CN112852827B - 拟南芥转录因子at3g46090基因在培育抗病性转基因植物中的应用 - Google Patents

Abstract

拟南芥转录因子AT3G46090基因在培育抗病性转基因植物中的应用，通过将拟南芥AT3G46090基因的CDS序列通过Gateway技术构建到带有FLAG蛋白标签的上游，并转化拟南芥植物，筛选并鉴定，最终获得转基因植物。对筛选到的植物进行分析发现其具有增强植物对丁香假单胞菌番茄亚种的抗性，该基因的表达影响植物的抗病表型，农作物中同源基因可能具有同样的功能，因此在生产中具有重要的意义。

Description

拟南芥转录因子AT3G46090基因在培育抗病性转基因植物中 的应用

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体地说，涉及拟南芥转录因子AT3G46090基因在培育抗病性转基因植物中的应用。

背景技术

我国作为人口大国，每年对粮食的需求量巨大。农业生产中农作物的产量会受各种因素的影响导致减产，其中病虫害是影响全球农业生产的重要因素之一。现在对农作物病虫害的防治主要采取化学药剂或生物防治的办法，但是这两种常见方法会引起二次污染，或其他一些生态危害。因此利用现代生物技术挖掘广谱抗性基因，为传统育种技术提供指导是十分必要的。现在已有一些广谱的抗病基因被挖掘到。对抗病相关基因进行进一步挖掘及拓展，为育种工作者提供更多的选择对未来的农作物生产具有重大意义。

发明内容

发明人针对筛选获得的一个拟南芥转录抑制因子AT3G46090进行了基因克隆、转基因植物构建及初步的抗病分析，发现该基因在植物抗病中发挥功能，该基因在不同物种中具有一定的保守性，后期或可进行农作物的抗病育种及改良。

作为本发明的一个方面，提供了拟南芥转录因子AT3G46090基因在培育抗病性转基因植物中的应用。

进一步的，所述应用具体包括，克隆转录因子AT3G46090基因的CDS序列，其序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列；利用Gateway技术构建融合表达载体，该载体可在植物中表达融合蛋白AT3G46090-Linker-FLAG，其中linker为Gateway载体重组位点编码的氨基酸序列YPAFLYKVVDNS，FLAG标签的氨基酸序列为DYKDDDDK，AT3G46090为拟南芥转录因子AT3G46090编码的氨基酸序列；转化植物，筛选，鉴定，获得具有抗病性的转基因植物。

作为本发明的另一个方面，提供了前述载体及含有该载体的工程菌及含有该载体的转基因细胞系。

本发明的有益效果：本发明对拟南芥转录因子AT3G46090进行克隆和表达载体的构建，并转化到植物中进行研究，对筛选到的植物进行分析发现其可增强植物的抗病性，对农作物中同源基因可能具有同样的功能，因此在生产中具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中pGWB11的载体图谱；

图2为本发明实施例1中pGWB11-AT3G46090载体图谱；

图3为本发明实施例5中拟南芥接种丁香假单胞菌番茄亚种的表型分析，其中，左侧为拟南芥Col-0，右侧为AT3G46090转基因拟南芥株系。

具体实施方式：

本发明提供的项目实施方案用于说明本发明，但是不局限于本发明的研究范围。如果没有特别指出，本发明实施中的技术手段为本研究领域的常用技术，所用原料为市场所购。

实施例1拟南芥转录因子AT3G46090基因序列的获得以及植物表达载体的构建。

登录拟南芥信息资源数据库网站https://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject？type＝sequence&id＝30046，找到转录因子AT3G46090基因的序列(SEQ IDNo.1)，根据AT3G46090基因的CDS设计PCR扩增引物，

AT3G46090-F:5'-ATGGTTGCGAGAAGTGAGGAA-3'

AT3G46090-R:5'-TTAACTCCAAGAAATCGTTCT-3'

培养野生型拟南芥Col-0，取短日照生长3周的拟南芥叶片为材料，TRIzol法提取植物总RNA，经反转录PCR获得cDNA，随后以cDNA为模板扩增目的序列。

提取RNA具体步骤如下：在液氮环境中将拟南芥叶片研磨粉碎，待液氮完全挥发后，将样品分装至装有1mL TRIzol的离心管中快速混匀，室温静置，酚氯仿抽提两次，取上清，而后用等体积异丙醇沉淀20分钟，低温高速离心，弃上清后用乙醇洗沉淀两次，待吹干乙醇后用20μL Rnase-free的去离子水溶解即为提取好的RNA。

反转录PCR方法如下：离心管中依次加入取2μL拟南芥总RNA(1μg)、10μL不含核酸酶的ddH₂O、4μL 5*反应缓冲液、1μL Oligo(dT)₁₈引物、2μL dNTP、1μL RNase抑制剂及1μL反转录酶，混合均匀后42℃反应1小时,70℃处理5min终止反应，即为反转录的cDNA。将cDNA稀释后依次加入PCR缓冲液、dNTP、引物、DNA聚合酶和不含核酸酶的ddH₂O后用PCR仪进行扩增反应，程序如下，热启动98℃10s，60℃5s，72℃15s，30个循环后，72℃延伸5min。

获得拟南芥转录因子AT3G46090基因的CDS序列：按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。根据Gateway克隆技术的要求，此过程中包含两轮PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的引物，而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物采用完整的adaptor attB引物。将PCR产物克隆到连接pDONR克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。通过LR反应将AT3G46090基因构建到植物表达载体pGWB11(图1)上，获得载体AT3G46090-FLAG::pGWB11(图2)，该载体全序列如SEQ ID No.2所示。该载体具有在植物中表达融合蛋白AT3G46090-Linker-FLAG的功能，其中linker为Gateway载体重组位点编码的氨基酸序列YPAFLYKVVDNS，FLAG标签的氨基酸序列为DYKDDDDK；AT3G46090为拟南芥转录因子AT3G46090编码的氨基酸序列(SEQ ID No.3)。

实施例2转基因拟南芥植株的获得

首先植物培养至开花期，随后用农杆菌蘸花法进行转化，收取种子后进行转基因植物的筛选。

植物培养的方法：

取足量拟南芥种子装入离心管中进行表面消毒。首先用75％乙醇表面消毒30s，无菌水漂洗一次，接着用1％NaClO表面消毒5-8min后，用无菌水漂洗三次；完成表面消毒后，将处理好的种子播种于1/2MS培养基平板上。将点好的平板用parafilm膜封口，并放于4℃黑暗处理。2-4天后将平板放置于植物光照培养箱(光照周期为12h光照/12h黑暗)。待种子萌发后8天，将拟南芥幼苗转载至营养土，同样光照条件下进行生长，定期浇水。待上述培养的拟南芥生长至6-8周时，剪去成熟的果荚，用以准备转化。

农杆菌蘸花法转化：

将植物表达载体AT3G46090-FLAG::pGWB11转化农杆菌GV3101(pMD19)，并筛选阳性克隆；将阳性克隆用YEB于28℃进行培养，随后以1:100比例接种至200mL YEB液体培养基扩大培养，室温离心收集菌体，并将之重悬于新配的5％蔗糖溶液；在蘸花转化前，在菌悬液中加入终浓度为0.02％的Silwet L-77，混匀后将拟南芥花序浸泡于菌液中30s，将植物平放于黑暗高湿环境中16-24h后，正常培养至种子成熟，收取种子以备筛选。

转基因植物的筛选：

将收取的拟南芥种子经表面消毒处理后(处理方法同上)，平铺于含有50mg/L卡那霉素抗性的1/2MS平板，经4℃黑暗处理两天后，置于植物光照培养箱培养；7-10天后可见明显的转化子表型。成功的转化子正常生长，而未成功转化的植物黄化并且不再生长。将获得的转化子转移至营养土中进一步生长，按期浇水管理。3-4周后，将拟南芥叶片提取基因组DNA进行进一步鉴定。

实施例3转基因拟南芥的验证

以转基因植物的叶片为材料提取基因组DNA，并进行PCR验证，确认AT3G46090-flag DNA片段插入拟南芥基因组。

基因组DNA的提取：

取50mg待检测的正常生长的拟南芥叶片研磨后加入400μL植物基因组DNA提取液(200mM Tris-Cl pH7.4，250mM NaCl，25mM EDTA，1％SDS)，涡旋混匀后高速离心5min，吸取上清并加入等体积异丙醇，室温沉淀30min，高速离心5min后弃上清，用70％乙醇清洗沉淀两次，将沉淀溶解于20μL无核酸酶的ddH₂O。

利用pGWB11载体的特异引物进行PCR扩增：

以上述提取的基因组DNA为模板进行PCR，体系包括5*缓冲液4μL、上游引物及下游引物各1μL、10mM dNTP 0.5μL、基因组DNA 1μL、Taq聚合酶0.5μL和无核酸酶的ddH₂O12μL。PCR程序为热启动95℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环后，72℃延伸5min，结束反应。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，转化子基因组DNA中可以扩增得到目标条带，而未转化的不能得到目标条带。

pGWB11特异引物为：

pGWB11-F:5'-gggactctagagttatca-3'

pGWB11-R:5'-gggaaattcgagctctaagc-3'

实施例4转基因植物的WB检测

取生长4周的植物叶片1g，用液氮速冻，并迅速将植物叶片研磨粉碎，在蛋白提取缓冲液中混匀，13000g离心15分钟，即为蛋白粗提液。配置12％分离胶、4％浓缩胶的SDS-PAGE。取10ul蛋白粗提液进行电泳检测。首先80V的低电压电泳30分钟，使蛋白样品跑至同一条线，然后再120V的高电压下电泳90分钟左右，直至溴酚蓝条带跑到底端，停止电泳。电泳后利用湿转法转膜约60分钟，接着用丽春红染液进行染色观察，确定转膜质量；然后将膜置于含有5％脱脂奶粉PBST溶液中封闭60分钟，接着用一抗FLAG单抗隆抗体(sigma，CAT号为：F2555)孵育2小时，完成后用PBST洗涤3次，每次10分钟；随后用5％的PBST脱脂奶粉封闭30分钟，用二抗山羊抗兔IgG(H&L,HRP,货号ab6721)标记2小时，最后用PBST洗涤3次，每次5分钟，在膜上加入底物，黑暗条件下进行曝光。鉴定结果表明在野生型Col-0中没有发现FLAG出现的蛋白条带，但是在转基因植物中存在可以被FLAG抗体识别且大小符合预测的蛋白条带。

实施例5转基因拟南芥植株的抗病表型分析

本发明中施用的病原菌为丁香假单胞菌番茄亚种(Pst DC3000)。该病原菌可侵染包括番茄、拟南芥等在内的植物。

首先将病原细菌Pst DC3000菌种涂布于含有20mg/mL利福平的LB培养基，28℃黑暗培养，待生长出单克隆后挑取单克隆于2mL加有利福平的LB培养基过夜培养。将过夜培养的菌液离心收集菌体，并用10mM MgCl₂洗菌体两次，最后用10mM MgCl₂重悬菌体并调节至合适浓度。将菌悬液分别注射野生型及转基因拟南芥叶片，并以注射10mM MgCl₂的为对照，3天后观察表型，结果如图3所示，野生型拟南芥叶片(左)病原菌大量增殖，呈现黄色病斑，而转基因拟南芥的叶片(右)几乎无表征或者呈现坏死，病原菌的增殖受到抑制。

以上提供的实施例是将拟南芥AT3G46090基因的CDS序列通过Gateway技术构建到带有FLAG蛋白标签的上游，并成功转化拟南芥，该基因的表达可影响拟南芥抗病表型。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽描述，但在本发明基础上，可以对之稍作修改或改进，这对本领域技术人员是显而易见的。同样的，将拟南芥AT3G46090的CDS序列构建到其他蛋白标签的上游或下游也可以达到相应效果。因此，在不偏离本发明的精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 拟南芥转录因子AT3G46090基因在培育抗病性转基因植物中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 507

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atggttgcga gaagtgagga aattgtgata gtggaagaag atacgactgc gaaatgtttg 60

atgttgttat caagagtcgg agaatgcggc ggcggctgcg ggggagatga acgtgttttc 120

cgatgcaaga cttgtcttaa agagttctca tcgtttcaag ctttgggagg tcatcgtgca 180

agccacaaga aacttatcaa cagtgacaat ccatcacttc ttggatcctt gtccaacaag 240

aaaactaaaa cgtctcatcc ttgtccgata tgtggagtga agtttccgat gggacaagct 300

cttggtggtc acatgaggag acataggaac gagaaagtct caggctcgtt ggttacacgt 360

tcttttctac cggagacgac gacggtgacg gctttgaaga aatttagtag tgggaagaga 420

gtggcttgtt tggatttgga cttagattcg atggagagtt tggtcaattg gaagttggag 480

ttgggaagaa cgatttcttg gagttaa 507

<210> 2

<211> 16103

<212> DNA

<213> 载体(AT3G46090-FLAG::pGWB11)

<400> 2

tgagcgtcgc aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg tgatgtactt caccagctcc 60

gcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct tggcaatcac gcgcaccccc 120

cggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc gggcggacca cgcccatcat 180

gaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc agcagggcga ggatcgtggc 240

atcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag agtttcagca ggccgcccag 300

gcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg tgctcatagt ccacgacgcc 360

cgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc gacaggctca tgccggccgc 420

cgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg cagtacacct tgataggtgg 480

gctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc ttgccctcat ctgttacgcc 540

ggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaata 600

agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct acttcaccta tcctgcccgg 660

ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtata 720

tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata atgaccccga agcagggtta 780

tgcagcggaa aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 840

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 900

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 960

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1020

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1080

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1140

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgccaga aggccgccag agaggccgag cgcggccgtg 1200

aggcttggac gctagggcag ggcatgaaaa agcccgtagc gggctgctac gggcgtctga 1260

cgcggtggaa agggggaggg gatgttgtct acatggctct gctgtagtga gtgggttgcg 1320

ctccggcagc ggtcctgatc aatcgtcacc ctttctcggt ccttcaacgt tcctgacaac 1380

gagcctcctt ttcgccaatc catcgacaat caccgcgagt ccctgctcga acgctgcgtc 1440

cggaccggct tcgtcgaagg cgtctatcgc ggcccgcaac agcggcgaga gcggagcctg 1500

ttcaacggtg ccgccgcgct cgccggcatc gctgtcgccg gcctgctcct caagcacggc 1560

cccaacagtg aagtagctga ttgtcatcag cgcattgacg gcgtccccgg ccgaaaaacc 1620

cgcctcgcag aggaagcgaa gctgcgcgtc ggccgtttcc atctgcggtg cgcccggtcg 1680

cgtgccggca tggatgcgcg cgccatcgcg gtaggcgagc agcgcctgcc tgaagctgcg 1740

ggcattcccg atcagaaatg agcgccagtc gtcgtcggct ctcggcaccg aatgcgtatg 1800

attctccgcc agcatggctt cggccagtgc gtcgagcagc gcccgcttgt tcctgaagtg 1860

ccagtaaagc gccggctgct gaacccccaa ccgttccgcc agtttgcgtg tcgtcagacc 1920

gtctacgccg acctcgttca acaggtccag ggcggcacgg atcactgtat tcggctgcaa 1980

ctttgtcatg cttgacactt tatcactgat aaacataata tgtccaccaa cttatcagtg 2040

ataaagaatc cgcgcgttca atcggaccag cggaggctgg tccggaggcc agacgtgaaa 2100

cccaacatac ccctgatcgt aattctgagc actgtcgcgc tcgacgctgt cggcatcggc 2160

ctgattatgc cggtgctgcc gggcctcctg cgcgatctgg ttcactcgaa cgacgtcacc 2220

gcccactatg gcattctgct ggcgctgtat gcgttggtgc aatttgcctg cgcacctgtg 2280

ctgggcgcgc tgtcggatcg tttcgggcgg cggccaatct tgctcgtctc gctggccggc 2340

gccagatctg gggaaccctg tggttggcat gcacatacaa atggacgaac ggataaacct 2400

tttcacgccc ttttaaatat ccgattattc taataaacgc tcttttctct taggtttacc 2460

cgccaatata tcctgtcaaa cactgatagt ttaaactgaa ggcgggaaac gacaatctga 2520

tcatgagcgg agaattaagg gagtcacgtt atgacccccg ccgatgacgc gggacaagcc 2580

gttttacgtt tggaactgac agaaccgcaa cgttgaagga gccactcagc cgcgggtttc 2640

tggagtttaa tgagctaagc acatacgtca gaaaccatta ttgcgcgttc aaaagtcgcc 2700

taaggtcact atcagctagc aaatatttct tgtcaaaaat gctccactga cgttccataa 2760

attcccctcg gtatccaatt agagtctcat attcactctc aatccaaata atctgcaccg 2820

gatctggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 2880

gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 2940

ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 3000

gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg 3060

ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 3120

gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 3180

tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 3240

accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 3300

aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 3360

aggcgcgcat gcccgacggc gatgatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 3420

atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 3480

cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 3540

aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 3600

ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga 3660

ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag 3720

gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct 3780

catgctggag ttcttcgccc acgggatctc tgcggaacag gcggtcgaag gtgccgatat 3840

cattacgaca gcaacggccg acaagcacaa cgccacgatc ctgagcgaca atatgatcgg 3900

gcccggcgtc cacatcaacg gcgtcggcgg cgactgccca ggcaagaccg agatgcaccg 3960

cgatatcttg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc ggatgatccc 4020

cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 4080

gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 4140

catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 4200

cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 4260

tatgttacta gatcgggcct cctgtcaatg ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg 4320

gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga gggtggcggc tctgagggag 4380

gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta 4440

ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca 4500

aacttgattc tgtcgctact gattacggtg ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt 4560

ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg 4620

ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt 4680

ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt ttgtctttgg cccaatacgc aaaccgcctc 4740

tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 4800

cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 4860

tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 4920

caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg cctgcaggtc cccagattag 4980

ccttttcaat ttcagaaaga atgctaaccc acagatggtt agagaggctt acgcagcagg 5040

tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa tctccaggaa atcaaatacc ttcccaagaa 5100

ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taactgcatc aagaacacag agaaagatat 5160

atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt caaggcttgc ttcacaaacc 5220

aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt cccactgaat caaaggccat 5280

ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg gcgaacagtt 5340

catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca tggtggagca 5400

cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 5460

tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 5520

ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 5580

cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 5640

cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 5700

ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 5760

agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg ggactctaga 5820

gttatcaaca agtttgtaca aaaaagcagg cttaatggtt gcgagaagtg aggaaattgt 5880

gatagtggaa gaagatacga ctgcgaaatg tttgatgttg ttatcaagag tcggagaatg 5940

cggcggcggc tgcgggggag atgaacgtgt tttccgatgc aagacttgtc ttaaagagtt 6000

ctcatcgttt caagctttgg gaggtcatcg tgcaagccac aagaaactta tcaacagtga 6060

caatccatca cttcttggat ccttgtccaa caagaaaact aaaacgtctc atccttgtcc 6120

gatatgtgga gtgaagtttc cgatgggaca agctcttggt ggtcacatga ggagacatag 6180

gaacgagaaa gtctcaggct cgttggttac acgttctttt ctaccggaga cgacgacggt 6240

gacggctttg aagaaattta gtagtgggaa gagagtggct tgtttggatt tggacttaga 6300

ttcgatggag agtttggtca attggaagtt ggagttggga agaacgattt cttggagtta 6360

atacccagct ttcttgtaca aagtggttga taacagcgac tacaaggatg acgatgacaa 6420

ggcttagagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt 6480

gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 6540

tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 6600

cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 6660

attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttagcttcat caacgcaaga 6720

catgcgcacg accgtctgac aggagaggaa tttccgacga gcacagaaag gacttgctct 6780

tggacgtagg cctatttctc aggcacatgt atcaagtgtt cggacgtggg ttttcgatgg 6840

tgtatcagcc gccgccaact gggagatgag gaggctttct tggggggcag tcagcagttc 6900

atttcacaag acagaggaac ttgtaaggag atgcactgat ttatcttggc gcaaaccagc 6960

aggacgaatt agtgggaata gcccgcgaat atctaagtta tgcctgtcgg catgagcaga 7020

aacttccaat tcgaaacagt ttggagaggt tgtttttggg catacctttt gttagtcagc 7080

ctctcgattg ctcatcgtca ttacacagta ccgaagtttg atcgatctag taacatagat 7140

gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat 7200

taaatgtata attgcgggac tctaatcata aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat 7260

tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca 7320

agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa ctttattgcc aaatgtttga acgatctgct 7380

tcgacgcact ccttctttac tccaccatct cgtccttatt gaaaacgtgg gtagcaccaa 7440

aacgaatcaa gtcgctggaa ctgaagttac caatcacgct ggatgatttg ccagttggat 7500

taatcttgcc tttccccgca tgaataatat tgatgaatgc atgcgtgagg ggtatttcga 7560

ttttggcaat agctgcaatt gccgcgacat cctccaacga gcataattct tcagaaaaat 7620

agcgatgttc catgttgtca gggcatgcat gatgcacgtt atgaggtgac ggtgctaggc 7680

agtattccct caaagtttca tagtcagtat catattcatc attgcattcc tgcaagagag 7740

aattgagacg caatccacac gctgcggcaa ccttccggcg ttcgtggtct atttgctctt 7800

ggacgttgca aacgtaagtg ttggatcccg gtcggcatct actctattcc tttgccctcg 7860

gacgagtgct ggggcgtcgg tttccactat cggcgagtac ttctacacag ccatcggtcc 7920

agacggccgc gcttctgcgg gcgatttgtg tacgcccgac agtcccggct ccggatcgga 7980

cgattgcgtc gcatcgaccc tgcgcccaag ctgcatcatc gaaattgccg tcaaccaagc 8040

tctgatagag ttggtcaaga ccaatgcgga gcatatacgc ccggagccgc ggcgatcctg 8100

caagctccgg atgcctccgc tcgaagtagc gcgtctgctg ctccatacaa gccaaccacg 8160

gcctccagaa gaagatgttg gcgacctcgt attgggaatc cccgaacatc gcctcgctcc 8220

agtcaatgac cgctgttatg cggccattgt ccgtcaggac attgttggag ccgaaatccg 8280

cgtgcacgag gtgccggact tcggggcagt cctcggccca aagcatcagc tcatcgagag 8340

cctgcgcgac ggacgcactg acggtgtcgt ccatcacagt ttgccagtga tacacatggg 8400

gatcagcaat cgcgcatatg aaatcacgcc atgtagtgta ttgaccgatt ccttgcggtc 8460

cgaatgggcc gaacccgctc gtctggctaa gatcggccgc agcgatcgca tccatggcct 8520

ccgcgaccgg ctgcagaaca gcgggcagtt cggtttcagg caggtcttgc aacgtgacac 8580

cctgtgcacg gcgggagatg caataggtca ggctctcgct gaattcccca atgtcaagca 8640

cttccggaat cgggagcgcg gccgatgcaa agtgccgata aacataacga tctttgtaga 8700

aaccatcggc gcagctattt acccgcagga catatccacg ccctcctaca tcgaagctga 8760

aagcacgaga ttcttcgccc tccgagagct gcatcaggtc ggagacgctg tcgaactttt 8820

cgatcagaaa cttctcgaca gacgtcgcgg tgagttcagg ctttttcata tcggggtcgt 8880

cctctccaaa tgaaatgaac ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga 8940

ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt 9000

ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc 9060

actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta 9120

ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa 9180

tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc 9240

tgagactgta tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttgac 9300

ggatctctag gacgcgtcct agaagctaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 9360

tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 9420

tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 9480

ggcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 9540

tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 9600

ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 9660

ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 9720

aacaacactc aaccctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 9780

ggaaccacca tcaaacagga ttttcgcctg ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg 9840

caactctctc agggccaggc ggtgaagggc aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa 9900

agaaaaacca ccccagtaca ttaaaaacgt ccgcaatgtg ttattaagtt gtctaagcgt 9960

caatttgttt acaccacaat atatcctgcc accagccagc caacagctcc ccgaccggca 10020

gctcggcaca aaatcaccac tcgatacagg cagcccatca gtccgggacg gcgtcagcgg 10080

gagagccgtt gtaaggcggc agactttgct catgttaccg atgctattcg gaagaacggc 10140

aactaagctg ccgggtttga aacacggatg atctcgcgga gggtagcatg ttgattgtaa 10200

cgatgacaga gcgttgctgc ctgtgatcaa atatcatctc cctcgcagag atccgaatta 10260

tcagccttct tattcatttc tcgcttaacc gtgacaggct gtcgatcttg agaactatgc 10320

cgacataata ggaaatcgct ggataaagcc gctgaggaag ctgagtggcg ctatttcttt 10380

agaagtgaac gttgacgata tcaactcccc tatccattgc tcaccgaatg gtacaggtcg 10440

gggacccgaa gttccgactg tcggcctgat gcatccccgg ctgatcgacc ccagatctgg 10500

ggctgagaaa gcccagtaag gaaacaactg taggttcgag tcgcgagatc ccccggaacc 10560

aaaggaagta ggttaaaccc gctccgatca ggccgagcca cgccaggccg agaacattgg 10620

ttcctgtagg catcgggatt ggcggatcaa acactaaagc tactggaacg agcagaagtc 10680

ctccggccgc cagttgccag gcggtaaagg tgagcagagg cacgggaggt tgccacttgc 10740

gggtcagcac ggttccgaac gccatggaaa ccgcccccgc caggcccgct gcgacgccga 10800

caggatctag cgctgcgttt ggtgtcaaca ccaacagcgc cacgcccgca gttccgcaaa 10860

tagcccccag gaccgccatc aatcgtatcg ggctacctag cagagcggca gagatgaaca 10920

cgaccatcag cggctgcaca gcgcctaccg tcgccgcgac cccgcccggc aggcggtaga 10980

ccgaaataaa caacaagctc cagaatagcg aaatattaag tgcgccgagg atgaagatgc 11040

gcatccacca gattcccgtt ggaatctgtc ggacgatcat cacgagcaat aaacccgccg 11100

gcaacgcccg cagcagcata ccggcgaccc ctcggcctcg ctgttcgggc tccacgaaaa 11160

cgccggacag atgcgccttg tgagcgtcct tggggccgtc ctcctgtttg aagaccgaca 11220

gcccaatgat ctcgccgtcg atgtaggcgc cgaatgccac ggcatctcgc aaccgttcag 11280

cgaacgcctc catgggcttt ttctcctcgt gctcgtaaac ggacccgaac atctctggag 11340

ctttcttcag ggccgacaat cggatctcgc ggaaatcctg cacgtcggcc gctccaagcc 11400

gtcgaatctg agccttaatc acaattgtca attttaatcc tctgtttatc ggcagttcgt 11460

agagcgcgcc gtgcgtcccg agcgatactg agcgaagcaa gtgcgtcgag cagtgcccgc 11520

ttgttcctga aatgccagta aagcgctggc tgctgaaccc ccagccggaa ctgaccccac 11580

aaggccctag cgtttgcaat gcaccaggtc atcattgacc caggcgtgtt ccaccaggcc 11640

gctgcctcgc aactcttcgc aggcttcgcc gacctgctcg cgccacttct tcacgcgggt 11700

ggaatccgat ccgcacatga ggcggaaggt ttccagcttg agcgggtacg gctcccggtg 11760

cgagctgaaa tagtcgaaca tccgtcgggc cgtcggcgac agcttgcggt acttctccca 11820

tatgaatttc gtgtagtggt cgccagcaaa cagcacgacg atttcctcgt cgatcaggac 11880

ctggcaacgg gacgttttct tgccacggtc caggacgcgg aagcggtgca gcagcgacac 11940

cgattccagg tgcccaacgc ggtcggacgt gaagcccatc gccgtcgcct gtaggcgcga 12000

caggcattcc tcggccttcg tgtaataccg gccattgatc gaccagccca ggtcctggca 12060

aagctcgtag aacgtgaagg tgatcggctc gccgataggg gtgcgcttcg cgtactccaa 12120

cacctgctgc cacaccagtt cgtcatcgtc ggcccgcagc tcgacgccgg tgtaggtgat 12180

cttcacgtcc ttgttgacgt ggaaaatgac cttgttttgc agcgcctcgc gcgggatttt 12240

cttgttgcgc gtggtgaaca gggcagagcg ggccgtgtcg tttggcatcg ctcgcatcgt 12300

gtccggccac ggcgcaatat cgaacaagga aagctgcatt tccttgatct gctgcttcgt 12360

gtgtttcagc aacgcggcct gcttggcctc gctgacctgt tttgccaggt cctcgccggc 12420

ggtttttcgc ttcttggtcg tcatagttcc tcgcgtgtcg atggtcatcg acttcgccaa 12480

acctgccgcc tcctgttcga gacgacgcga acgctccacg gcggccgatg gcgcgggcag 12540

ggcaggggga gccagttgca cgctgtcgcg ctcgatcttg gccgtagctt gctggaccat 12600

cgagccgacg gactggaagg tttcgcgggg cgcacgcatg acggtgcggc ttgcgatggt 12660

ttcggcatcc tcggcggaaa accccgcgtc gatcagttct tgcctgtatg ccttccggtc 12720

aaacgtccga ttcattcacc ctccttgcgg gattgccccg actcacgccg gggcaatgtg 12780

cccttattcc tgatttgacc cgcctggtgc cttggtgtcc agataatcca ccttatcggc 12840

aatgaagtcg gtcccgtaga ccgtctggcc gtccttctcg tacttggtat tccgaatctt 12900

gccctgcacg aataccagcg accccttgcc caaatacttg ccgtgggcct cggcctgaga 12960

gccaaaacac ttgatgcgga agaagtcggt gcgctcctgc ttgtcgccgg catcgttgcg 13020

ccacatctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata atattttatt ttctcccaat 13080

caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata ctgttcttcc ccgatatcct 13140

ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt gtccgccctg ccgcttctcc 13200

caagatcaat aaagccactt actttgccat ctttcacaaa gatgttgctg tctcccaggt 13260

cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt ctttaaaaaa tcatacagct 13320

cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc gcaatccaca tcggccagat 13380

cgttattcag taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc taagctattc gtatagggac 13440

aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc cgcatacagc tcgataatct 13500

tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag gacgccatcg gcctcactca 13560

tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag gacctttgga acaggcagct 13620

ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac atcataggtg gtccctttat 13680

accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc tcccaccagc ttatatacct 13740

tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta tttttcgatc agttttttca 13800

attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct tcctcttttc tacagtattt 13860

aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc aattcactgt tccttgcatt 13920

ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg ttttcaaagt tggcgtataa 13980

catagtatcg acggagccga ttttgaaacc acaattatgg gtgatgctgc caacttactg 14040

atttagtgta tgatggtgtt tttgaggtgc tccagtggct tctgtgtcta tcagctgtcc 14100

ctcctgttca gctactgacg gggtggtgcg taacggcaaa agcaccgccg gacatcagcg 14160

ctatctctgc tctcactgcc gtaaaacatg gcaactgcag ttcacttaca ccgcttctca 14220

acccggtacg caccagaaaa tcattgatat ggccatgaat ggcgttggat gccgggcaac 14280

agcccgcatt atgggcgttg gcctcaacac gattttacgt cacttaaaaa actcaggccg 14340

cagtcggtaa cctcgcgcat acagccgggc agtgacgtca tcgtctgcgc ggaaatggac 14400

gaacagtggg gctatgtcgg ggctaaatcg cgccagcgct ggctgtttta cgcgtatgac 14460

agtctccgga agacggttgt tgcgcacgta ttcggtgaac gcactatggc gacgctgggg 14520

cgtcttatga gcctgctgtc accctttgac gtggtgatat ggatgacgga tggctggccg 14580

ctgtatgaat cccgcctgaa gggaaagctg cacgtaatca gcaagcgata tacgcagcga 14640

attgagcggc ataacctgaa tctgaggcag cacctggcac ggctgggacg gaagtcgctg 14700

tcgttctcaa aatcggtgga gctgcatgac aaagtcatcg ggcattatct gaacataaaa 14760

cactatcaat aagttggagt cattacccaa ttatgataga atttacaagc tataaggtta 14820

ttgtcctggg tttcaagcat tagtccatgc aagtttttat gctttgccca ttctatagat 14880

atattgataa gcgcgctgcc tatgccttgc cccctgaaat ccttacatac ggcgatatct 14940

tctatataaa agatatatta tcttatcagt attgtcaata tattcaaggc aatctgcctc 15000

ctcatcctct tcatcctctt cgtcttggta gctttttaaa tatggcgctt catagagtaa 15060

ttctgtaaag gtccaattct cgttttcata cctcggtata atcttaccta tcacctcaaa 15120

tggttcgctg ggtttatcgc acccccgaac acgagcacgg cacccgcgac cactatgcca 15180

agaatgccca aggtaaaaat tgccggcccc gccatgaagt ccgtgaatgc cccgacggcc 15240

gaagtgaagg gcaggccgcc acccaggccg ccgccctcac tgcccggcac ctggtcgctg 15300

aatgtcgatg ccagcacctg cggcacgtca atgcttccgg gcgtcgcgct cgggctgatc 15360

gcccatcccg ttactgcccc gatcccggca atggcaagga ctgccagcgc tgccattttt 15420

ggggtgaggc cgttcgcggc cgaggggcgc agcccctggg gggatgggag gcccgcgtta 15480

gcgggccggg agggttcgag aagggggggc accccccttc ggcgtgcgcg gtcacgcgca 15540

cagggcgcag ccctggttaa aaacaaggtt tataaatatt ggtttaaaag caggttaaaa 15600

gacaggttag cggtggccga aaaacgggcg gaaacccttg caaatgctgg attttctgcc 15660

tgtggacagc ccctcaaatg tcaataggtg cgcccctcat ctgtcagcac tctgcccctc 15720

aagtgtcaag gatcgcgccc ctcatctgtc agtagtcgcg cccctcaagt gtcaataccg 15780

cagggcactt atccccaggc ttgtccacat catctgtggg aaactcgcgt aaaatcaggc 15840

gttttcgccg atttgcgagg ctggccagct ccacgtcgcc ggccgaaatc gagcctgccc 15900

ctcatctgtc aacgccgcgc cgggtgagtc ggcccctcaa gtgtcaacgt ccgcccctca 15960

tctgtcagtg agggccaagt tttccgcgag gtatccacaa cgccggcggc cgcggtgtct 16020

cgcacacggc ttcgacggcg tttctggcgc gtttgcaggg ccatagacgg ccgccagccc 16080

agcggcgagg gcaaccagcc cgg 16103

<210> 3

<211> 168

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

Met Val Ala Arg Ser Glu Glu Ile Val Ile Val Glu Glu Asp Thr Thr

1 5 10 15

Ala Lys Cys Leu Met Leu Leu Ser Arg Val Gly Glu Cys Gly Gly Gly

20 25 30

Cys Gly Gly Asp Glu Arg Val Phe Arg Cys Lys Thr Cys Leu Lys Glu

35 40 45

Phe Ser Ser Phe Gln Ala Leu Gly Gly His Arg Ala Ser His Lys Lys

50 55 60

Leu Ile Asn Ser Asp Asn Pro Ser Leu Leu Gly Ser Leu Ser Asn Lys

65 70 75 80

Lys Thr Lys Thr Ser His Pro Cys Pro Ile Cys Gly Val Lys Phe Pro

85 90 95

Met Gly Gln Ala Leu Gly Gly His Met Arg Arg His Arg Asn Glu Lys

100 105 110

Val Ser Gly Ser Leu Val Thr Arg Ser Phe Leu Pro Glu Thr Thr Thr

115 120 125

Val Thr Ala Leu Lys Lys Phe Ser Ser Gly Lys Arg Val Ala Cys Leu

130 135 140

Asp Leu Asp Leu Asp Ser Met Glu Ser Leu Val Asn Trp Lys Leu Glu

145 150 155 160

Leu Gly Arg Thr Ile Ser Trp Ser

165

Claims (2)

1.拟南芥转录因子AT3G46090基因在培育抗丁香假单胞菌番茄亚种转基因植物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括，克隆转录因子AT3G46090基因的CDS序列，其序列如SEQ ID No.1 所示；利用Gateway技术构建融合表达载体，该载体可在植物中表达融合蛋白AT3G46090-Linker-FLAG，其中linker为Gateway载体重组位点编码的氨基酸序列YPAFLYKVVDNS，FLAG标签的氨基酸序列为DYKDDDDK，AT3G46090为拟南芥转录因子AT3G46090编码的氨基酸序列；转化植物，筛选，鉴定，获得具有抗丁香假单胞菌番茄亚种的转基因植物。

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