#6，可以看出，突变体植株的株高显著高于野生型番茄；(B)为植株高度比较图，小写字母a，b代表不同植株间在5％水平上的差异显著，所用统计方法为Turkey’s test。

图4为野生型番茄和cpk27缺失突变体中CS的含量，小写字母a，b代表不同植株间在5％水平上的差异显著，所用统计方法为Turkey’s test。

图5为野生型番茄和cpk27缺失突变体中BL的含量，小写字母a，b代表不同植株间在5％水平上的差异显著，所用统计方法为Turkey’s test。

图6为CYP85A1基因在野生型番茄和cpk27缺失突变体中的表达量，可以看出，野生型番茄的CYP85A1基因表达量远远低于cpk27缺失突变体。小写字母a，b代表不同植株间在5％水平上的差异显著，所用统计方法为Turkey’s test。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

下述实施例中采用的番茄材料为常规野生型番茄品种Condine Red。

实施例1：含2个特异sgRNA的CRISPR/Cas9载体的构建

在SGN网站https://solgenomics.net/上找到CPK27基因的DNA全长序列如SEQ IDNO.3所示，将其序列输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR网站，查找PAM序列，即5‘-NGG-3’的序列(N代表A、T、C、G任一种核苷酸)，将NGG之前20bp的序列定义为sgRNA，寻找特异性靶向基因蛋白编码区的sgRNA。该特异性靶向CPK27基因的蛋白编码区的2个sgRNA的DNA序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

设计CRISPR引物，如下所示：

sgRNA1-F:5’-GCGGTCTCTATTGAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTG-3’(SEQ ID NO.6)；

sgRNA1-R:

5’-GCGGTCTCTCCCTCACAAAGTTCCATCACTGCACCAGCCGGGAAT CG-3’(SEQ ID NO.7)；

sgRNA2-F:

5’-GCGGTCTCTTACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAA-3’(SEQ ID NO.8)；

sgRNA2-R:

5’-GCGGTCTCTAAACATCAAACAACTCACCCCCCTTGCACCAGCCGG GAATCG-3’(SEQ IDNO.9)；

上述引物分别以pBAtC-tRNA质粒为模板进行PCR扩增，产物经普通DNA纯化试剂盒纯化后，用BsaI酶将扩增片段与pHEE401质粒连接，产物42℃转化大肠杆菌涂板，抗性为卡那霉素。

挑单克隆菌落，用pHEE401载体通用前引物M13-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO.10)和通用后引物M13-R：5’-GGTATTGGTTTATCTCATCGGAACTGCA-3’(SEQ IDNO.11)，进行PCR验证。

将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果显示载体包含2个sgRNA序列，提质粒后电击入农杆菌GV3101感受态，28℃培养两天后挑斑进行PCR验证，获得可用于构建其CRISPR/Cas9基因编辑材料的农杆菌菌株。

实施例2：CPK27基因突变体材料制备与鉴定

在播种培养基播种已消毒的种子，7天后切子叶。农杆菌侵染法将实施例1制备的最终质粒转化入子叶中，利用植物细胞全能性，获得T0代基因编辑番茄。T0代基因编辑番茄苗检测：利用CTAB法提取T0代植株的基因组DNA并以其为模板，在包含sgRNA的DNA序列前后约200bp处设计如下引物，进行PCR扩增测序验证：

验证前引物：5’-TGGTGCAACTCAAGCATCTG-3’(SEQ ID NO.12)；

验证后引物：5’-GGATGGTGAAATCCTGTGTG-3’(SEQ ID NO.13)；

所得PCR产物送测序公司测序。测序结果与该段基因原序列利用Snapgene软件进行比对，选取sgRNA序列发生碱基缺失或减少、且测序显示单峰的植株，进行自交繁种，获得T0代的种子。

上述T0代种子种植于生长室中，获得T1代植株。利用上述同样方法检测T1代植株的sgRNA序列碱基编辑情况。同时，利用Cas9基因引物对T1代植株的DNA进行PCR扩增，检测是否含有Cas9序列。选取sgRNA发生变异，但不含Cas9的T1代植株，确定为基因编辑植株的两个株系，分别命名为cpk27#2和cpk27#6，其基因编辑位点如图2所示。

cpk27#2比对照植株多一个碱基A，cpk27#6比对照植株多一个碱基T。对上述两个株系进一步自交繁种，获得T1代种子。上述两个株系T1代种子播种后，获得不含外源基因Cas9，且sgRNA发生变异的稳定遗传的T2代植株。如图3所示，突变体植株的株高显著高于野生型番茄。

以下实施例均以上述两个纯合株系T2代植株作为材料进行实验。

实施例3：番茄CPK27基因对内源油菜素内酯类物质含量的影响

制备MCX@BBII：将1.0g商用MCX固相萃取吸附剂放入装有7mLBBII溶液的15mL管中。剧烈搅拌3min后，以10,000g离心3min，弃上清，用7mL 60％乙腈洗涤。最后，物料在60℃的真空中干燥保存。

番茄苗种植在生长室中，35天后取幼嫩的叶片0.1g，用液氮充分研磨后加入1mL乙腈(HPLC级)和1ng/μL的标样，放置在摇床上4℃震荡过夜。4℃，12，000g离心10min后，上清转移至含有0.3g MCX@BBII和3mL双蒸水的离心管中，充分涡旋。4℃，10，000g离心10min后，用5mL含有0.5％甲酸的90％丙酮重悬浮沉淀，充分涡旋。4℃，10,000g离心10min后，弃上清，加入1.2mL丙酮和0.3g醋酸铵，涡旋1min后10,000g离心3分钟。吸上清液于新的1.5mL管中，氮气吹干后用100μL 45％乙腈溶解，上机检测。油菜素内酯类物质含量分析采用ACQUITY超高效液相色谱联用Waters Xevo TQ-XS三重四重质谱仪。结果如图4和图5所示。

结果表明：cpk27缺失突变体中有生物活性的CS和BL含量显著高于野生型。

实施例4：番茄CPK27基因对内源油菜素内酯类物质合成基因CYP85A1的影响

取叶片样品0.2g，用总RNA提取试剂盒(Tiangen，DP419)按照Trizol裂解法提取RNA，具体步骤为：

(1)取0.1g叶片在液氮中磨碎，加1mL裂解液，后用均浆仪混匀；

(2)将均浆样品在15-30℃放置5min；

(3)4℃，12,000rpm离心5min，去上清；

(4)加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min；

(5)4℃，12，000rpm离心10min，将上部水相转移到新的1.5mL管中，进行下一步操作；

(6)缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混合均匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；

(7)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；

(8)向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW，室温静止2min，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；

(9)重复操作步骤(8)；

(10)将吸附柱放入2mL收集管中，4℃，12000rpm离心2min，去废液；使用HiScriptII QRT SuperMix(Vazyme Biotech,Nanjing,China)将RNA反转录成cDNA，进行qRT-PCR实验，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)采用480II Real-TimePCR detection system(Roche，Swiss)，并使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix kits(Vazyme Biotech,Nanjing,China)。PCR反应条件为：95℃3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，40个循环。在每个循环的延伸末期采集荧光数据。

根据番茄的CYP85A1基因序列设计特异性引物：

CYP85A1基因前引物：5’-ATGAAGCGAAAGGACTGGTC(SEQ ID NO.14)；

CYP85A1基因后引物：5’-TGCACCCCTCATGTACTTGT(SEQ ID NO.15)；

结果如图6所示，cpk27基因缺失突变体的CYP85A1基因表达量提高了100倍左右，表明CPK27负调控CYP85A1的表达进而抑制CS和BL的含量。

序列表

<110> 浙江大学

浙江大学山东（临沂）现代农业研究院

<120> 一种高含量油菜素内酯番茄植株的培育方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1602

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

atggggaatt gctgtgggac acctggtaat tcttctgaga ataagaagaa gaagaacaaa 60

ccaaaccctt ttgctcttga ttatggtgca actcaagcat ctggaggtga tggaaacaag 120

cttgttgtgt tgaaagatcc aacaggacac aatattcaag aaaaatatga tcttggttgt 180

gagctaggaa gaggagaatt tggggttaca tatttatgta ctgatgttga tacaggggac 240

aaatatgctt gcaaatcgat atcaaagaag aaacttagga ctgctgtaga tatagatgat 300

gttaggagag aagttgagat catgaagcat ttgcctaaac atcctaatat tgtgaccttg 360

aaggacactt atgaggatga taatgcagtg catattgtga tggaactttg tgaggggggt 420

gagttgtttg ataggattgt tgccagggga cattatacag agagagcagc tgcggttatt 480

atgaagacta tagtagaagt tgttcagatg tgtcatatgc atggagtaat gcatcgtgat 540

ctcaaacctg agaactttct gtttggtaac aagaaagaaa ctgctccttt gaaggctatt 600

gactttggat tatcagtgtt ctttaaaccc ggggaacgct ttaatgagat tgtgggaagt 660

ccttattaca tggctccaga ggtcctaaaa cgcaattatg gcccggaggt tgatgtctgg 720

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cgacgactca cagctcagca ggttcttgag cacacctggt tacaaaatat aaagaaagca 960

ccaaatgtct cattgggtga gactgtgaaa gcaaggctta aacaattttc agtaatgaac 1020

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ggaatgaagg acgcatttga tatgatggat acaggaaaga aaggcaagat taaccttgga 1140

gaacttaaaa atggtctgca aaagcttggc catcagatcc ctgatgttga tcttcagatt 1200

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agagatggct cgatacaagt cggaaaggaa gaaggtagat ga 1602

<210> 2

<211> 533

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

Met Gly Asn Cys Cys Gly Thr Pro Gly Asn Ser Ser Glu Asn Lys Lys

1 5 10 15

Lys Lys Asn Lys Pro Asn Pro Phe Ala Leu Asp Tyr Gly Ala Thr Gln

20 25 30

Ala Ser Gly Gly Asp Gly Asn Lys Leu Val Val Leu Lys Asp Pro Thr

35 40 45

Gly His Asn Ile Gln Glu Lys Tyr Asp Leu Gly Cys Glu Leu Gly Arg

50 55 60

Gly Glu Phe Gly Val Thr Tyr Leu Cys Thr Asp Val Asp Thr Gly Asp

65 70 75 80

Lys Tyr Ala Cys Lys Ser Ile Ser Lys Lys Lys Leu Arg Thr Ala Val

85 90 95

Asp Ile Asp Asp Val Arg Arg Glu Val Glu Ile Met Lys His Leu Pro

100 105 110

Lys His Pro Asn Ile Val Thr Leu Lys Asp Thr Tyr Glu Asp Asp Asn

115 120 125

Ala Val His Ile Val Met Glu Leu Cys Glu Gly Gly Glu Leu Phe Asp

130 135 140

Arg Ile Val Ala Arg Gly His Tyr Thr Glu Arg Ala Ala Ala Val Ile

145 150 155 160

Met Lys Thr Ile Val Glu Val Val Gln Met Cys His Met His Gly Val

165 170 175

Met His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Gly Asn Lys Lys

180 185 190

Glu Thr Ala Pro Leu Lys Ala Ile Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Phe

195 200 205

Lys Pro Gly Glu Arg Phe Asn Glu Ile Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Met

210 215 220

Ala Pro Glu Val Leu Lys Arg Asn Tyr Gly Pro Glu Val Asp Val Trp

225 230 235 240

Ser Ala Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Cys Gly Val Pro Pro Phe

245 250 255

Trp Ala Glu Thr Glu Gln Gly Val Ala Gln Ala Ile Ile Arg Ser Val

260 265 270

Val Asp Phe Lys Arg Asp Pro Trp Pro Lys Val Ser Asp Asn Ala Lys

275 280 285

Asp Leu Val Lys Lys Met Leu Asp Pro Asp Pro Thr Arg Arg Leu Thr

290 295 300

Ala Gln Gln Val Leu Glu His Thr Trp Leu Gln Asn Ile Lys Lys Ala

305 310 315 320

Pro Asn Val Ser Leu Gly Glu Thr Val Lys Ala Arg Leu Lys Gln Phe

325 330 335

Ser Val Met Asn Lys Leu Lys Lys Arg Ala Leu Thr Ile Met Ala Glu

340 345 350

Phe Leu Ser Ala Glu Glu Val Ala Gly Met Lys Asp Ala Phe Asp Met

355 360 365

Met Asp Thr Gly Lys Lys Gly Lys Ile Asn Leu Gly Glu Leu Lys Asn

370 375 380

Gly Leu Gln Lys Leu Gly His Gln Ile Pro Asp Val Asp Leu Gln Ile

385 390 395 400

Leu Met Glu Ala Ala Asp Val Asp Gly Asp Gly Ser Leu Asn Tyr Gly

405 410 415

Glu Phe Val Ala Val Ser Val His Leu Arg Lys Met Ala Asn Asp Glu

420 425 430

His Leu His Lys Ala Phe Ser Val Phe Asp Arg Asp Gln Ser Gly Tyr

435 440 445

Ile Glu Ile Glu Glu Leu Arg Ser Ala Leu Ser Asp Glu Asp Gly Gly

450 455 460

Asn Ser Glu Glu Val Ile Asn Ala Ile Met His Asp Val Asp Thr Asp

465 470 475 480

Lys Asp Gly Arg Ile Ser Tyr Glu Glu Phe Ala Ala Met Met Lys Ala

485 490 495

Gly Thr Asp Trp Arg Lys Ala Ser Arg Gln Tyr Ser Arg Glu Arg Phe

500 505 510

Asn Ser Leu Ser Leu Lys Leu Met Arg Asp Gly Ser Ile Gln Val Gly

515 520 525

Lys Glu Glu Gly Arg

530

<210> 3

<211> 4914

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 3

atggggaatt gctgtgggac acctggtaat tcttctgaga ataagaagaa gaagaacaaa 60

ccaaaccctt ttgctcttga ttatggtgca actcaagcat ctggaggtga tggaaacaag 120

cttgttgtgt tgaaagatcc aacaggacac aatattcaag aaaaatatga tcttggttgt 180

gagctaggaa gaggagaatt tggggttaca tatttatgta ctgatgttga tacaggggac 240

aaatatgctt gcaaatcgat atcaaagaag aaacttagga ctgctgtaga tatagatgat 300

gttaggagag aagttgagat catgaagcat ttgcctaaac atcctaatat tgtgaccttg 360

aaggacactt atgaggatga taatgcagtg catattgtga tggaactttg tgaggggggt 420

gagttgtttg ataggattgt tgccagggga cattatacag agagagcagc tgcggttatt 480

atgaagacta tagtagaagt tgttcaggta cagttttact aattaatgct tgtctttgct 540

tttcatctat aattgttact tgtttgttta tttcatgtaa tttaggggtt gctaatttag 600

gattatgtta atgaagtttg aattgacaat gccaactgaa agtgtcaatt tagactagaa 660

aggaatgttg agattgaagt ttcatgtttg taagcagaat gaatgttctt gtcgaagaat 720

ctcttttaag aatatctttc ccacttcttc agtaaatttt cctactttct tatgtcgata 780

actgccactc cttttctgag tttgcctgca ctctcttggt agataggaca ctccctttct 840

tagctcagga tctactttgc ttgtgtaaat gagtgcttaa tgtttttatt tgattcattt 900

tacacgttga gatcctatag catttaatta gactagattt tatcttccaa tatcactaaa 960

cctagatgtc aaatatagta aaaagttatg ttgctcgaac tcttcaaaga tatcgacatg 1020

tgtgtgtcag atcctccaaa agtagtgcat ttttggagga tccgacgggg gtggggcaac 1080

aattttggag agttcgagca acttaggtaa aaagtgtatt catgctctaa atgttgttag 1140

gttttctatc tttcttatct tgtcttgtga attttgcttt cttggcaact gtttcattgt 1200

cctatatttt tctcatgcaa atacctttaa aattatatac tttcgtgcca accatttaaa 1260

tgaaacttaa ggaagctaat cacacaggat ttcaccatcc aaatgtcgaa aatgaatcgc 1320

aatttgtgat agttttagac agagagctta tttttataga tgcaattaga ataatagaaa 1380

tgtaaaataa ctatcagtaa ccagtaagat gccggtcttt atggtctatt ttcagagggg 1440

gagatctatt gtagcttgct ttcagcatca gttagtatag cataggactg ttgctaacag 1500

ggttcaattt taaactgtat ttggtgaaca taatgacatg agagctcaac ttacataact 1560

acagattaga gagagacatt cattttatgg aatggattta agaagttcat gtttctacat 1620

ttagttgtta taagaacagg gtggtaactg gtaaccgacg caaacatgat ggctaattat 1680

cccaagttta tacaatttaa tctatgtggt tgctcataca tctttggtca atgttcactt 1740

tacagttgca ttatgtttcc tcaagaaatg gctgttcttc tttcaatttt caacttacgg 1800

agtttcaatt gacattgcag atgtgtcata tgcatggagt aatgcatcgt gatctcaaac 1860

ctgagaactt tctgtttggt aacaagaaag aaactgctcc tttgaaggct attgactttg 1920

gattatcagt gttctttaaa cccggtaatg caataagtaa tgatagtgtg ttgtaacttt 1980

ttttcatgct aaaaaagatt aatgttggaa tcatctttta atatgtttaa caggggaacg 2040

ctttaatgag attgtgggaa gtccttatta catggctcca gaggtcctaa aacgcaatta 2100

tggcccggag gttgatgtct ggagtgctgg agttatcctt tatattcttc tttgtggtgt 2160

tccacctttc tgggcaggtc cgtttctttt atttgccttc tttaggtaac aagtaatacc 2220

tcggttcacc gacaaataac aaagtaaatc aaccttggtg catactattc atttcttaga 2280

acttggtaat ttattaatga gtgtcaaaat gaaatggaat ttgaaacata ttgatgcgtt 2340

gttaacatcg tcgatgacta ggtgagggtg gctgcaagag tgaatcccac ctcttcctgg 2400

accaattcaa aatcaaagtt cctttttttc cttttggcct gtgatagtca gtactttgtg 2460

cttccattaa tttactcaca gctttctcag taattgccta aaattctact gaatatgtgc 2520

agagactgaa caaggagtag cccaagcaat tattcggtct gtggttgatt tcaagagaga 2580

tccatggcct aaggtttctg ataatgcaaa ggatcttgta aagaagatgc ttgacccgga 2640

tccaactcga cgactcacag ctcagcaggt tcttggtaat gtttgttaat ccttgagatg 2700

ctatactttc atttgcttgc tgtttgttct ctcttagttt cataagttca attttgtgac 2760

ttttttgggg ctttcgtgca tatacatgaa tgcagagcac acctggttac aaaatataaa 2820

gaaagcacca aatgtctcat tgggtgagac tgtgaaagca aggcttaaac aattttcagt 2880

aatgaacaag ctcaagaaaa gagctctaac ggtaaaatat tcccttttca tttgcagtta 2940

catatcatta gcgttctgca ccttctcaga aggatatctt catatgccta attcttaaag 3000

cccaaaataa ggacaaaaga ttttctgcct tctcacaaaa gtttcgggtg ttatattctt 3060

tcttcattgc ttgcacagat tatggccgag tttttatcag cggaagaagt ggctggaatg 3120

aaggacgcat ttgatatgat ggatacagga aagaaaggca agattaacct tggagaactt 3180

aaaaatggtc tgcaaaagct tggccatcag atccctgatg ttgatcttca gattcttatg 3240

gaagctgtaa gcattctcat gctcttcatt tcacttgatt ggattttctt tcaactttac 3300

gaagactaaa tatatatatt tataagtcaa gcgtctaata ttattataat tgttcccttt 3360

tttatcttct gcttcacttt tataggcgga tgttgatgga gatggaagct taaattatgg 3420

ggagtttgtt gctgtatctg ttcatctcag aaaaatggca aatgatgagc acctgcacaa 3480

agcattttca gtttttgaca gagatcagag tggttacata gaaatcgagg agctgcgcag 3540

tgccttgagt gatgaggatg gtggcaacag tgaggaagtc atcaatgcca ttatgcatga 3600

tgttgacact gacaaggtta gaattttttt tgtgtccatt catgtatatc tactggattt 3660

catactagtg catatacttc ttttataaat gtctctttaa ttgcttgtgg aaccataaat 3720

acccccctta tcttgttccg cagctccaac tacacacgaa actatgttga agacgtatta 3780

cccccttgta cttgtaaaat gtgtatcttc cgtcatcctg agaggcatat atgatgtaac 3840

caaatgtgaa catttaagta tatgcatgtg ctgcctcatg tcatttaccc ctttttccct 3900

tttcacttct cttccatctc cgcaacatgt taatgtcctc tagcaaatct gaaaaaagat 3960

ggagtgagct tctcaacgga aaaaatcgga ttcaccctag ttttagtttt ctggcaacat 4020

aaacagctca agtcgataca aaaaaacaaa tgttcctatc aaaaaactca aattagtaga 4080

aaggaaaaga agggtcatag gtaagggaag aacaaaaagg aatagaaaga cccttcgggg 4140

tggcccagtt atttgggctt ggggcttggg gcttgggact tccatgttgg aggtctcaag 4200

ttcaaaaccc cttgccaatg aaagcaacgg gttttccttc tacgttgact gtcgagctcg 4260

tcgcaccggg cttacctagt gcggtttacc tctcctttgc gtgctatagg aataggggtt 4320

ttaccctgtg tgcactcaaa gggtagcgac tgcggatttc ccaaaagaaa aaggaagaga 4380

aaggtaaaga aaacatttta aaaaagagta ggatggttat aatagaagaa atgctacaat 4440

attttttcac ctcaggcgct ttaagagagt aaatactcta cgttacatgg cgtcccaatg 4500

ttgtcgtagt tacattttgg acaagaacag ggagtaatag gcctcccgca aagttaaaat 4560

gtagtgggga atgggggaat aattgaggaa ggtatttata tattttctcc tttctaaatc 4620

atattttctt ttccattcac tgctcttctg ttcaacctta tcattcattt ggactaaatg 4680

ttgaattgat tttgagcttt tagtttgtta ccacagcttc aaagttcatc agttacattg 4740

tctataacca tgcaggatgg ccgcattagt tacgaggaat ttgctgcaat gatgaaggct 4800

ggcacagatt ggagaaaagc atcgagacag tattctcgtg aaagattcaa cagtctcagc 4860

ttaaaattga tgagagatgg ctcgatacaa gtcggaaagg aagaaggtag atga 4914

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 4

gtgatggaac tttgtgaggg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 5

aggggggtga gttgtttgat 20

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcggtctcta ttgaacaaag caccagtggt ctagtg 36

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggtctctc cctcacaaag ttccatcact gcaccagccg ggaatcg 47

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggtctctt accgttttag agctagaaat agcaagttaa 40

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcggtctcta aacatcaaac aactcacccc ccttgcacca gccgggaatc g 51

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtattggtt tatctcatcg gaactgca 28

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggtgcaact caagcatctg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggatggtgaa atcctgtgtg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgaagcgaa aggactggtc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgcacccctc atgtacttgt 20

Claims

1.CPK27基因作为负调控因子在提高植物油菜素内酯含量中的应用，其特征在于，所述CPK27基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用生物学技术使得所述CPK27基因功能缺失，进而提高植物内源油菜素内酯类物质的含量。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述油菜素内酯包括油菜素甾酮和芸薹甾内酯。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CPK27基因编码的蛋白质负调控油菜素甾酮合成基因CYP85A1的表达。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述CPK27基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.一种提高番茄内源油菜素内酯含量的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)构建含步骤(1)所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；

8.如权利要求7所述的提高番茄内源油菜素内酯含量的培育方法，其特征在于，步骤(1)中，所述靶标片段PAM结构前20个碱基如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

9.如权利要求8所述的提高番茄内源油菜素内酯含量的培育方法，其特征在于，构建CRISPR/Cas9载体的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，或者如SEQID NO.8和SEQ ID NO.9所示。